Національна академія наук України

Інститут фізіології ім.О.О.Богомольця

Ткачук Світлана Сергіївна

УДК 616.8-092:616.43/.45-001.1/3:599.323.4

НЕЙРОЕНДОКРИННІ ТА БІОХІМІЧНІ МЕХАНІЗМИ ПОРУШЕНЬ СТРЕС-ЛІМІТУЮЧОЇ ТА СТРЕС-РЕАЛІЗУЮЧОЇ СИСТЕМ МОЗКУ У ЩУРІВ З СИНДРОМОМ ПРЕНАТАЛЬНОГО СТРЕСУ

14.03.04 ѕ патологічна фізіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Буковинській державній медичній академії Міністерства охорони здоров'я України

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор

П і ш а к В а с и л ь П а в л о в и ч

Буковинська державна медична академія, завідувач кафедри медичної біології та генетики

Офіційні опоненти: член-кореспондент АМН України, професор

Є л ь с ь к и й В і к т о р М и к о л а й о в и ч,

Донецький державний медичний університет

ім. Максима Горького,

завідувач кафедри патологічної фізіології

доктор біологічних наук, професор

К о с е н к о А н а т о л і й Ф е д о р о в и ч,

Інститут фізіології ім. Петра Богача

при Національному університеті

ім. Тараса Шевченка

доктор медичних наук,

Л у ч и ц ь к и й Є в г е н В а с и л ь о в и ч

Інститут ендокринології та обміну речовин

ім. В.П.Комісаренка АМН України,

завідувач відділенням клінічної андрології

Провідна установа: Національний медичний університет ім.О.О.Богомольця

Міністерства охорони здоров'я України,

кафедра патологічної фізіології, м. Київ

Захист відбудеться “26” вересня 2000 р. о 14 год

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (01024, Київ-24, вул. Богомольця, 4)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України (01024, Київ-24, вул. Богомольця, 4).

Автореферат розісланий “ 25" серпня 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Перенасиченість життя сучасної людини різноманітними по модальності, силі та тривалості стресовими впливами дозволяє стверджувати про стресорний континуум, успішність адаптації до якого визначається чутливістю, надійністю, економічністю, резервною потужністю адаптивних механізмів [Филаретов А.А. и др., 1993; Судаков К.В., 1996].

Однак у складних, безвихідних ситуаціях, або при дії на організм надто сильних факторів, стрес-реакція набуває надмірної інтенсивності та тривалості, перетворюючись з ланки адаптації на загальну ланку патогенезу так званих ендогенних, або стресорних захворювань, які складають одну з головних проблем сучасної медицини [Меерсон Ф.З. и др., 1989; Судаков К.В., 1996; Юматов Е.А., 1992].

У зв'язку з цим центральне місце в проблемі стресу займає вивчення фундаментальних фізіологічних закономірностей стрес-резистентності.

При дії стресора у системі нейроендокринної регуляції стресу виникає активаційний контур гормонального та вегетативного забезпечення функцій, який врівноважується складноорганізованим стрес-лімітуючим регуляторним контуром, спрямованим на підтримання гомеостатичних параметрів [Шаляпина В.Г. и др., 1995; Castro M.G., et al. 1996]. На сучасному етапі до системи обмеження стрес-реакції відносять ГАМК, дофамін, ?-ендорфін, простагландини та сімейство натрійуретичних пептидів [Пшенникова М.Г. и др., 1992; Шаляпина В.Г. и др., 1995]

Стрес, на думку цілого ряду дослідників [Дыгало Н.Н. и др., 1990; Красильников М.А., 1993; Маслова Л.Н. и др., 1990] виконує роль посередника між середовищем та генетичним апаратом.

Саме тому особливої значимості набувають ефекти стресу в період раннього індивідуального онтогенезу, коли відбувається прискорене розгортання генетичної програми та бурхливий розвиток головного мозку [Резніков О.Г. та ін., 1996; Носенко Н.Д., 2000].

У ці "критичні періоди" онтогенезу гормон-нейротрансмітерні впливи детермінують впродовж життя експресивність генетичного матеріалу в нейронах центральної нервової системи [Резніков О.Г. та ін., 1996].

Згідно концепції О.Г.Резнікова [Резников А.Г., 1982; Резніков О.Г. та ін., 1996] подібна автомодифікація клітинної реактивності зумовлена імпринтинговими процесами, які заздалегідь програмують рівень функціональної відповіді на той гуморальний подразник, який під час критичного періоду диференціації клітини спричинив репресію-дерепресію геному, зберігаючи генетичну пам'ять про даний подразник впродовж життя.

Виявлена О.Г.Резніковим закономірність автомодифікації має загальнобіологічне значення. Імпринтингові властивості щодо своїх клітин-мішеней проявляють катехоламіни, глюкокортикоїди, вазопресин, окситоцин, тироліберин, нікотин, статеві гормони, інсулін та ін. [Reznikov A.G., 1994].

Роль імпринтингових чинників можуть виконувати перинатальні впливи, і в першу чергу стрес, який супроводжується порушенням балансу кортикостероїдів, нейротрансмітерів, нейрогормонів не лише в організмі матері, але й плода.

Стрес матері впродовж останнього триместру вагітності спричиняє розвиток у нащадків синдрому пренатального стресу, який характеризується нейроендокринними порушеннями стрес-реактивності та статевої диференціації мозку [Ward I.L., 1972; Takahashi L.K. et al., 1990; Носенко Н.Д., 1996].

Описані в літературі дослідження присвячені, в основному, вивченню імпринтингових властивостей глюкокортикоїдів, катехоламінів та статевих гормонів.

Однак фетальний мозок впродовж останньої третини вагітності реагує на материнський стрес змінами секреції ?-ендорфіну [Rohde W. et al., 1989], передсердного натрійуретичного пептиду [Irons D.W. et al., 1996], коливаннями метаболізму арахідонової кислоти [Rudolph A.M., 1977], ГАМК та ін. компонентів стрес-лімітуючої системи, що з огляду на концепцію автомодифікації клітинної реактивності може призвести до тривалих порушень діяльності цієї системи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в Буковинській державній медичній академії у рамках тематики планової науково-дослідної міжкафедральної роботи (кафедр нормальної фізіології, патологічної фізіології, медичної біології та генетики і гістології) Буковинської державної медичної академії (№ державної реєстрації 0195U020510).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи — виявити окремі ендокринні, нейрохімічні та біохімічні механізми порушення стрес-реактивності у щурів з синдромом пренатального стресу за показниками функціонального стану стрес-реалізуючої та стрес-лімітуючої систем, на основі чого встановити закономірності функціонування адаптивної системи організму пренатально стресованих самців щурів та дослідити резервні можливості цієї системи при переході від стану функціонального спокою до стану активності.

Для досягнення поставленої мети були сформульовані наступні основні задачі:

1. Вияснити механізми тривалої модифікації стрес-реалізуючих систем у щурів з синдромом пренатального стресу за станом деяких нейроендокринних та біохімічних корелятів стрес-реактивності.

2. Дослідити віддалені наслідки пренатального стресу на окремі нейрохімічні, ендокринні та біохімічні показники функціонального стану стрес-лімітуючої системи у дорослих самців щурів.

3. Провести порівняльний аналіз взаємовідносин стрес-реалізуючих та стрес-лімітуючих механізмів у контрольних та пренатально стресованих самців щурів.

4. Виявити функціональні резерви стрес-реалізуючої та стрес-лімітуючої систем у дорослих самців щурів з синдромом пренатального стресу за умов іммобілізації.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше:—

теоретично та експериментально обгрунтована концепція структурної, нейроендокринної та біохімічної дезінтеграції стрес-реалізуючої та стрес-лімітуючої систем у патогенезі порушень стрес-реактивності у самців з синдромом пренатального стресу. Показано, що зниження відповіді на стрес має місце за умов дефіциту механізмів обмеження стрес-реакції. —

доведено, що співвідношення між активністю стрес-реалізуючої та стрес-лімітуючої систем формується не лише на основі генетичних особливостей організму, але й за рахунок порушення імпринтингових механізмів під впливом пренатального стресу; —

продемонстрована тривала модифікація стрес-лімітуючих та окремих, не описаних раніше, стрес-реалізуючих механізмів пренатальними стресорними впливами. Встановлено, що у структурах мозку щурів, які перенесли материнський стрес, значно знижені конститутивні рівні простагландинів, ?-передсердного натрійуретичного пептиду (?-ПНП), спостерігаються різноспрямовані зміни вмісту ?-ендорфіну, знижена активність глутатіонпероксидази, підвищується вміст циклічних нуклеотидів та має місце акумуляція оксидованих протеїнів, що свідчить про порушення проокисно-антиоксидантної рівноваги. Показана модифікація моноамінергічних механізмів в окремих ядрах гіпоталамуса, перегородки, мигдалеподібного комплексу за даними зв'язування мічених 3Н-дофаміну, 3Н-норадреналіну, 3Н-серотоніну;—

шляхом застосування гострого іммобілізаційного стресу виявлені нові патогенетичні ланки порушення стрес-реактивності, зумовлені хронічним впливом стресорних чинників впродовж пренатального періоду індивідуального розвитку мозку. Встановлено зниження функціональних резервів стрес-реалізуючої та стрес-лімітуючої систем у дорослих пренатально стресованих самців. Доведено, що за цих умов стрес-лімітуюча дія ?-ПНП відсутня внаслідок порушення зворотного зв'язку в системі "?-ПНП-глюкокортикоїди". Реакція в-?ндорфіну на стрес у гіпоталамусі даної групи тварин значно редукована і структурно обмежена, як і реакція з боку супероксиддисмутази, а стрес-індукована активація глутатіонпероксидази та простагландинів — відсутня. Порушені рецепторні механізми ГАМК-ергічної регуляції стрес-індукованого вмісту кортикостерону, пролактину, тироксину у плазмі крові та ?-ендорфіну у гіпоталамусі за рахунок функціональної інактивації ГАМКА-рецепторів та серотонінергічна регуляція вмісту вказаних гормонів. Виявлена стрес-індукована модифікація вмісту циклічних нуклеотидів та циклазного індексу у структурах мозку, а також порушення взаємовідносин між окремими компонентами моноамінергічних систем гіпоталамуса, перегородки та мигдалика за даними гістоавторадіографії;—

обгрунтована стрес-протекторна дія мелатоніну у інтактних тварин за рахунок: а) обмеження стрес-реактивності шляхом зменшення стрес-індукованого вмісту глюкокортикоїдів та збільшення вмісту пролактину в плазмі крові; б) підвищення стрес-індукованого вмісту ?-ендорфіну в гіпоталамусі; в) зменшення вмісту продуктів пероксидного окиснення ліпідів, підвищення активності антиоксидантних ферментів та зниження стрес-індукованої інтенсивності окиснювальної модифікації білків у структурах мозку;—

встановлено, що у тварин, які зазнали материнського стресу, мелатонін втрачає модулюючий вплив на стрес-індукований рівень глюкокортикоїдів та пролактину. Протекторна антиоксидантна дія мелатоніну обмежена впливом на окремі показники вільнорадикального окиснення: зниження вмісту дієнових кон'югатів та обмеження окиснювальної модифікації білків, вираженість якого значно нижча, ніж у інтактних тварин.

Практичне значення одержаних результатів. Робота відноситься до фундаментальних досліджень.

Отримані результати розширюють та поглиблюють існуючу уяву про наслідки та механізми розвитку синдрому пренатального стресу. Конкретизуються структури мозку, в яких пренатальний стрес викликає найбільш значні тривалі нейрохімічні порушення. Показано, що пренатальні стресорні впливи відіграють роль функціональних тератогенів щодо адаптивних механізмів, значно послаблюючи стрес-лімітуючі системи, особливо за умов функціонального навантаження.

Отримані дані мають значення для прогнозування розвитку хвороб адаптації і формування груп ризику стосовно цієї патології серед нащадків чоловічої статі, матері яких впродовж вагітності перебували під впливом стресуючих факторів. Знання механізмів патології створює можливості для застосування корегуючих засобів та відкриває нові перспективи превентивної медицини.

Результати роботи можуть бути використані у навчальному процесі при викладанні нормальної та патологічної фізіології, ендокринології, нервових, дитячих та внутрішніх хвороб, медичної хімії і біології, загальної гігієни, фармакології, в роботі лабораторій науково-дослідних інститутів з відповідними науковими напрямками, при написанні підручників та монографій із зазначених галузей теоретичної медицини.

Результати досліджень впроваджено у навчальний процес кафедр патофізіології Донецького державного медуніверситету ім. М. Горького, Львівського державного медичного університету ім. Данила Галицького, Івано-Франківської державної медакадемії, Луганського державного медичного університету та кафедр Буковинської державної медичної академії (акти впроваждення від 30.03.99р., 5.04.99р, 6.04.99р., 11.04.2000).

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно підібрана та проаналізована література з проблеми дослідження, що дало можливість сформулювати тему, визначити актуальність та дослідницьку програму роботи.

Особисто виконана експериментальна частина та більшість біохімічних, авторадіографічних, радіоімунологічних та імуноферментних досліджень.

Частина біохімічних досліджень виконана співробітниками центру науково-медичних досліджень (дир. — д.м.н. О.Л.Кухарчук), біохімічної лабораторії кафедри медичної хімії (зав. — проф. І.Ф.Мещишен), а заключна фаза радіоімунологічних досліджень — за участю співробітників радіоімунологічної лабораторії при кафедрі медичної біології і генетики (зав. — проф. В.П.Пішак) Буковинської державної медичної академії та лабораторії відділу ендокринології репродукції та адаптації ім. В.П.Комісаренка АМН України (зав. – член-кореспондент АМН України проф. О.Г.Резніков), за що автор висловлює щиру подяку. Статистична обробка, теоретичний аналіз і узагальнення результатів досліджень проведені автором самостійно.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації оприлюднено та обговорено на симпозіумі з Міжнародною участю "Актуальные вопросы сексологии и андрологии" (Київ, 26-29 вересня 1995 р.); ІІІ та ІV Міжнародній конференціях з кореляційної оптики (Чернівці, 20-22 травня 1997 р. та 11-14 травня 1999 р.); ІІІ Міжнародній науково-практичній конференції "30 лет физики живого — от резонансов на простейших до квантовой медицины" (Донецьк, 23-26 вересня 1998 р.); І Російському Конгресі з патофізіології (Москва, 17-19 жовтня 1996 р.); V Всеросійській конференції “Нейроендокринологія – 2000” (Санкт-Петербург, 18-20 квітня 2000 р.); Пленумі Українського товариства патофізіологів, присвяченому 90-річчю від дня народження М.Н.Зайка (Чернівці, 20-22 травня 1998 р.); ХV з'їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк, 12-15 травня 1998 р.); ІІІ Національному Конгресі патофізіологів України з міжнародною участю присвяченого 100-річчю від дня народження академіка М.М.Горєва (Одеса, 23-27 травня 2000р.); на спільних засіданнях наукової комісії Буковинської державної медичної академії та Чернівецьких відділень наукових товариств фізіологів і патофізіологів України (Чернівці, 27 квітня 2000 р.) та Київського відділен-ня наукового товариства патофізіологів України і сектору фізіології вісцеральних систем Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України (Київ, 8 червня 2000 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 56 робіт, з них 28 статей у фахових наукових журналах, 6 статей у журналах та збірниках, решта — у матеріалах і тезах конференцій.

Cтруктура та обсяг дисертації. Робота складається з вступу, огляду літератури, описання матеріалів та методів досліджень, 8 розділів власних досліджень, аналізу отриманих результатів, висновків, практичних рекомендацій та покажчика літератури, який містить 652 джерела. Дисертація викладена на 326 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 52 таблицями та 5 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Дослідження виконані на інтактних та пренатально стресованих самцях щурів віком 3 місяці, у яких нейроендокринна система повністю сформована і зріла [О.Г.Резніков та ін.,1998], що дозволяє трактувати знайдені відхилення саме як віддалені наслідки пренатальних стресових впливів. Усього використано 1064 тварини.

Пренатальний стрес викликали шляхом одногодинної жорсткої іммобілізації самок на спині впродовж 15-го - 21-го днів вагітності [Резніков О.Г. та ін.,1996]. Першим днем вагітності вважали наступний після еструсу за умов виявлення сперматозоїдів у вагінальних мазках.

Функціональні резерви адаптивних систем у інтактних та пренатально стресованих тварин по досягненню ними 3-місячного віку вивчали шляхом застосування стандартної тест-процедури — одногодинного жорсткого іммобілізаційного стресу [Резніков О.Г. та ін., 1998].

Вибір статі тварин зумовлений більшою вразливістю нейроендокринної регуляції стрес-реактивності у самців [Анищенко Т.Г.,1991].

Щурів утримували при температурі 20-24о С на стандартному харчовому раціоні з вільним доступом до води, що дозволило нівелювати різницю у дії фізіологічних подразників оточуючого середовища і уникнути додаткових стрес-факторів (температурних, аліментарних та ін.).

Критерієм вибору структур були дані літератури стосовно участі їх нейроендокринних механізмів у реалізації стрес-реакції [Горбунова А.В. и др., 1995; Белоброва Е.Д. и др., 1998] та статева диморфність [Резніков О.Г., 1982; Акмаев И.Г., Калимуллина Л.Б.,1993;. Мыслицкий В.Ф, 1988, 1989], що є передумовою їх чутливості до пренатальних впливів впродовж критичного періоду розвитку мозку.

З метою вивчення рецепторних механізмів ГАМК-ергічної регуляції секреції кортикостерону, пролактину, тироксину використовували агоністи ГАМКА та ГАМКВ рецепторів мусцимол ("Serva") та баклофен ("Sigma"). Досліджувані препарати вводили інтрацистернально в дозах: баклофен – 2,5 мкг, мусцимол – 15 мкг в 10 мкл розчинника [Амикишева А.В и др.,1998, Кулинский В.И., Михельсон Г.В.,1998]. Для стимуляції серотонінергічних систем мозку інтрацистернально вводили серотонін креатинін сульфат ("Reanal", Угорщина), 50 мкг в 10 мкл фізіологічного розчину.

Стрес-лімітуючі властивості мелатоніну вивчали за методикою Арушанян Э.Б, Арушанян Л.Г. [1991]. Згідно даних літератури існує два добових піки підвищеної чутливості до мелатоніну — з 5 до 6 ранку та між 15 і 21 годинами. У наших дослідах мелатонін ("Sigma", США) вводили внутрішньочеревно о 6-й год ранку за 1 год до іммобілізації у дозі 0,1 мг/кг маси тіла в 0,1%-ному розчині етанолу. Контрольним тваринам вводили відповідні розчинники у тому ж об'ємі та у той же спосіб.

Дослідження проведені у весняно-літній період.

Евтаназію тварин виконували шляхом декапітації під легким ефірним наркозом по закінченню періоду іммобілізації. Мозок швидко виймали на холоді й одразу занурювали в рідкий азот. Робили кріостатні зрізи товщиною 300 мкм, виділяли перегородку мозку (ПМ), преоптичну ділянку (ПОД), медіобазальний гіпоталамус (МБГ) та мигдалеподібний комплекс (МК) за методом Palkovits M. [1973], звіряючись з атласом стереотаксичних координат [Konig J.F., Klippel P.A.,1963]. У момент декапітації кров збирали у центрифужні пробірки, покриті ЕДТА, центрифугували 20 хв при 600 g, плазму зливали в пластикові мікропробірки по 0,25 мл і заморожували при – 20оС для проведення радіоімунних досліджень.

Для визначення вмісту радіоімунного ?-ендорфіну, ?-ПНП, простагландинів об'єднували досліджувані структури мозку від трьох тварин. Екстракцію ?-ПНП та простагландинів проводили на мікроколонках Amprer C8 ("Amеrsham", Англія). Для елюації ?-ПНП та ?-ендорфіну з сорбенту мікроколонок використовували ацетонітрил, а простагландинів — етилацетат. Визначення ?-ПНП, ПГЕ2, ПГF2б, 6-кето-ПГF1б та ТхВ2 проводили наборами фірми "Amersham" (Англія), а ?-ендорфіну — наборами фірми "Inc Star" (США) у відповідності до інструкцій, які додавалися до наборів.

Екстракцію циклічних нуклеотидів проводили на мініколонках "Amprer SAX" ("Amersham" Англія). Елюацію нуклеотидів здійснювали розчином трихлороцтової кислоти. Визначення цАМФ та цГМФ виконували наборами "сАМР" і "cGMP" ("Immunotech", Франція). Рівень сумарних глюкокортикоїдів, пролактину та тироксину в плазмі крові визначали наборами фірми “ИБОХ” (Білорусь), а кортикостерону — набором "Corticosterone" ("ISN", США) у відповідності до наданих фірмами інструкцій та наявних у літературі рекомендацій [Резников А.Г., 1980].

Вміст серотоніну визначали імуноферментним методом за допомогою набору "Serotonine" ("Immunotech", Франція).

Інтенсивність процесів пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) оцінювали за накопиченням у тканині структур мозку тварин дієнових кон'югатів (ДК) та малонового діальдегіду (МДА), а показниками стану антиоксидантної активності слугували активність супероксиддисмутази (СОД) [КФ 1.15.1.1] та глутатіонпероксидази (ГПО) [КФ 1.11.1.9].

Первинні продукти ПОЛ — дієнові кон'югати і вторинні — малоновий діальдегід визначали за методами Костюк В.А. и др., [1984], Мещишен И.Ф. [1991], Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. [1977].

Активність супероксиддисмутази визначали за здатністю фермента пригнічувати відновлення нітросинього тетразолію [Fried R.,1975; Nashikimi N. et al.,1972], а глутатіонпероксидази — за кількістю утвореного окисненого глутатіону [Мещишен И.Ф.,1991].

Продукти окиснювальної модифікації білків (ОМБ) визначали за кількістю 2,4-динітрофенілгідразонів, отриманих при взаємодії 2,4-динітрофенілгідразину з альдегідними і кетонними групами, утвореними в процесі ОМБ у радикалах залишків аліфатичних амінокислот [Мещишен І.Ф.,1998]. Оптичну густину утворених динітрофенілгідразонів нейтрального та основного характеру реєстрували при 370 і 430 нм відповідно.

Вмісту білка визначали за методом Lowry O.H.et al. [1951].

3Н-серотонін (3Н-СТ) (5-окси (G-3Н)-триптамін креатинінсульфат) ("Amersham", Англія) зі специфічною активністю 13 Ки/мМ вводили інтрацистернально по 20 мкКи у 10 мкл розчину під легким ефірним наркозом [Угрюмов М.В. и др.,1987]. Неспецифічне включення серотоніну у катехоламінергічні нейрони пригнічували шляхом додавання до розчину 3Н-серотоніну неміченого норадреналіну (НА) (норадреналін бітартрат) у 10-кратній концентрації. Водний розчин DL-[7- 3H] Noradrenaline hydrochloride, 555 GBQ/ммоль з питомою активністю 15Сі/ммоль та [2,5,6 - 3H] Dopamine, (3H-ДА) 266 GBQ/ммоль з питомою активністю 7,2 Сі/моль в 0,02 моль ("Amersham", Англія) вводили інтрацистернально з розрахунку 1 мкг/100г маси тіла перед іммобілізацією [Сапронова А.Я. и др.,1991; Третьяк Т.М., Архипова Л.В., 1992]. Для попередження неспецифічного зв'язування до розчинів додавали відповідно немічений дофамін та норадреналін у концентрації, яка у 10 разів перевищувала мічений катехоламін.

Контрольних тварин декапітували через 1 год після введення препаратів, а дослідних — одразу після закінчення одногодинної іммобілізації. Мозок виймали, забирали ділянки, призначені для дослідження, заморожували у рідкому азоті, ліофілізували під вакуумом 0,66 х 10-5 — 10-6 КПа.

Для світлооптичної радіоавтографії використовували серійні зрізи (товщиною 5 мкм), зроблені у коронарній площині, покривали емульсією типу "М", експонували у темряві протягом 2-х — 3-х тижнів. Подальшу обробку проводили за рекомендаціями М.В. Угрюмова и др. [1987], Н.Г. Хрущева [1969]. Користуючись атласом стереотаксичних координат [Konig J.F., Klippel P.A.,1963] відбирали по 8 ідентичних коронарних зрізів ядер гіпоталамуса, перегородки мозку та мигдалеподібного комплексу і проводили підрахунок автографів над ядерцем, ядром і цитоплазмою, перераховуючи їх кількість на 100 мкм2 [Хотимченко Ю.С.,1979; Walch R.J. et al.,1990].

Зв'язуюча здатність вивчена у нейронах паравентрикулярного (ПВЯ), преоптико-медіального (ПОМЯ), преоптико-латерального (ПОЛЯ), аркуатного (АЯ), вентромедіального (ВМЯ) ядер гіпоталамуса, дорзального (ДЯ), латерального (ЛЯ), медіального (МЯ), прилеглого (ПЯП) ядер перегородки, ядра діагональної зв'язки (ЯДЗ), ядра ложа термінальної смужки (ЯЛТС), кортикального (КЯ), медіального (МЯ), центрального (ЦЯ), латерального (ЛЯ) та базолатерального (БЛЯ) ядер мигдалика.

Окремо проводили підрахунок числа міток над ядрами, враховуючи концепцію прямої ядерної дії моноамінів [Третьяк Т.М., Архипова Л.В., 1992].

Отримані дані оброблені методом варіаційної статистики за допомогою пакетів статистичних програм ("StatSoft" США та "Stat Graf") [Боровиков В.П.,1998] з використанням параметричного t-критерію Стьюдента і, в окремих випадках, непараметричних критеріїв Вілкоксона U Манна-Уітні [Лакин Г.Ф.,1990]. Залежність між показниками окремих груп даних визначалася за допомогою регресійного аналізу.

Числові значення в таблицях наведені у вигляді середніх величин та їх стандартних похибок. Статистично вірогідними вважали зміни при Р Ј 0,05.

Результати досліджень та їх обговорення

Ендокринні показники іммобілізаційного стресу у інтактних та пренатально стресованих щурів. Дія стресорів впродовж останнього триместру вагітності значно модифікує стрес-реактивність у дорослих нащадків самців щурів [Резников А.Г. и др.,1998]. Наявні у літературі дані відносно ендокринних корелятів порушення стрес-реактивності у пренатально стресованих самців стосуються, в основному, гормонів гіпофізарно-наднирникової системи. Проте внутрішньоутробна експресія рецепторів пролактину та стрес-індукована реакція фетальних нейрохімічних механізмів регуляції секреції пролактину і тироксину дозволяють думати про можливість їх автомодифікації пренатальними впливами, що може проявитися змінами вмісту цих гормонів у плазмі крові.

Отримані результати свідчать, що у самців щурів пренатальний стрес не впливає на базальні рівні кортикостерону в плазмі крові, а гостра іммобілізація пренатально стресованих тварин хоча і спричиняє підвищення вмісту кортикостерону у плазмі, проте воно було значно нижчим, ніж у контрольних (табл. 1), що відповідає даним інших дослідників [Резніков О.Г. та ін., 1998; Meaney M.J. et al., 1996].

Конститутивний вміст ПРЛ був значно вищим у пренатально стресованих самців, а тироксину — залишався незмінним.

Таблиця 1

Вплив іммобілізаційного стресу на рівні кортикостерону, пролактину та тироксину у плазмі крові інтактних та пренатально стресованих щурів (M±m; n=8)

Характер впливу Рівень кортикостерону (мкмоль на л) Рівень пролактину (мкг на л) Рівень тироксину (нмоль на л)

Інтактні 0,30±0,019 4,15±0,37 32,79±1,88

Іммобілізація інтактних 0,79±0,049 р1<0,005 28,69±1,78 р1<0,005 14,50±0,87 р1<0,005

Пренатально стресовані 0,28±0,015 5,40±0,49 р1<0,05 31,29±1,19

Іммобілізація пренатально стресованих 0,54±0,039 р2<0,005 р3<0,005 36,13±1,58 р2<0,005 р3<0,01 20,43±0,81 р2<0,005 р3<0,005

Примітки: р1, р2 р3 — зміни, вірогідні стосовно аналогічних показників у інтактних, пренатально стресованих та при іммобілізації інтактних тварин відповідно. У решті випадків зміни невірогідні.

Іммобілізаційний стрес спричинив приріст вмісту ПРЛ та зниження рівня тироксину у тварин обох груп, однак ці зміни носили різний кількісний характер — у пренатально стресованих тварин приріст ПРЛ був вищим, а зниження тироксину менш вираженим, ніж після іммобілізації інтактних, що свідчить про модифікацію стрес-реактивності.

Експресія мРНК рецепторів пролактину у мозку вперше простежується на 14-й, а гіпофізарних рецепторів гормону — на 18-й день пренатального розвитку [Brownborg H.M. et al., 1996]. Тому тривала модифікація рівнів пролактину пренатальними стресорними впливами цілком вкладається в концепцію ранньої автомодифікації функціональної відповіді [Резніков О.Г. та ін., 1998], особливо якщо врахувати, що регуляція рецепторів пролактину в тканинах-мішенях здійснюється стероїдними гормонами, а модифікація рівнів статевих гормонів та кортикостероїдів впродовж раннього онтогенезу є головною причиною розвитку синдрому пренатального стресу.

Відомо, що стрес-індуковане зниження тиреоїдних гормонів через стимуляцію препроТРФ обмежує активацію гіпофізарно-наднирникової осі [Redei E. et al.,1998].

Існують також експериментальні підтвердження прямого інгібіторного впливу екзогенних чи індукованих стресом ендогенних глюкокортикоїдів на активність гіпоталамо-гіпофізарно-тиреоїдної системи у дорослих щурів [Kohn E.R. et al., 1998]. Однак у період ембріонального розвитку КРФ індукує збільшення тиротропіну у плазмі крові і, таким чином, підйом концентрації Т4. Зрозуміло, що активація фетальної та материнської ГГНС під час іммобілізації вагітних самок може у такий спосіб спричинити автомодифікацію реактивності гіпоталамо-гіпофізарно-тиреоїдної осі до дії стресорів, яка у наших дослідах полягала у менш вираженому стрес-індукованому зниженні тироксину у щурів, котрі зазнали впливу материнського стресу.

Нейрохімічні механізми регуляції стрес-реактивності у інтактних та пренатально стресованих самців щурів. Cтрес-індукована регуляція секреції кортикостерону, пролактину та тироксину складна і багатогранна. У механізмах цієї регуляції важливе місце належить серотоніну.

Відомо, що СТ є важливим стимулятором функції гіпоталамо-гіпофізарно-наднирникової системи [Burnet P.W. et al.,1995]. Доведено зворотний зв'язок між глюкокортикоїдною функцією наднирників та СТ-ергічною системою мозку

Можливість авторегуляції розвитку СТ-ергічної системи на ранніх етапах ембріогенезу продемонстрована дослідженнями А.Я. Сапроновой и др. [1996], а здатність ембріональних серотонінових рецепторів реагувати на стресорні впливи — J.K. Singh et al. [1996]. Показана також модифікація вмісту СТ та продуктів його обміну пренатальними стресорними впливами в мозку щурів 10-денного віку [Резніков О.Г. та ін., 1998].

За нашими показниками іммобілізаційний стрес знижує вміст цього індоламіну в усіх структурах мозку інтактних та у ПМ, ПОД, МБГ пренатально стресованих тварин, однак слід відмітити, що у останніх це зниження було менш вираженим (табл.2).

Цілком вірогідно, що ця кількісна різниця може бути одним з механізмів редукованої глюкокортикоїдної реакції на іммобілізаційний стрес у пренатально стресованих самців [Рoде В. и др., 1990].

Таблиця 2

Вплив іммобілізаційного стресу на вміст серотоніну в структурах мозку контрольних та пренатально стресованих щурів (M±m; n=6)

Характер впливу Вміст серотоніну в нмоль на г тканини

ПМ ПОД МБГ МК

Контрольні 4,56±0,43 5,77±0,92 17,20±1,19 10,67±0,66

Іммобілізація контрольних 1,99±0,19 р1<0,001 2,88±0,90 р1<0,05 11,29±0,47 р1<0,001 8,45±0,34 р1<0,01

Пренатальний стрес 4,43±0,30 7,15±0,46 19,30±1,25 7,04±0,41 р1<0,001

Іммобілізація пренатально стресованих 3,52±0,23 р2<0,05 5,37±0,48 р2<0,025 16,20±0,89 р2<0,05 7,25±0,21

Примітки: р1, р2 — зміни, вірогідні щодо показників у контрольних та пренатально стресованих тварин відповідно.

Пренатальний стрес може впливати на секрецію гормонів, детермінуючи характер функціонування їх регуляторних нейрохімічних механізмів [Reznikov A.G. et al., 1999]. Тому логічно очікувати, що пренатальна модифікація СТ-ергічних механізмів мозку може вплинути на рівні досліджених нами гормонів.

Дані літератури свідчать про наявність зворотного зв'язку між глюкокортикоїдною функцією наднирників та СТ-ергічною системою мозку, який здійснюється за участю СТ-авторецепторів [Norman T.R., 1996]. Серотонін гіпоталамуса є головним фізіологічним посередником секреції пролактину та тироксину у тварин і людей [Алиев М.Г. и др., 1990; Курипка В.И. и др., 1989]. Спостерігається також стрес-індуковане серотонінергічне підвищення секреції пролактину та зниження тироксину [Martin A.I. et al., 1995; Josko J., 1996].

Після введення СТ вміст кортикостерону у плазмі крові інтактних щурів був значно вищим, ніж після введення фізіологічного розчину (табл.3.).

Таблиця 3

Вплив серотоніну на вміст кортикостерону, пролактину та тироксину в плазмі крові (M±m; n=8)

Група тварин Характер впливу Рівень кортикостерону (мкмоль на л) Рівень пролактину (мкг на л) Рівень тироксину (нмоль на л)

Інтактні Інтактні 0,30±0,019 4,15±0,37 32,79±1,88

Розчинник 0,38±0,022 р1<0,025 8,46±0,82 р1<0,005 28,85±0,96 р1<0,05

Серотонін 0,53±0,02 р1<0,005 р2<0,005 14,42±1,30 р1<0,005 р2<0,005 13,85±1,129 р1<0,005 р2<0,005

Пренатально стресовані Пренатальний стрес 0,28±0,015 5,40±0,49 р1<0,05 31,29±1,91

Розчинник 0,39±0,024 р3<0,005 12,13±1,10 р3<0,005 29,28±2,35

Серотонін 0,40±0,016 р3<0,005 18,78±1,39 р3<0,005 р4<0,005 23,21±1,55 р4<0,05

Примітки: зміни, вірогідні стосовно: р1— інтактних тварин; р2 — введення розчинника інтактним тваринам; р3 —пренатально стресованих тварин; р4 —введення розчинника пренатально стресованим тваринам.

Цю різницю можна розцінити як стимулюючий вплив СТ на секрецію глюкокортикоїдів, що узгоджується з даними літератури [Fuller R.W., 1995].

У тварин, які зазнали материнського стресу, глюкокортикоїдна реакція на введення СТ залишається такою ж, як на введення фізіологічного розчину, що свідчить про порушення у них зворотного зв'язку у даній системі і може відігравати певну роль у модифікації стрес-реактивності.

Нами показано, що центральне введення серотоніну контрольним тваринам призводить до приросту вмісту пролактину та зменшення тироксину у плазмі у порівнянні з введенням розчинника (див. табл. 3).

У пренатально стресованих тварин реакція гормонів на аналогічні втручання має ту ж тенденцію, але у кількісному відношенні вона є більш вираженою щодо пролактину та зниженою стосовно тироксину, що може бути наслідком порушення імпринтингових процесів.

Важливим чинником, здатним обмежувати прояви стрес-реакції за рахунок регуляції секреції гормонів стресу, є ГАМК.

У наших дослідженнях іммобілізація після введення мусцимолу та баклофену показала, що у контрольних тварин у зниженні стрес-індукованої секреції кортикостерону беруть участь як ГАМКА, так і ГАМКВ типи рецепторів (рис.1).

Рис.1. Рецепторні механізми ГАМК-ергічної регуляції вмісту кортикостерону, пролактину та тироксину в плазмі крові

Примітка: вірогідність змін у порівнянні з: * — інтактними; ** — іммобілізацією інтактних; *** — комбінованим впливом іммобілізації та введення розчинника інтактним; ^ — пренатально стресованими; ^^ — іммобілізацією пренатально стресованих; ^^^ — комбінованим впливом іммобілізації та введення розчинника пренатально стресованим.

У цілому результати наших досліджень узгоджуються з даними літератури щодо обмежуючого впливу ГАМК на стрес-індукований стероїдогенез у наднирниках [Мишунина Т.М. и др., 1990; Miques I. et al., 1990].

Вивчення ГАМК-ергічних механізмів регуляції вмісту пролактину та тироксину показало, що у контрольних тварин передстресове введення мусцимолу зменшувало рівень пролактину і не впливало на Т4, а у тварин, які перебували під впливом материнського стресу, цей чинник не впливав на індукований іммобілізацією вміст жодного з досліджених гормонів. Ефект введення баклофену за спрямуванням був таким же, як і у контрольних тварин.

Таким чином, складається враження, що у пренатально стресованих тварин ГАМКА рецептори втрачають здатність відповідати активацією на стрес. За цих умов логічно було б очікувати значного зростання рівня кортикостерону, однак як вже було зазначено, він залишається значно нижчим, ніж у контрольних тварин. Очевидно, в даному випадку має місце порушення зворотного зв'язку між ГАМКА рецепторами та кортикостероїдами, функціонування якого було доведено дослідженнями Т.М. Мишуниной и др. [1990].

Порушення функціонування ГАМКА рецепторів у пренатально стресованих щурів, на наш погляд, обумовлені особливостями онтогенетичного розвитку ГАМК-ергічної системи. В ембріональному мозку ГАМК знаходять вже з 15-ї доби [Vandenpol A.N. et al., 1995]. Розвиток ГАМК – рецепторів починається теж з цього дня з формування субодиниць саме ГАМКА рецепторів [Ma V. et al., 1995; Vaneden C.G. et al., 1995], а за умовами наших дослідів якраз з 15-ї доби тварини зазнавали дії материнського стресу. Окрім того, ГАМКА рецептори у період ембріогенезу опосередковують впливи стероїдних гормонів, тому взаємовідносини ГАМК з глюкокортикоїдами під час материнського стресу визначають принаймні окремі порушення в системі гормон-медіаторного імпринтингу, які мають місце у пренатально стресованих щурів.

При аналізі результатів даної серії привертає увагу ще одна особливість — на тлі значних порушень у системі ГАМКА рецепторів мозку пренатально стресованих щурів функціональна активність ГАМКВ рецепторів під час іммобілізації цих тварин не просто зберігалася, але й вірогідно перевищувала її у порівнянні з інтактними.

Це стає зрозумілим, коли зауважити, що пресинаптичні ГАМКВ рецептори у ссавців з'являються при народженні, а постсинаптичні — тільки до кінця першого тижня постнатального життя [Fucuda A. et al., 1993; Gaiarsa J.L. et al., 1995], тобто їх онтогенез, на відміну від ГАМКА рецепторів, не співпадає з періодом материнського стресу, що створює сприятливі умови для їх формування.

Серед ендогенних чинників резистентності до емоційного стресу епіфізарний гормон мелатонін посідає одне з провідних місць [Арушанян Э.Б. и др., 2000; Пишак В.П., 1996].

У інтактних щурів, яких іммобілізували через годину після введення мелатоніну, рівень глюкокортикоїдів був значно нижчим, ніж після введення розчинника (табл.4), що можна розцінити, як обмеження мелатоніном основного прояву стрес-реактивності — активації ГГНС.

Таблиця 4

Вплив мелатоніну на стрес-індуковані рівні сумарних глюкокортикоїдів і пролактину у плазмі крові інтактних та пренатально стресованих щурів (М±m; n=8)

Характер впливу Сумарні глюкокортикоїди (нмоль/л) Пролактин (мкг/л)

Інтактні Пренатально стресовані Інтактні Пренатально стресовані

Контроль 15,14±0,96 14,42±1,10 рі<0,1 4,15±0,37 5,40±0,49 рі<0,05

Етанол 26,18±0,82 р1<0,005 20,83±0,40 рі<0,001 р1<0,005 12,59±0,35 р1<0,001 18,17±0,54 рі<0,001 р1<0,001

Іммобілізація та введення етанолу 63,28±4,47 р2<0,005 33,75±0,59 рі<0,001 р2<0,005 28,69±0,78 р2<0,001 36,13±0,58 рі<0,001 р2<0,001

Іммобілізація та введення мелатоніну 40,28±0,77 р3<0,005 32,36±1,20 рі<0,001 р3>0,1 47,04±1,0 р3<0,001 34,81±0,72 рі<0,001 р3>0,05

Примітки: рі — ступінь вірогідності змін досліджуваних показників між відповідними групами інтактних та пренатально стресованих тварин; вірогідність змін стосовно показників у: р1 —контрольних тварин; р2 —у контрольних тварин після введення етанолу; р3 —у контрольних тварин після комбінованого впливу введення етанолу та іммобілізації.

Наші дані співпадають з літературними, згідно яких мелатонін забезпечує поправочну модуляцію центральних та периферичних ендокринних механізмів, що приймають участь у формуванні адаптивних реакцій тільки за умов різких відхилень у роботі наднирників [Арушанян Э.Б. и др., 1991; Арушанян Э.Б., 1996].

Мелатонін має дозозалежний вплив на секрецію пролактину — у великих дозах спостерігається гальмівний, а у фізіологічних — стимулюючий [Арушанян Э.Б. и др., 1991; Juszczak M. et al., 1996]. У наших експериментах, при використанні дози, близької до фізіологічної, за умов емоційного стресу ми спостерігали виражений стимулюючий вплив мелатоніну на вміст пролактину в плазмі, що дає нам підстави вважати цей механізм одним з ендокринних корелятів участі мелатоніну у стрес-реакції.

У пренатально стресованих тварин мелатонін не впливає на стрес-індукований рівень сумарних глюкокортикоїдів та пролактину, що свідчить про втрату ним здатності модулювати активовані стресом ендокринні механізми.

Для здійснення ефекту екзогенного мелатоніну на пролактин необхідною умовою є цілісний, нормально функціонуючий епіфіз — у епіфізектомованих тварин вплив гормону повністю втрачається [Арушанян Э.Б. и др., 1991; Юматов Е.А., 1995]. Отже, відсутність реакції глюкокортикоїдів та пролактину на передстресове введення мелатоніну свідчить про можливі порушення функції епіфіза або ж десенситизацію мелатонінових рецепторів гіпоталамуса/гіпофіза з втратою, принаймні частковою, антистресорного впливу.

Відомо також, що мелатонін, при введенні вагітним самкам наприкінці вагітності спричиняє структурні зміни гіпофізарних клітин у нащадків, які зберігаються впродовж життя [Гудошников В.И и др., 1993]. При стресуванні вагітних самок у наших дослідах плоди, ймовірно, зазнавали впливу підвищеного рівня материнського мелатоніну, який добре проникає через фетоплацентарний бар'єр і може спричинити описані порушення у гіпофізі з відповідними ендокринними модифікаціями.

Наступним етапом наших досліджень було вивчення впливу пренатального стресу на стан стрес-лімітуючих ?-ендорфінергічних систем мозку. Обмеження стрес-реакції опіоїдами визначається їх здатністю лімітувати активацію ГГНС та адренергічної системи мозку [Inder W.J. еt al., 1996; Travagli R.A. et al., 1996].

в-?ндорфінімунореактивні клітини в мозку плодів вперше виявляються на початку останнього триместра вагітності. Практично в цей же час фетальний мозок починає реагувати коливаннями вмісту ?-ендорфіну у відповідь на стресування матерів [Роде В. и др., 1990]. З точки зору концепції ранньої автомодифікації функціональної відповіді [Резников О.Г. и др.,1996] у дорослих нащадків самок, які зазнавали дії іммобілізаційного стресу, логічно очікувати якісних та/або кількісних порушень програмування рівня функціональної відповіді з боку ?-ендорфінів мозку на дію аналогічного подразника, що й спонукало нас до проведення даної серії.

Іммобілізація контрольних самців призвела до зростання вмісту ?-ендорфіну в ПОД, МБГ та МК мозку. Наслідком пренатальних стресорних впливів був приріст конститутивного вмісту ?-ендорфіну в ПМ та МБГ і зменшення в ПОД. Стрес-індуковані зміни вмісту ?-ендорфіну у пренатально стресованих самців мали місце лише в ПОД, що створює дефіцит у системі стрес-обмеження, тим більше, що за абсолютним значенням цей показник залишався нижчим від аналогічного у інтактних тварин (p<0,05) (табл.5).

Таблиця 5

Вплив пренатального стресу на рівень ?-ендорфіну в окремих ділянках мозку (М±m, n=5)

Характер впливу Вміст ?-ендорфіну (пмоль/г тканини)

ПМ ПОД МБГ МК

Інтактні 2,49±0,14 4,77±0,265 4,78±0,264 1,64±0,19

Іммобілізація інтактних 2,54±0,10 5,59±0,17 р1<0,025 5,87±0,33 р1<0,025 2,08±0,10 р1<0,05

Пренатально стресовані 3,70±0,20 р1<0,005 3,58±0,23 р1<0,01 7,71±0,24 р1<0,005 1,52±0,10

Іммобілізація пренатально стресованих 3,53±0,26 5,06±0,20 р2<0,005 8,19±0,23 1,47±0,10

Примітки: р1 - р2-— вірогідність змін стосовно показників у інтактних та пренатально стресованих тварин відповідно.

Таким чином, пренатальний стрес має неоднаковий вплив на формування функціональної активності опіоїдергічних систем різних структур ЦНС, що може бути зумовлено різницею в настанні періоду найбільшої чутливості до дії стероїдних гормонів та їх метаболітів [Kerchner M. et al., 1995], тим більше, що експресія мРНК опіатних рецепторів у структурах мозку здійснюється стероїдними гормонами [Jukhananov R.Y. et al., 1996].

в-?ндорфінергічні клітини аркуатного ядра, котрі проекуються в преоптичну ділянку, є постсинаптичними мішенями ГАМК-ергічних терміналей [Horvath T.L. et al., 1992], а у деяких ділянках мозку мю-опіоїдні рецептори локалізовані на плазматичних мембранах ГАМК-ергічних нейронів [Svingos A.L. et al.,1997], що створює морфологічну передумову для їх узгодженого функціонування та взаємного підсилення стрес-лімітуючої дії. Виходячи з цього, ми поставили за мету дослідити роль ГАМКА та ГАМКВ рецепторів у стрес-індукованих коливаннях рівнів ?-ендорфіну в структурах гіпоталамуса та вплив пренатального стресу на ці процеси.

Стимуляція ГАМКА рецепторів шляхом введення мусцимолу перед іммобілізацією у контрольних тварин спричинила приріст вмісту ?-ендорфіну в ПОД та МБГ в порівнянні з введенням розчинника, що свідчить про активацію стрес-індукованих опіоїдергічних механізмів (рис.2).

Рис.2. Вплив агоністів ГАМК-рецепторів на стрес-індукований вміст ?-ендорфіну в структурах гіпоталамуса

Примітка: вірогідність змін у порівнянні з: *— інтактними; **— іммобілізацією інтактних; *** — комбінованим впливом іммобілізації та введення розчинника інтактним; ^ — пренатально стресованими; ^^ — іммобілізацією пренатально стресованих; ^^^ — комбінованим впливом іммобілізації та введення розчинника пренатально стресованим.

Баклофен, агоніст ГАМКВ рецепторів, не вплинув на вміст ?-ендорфіну в ПОД та зменшив його в МБГ стосовно комбінованого впливу іммобілізації та