Одним із аспектів аналізу сіквенсів ДНК є процес визначення нуклеотидної послідовності клону. В експерименті з відомим сіквенсом гену необхідно перевірити чи клонована послідовність насправді ідентична опублікованій. Якщо ні – то експеримент повинен бути змінений з метою отримання коректного сіквенса. Помилки клонування можуть виникати в результаті використання некоректних праймерів при клонуванні, або використання у ланцюговій полімеразній реакції ферменту з низькою фідельністю (нагадаю, що це здатність полімерази міцно утримуватись на ДНК в процесі біосинтезу).

Клон кДНК синтезується з використанням у якості матриці іРНК. Далі він сіквенується з використанням спеціально сконструйованих праймерів до відомих олігонуклеотидів, які є у векторі клонування і які межують з вставленою ДНК. Коли праймери гібридизуються у відповідні сіквенси, вони розмножуються в полімеразній реакції з використанням вставлених сіквенсів як матриці.

Реакція зупиняється вбудовуванням дидеоксинуклеотиду (dATP, dFTP, dTTP, dCTP). Це призводить до утворення серії фрагментів різної довжини, синтез яких закінчився на різних позиціях. Отримані фрагменти розділюються на гем для визначення порядку основ у сіквенсі (рис. 5.2). За один раз неможливо повністю сіквенувати CDS. Тому шляхом множинних вирівнювань будується набір фрагментів. Цей процес називають монтажем сіквенсів (sequence assembly). Для клону монтують консенсусний сіквенс у відповідності до зважування даного для певної позиції нуклеотиду у сіквенсі. Підбираються параметри монтажу щодо числа дозволених на позицію неправильних спарювань. Наприклад, щонайменше, два прочитування на позицію на кожному ланцюзі („” і „”) дає високу надійність результатів (рис. 5.3). Сіквенування і ступінь надійності є результатом затраченого часу і терпіння. Високоякісний кінцевий сіквенс вимагає досвідченого аполітика, багато годин інтерпретації хроматографічних даних і надійної програми монтажу.

4. Інтерпретація пошуків EST

Більшість доступних зараз даних по ДНК отримані як часткові сіквенси, основну кількість яких складають ESTs. Тут ми проаналізуємо їх властивості і їх відношення до інтерпретації сіквенсів. При аналізі ESTs слід мати на увазі наступне:

Абетка EST має п’ять букв: ACGTN( N – ненадійно встановлений нуклеотид, невідомий).

Це може бути фантомний INDELs, отриманий при зсуві рамки трансляції).

EST часто є субсіквенсом іншої послідовності у базі даних.

EST може не представляти CDS будь-якого гену.

Абетка EST

Продукція EST зазвичай високоавтоматизована і типово включає флуоресцентну лазерну систему, яка читає, сіквенуючи гем. Отримані дані сіквенування завантажуються в комп’ютер для модельного аналізу з мінімальною участю людини. Хоча аналіз здійснюється дуже надійними програмами, іноді неможливо прийняти рішення про те, яка основа знаходиться у певній позиції сіквенсу. Тоді програма вставляє символ N. Проте, у відповідності до системи JUPAC можуть вставлятись інші символи, приведені в табл. 5.3. Тому сіквенс міститиме певну кількість символів N.

Нормальний рівень доброї лабораторії <5% Ns. Типово, EST має довжину 200-500 основ, але сучасні технології збільшують теоретичну довжину до 1000 основ і більше.

Вставки, делеції і зсуви рамок

У спрощеному вигляді програми ідентифікації просто виявляють піки флуоресценції чотирьох сіквенуючих реакцій у лініях на секвінуючому гелі. У нормі піки повинні бути через рівні інтервали. Проте, якщо фізичні властивості гелю чи якісь інші умови впливають на потік через нього – це може призвести до збою. Незважаючи на високу надійність програм аналізу, іноді вони або видають основу зашвидко, або зовсім не видають її. Це призводить до так званих фантомних (тіневих) INDELs. На рівні порівняння сіквенсів ДНК існують певні алгоритми вирівнювання. Вони вставляють сигнал INDEL у послідовність до якої вирівнювалась EST.

Для роботи з EST важливо враховувати можливість альтернативного сплайсингу. EST можуть бути фрагментам кількох екзонів. Проте, проблема ускладнюється, коли EST невелика і повністю попадає в певний екзон.

5. Два підходи до „полювання” на гени (hunting)

Останніми роками значні фінансові ресурси затрачені на пошук нових генів, які можуть бути пов’язані з певними хворобами. Вважається, що це дозволить розробити нові терапевтичні підходи до таких хвороб як рак шлунка, астма, нейрон-дегенеративні хвороби тощо. Є дві головні стратегії відкриття білків, які можуть бути використані як молекулярні мішені – для відкриття невеликих молекул-кілерів чи для генної терапії. Першим підходом є клонування. Тут хромосому, яка пов’язана з хворобою встановлюють, аналізуючи популяцію суб’єктів, деякі з яких мають хворобу. Коли виявляють зв’язок з певною ділянкою хромосоми, велику частину хромосоми поблизу цього гену (відому як локус) сіквенують При цьому отримують ДНК в кілька мегаоснов (mega bases). Такий локус може містити кілька десятків генів з яких тільки один може бути пов’язаний з хворобою. Дані послідовно аналізують роль кількох генів у патогенезі шляхом тривалих і трудомістких експериментів. Навіть отримання позитивного результату не гарантує, що ідентифікований ген буде доброю мішенню для лікування.

Другим, альтернативним є так званий аналіз транскриптів РНК. Він вимагає набагато менше зусиль для сіквенування і більш покладається на потужність комп’ютерних систем. Тут порівнюються профілі генів, які експресуються у хворих і здорових індивідуумів. Такий підхід є більш прямим і швидким, хоча знову ж, не гарантує відкриття доброї мішені для терапії.

Єрархія геномної інформації

Геном людини складається з приблизно 3 мільярдів пар основ (basepaites – b.р.) ДНК. З них тільки ~3% є кодуючими. Тобто лишень 3% транскрибуються і транслюються в білки. Решту геному складають області, необхідні для компактної укладки хромосом, реплікації при поділі клітин, контролю транскрипції тощо. Тому можемо мати три рівні геномної інформації:

Хромосомний геном (або просто геном) – генетична інформація загальна для кожної клітини неспецифічної стадії розвитку.

Експресований геном (або транскриптон) – частина геному, яка експресується в клітинах на специфічній стадії розвитку.

Протеон