Національна академія наук україни

інститут проблем кріобіології і кріомедицини

Дунаєвська Аліна Володимирівна

УДК: 611.013.12.616.69.008.6:615.361.014.41

Вплив високих швидкостей охолодження

на морфофункціональні властивості сперміїв людини

при нормо- та олігоастеноспермії

03.00.19 - кріобіологія і кріомедицина

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Харків – 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник: |

академік НАН України, доктор медичних наук, професор, лауреат Державних премій СРСР та України

Грищенко Валентин Іванович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, директор

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Гордієнко Євген Олександрович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділом низькотемпературної консервації

Доктор медичних наук, професор

Лісовий Володимир Миколайович, Харківський державний медичний університет, завідувач кафедрою урології і андрології

Провідна установа:

Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, кафедра педіатрії, акушерства та гінекології факультету фундаментальної медицини, Міністерство освіти і науки України

Захист відбудеться “22” травня 2001 року о 1330 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІПКіК:

вул. Переяславська, 23, м. Харків, 61015

Автореферат розісланий “20” квітня 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор мед. наук, професор Гольцев А.М.

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. За даними експертів ВООЗ, за останні десятиліття поряд з низькою народжуваністю зростає число безплідних шлюбів. З метою збереження сімейного генофонду все більше застосування знаходять допоміжні репродуктивні технології. Використання кріоконсервованих сперматозоїдів в цих технологіях призводить до необхідності поглибленого вивчення впливу чинників кріоконсервування на чоловічі гамети. Незважаючи на те, що різні аспекти проблеми кріоконсервування сперміїв людини знаходяться в центрі уваги фахівців протягом останніх десятиліть, багато питань залишаються невирішеними.

В останні роки переглянуто питання про проникнення через мембрани репродуктивних клітин води і кріопротекторів. Відповідно до теоретичних розрахунків оптимальна швидкість охолодження для сперміїв людини находиться в діапазоні 7000 оС/хв, на відміну від знайденої раніше експериментально – 10 оС/хв (Henry,, 1993). У 1994 р. В.І. Грищенко та ін. показали доцільність кріоконсервування сперміїв людини зі швидкістю охолодження 3000-5000 оС/хв. Водночас не вивчена дія швидкостей охолодження від 1000 до 2500 оС/хв і більш 5000 оС/хв на виживаність сперміїв після відігріву.

Для підвищення ефективності кріоконсервування в кріозахисне середовище додають, зокрема, альбумін (Ming-Huei Lin, 1998). У той же час, кордова сироватка крім альбуміну містить широкий спектр біологічно активних речовин. Вплив кордової сироватки на виживаність сперміїв після відігріву в літературі не відображено, в зв’язку з чим, це питання доцільно вивчати.

Для використання сперміїв у допоміжних репродуктивних технологіях з еякуляту необхідно виділити фертильну фракцію. В даний час застосування всіх існуючих методів виділення популяції поступоворухливих сперміїв з суспензії кріоконсервованих клітин призводить до ушкодження і втрати великої кількості гамет, що мають здатність до запліднення, тому доцільна розробка методів виділення фертильної фракції з суспензії кріоконсервованих сперміїв.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Обра-ний напрямок досліджень пов’язаний з науковою темою Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України: “Вивчити механізми підвищення фертиль-ності гамет та стійкості фетальних клітин людини та тварин при дії низьких тем-ператур у поєднанні з іншими фізичними та хімічними факторами” (шифр - 2.6.66. № держреєстрації 0100U000408).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було вивчення впливу швид-костей охолодження 1000, 2500 і 10000 оС/хв, складу кріозахисного середовища і методу виділення рухливої фракції сперміїв на їх біологічну повноцінність після відігріву.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:

·

·

·

·

·

Об'єкт дослідження. Еякулят людини з нормо- та олігоастеноспермією, кордова сироватка та сироватка крові людини.

Предмет дослідження. Морфофункціональні властивості сперміїв людини до і після кріоконсервування з різними швидкостями заморожування, вплив спермальної плазми та кордової сироватки в середовищі заморожування на виживаність сперміїв після відігріву, вплив процесу виділення рухливої фракції сперміїв на ефективність кріоконсервування.

Методи дослідження. Для дослідження морфофункціональних характеристик сперміїв використовувалися методи світлової та флюоресцентної мікроскопії, для вивчення активності акрозину застосовували спектрофото-метричний метод.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше вивчені морфофункціональні властивості сперміїв людини після кріоконсервування з швидкостями охолодження біля 1000, 2500 і 10000 оС/хв. Для цих швидкостей заморожування визначені оптимальні параметри кріозахисного середовища, зокрема його осмолярність і вміст в ньому гліцерину.

Встановлено, що залежність виживаності сперміїв після відігріву від швидкості заморожування має максимум в діапазоні високих швидкостей.

Уперше для підвищення рухливості і збільшення часу життездатності сперміїв після відігріву показана доцільність додання в середовище кріоконсервування кордової сироватки, а також визначена її оптимальна концентрація. показано, що в середовищах, які містять альбумін, цілісність сперміїв після кріоконсервування зі швидкістю охолодження 2500 оС/хв вище, ніж у середовищах, до складу яких альбумін не входить.

Розроблено оригінальний метод виділення рухливої фракції кріоконсервованих сперміїв, що дозволяє одержати фертильну популяцію гамет з еякулятів як з нормо-, так і з олігоастеноспермією.

Практичне значення отриманих результатів. Модифіковано з поліпшенням його результатів, метод кріоконсервування сперміїв людини при нормо- та олігоастеноспермії за допомогою використання нового режиму кріоконсервування, додання в кріозахисне середовище кордової сироватки людини і виділення фертильної фракції кріоконсервованих сперміїв. Цей метод можна використовувати в лікувальних установах для допоміжних репродуктивних технологій.

Підібрано високоінформативний комплекс тестів оцінки біологічної повноцінності чоловічих статевих клітин, що дозволяє вивчити особливості впливу різних швидкостей охолодження на морфологічні та функціональні властивості гамет, отриманих з еякулятів при нормо- та олігоастеноспермії.

Особистий внесок здобувача. результати, які виносяться на захист, отримані дисертантом особисто. Співавтори робіт здобувача к.м.н. Г.Г. Юрченко і к.б.н. М.І. Крамар допомагали в підборі матеріалу дослідження при нормоспермії та олігоастеноспермії, оволодінні методами дослідження сперми людини, к.б.н. Ю.В. Калугін надав методичну допомогу в розробці кріозахисного середовища й вимірюванні швидкості охолодження. У публікаціях, які видані у співавторстві із зазначеними дослідниками, дисертанту належить ідея та проведення експериментів, статистична обробка отриманих даних і підготовка матеріалів до друку. Дисертант самостійно провів аналіз отриманих результатів і зробив висновки по матеріалах роботи.

Апробація результатів дисертації. Про результати досліджень проінформовано на Конференції молодих вчених ІПКіК НАН України (1999 р., Харків) та міжнародному науковому форумі “Консервация генетических ресурсов” (2000 р., Росія).

Публікації. Основні положення дисертації викладені в чотирьох роботах: трьох наукових статтях, опублікованих в центральних фахових журналах, та в тезах доповіді на 35-ому щорічному Міжнародному конгресі крібіологів (1998, Pittsburgh, Pennsylvania, USA).

структура дисертації. Робота викладена на 171 сторінці і має вступ, основну частину, яка складається з трьох розділів (огляд літератури, матеріали і методи дослідження, одержані результати та їх обговорювання), закінчення, висновки, список використаних джерел (270 найменувань на 26 сторінках). Дисертація містить 34 ілюстрації (1 сторінка) і 12 таблиць (1 сторінка).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Загальна методика і основні методи дослідження. Дослідження еякулятів проводилося відповідно до рекомендацій ВООЗ (1992, 1997), за загальноприйнятою методикою. Концентрацію і рухливість сперміїв визначали за допомогою лічильної камери Makler (Ізраїль). Життєздатність сперміїв вивчали методом суправітального забарвлення еозин - нігрозином. Функціональну цілісність цитоплазматичної мембрани визначали за допомогою тесту гіпоосмотичного набрякання (HOS-тест), що дозволяє визначити толерантність мембран сперматозоїдів до гіпоосмотичного стресу (Jeyendran, 1984). Для визначення відповідності ушкоджень мембран голівки і хвоста спермія ми комбінували HOS-тест з суправітальним забарвленням. Стан хроматину сперміїв оцінювали за допомогою методу Tejada (1984), в якому використовуються метахроматичні властивості акридину оранжевого. Визначення активності ферменту акрозину проводили за методикою, яка заснована на визначенні кількості казеїна, нерозщепленого ферментом. Для проведення морфометрії мазки зразків, забарвлені акридином оранжевим, вивчали за допомогою комп’ютерної програми Scion image. Середню кількість дефектів на один спермій з морфологічними порушеннями визначали за допомогою індексу тератозооспермії, що дорівнює відношенню суми кількості всіх дефектів, визначених у 100 сперміях, до відсотка атипічних форм.

Для виділення рухливої фракції сперміїв застосовували метод swim-up (Lopata, 1976), фільтрування через скловату (Sterzik, 1998) і розроблений нами двоетапний метод.

Кордову кров отримували під час пологів, центрифугували при 200 g 10 хвилин, збирали надосадову рідину та пастеризували при 56оС на протязі 30 хв. Під час експериментів також використовували нативну інактивовану сироватку людини та 40ний альбумін сироватки людини.

Для одержання досліджуваних швидкостей охолодження використовували 3 типи контейнерів. Заморожування проводили зануренням в рідкий азот. За зміною температури спостерігали за допомогою мідь-константанової термопари, сигнал від якої подавався на чутливий підсилювач осцилографа С-8-12, що дозволяє отримати залежність напруги від часу. Вимір температур проводили від –5 оС до –50 оС. Розморожування проводили на водяній бані при 40оС. У ході експериментів досліджували вплив кріозахисних середовищ з різними осмолярностями (280, 350, 430 і 600 мОсм/кг) на виживаність кріоконсервованих сперміїв. осмолярність досягалася за допомогою зміни концентрації лимонно-кислого натрію і глюкози. Після додавання кріозахисного середовища до зразків кінцеві концентрації гліцерину складали 1,5; 2,5; 4; 5 і 7,5 %.

Статистичну обробку одержаних результатів проводили за методом Стьюдента-Фішера та кореляції Спірмана (Зайцев, ) на IBM PC Pentium-II з використанням пакета програм Microsoft Excel.

Результати власних досліджень автора. Метою першої серії експериментів було дослідження цілісності сперміїв після заморожування зі швидкостями біля 1000, 2500 і 10000 оС/хв. Поряд з цим нами була вивчена цілісність сперміїв у процесі еквілібрації і заморожування при використанні середовищ з різними осмолярностями і концентраціями гліцерину. Дослідження було проведено на 40 еякулятах з нормоспермією.

Встановлено, що 30-хвилинна еквілібрація сперміїв у кріозахисних середовищах з осмолярностями 280, 350 і 430 мОсм/кг і кінцевими концентраціями гліцерину в середовищі інкубації 2,5; 4; 5 і 7,5стимулює кінетичну функцію сперміїв. При інкубації протягом 24 годин у середовищі, що містить 7,5гліцерину, показник рухливості сперміїв достовірно нижчий, ніж аналогічний показник при інкубації гамет у середовищах з концентрацією гліцерину 5і нижче. еквілібрація у гіперосмолярному (600 мОсм/кг) кріозахисному середовищі інгібує рухливість і життєздатність сперміїв. Експерименти показали, що максимальна виживаність сперміїв при заморожуванні з досліджуваними швидкостями спостерігається при швидкості охолодження близькій до 2500 оС/хв (табл. і 2).

При заморожуванні сперміїв зі швидкістю 1000 оС/хв максимальна рухливість гамет спостерігалася при використанні кріозахисних середовищ з осмолярностями 350 і 430 мОсм/кг і концентрацією гліцерину в середовищі кріоконсервування 5 і 7,5(табл. ). Однак і в цих середовищах показник відновлення рухливості сперміїв після відігріву не перевищував 46і був достовірно нижчим за аналогічним показником при швидкості заморожування 2500 оС/хв. При цій швидкості охолодження, з використанням кріозахисного середовища з осмолярністю 430 мОсм/кг і кінцевої концентрації гліцерину 4у середовищі кріоконсервування кількість сперміїв, що відновили рухливість, склала 62,7при збільшенні концентрації гліцерину до 5і 7,5показник рухливості достовірно не змінився (табл. 2).

середовище з помірно підвищеною осмолярністю (350 і 430 мОсм/кг) забезпечує максимальний захист при кріоконсервуванні сперміїв зі швидкостями охолодження 1000 та 2500 оС/хв. (табл. и 2). Заморожування зі швидкістю 10000 оС/хв призводить до загибелі всіх сперміїв незалежно від складу кріозахисного середовища.

Таблиця 1

Вплив осмолярності кріозахисного середовища і концентрації гліцерину в ньому на відновлення рухливості сперміїв після заморожування зі швидкістю охолодження 1000 оС/хв, % (M m)

Концентрація гліцерину, % | Осмолярність середовища, мОсм/кг

280 | 350 | 430 | 600

2,5 | 8,3  ,5в | 15,4  ,0в | 12,9  ,1в | 1,6 0,2а

4 | 13,4  ,2 | 28,7  ,1 | 31,7  ,3 | 2,1  ,5а

5 | 28,9  ,8 | 46,3  ,8 | 44,6  ,4 | 3,5  ,3а

7,5 | 32,5  ,7 | 40,1 6,2 | 45,0  ,2 | 1,2  ,2а

а р < 0,05 по відношенню до показника сперміїв після кріоконсервування в середовищі з осмолярністю 280, 350 і 430 мОсм/кг;

в р < 0,05 по відношенню до показника сперміїв після кріоконсервування в середовищі з кінцевою концентрацією гліцерину 5 %.

Таблиця 2

Вплив осмолярності кріозахисного середовища і концентрації гліцерину в ньому на відновлення рухливості сперміїв після заморожування зі швидкістю охолодження 2500 оС/хв, % (M m)

Концентрація гліцерину, % | осмолярність середовища, мОсм/кг

280 | 350 | 430 | 600

2,5 | 16,4  6,2в | 20,3  5,4в | 29,5  ,5в | 3,4  ,5а

4 | 37,5  6,5 | 54,5  7,3 | 62,7  ,8 | 2,5  0,3а

5 | 41,8  7,3 | 63,6  8,0 | 64,1  7,5 | 3,8  ,6а

7,5 | 55,5  9,0 | 60,6  ,1 | 60,4  ,7 | 2,6  0,2а

а р < 0,05 по відношенню до показника сперміїв після кріоконсервування в середовищі з осмолярністю 280, 350 і 430 мОсм/кг;

в р < 0,05 по відношенню до показника сперміїв після кріоконсервування в середовищі з кінцевою концентрацією гліцерину 4 %.

З огляду на отримані нами дані надалі в роботі ми використовували кріозахисне середовище з осмолярністю 430 мОсм/кг і кінцевою концентрацією гліцерину в середовищі 4

Метою другої серії експериментів було вивчення взаємозв'язку між морфологією сперміїв, станом акросоми й активністю акрозину в нативних еякулятах при нормоспермії й олігоастеноспермії, а також оцінка морфологічних характеристик сперміїв і морфометричних показників голівки гамет і акросом та активності акрозину після інкубації сперміїв у кріозахисному середовищі і після кріоконсервування при різних швидкостях заморожування.

При проведенні морфометрії нативних еякулятів було використано 40 еякулятів, у тому числі 25 - з нормоспермією і 15 - з олігоастеноспермією. В нативних зразках з нормоспермією кількість сперміїв з нормальними морфологічними показниками склала 61,3  ,2у еякулятах з патоспермією кількість форм з нормальними показниками була достовірно нижчою - 38,7  ,8 %. Після кріоконсервування зразків з нормоспермією кількість гамет з нормальними морфолічними показниками знизилася, в основному, за рахунок збільшення вмісту гамет з патологією хвоста і голівки. Найбільше підвищення кількості дефектів голівки, на відзначали при швидкості заморожування 10000 оС/хв. При кріоконсервуванні еякулятів з олігоастеноспермією також достовірно знизилося число гамет з нормальними морфологічними показниками, в основному, за рахунок збільшення кількості клітин з дефектами голівки та хвоста.

Результати морфометрії голівки сперміїв свідчать про те, що при використанні всіх досліджуваних швидкостей охолодження площа, периметр зображення, поперечна і повздовжня вісь, форма голівки істотно не змінилися. У той же час морфометрія акросоми сперміїв, заморожених зі швидкістю біля 1000 і 10000 оС/хв, показала достовірне зменшення її периметра, акросома набула більш округлої форми, що, можливо, зв'язано зі змінами в акросомальній мембрані.

Вивчення стану акросомального апарату показало, що в нативних еякулятах при нормоспермії більше 60сперміїв мали неушкоджену акросому. Цілісність акросом у контрольній групі еякулятів (кількість сперміїв з цілою акросомою) умовно прийняли за 100(рис. ). При олігоастеноспермії спермії з нормальною акросомою склали 72 % у порівнянні з контролем.

Рисії

При вивченні стану акросом кріоконсервованих сперміїв зі зразків з нормоспермією було встановлено, що при швидкості заморожування 1000 Со/хв, кількість сперміїв з цілою акросомою достовірно знижується до 45,3  ,7у порівнянні з контролем - 64,2 6,1 %. При заморожуванні зі швидкістю 2500 оС/хв цілісність акросом складала 91,3  ,3від показника нативних еякулятів. Це досить високий показник цілісності акросом, при якому не порушується здатність гамет до запліднення. При кріоконсервуванні еякулятів з нормоспермією при швидкості заморожування 10000 оС/хв цілісність акросом склала 23у порівнянні з нативними еякулятами. При заморожуванні еякулятів з олігоастеноспермією зі швидкістю 2500 оС/хв кількість сперміїв з неушкодженими акросомами складала 48у порівнянні з нативним зразком, що було значно нижче, ніж при нормоспермії.

Нами було встановлено, що при нормоспермії активність акрозину сперміїв з нативних еякулятів складала 5,7 0,8 мг/хв на 106 сперміїв (С) . Цей показник був прийнятий за 100При олігоастеноспермії активність ферменту була достовірно нижча, вона складала 71від показника при нормоспермії. При цьому простежувалася пряма залежність активності акрозину, стану акросом і рухливості. Після еквілібрації еякулятів у кріозахисному середовищі активність акрозину не знизилася і склала 5,6  ,5 мг/хв на 6С, після кріоконсервування еякулятів з нормоспермією цей показник знизився при всіх швидкостях охолодження. При швидкості заморожування біля 1000 оС/хв активність ферменту склала 3,2  ,4 мг/хв на 6С, при швидкості біля 2500 оС/хв – 4,3  ,5 мг/хв на 6С і при швидкості біля 10000 оС/хв, цей показник різко знизився до 0,6  ,1 мг/хв на 6С. Таким чином, при швидкості охолодження 2500 оС/хв активність акрозину залишилася на досить високому рівні і була достовірно вищою, ніж аналогічний показник при швидкостях 1000 і 10000 оС/хв.

Еквілібрація в кріозахисному середовищі сперміїв із еякулятів з олігоастеноспермією, як і при нормоспермії, не викликала зниження активності акрозину. Активність ферменту склала 4,0  ,6 мг/хв на 6С. При заморожуванні еякулятів з олігоастеноспермією зі швидкістю 2500 оС/хв активність акрозину після відігріву зменшилась на 50у порівнянні з нативними еякулятами. При заморожуванні з такою ж швидкістю сперміїв з еякулятів з нормоспермією активність акрозину знизилася тільки на 25 %.

Вцілому цілісність акросом дещо вища, ніж активність акрозину при всіх швидкостях заморожування. Отримані дані свідчать про те, що порушення функціональної і структурної цілісності акросоми призводять до зниження активності акрозину.

Метою третьої серії експериментів було вивчення стану хроматину сперміїв у нативних еякулятах, після їх еквілібрації у кріозахисному середовищі і після кріоконсервування з швидкостями охолодження 1000, 2500 і 10000 оС/хв. Нами було досліджено 30 еякулятів. У нативних зразках після забарвлення акридіном оранжевим у 72,4  ,8 % сперміїв голівки світилися зеленим кольором. У групі еякулятів з олігоастеноспермією зеленим кольором світилися лише 47,9  ,8голівок сперміїв, що, можливо, пов'язано з високим вмістом незрілих форм (табл. 3).

Після еквілібрації в кріозахисному середовищі стан хроматину сперміїв істотно не змінився. Після кріоконсервування зміни досліджуваних параметрів сперміїв істотно залежали від швидкості їх охолодження. При швидкості заморожування 2500 оС/хв рухливість сперміїв і стан конденсації хроматину залишалися в межах показників при нормоспермії, при швидкості 1000 оС/хв кількість сперміїв з деконденсованим хроматином збільшилась у 2 рази. При збільшенні швидкості заморожування до 10000 оС/хв усі голівки сперміїв світилися червоним кольором, у той же час одиничні спермії зберігали рухливість.

Кріоконсервування сперміїв з еякулятів з олігоастеноспермією при використанні швидкості охолодження 2500 оС/хв, призвела до вираженого зменшення числа гамет з конденсованим хроматином до 24,1  ,2 %. Цей показник був достовірно нижчий в порівнянні з аналогічними показниками зразків з патоспермією до заморожування і зразків з нормоспермією після заморожування зі швидкістю 2500 оС/хв.

Таблиця 3

Рухливість сперміїв і стан нуклеарного хроматину при нормоспермії в процесі кріоконсервування (M m)

Параметри сперміїв | Нативний еякулят | спермії після еквілібрації | Спермії після кріоконсервування

Швидкість охолодження, оС/хв

1000 | 2500 | 10000

Поступова рухливість, % | 56,4  ,8  | 82,9  ,0* | 21,7  ,3* | 51,3  ,1 | 0*

Конденсований хроматин, % | 72,4  ,8  | 70,8  ,4  | 27,3  ,8* | 68,4  ,5 | 0*

* р .05 по відношенню до нативного еякуляту.

Метою четвертої серії експериментів було дослідження взаємозв'язку між пошкодженням мембран голівки (забарвлення еозин-нігрозином) та хвоста (HOS-тест) сперміїв і рухливістю клітин до і після кріоконсервування зі швидкістю охолодження біля 2500 оС/хв, а також осморегуляторної здатності мембрани (ОЗМ) хвоста сперміїв при швидкостях заморожування біля 1000 і 10000 оС/хв при нормоспермії. З цією метою поряд із стандартними тестами був використаний HOS-тест, комбінований із забарвленням еозин-нігрозином.

Дослідження проводилося на еякулятах з нормоспермією – група А і на еякулятах з олігоастеноспермією – група В. У нативних зразках еякулятів груп А і В спостерігалася висока кореляція між показниками рухливості і результатами обох тестів. між показником рухливості і даними HOS-тесту r ,743 і r ,752, відповідно. між показником рухливості і даними забарвлення еозином r = ,726 і r ,698, відповідно, і між результатами HOS-тесту і забарвлення еозином r = 0,708 і r = 0,685, відповідно. У нативних зразках сперми з олігоастеноспермією всі досліджувані показники були значно нижчими, ніж у зразках з нормоспермією. Після кріоконсервування це розходження збільшилося. У кріоконсервованих зразках групи А кореляція (r) між показником рухливості гамет і даними HOS-тесту дорівнювала 0,637, між показником рухливості і даними забарвлення еозином r = 0,614 і між результатами HOS-тесту і забарвлення еозином r = 0,752. При нормоспермії осморегуляторна здатність сперміїв, заморожених зі швидкістю 1000 оС/хв, збереглася в 37,0 4,6 % гамет, зі швидкістю 10000 оС/хв, у всіх сперміїв ОЗМ була порушена. Водночас нами встановлено, що після відігріву кріоконсервованих зразків з олігоастеноспермією кореляція між результатами HOS-тесту і забарвленням еозин  нігрозином була нижчою, ніж до кріоконсервування. Між показником рухливості гамет і даними HOS-тесту кореляція дорівнювала 0,453, між показником рухливості і даними забарвлення еозином r0,518. У той же час між результатами HOS-тесту і забарвлення еозином кореляція була вище: r = 0,728. Таким чином, у сперміїв з еякулятів з нормоспермією до і після кріоконсервування, і у нативних гамет з еякулятів при олігоастеноспермії результати тесту гіпоосмотичного набрякання і забарвлення еозином мають високу кореляцію з показниками рухливості. Кріоконсервування сперміїв з еякулятів з олігоастеноспермією призвело до значного зниження рухливості сперміїв і порушення в них цілісності мембран голівки і хвоста, зниження рухливості було більш вираженим, ніж ушкодження мембран і кореляція між цими показниками була нижчею, ніж у нативних еякулятах.

Метою п’ятої серії експериментів було порівняння впливу різних концентрацій спермальної плазми (СП), кордової сироватки (КС) та сироватки крові людини (СКЛ) в середовищі кріоконсервування на виживаність кріоконсервованих сперміїв. Дослідження було проведено на 30 еякулятах.

Встановлено, що після відігріву кінетика сперміїв істотно залежала від вмісту в середовищі кріоконсервування спермальної плазми і сироваток (рис. ). Виживаність сперміїв ссссс

сРис. . Вплив вмісту в середовищі кріоконсервування спермальної плазми, сироватки крові і кордової сироватки на рухливість сперміїв після відігріву

була істотно вищою (р0,05) у середовищах, що містять 35 і 50 % СП і 35 і 50 % КС, у порівнянні з виживаністю в середовищах, що містять 25 і 75 % СП і 25 і 75 % КС. При заміні СП еквівалентною кількістю інактивованою СКЛ виживаність сперміїв достовірно знижувалася (р0,05). У середовищі, що містить сироватковий альбумін людини, відновлення рухливості сперміїв достовірно не відрізнялося від показників сперміїв, заморожених у середовищах, що містять 35 і 50 % СП і КСЛ. При цьому рухливість сперміїв залишалася в межах нормоспермії. При заморожуванні сперміїв у середовищі, до складу якого не входили кс і сп, рухливість гамет була достовірно нижчою (р ,05), ніж у середовищах, в складі яких вони були присутні. Позитивний вплив при додаванні в середовище кріоконсервування спермальної плазми,кордової сироватки й альбуміну на кінетику і переживаність сперміїв після відігріву дають підстави зробити висновок, що спермії краще зберігають рухливість у середовищах, що містять альбумін.

Тільки в середовищах, що містять КС і альбумін, спермії більш 12 годин після відігріву зберігають рухливість, причому в середовищі з КС кінетика клітин була достовірно вищою, ніж у середовищі з альбуміном (рис. ).

Рис. . Залежність переживаності кріоконсервованих сперміїв людини від змісту в кріозахистному середовищі спермальної плазми, кордової сироватки, сироватки крові й альбуміну сироватки людини.

метою шостої серії експериментів була розробка ефективного методу виділення рухливої фракції кріоконсервованих сперміїв як при нормо-, так і при олігоастеноспермії, а також його порівняльна оцінка з методом swim-up і фільтрацією через скловату. Дослідження були проведені на двох групах еякулятів. Першу групу (I) склали 35 еякулятів донорів, другу групу (II) - 20 еякулятів з олігоастеноспермією. Кожен зразок було поділено на 6 частин. У першій частині (I) вивчали характеристики нативного еякуляту. Другу частину (II) кріоконсервували без виділення поступово-рухливої фракції і використовували як контроль.У третьої (III) - рухливу фракцію сперміїв виділяли методом swim-up перед кріоконсервуванням. У четвертій (IV) - рухливу фракцію сперміїв також виділяли методом swim-up, але після кріоконсервування. У п'ятій (V) - до заморожування спермії центрифугували при 2500 об/хв протягом 10 хвилин. Для збільшення концентрації клітин надосадову рідину відбирали піпеткою і осад ресуспендували в середовищі, об'єм якого, залежав від початкової концентрації сперміїв. Фільтрацію через скловату проводили після кріоконсервування. Цей метод був названий нами двоетапним методом. У шостій (VI) - центрифугування і фільтрацію сперміїв через скловату проводили після кріоконсервування. Зразки заморожували зі швидкістю охолодження біля 2500 оС/хв.

У контрольних зразках усі вивчені характеристики гамет знизилися в порівнянні з вихідними, проте, вони знаходилися в межах нормоспермії (рис. ). Після відігріву зразків еякулятів, у яких рухливу фракцію виділяли методом swim-up перед кріоконсервуванням, у порівнянні з контролем достовірно збільшилася тільки кількість сперміїв з нормальними морфологічними показниками (р  0,05). При застосуванні методів swim-up і фільтрації через

Рис. 4. Ефективність методів виділення рухливої фракції сперміїв з еякулятів з нормоспермією в процесі кріоконсервування

1 – контроль ( без виділення рухливої фракції сперміїв);

2 - swim-up до кріоконсервування;

3 - swim-up після кріоконсервування;

4 - двоетапний метод;

5 - фільтрація після кріоконсервування

скловату після кріоконсервування, а також двоетапного методу рухливість і життєздатність сперміїв, кількість гамет з конденсованим хроматином і сперміїв без морфологічних порушень були достовірно вищі в порівнянні з контролем (Р ,05). Однак концентрація поступово-рухливих сперміїв достовірно збільшилася в порівнянні з контролем тільки при використанні двоетапного методу, при якому вона склала 16,8  ,1 млн./мл. При застосуванні двоетапного методу, морфологічні показники сперміїв виділеної фракції були кращими, ніж при застосуванні swim-up як до, так і після кріоконсервування.

Після відігріву контрольних зразків еякулятів з олігоастеноспермією було виявлено істотне зниження показників цілісності сперміїв, у порівнянні з відповідними показниками контролю при нормоспермії. У зразках з низькою концентрацією сперміїв дія факторів кріоконсервування призвела до зниження кінетичної функції гамет, збільшення кількості сперміїв з деконденсованим хроматином і з морфологічною патологією. У зразках гамет рухливої фракції, попередньо концентрованих і виділених методом swim-up, після кріоконсервування концентрація поступово-рухливих сперміїв була істотно вищою, ніж в аналогічних контрольних зразках. Однак істотних розходжень у кількості сперміїв з нормальними морфологічними показниками в суспензії гамет, виділених методом swim-up, і контролем виявлено не було. Отже, з метою підвищення ефективності кріоконсервування сперміїв як при патоспермії, так і нормоспермії доцільно рухливу фракцію гамет виділяти з суспензії після заморожування. При олігоастеноспермії, як і при нормоспермії, після застосування двоетапного методу виділення рухливої фракції сперміїв у порівнянні з контролем відзначалося значне збільшення кількості сперміїв з нормальними морфологічними показниками і конденсованим хроматином, а також концентрація клітин з поступовою рухливістю у виділеній суспензії. Цей показник був достовірно вищим не тільки в порівнянні з аналогічним показником контролю, але й з концентрацією поступово-рухливих гамет при застосуванні методів swim-up як до, так і після кріоконсервування, і фільтрування через скловату після відігріву.

ВИСНОВКИ

1. Широке застосування допоміжних репродуктивних технологій викликає необхідність пошуку ефективних методів підвищення фертильності сперміїв і тривалого збереження біологічно повноцінних чоловічих гамет. Проведена оцінка морфологічних і функціональних властивостей сперміїв після кріоконсервування зі швидкостями заморожування 1000, 2500 і 10000 оС/хв дозволяє вважати, що з досліджуваних швидкостей заморожування найбільш ефективна - 2500 оС/хв, при використанні якої максимальна кількість сперміїв зберегла здатність до запліднення.

2. Вперше встановлено мінімальну концентрацію гліцерину (4у середовищі кріоконсервування та оптимальну осмолярність середовища (430 мОсм/кг), які при швидкості заморожування 2500 оС/хв дозволяють одержати достатню для клінічного застосування кількість неушкождених сперміїв.

3. Вперше показано, що додавання кордової сироватки людини в середовище кріоконсервування позитивно впливає на відновлення і час збереження рухливості сперміїв після відігріву. У середовищах, що містять 35 та 50кордової сироватки або спермальної плазми, а також 0,4альбуміну сироватки, цілісність сперміїв після кріоконсервування в 2 рази вища, ніж у середовищах, до складу яких вони не включені.

4. Результати проведеної морфометрії показали, що при швидкостях заморожування 1000 і 10000 оС/хв периметр акросоми достовірно зменшився, що може свідчити про ушкодження мембрани акросоми, тоді як при швидкості 2500 оС/хв таких змін не відбулось.

5. Встановлено, що процес кріоконсервування призводить до деконденсації ядерного хроматину. У досліджуваному діапазоні швидкостей заморожування мінімальні зміни в стані хроматину відбуваються при швидкості 2500 оС/хв.

6. Показано, що після кріоконсервування відзначався відмінний ступінь пошкодження мембран голівки та хвоста сперміїв із еякулятів з олігоастеноспермією.

7. Розроблено оригінальний метод виділення кріоконсервованих сперміїв з поступовою рухливістю, це дозволяє в нормі і при олігоастеноспермії одержати суспензію біологічно повноцінних сперміїв, які відповідають вимогам программ штучного запліднення.

СПИСОК ОПУБЛіКОВАНИХ РОБІТ ЗДОБУВАЧА

ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Грищенко В.И., Дунаевская А.В., Калугин Ю.В. Влияние быстрых и сверхбыстрых скоростей замораживания на сохранность спермиев человекаПробл. Криобиологии. – 2000. - №2. – С. 52-57.

2. Дунаевская А.В. Влияние спермальной плазмы, кордовой сыворотки и сыворотки крови человека в среде криоконсервации на сохранность криоконсервированных спермиев // Пробл. Криобиологии. – 2000. - №3. – С. .

3. Дунаевская А.В., Крамар М.И. Изменение состояния нуклеарного хроматина спермиев человека в процессе криоконсервации // медицина сегодня и завтра. – 2000. - №3. – С. .

4. GrischenkoLuchko N.A., YurchenkoKalugin Yu.V., DunayevskayaCherepanovaIntegrity of Morphofunctional Properties of Spermatozoa Depending on Cooling Rates // 35th Annual Meeting of the Society for Cryobiology. - Pittsburgh, USA. - 1998. – Р. 58

АНОТАЦІЇ

Дунаєвська А.В. Вплив високих швидкостей охолодження на морфофункціональні властивості сперміїв людини при нормо- та олігоастеноспермії. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.19 – кріобіологія і кріомедицина. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків – 2001.

В роботі вивчався вплив високих швидкостей заморожування: 1000, 2500 та 10000о С/хв, осмолярності кріозахисного середовища і концентрації гліцерину в ньому на цілісність сперміїв після відігріву. Показано, що краща цілісність морфофункціональних параметрів кріоконсервованих сперміїв спостерігається при швидкості заморожування 2500о С/хв при осмолярності кріозахисного середовища 430 мОсм/кг і концентрації гліцерину 4Результати досліджень показали, що додавання кордової сироватки в кріозахисне середовище збільшує виживаність і час рухливості сперміїв після відігріву. Розроблено ефективний метод виділення рухливої фракції кріоконсервованих сперміїв при нормо- і олігоастеноспермії.

Ключові слова: спермії людини, кріоконсервування, швидкість заморожування, кріозахисне середовище, кордова сироватка, морфофункціональні властивості, олігоастеноспермія, методи виділення рухливої фракції.

Дунаевская А.В. Влияние высоких скоростей охлаждения на морфофункциональные свойства спермиев человека при нормо- и олигоастеноспермии. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.19 – криобиология и криомедицина. – Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков – 2001.

В работе изучалось влияние высоких скоростей замораживания: 1000, 2500 и 10000о С/мин, осмолярности криозащитной среды и концентрации глицерина в ней на сохранность спермиев после отогрева. Показано, что лучшая сохранность морфофункциональных параметров криоконсервированных спермиев наблюдается при скорости замораживания 2500о С/мин при осмолярности криозащитной среды 430 мОсм/кг и концентрации глицерина 4Результаты исследований показали, что добавление кордовой сыворотки в криозащитную среду увеличивает выживаемость и время сохранения подвижности спермиев после отогрева. Разработан эффективный метод выделения подвижной фракции криоконсервированных спермиев при нормо- и олигоастеноспермии.

Ключевые слова: спермии человека, криоконсервирование, скорость замораживания, криозащитная среда, кордовая сыворотка, морфофункциональные свойства, олигоастеноспермия, методы выделения подвижной фракции.

Dunayevskaya A.V. rapid rates of freezing effect on the morphological and functional state of human sperm. – Manuscript.

The thesis for scientific degree of a candidate’s medical sciences on speciality 03.00.19 – cryobiology and cryomedicine. - Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, 2001.

The thesis is devoted to the study of active of freezing rates of 1000, 2500 and 10000оC/min, osmotic pressure of cryoprotective medium and concentration of glycerin on sperm survival after thawing. It was shown, that at adding of cord serum in to cryoprotective medium improved kinetic characteristics and survival of sperm after thawing.

Human sperm and cord serum were used as investigating objects. Freezing was performed by submersion of 3 variants of plastic containers with the sample into liquid nitrogen, by this achieving the rates of cooling. For temperature measurement copper-constantan thermocouple, attached to a display oscilloscope was used. Thawing was performed by water bath at 37 оС. For cryopreservation of the specimens cryoprotective medium with glucose, citrate, egg yolk and glycerol was used. During experiments the cryoprotective medium with the following osmolality (osmotic pressure of glycerol and egg yolk) - 280, 350, 430 and 600 мOsm/kg was applied. Final concentrations of glycerol were 1,5, 2,5, 4, 5 и 7,5

Motility, concentration, viability (eosin-Y stain), morphology, plasma membrane integrity chromatin stability (acridine orange staining), acrosin activity, morphometric parameters of heads and acrosoms of spermatozoa were analyzed before and after cryopreservation. Plasma membrane integrity was assessed by the hypo-osmotic swelling test (HOS- test). Acrosin activity was investigated by assaying casein. For the morphometry assessment, photographs of individual spermatozoa were collected with IBM PC computer using a color video camera.

It is shown, that the best safety of morphological and functional parameters of cryopersevered sperm is observed at freezing rate of 2500 оC/min at cryoprotective medium with moderately increased osmolality - 430 мOsm/kg and minimal concentration of glycerol 4 – 5At cooling rate of 2500 оС/min the recovery of the spermatozoa motility was 65Slowing down of the freezing rate to 1000 оС/min reduced sperm survival, recovery of the spermatozoa motility was lower 45After cryopreservation with the freezing rate of 10000 оC/min only single spermatozoa survived.

Sperm cryopreservation with cooling rate of 2500 оС/min does not result in the change of a chromatin stability. At the cooling rate of 1000 оС/min the percentage of sperm with decondensed chromatin increased twice, at cooling rate of 10000 оС/min all sperm contained a decondensed chromatin.

The data of determination of morphometric parameters in the sperm heads and acrosomes confirmed that diameter, area, long axis, perimeter, and shape factor of sperm heads had no significant differences before and after cryopreservation with all studied rate of freezing, only the acrosomes diameter was significantly smaller after freezing with the rates 1000 and 10000 оС/min.

In one series of experiments in to the cryoprotective medium native inactivated cord serum, native inactivated serum of a human blood and 0,4 % serum albumin were added. Cord blood was received during labours, and then was centrifuged it at 200G for 10 minutes; over the supernatant was collected and inactivated it at 56 оС during 30 mines. Human blood was centrifuged and inactivated at the same way. Native cord serum, added to cryoprotective medium, increased the number of spermatozoa with linear progression and prolonged the period of survival for sperm after thawing. Practically, in during 12 hours incubation after cryopreservation of sperm in the medium, containing 50of cord serum, sperm motility remained intact in 23 % those were reliably higher as compared with control (cryoprotective medium without cord serum) – 1Cryopreservation in the absence of seminal plasma can be used for intrauterine insemination in AIH, AID programs with frozen semen.

The effective method of selection of motile fraction from cryopersevered sperm is developed. Before cryopreservation sperm were centrifuged at 300 g for 10 min, than the pellet was resuspended in medium. In oligoasthenozoospermic samples the sperm concentration was increased. glass wool filtration was performed after freezing The samples processed this method had higher concentration of cells with progressive motility, and sperm with normal morphology and chromatin structure in normo- and oligoasthenozoospermic samples. This selection method of motile sperm can be used for assisted reproductive techniques.

Key Words: human spermatozoa, cryopreservation, rapid rate, cryoprotective medium, cord serum morphological and functional state, oligoasthenospermia, method of motile sperm fraction selection.