Академія медичних наук україни

інститут нейрохірургії

імені академіка А.П. Ромоданова

ЛУЗАН Борис Миколайович

УДК 616.833-001-003.93:616.-089.843:611-013.7./.8-018.8

Вплив алогенної трансплантації ембріональної

нервової тканини на регенерацію ушкоджених

периферичних нервів

14.01.05 — нейрохірургія

автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті нейрохірургії ім. акад. А.П.Ромоданова АМН України та Національному медичному університеті ім. О.О.Богомольця МОЗ України

Науковий керівник член-кореспондент АМН України, доктор медичних наук, професор Цимбалюк Віталій Іванович, Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця, завідувач кафедри нейрохірургії; Інститут нейрохірургії ім. акад. А.П.Ромоданова АМН України, заступник директора з наукової роботи

Офіційні опоненти:

член-кореспондент АМН України, доктор медичних наук, професор Поліщук Микола Єфремович, Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика МОЗ України, завідувач кафедри нейрохірургії

доктор медичних наук Сташкевич Анатолій Трохимович, Інститут ортопедії та травматології АМН України, Республіканський спінальний нейрохірургічний центр, клініка хірургії хребта, провідний науковий співробітник

Провідна установа

Одеський державний медичний університет ім. М.І.Пирогова МОЗ України, кафедра факультетської хірургії з курсом нейрохірургії, м. Одеса

Захист відбудеться 06.03.2001 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д .557.01 при Інституті нейрохірургії ім. акад. А.П.Ромоданова АМН України (04050, м. Київ, вул. Мануїльського, 32)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту нейрохірургії ім. акад. А.П.Ромоданова АМН України (04050, м. Київ, вул. Мануїльського, 32)

Автореферат розісланий 05.02.2001 року

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради доктор медичних наук Чеботарьова Л.Л.

загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Травматичні ушкодження периферичної нервової системи (ПНС) складають приблизно 6% від загального травматизму, а за втратою працездатності посідають одне з перших місць та часто призводять до тяжкої інвалідизації хворих (Сташкевич А.Т., 1988; Шевелев И.Н., 1990; Сулий Н.Н., 1999; Kline D.G., Hudson A.R., 1995).

За останнє двадцятиріччя було зроблено значний крок у розвитку реконструктивної хірургії периферичних нервів завдяки впровадженню мікрохірургічної техніки. Проте, не зважаючи на значні успіхи, цілий ряд питань, особливо тих, що стосуються проблеми прискорення та більш повного відновлення функції нервово-м'язового апарату залишаються відкритими і потребують подальшого вивчення. Можна констатувати, що за останні роки подальшого покращення результатів мікрохірургічного лікування тільки за рахунок застосування мікрохірургічної техніки практично не відбувається. Багато хворих оперуються з приводу ушкоджень ПНС повторно або в пізні строки після травми, коли прогнозування щодо повноцінного відновлення функції нервово-м'язового апарату стає сумнівним (Шрамко В.И., Сулий Н.Н., Шамаев А.М., 1989; Полищук Н.Е., Сулий Н.Н., 1990; Katzman B.M., Bozentka D.J., 1999; Barrett J.P., Downey M.S., Hillstrom H.J., 1999; Flores A.J., Lavernia C.J., Owens P.W., 2000).

Все це зумовлює необхідність пошуку подальших шляхів, спрямованих на ефективне відновлення функцій ушкоджених нервів, прискорення темпів та збільшення об'єму регенерації, що в свою чергу неможливо здійснити без розуміння біологічних закономірностей репаративного гістогенезу нервової системи (Берснев В.П., 1986; Terris D.J., Fee W.E., 1993; Dagum A.B., 1998; Grant G.A., Goodkin R., Kliot M., 1999). На сьогоднішній день залишається не повністю з'ясованою участь імунологічних механізмів у процесах, що відбуваються при регенерації периферичних нервів після травматичних ушкоджень, серед методів стимуляції регенерації практично не існує такого, що ефективно впливав би на більшість механізмів репаративного гістогенезу (Цымбалюк В.И., Чайковский Ю.Б., Ломако Л.А. та ін., 1994; Medinaceli L., Church A.C., Wang Y.N., 1989; Kline D.G., Hudson A.R., 1996).

На сучасному етапі розвитку медичної науки одним з найперспективніших напрямків відновлення морфофункціонального стану центральної нервової системи вважають застосування ембріональних нервових тканин. Метод біотрансплантації з успіхом використовується для лікування таких поширених та важких захворювань, як дитячий церебральний параліч, хвороба Паркінсона, черепно-мозкова травма, апалічний синдром, проводяться експериментальні дослідження щодо застосування трансплантації ембріональної нервової тканини (ТЕНТ) при ушкодженнях спинного мозку, хворобі Альцгеймера, хореї Гантінгтона, розсіяному склерозі та ін. (Цимбалюк В.І., Пічкур Л.Д., 1999; Woerly S., Morassutti D.J., 1993; Bluml S., Kopyov O., Jacques S. et al., 1999; Walton K.M., 1999). Але практично відсутні ґрунтовні дослідження можливостей застосування цього методу з метою впливу на регенерацію структур ПНС.

Враховуючи все вищезгадане, з метою поліпшення відновлення функції ушкоджених нервів нами в експерименті був використаний метод ТЕНТ під час виконання реконструктивних хірургічних втручань та проведене всебічне вивчення дії біотрансплантації на процеси репаративного гістогенезу в периферичних нервах. Застосування результатів експериментальних наукових розробок в клінічній практиці може істотно вплинути на результати лікування хворих з ушкодженнями ПНС, що має велике практичне та теоретичне значення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася як індивідуальний фрагмент науково–дослідних тем Інституту нейрохірургії ім. акад. А.П.Ромоданова АМН України спільно з Національним медичним університетом ім. О.О.Богомольця МОЗ України у 1993–1998 рр. за №№ держреєстрації 0195И010358 та 0196И006537, які були присвячені проблемі розробки нових методів прискорення регенерації ушкоджених периферичних нервів шляхом поєднання хірургічних втручань з біотрансплантацією та фізико-хімічним впливом.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є покращення результатів відновлення функції нервово-м`язового апарату шляхом застосування нейротрансплантації під час виконання реконструктивних мікрохірургічних втручань на периферичних нервах в експерименті, визначення основних механізмів впливу нейротрансплантата на організм реципієнта і периферичний нерв, що регенерує, обґрунтування показань щодо застосування ТЕНТ при мікрохірургічному лікуванні травматичних ушкоджень периферичних нервів.

Поставлена мета визначала вирішення таких задач:

1. Розробити експериментальну модель ТЕНТ в ушкоджений периферичний нерв при його мікрохірургічному зшиванні.

2. Розробити експериментальну модель імунологічних порушень, що спостерігаються при ушкодженнях периферичних нервів.

3. Визначити методи об'єктивної реєстрації впливу біотрансплантації на репаративний гістогенез периферичних нервів в експерименті.

4. Визначити основні механізми впливу нейротрансплантата на процеси регенерації ушкодженого периферичного нерва.

5. Визначити основні зміни показників системи імунітету при ушкодженнях периферичних нервів та хірургічній корекції цих ушкоджень, в тому числі і при застосуванні ембріональної нервової тканини (ЕНТ).

6. Провести порівняльний аналіз ефективності відновлення функції нервово-м'язового апарату в різних експериментальних серіях.

7. Обґрунтувати покази до застосування ТЕНТ при мікрохірургічному лікуванні травматичних ушкоджень периферичних нервів, подати висновки про доцільність використання запропонованого методу.

Об'єкт дослідження — регенерація ушкоджених периферичних нервів після проведення реконструктивних хірургічних втручань.

Предмет дослідження — вивчення впливу трансплантації фрагментів ембріонального спинного мозку на регенерацію ушкоджених периферичних нервів в експерименті.

Методи дослідження — світлова мікроскопія з морфометричним аналізом, електронна мікроскопія, комп'ютерна електронейроміографія, імунологічні дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше розроблені експериментальна модель для вивчення впливу на регенерацію ушкоджених периферичних нервів трансплантованої тканини ембріонального спинного мозку та експериментальна модель імунологічних порушень, що спостерігаються при ушкодженнях периферичних нервів. Удосконалено комплекс об'єктивної реєстрації дії факторів, що впливають на регенерацію ушкоджених периферичних нервів, який включає поєднане використання електронної, світлової мікроскопії, морфометрії, комп'ютерну електронейроміографію та імунологічне дослідження. Вперше доведено, що застосування нейротрансплантації ембріонального спинного мозку позитивно впливає на регенераційні процеси в периферичних нервах шляхом пригнічення реакції оточуючого сполучнотканинного середовища, покращення мікроциркуляції в зоні шва нерва, прискорення швидкості проростання аксонів, що регенерують та їх мієлінізації. Дістало подальшого розвитку комплексне вивчення основних змін в імунному статусі при ушкодженнях периферичних нервів та після реконструктивних мікрохірургічних втручань, показаний вплив цих процесів на регенерацію периферичних нервів. Вперше досліджено вплив ТЕНТ при ушкодженнях периферичних нервів на основні показники гуморальної та клітинної ланок імунітету.

Практичне значення одержаних результатів. Розширено коло застосування ТЕНТ завдяки використанню цього методу при травматичних ураженнях ПНС. На експериментальному матеріалі вивчено процес взаємодії нейротрансплантата з оточуючими тканинами та організмом в цілому при трансплантації в периферичний нерв, показано, що застосування методу нейротрансплантації при мікрохірургічному лікуванні ушкоджень ПНС здатне поліпшити кількісні та якісні показники відновлення функції нервово-м'язового апарату, що дозволяє рекомендувати застосування цього методу у клінічну практику, а результати дослідження особливостей репаративного гістогенезу периферичних нервів дають можливість розробити рекомендації щодо використання фізико-хімічних та біологічних факторів з метою покращення процесів регенерації.

Результати проведеного експериментального дослідження впроваджені в практику роботи відділення відновної нейрохірургії Інституту нейрохірургії імені академіка А.П. Ромоданова АМН України та педагогічний процес на кафедрах нейрохірургії, гістології та ембріології Національного медичного університету імені О.О.Богомольця МОЗ України.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійним науковим дослідженням. Автор виконав аналіз наукової літератури за темою дисертації, провів патентно-інформаційний пошук, у тому числі й за електронними базами даних, розробив методологію проведення експерименту згідно до поставлених задач, запропонував модель ТЕНТ в ушкоджений периферичний нерв та модель імунологічних порушень при ушкодженнях периферичних нервів, як одного з факторів, що призводить до незадовільних результатів лікування при повторних оперативних втручаннях та втручаннях у віддаленому періоді після травми. Автор самостійно виконав хірургічні втручання на лабораторних тваринах (мікрохірургічне відновлення цілості сідничного нерва, ТЕНТ в ділянку шва нерва), забір матеріалу для досліджень. В Інституті нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова АМН України автором були виконані: електронномікроскопічне дослідження — під керівництвом д.мед.н., професора А.Т.Носова; електрофізіологічні дослідження — спільно з д.мед.н. Л.Л.Чеботарьовою; імунологічні дослідження — під керівництвом д.мед.н., професора М.І.Лісяного; аналіз результатів імунологічних досліджень проведений спільно з к.б.н. В.А.Руденко. Світлова мікроскопія та морфометричні дослідження виконані автором на кафедрі гістології та ембріології Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця під керівництвом д.мед.н., професора Ю.Б.Чайковського. Статистична обробка результатів усіх досліджень виконана автором особисто; результати досліджень та висновки обговорювалися з науковим керівником дисертації чл.-кор. АМН України, д.мед.н., професором В.І.Цимбалюком; усі розділи дисертаційної роботи написані автором особисто.

Автор щиро вдячний за допомогу та цінні поради при написанні дисертації д.мед.н. М.М.Сулію та висловлює глибоке співчуття рідним та близьким з приводу його передчасної смерті.

Апробація результатів дисертації. Основні положення наукових досліджень були оприлюднені на науково-практичній конференції “Актуальні проблеми експериментальної медицини” (Київ, 1997 р.; Київ, 1998 р.).; міжнародній конференції “Актуальні питання сучасної хірургії” (Ужгород, 1997 р.); ІІ з'їзді нейрохірургів України (Одеса, 1998 р.); І з'їзді трансплантологів України (Київ, 2000 р.). Дисертація пройшла апробацію на спільному засіданні спеціалізованої вченої ради Інституту нейрохірургії імені академіка А.П.Ромоданова АМН України з кафедрами нейрохірургії Національного медичного університету імені О.О.Богомольця та Київської медичної академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика, членами Української асоціації нейрохірургів (22.11.2000 р.).

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковані у 18 друкованих працях (8 статей у наукових журналах, 3 патенти України на винахід, 7 тез конференцій та з'їздів).

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, шістьох розділів (огляд літератури, матеріали та методи досліджень, чотири розділи власних досліджень), підсумків, висновків, списку літератури. Дисертація виконана на 171 сторінці машинопису, ілюстрована 8 таблицями і 45 рисунками. Таблиці і рисунки займають 18 сторінок.

Список літератури викладений на 42 сторінках і включає 409 найменувань, із них кирилицею – 152, латиницею – 257.

Основний зміст дисертації

Матеріали і методи дослідження

Робота була проведена на 190 білих щурах, самцях масою 200±25 г, яких згідно до поставлених задач було розподілено на чотири групи:

1) перетин лівого сідничного нерва в середній третині стегна з подальшою нейрорафією;

2) перетин лівого сідничного нерва в середній третині стегна з подальшою нейрорафією і ТЕНТ в зону шва субепіневрально;

3) імуносенсибілізація антигеном периферичного нерва з повним ад'ювантом Фрейнда тричі дозою 0,1 мг/100 г/ доб. за 2 тижні до оперативного втручання, потім перетин лівого сідничного нерва в середній третині стегна з подальшою нейрорафією;

4) імуносенсибілізація антигеном периферичного нерва з повним ад'ювантом Фрейнда тричі дозою 0,1 мг/100 г/ доб. за 2 тижні до оперативного втручання, потім перетин лівого сідничного нерва в середній третині стегна з подальшою нейрорафією і ТЕНТ в зону шва субепіневрально.

Кількість тварин в кожній з груп була однаковою і становила 45 щурів. Крім того, для імунологічних досліджень було використано ще 10 інтактних тварин з метою контролю імунологічних показників.

Оперативне втручання виконували в стерильних умовах під перитонеальним наркозом сумішшю каліпсолу та реланіуму на 0,9% розчині хлориду натрію. Доступ виконувався в середній–верхній третині стегна за проекційною лінією сідничного нерва. Після обробки операційного поля розтиналися м'які тканини, а потім тупо за допомогою затискача типу “москіт” виділяли сідничний нерв, який пересікали лезом безпечної бритви на рівні середньої третини стегна. Потім атравматичною голкою з монофіламентною поліамідною ниткою 10/0 накладали 3–4 епіпериневральні шви на кінці нерва. Для трансплантації використовували тканину спинного мозку 7–8-добових ембріонів щурів, отриманих шляхом кесарського розтину вагітної самки. Об'єм трансплантації становив 0,5±0,1 мм3.

Контроль за регенерацією виконували через 5, 14 та 90 діб після операції. Для контролю використовували світлову, електронну мікроскопію, комп'ютерну електронейроміографію та імунологічні дослідження.

З метою забору матеріалу для проведення гістологічного дослідження нерв було умовно поділено на три ділянки (кожна довжиною приблизно 5 мм): зона шва нерва, проксимальний відділ, дистальний відділ. Для світлової мікроскопії ділянки нерва фіксували в 10% нейтральному розчині формаліну протягом 24–48 годин і потім заливали у парафін. Гістологічні зрізи товщиною 15–30 мкм виготовляли за допомогою автоматичного мікротома НМ (CarlZeissJena GmbH, Німеччина), фарбували за Ван-Гізоном, а частину препаратів імпрегнували сріблом (Коломийцев А.К., Чайковский Ю.Б., Терещенко Т.Л., 1981) і фіксували в епоксидних смолах. Мікропрепарати вивчали за допомогою бінокулярного мікроскопа “Zetopa” (Австрія). Для морфометричного дослідження відбирали зрізи, товщина яких після фарбування та фіксації при визначенні найвищої та найнижчої точки зрізу при збільшенні об'єктива мікроскопа Ч100 відрізнялася не більше ніж на 0,2 мкм. Підрахунок середньої щільності розташування нервових волокон в 1 мм2 та середнього кута відхилення аксонів від поздовжньої вісі нерва проводили в чотирьох ділянках площею 65Ч65 мкм2 на кожному з п'яти зрізів.

Біоптати нерва для електронної мікроскопії обробляли за стандартними методиками і вміщували в епоксидні смоли. Ультратонкі зрізи (товщина становила 0,05–0,06 мкм) виготовляли на ультратомі ЛКБ. Для підвищення контрастності зрізи дофарбовували за Рейнтгольдсом і вивчали в електронному мікроскопі ЕМ–400Т “Philips®” (Голандія). Для прицільного ультратомування та поглибленої оцінки змін, що спостерігалися в ушкодженому периферичному нерві, виготовляли напівтонкі зрізи товщиною 0,08–0,1 мкм, які фарбували метиленовим синім і піроніном та вивчали у світловому мікроскопі “Біолам-3” (Росія).

Тестування функції нерва та м'яза виконували за допомогою комп'ютерного аналізатора біопотенціалів “B.A.S.I.S.” (Італія). Дослідження проводили під перитонеальним наркозом сумішшю каліпсолу та реланіуму. Після розрізу шкіри вздовж проекції сідничного нерва на максимальному протязі на оперованій та інтактній кінцівках тупо за допомогою пластмасового та скляного інструментарію розшаровували тканини вздовж нерва. Фізіологічним розчином змивали сліди крові, повністю очищуючи операційне поле. За допомогою кількох лігатур фіксували шкіру та м'які тканини на пластиковому петлеподібному фіксаторі таким чином, щоб утворилася своєрідна “ванночка”, яку наповнювали підігрітим до 37,50С вазеліновим маслом. При таких маніпуляціях тракція, чи будь-яке інше травмування нерва виключалося, нерв знаходився у своєму природному ложі, був захищений від висихання та контакту з оточуючими електропровідними тканинами. Стимулюючий електрод, що складався з двох платинових голок діаметром 0,22 мм з загнутими у вигляді гачка кінчиками, що були зафіксовані в тефлоновій канюлі на відстані 2,5 мм одна від одної, підводили під нерв проксимально по відношенню до лінії шва. Реєструючий електрод, що був змонтований подібно до стимулюючого, підводили під нерв дистальніше лінії шва, при цьому відстань між стимулюючим та реєструючим електродами становила приблизно 20 мм і була однаковою на обох кінцівках. Для реєстрації потенціалу дії (ПД) м'яза використовували концентричний голковий електрод діаметром 0,3 мм, площею відведення 0,015 мм2, який вводили у рухову точку литкового м'яза. Заземлювальний хлор-срібний чашечковий електрод діаметром 8 мм заповнювали струмопровідним гелем і фіксували підшкірно на дорсальній поверхні грудної клітки.

Стимуляцію проводили з катода (в деяких випадках з анода) поодинокими прямокутними імпульсами постійного струму тривалістю 0,05–0,1 мс, частотою 1/с. Інтенсивність стимуляції підбирали індивідуально, виходячи з того рівня, при якому досягали максимальної амплітуди ПД нерва та ПД м'яза. Реєстрацію ПД нерва та м'яза здійснювали на кожний стимул одночасно на двох каналах відведення (перший — для нерва, другий — для м'яза), усереднювали по 4 відповіді. Швидкість розгортання становила 0,01 с на поділку, чутливість підсилювача — від 100 до 2000 мкВ для ПД нерва і від 100 до 10  мкВ для ПД м'яза. Смуга перепускання частот становила від 10 до 10  Гц. Аналіз функції нервово-м'язового апарату лабораторних тварин здійснювали на підставі таких показників: латентний період (ЛП) ПД нерва; амплітуда ПД нерва; ЛП ПД м'яза, (ЛП М–відповіді); амплітуда ПД м'яза (амплітуда М–відповіді). Показники функції оперованого сідничного нерва та литкового м'яза порівнювали з аналогічними показниками на інтактній кінцівці і виражали у %.

Для імунологічних досліджень у тварин в стерильних умовах брали для аналізу кров та селезінку, які у подальшому опрацьовувалися за стандартними методиками. Для оцінки стану імунітету у експериментальних тварин вивчали: функціональну активність лімфоцитів периферичної крові в реакції бласттрансформації лімфоцитів на конканавалін А, декстран, загальний антиген периферичного нерва (АгПН), а також активність супресорів моноцитарного ряду. Функцію нейтрофілів оцінювали по активності внутрішньоклітинної мієлопероксидази, функцію антитілоутворення до нейроспецифічних білків — по рівню антитіл до основного білка мієліну (ОБМ).

Статистичну обробку результатів досліджень виконували за допомогою програми Mathcad .0™ (США) з визначенням середнього значення, середнього квадратичного відхилення, помилки середнього значення, довірчого інтервалу. Оцінка вірогідності отриманих даних та суттєвості відмінностей між різними групами спостережень виконувалася за допомогою критерію Стьюдента та непараметричного критерію відмінностей Уайта (Минцер О.П., Угаров Б.Н., Власов В.В., 1991).

Забій експериментальних тварин виконували, згідно міжнародних нормативів гуманного ставлення до тварин, шляхом передозування тіопенталу-натрію.

Особливості протікання процесів регенерації ушкоджених периферичних нервів

Проведені дослідження показали, що при застосуванні методу ТЕНТ в ушкоджений периферичний нерв при його мікрохірургічній реконструкції відбувається покращення протікання процесів репарації в першу чергу на ранніх найбільш важливих етапах. При цьому схожа картина спостерігалася, як при простому зшиванні нерва, так і при виконанні втручання на тлі попередньо проведенної синсибілізації. Швидше ніж у контрольних групах закінчувалися процеси дегенерації та прибирання мієліну з утворенням широких бюнгнерових тяжів, реакція запалення була виражена менше, що проявлялося меншим набряком сполучної тканини, менш вираженими судинними реакціями (паралітичне розширення судин, стаз формених елементів крові, набряк ендотелію). Також зменшувалася реакція клітин сполучнотканинного оточення в ділянці ушкодження — в меншій кількості виявлялися активні нейтрофіли, макрофаги, лімфоцити та тканинні базофіли. При гістологічному дослідженні відзначалися менші за активністю та поширенністю явища висхідної дегенерації аксонів.

Більшою ефективністю, ніж в контрольних групах, відзначалася регенерація аксонів, яка була досить добре виражена вже на п'яту добу після операції. Діаметр аксонів був збільшений, основна частина з них мала на кінцях колби росту. Кількість лемоцитів у складі згадуваних нервових волокон була більшою, ніж в серіях, де ТЕНТ не виконувалася.

Клітини ЕНТ виявлялися у ділянці нейрального анастомозу до 14 доби після втручання, причому частина новоутворених осьових циліндрів проникала між клітинами нейротрансплантата. Кількість фібрину та нейтрофільних гранулоцитів, макрофагоцитів, лімфоцитів і тканинних базофілів навколо груп клітин ЕНТ була суттєво меншою, ніж в інших ділянках. Щільність розміщення капілярів, у порівнянні з контрольними серіями, у цій ділянці була дещо збільшеною, а розташування судин більш упорядкованим.

Через три місяці після операції в ділянці регенераційної невроми, на відміну від контрольних серій досліджень, рідко зустрічалися зони щільної сполучної тканини, що містять колагенові волокна та невелику кількість клітинних елементів, і у зв'язку з цим васкуляризація ділянки регенераційної невроми, як і в дистальному відділі, також була більш рівномірна, ніж у тих груп тварин, яким ТЕНТ не проводилася, безсудинні та малосудинні зони практично не виявлялися.

Розташування нервових волокон у регенераційній невромі було більш упорядковане, ніж в контролі, більшість аксонів проникала у пучки дистального відрізка, діаметр більшості осьових циліндрів і товщина їх мієлінових оболонок перевищували ці показники в серіях без ТЕНТ.

В цілому за даними морфометричного дослідження в групах, де проводилася ТЕНТ, щільність розташування нервових волокон в дистальній ділянці нерва на 14-ту добу в усіх серіях спостережень була більшою від контрольної приблизно на 10%. На 90-ту добу після втручання в групі з ТЕНТ щільність розташування нервових волокон в дистальній ділянці нерва перевищувала контрольну на 13,7%, а в групах тварин з ТЕНТ, яким перед втручанням проводилася сенсибілізація до антигену периферичного нерва, цей показник був ще кращим і становив 36,2%, зменшення ж кута відхилення аксонів від осі нерва у порівнянні з контрольними тваринами становило в обох серіях приблизно 14% (рис. ).

Рис.1 Щільність розташування аксонів у дистальній ділянці периферичного нерва в різні терміни після оперативного втручання по відношенню до інтактної групи.

Вивчення серії напівтонких зрізів в ділянці шва нерва при ТЕНТ в обох групах показало, що на відміну від контролю спостерігаються в достатній кількості мієлінізовані аксони, котрі у вигляді суцільного пласта без диференціювання на окремі нервові пучки займають все поле зору мікроскопа. Виразність цих процесів в групі тварин з попередньою сенсибілізацією була гіршою.

У дистальній ділянці ушкодженого нерва через 14 діб після мікрохірургічного втручання гістоархітектоніка нервового волокна досить добре відновилася, виявлялися окремі пучки нервових волокон на фоні незначного периневрального набряку, напливів нейроплазми вздовж осьових циліндрів та дистрофічно зміненої фрагментованої мієлінової оболонки. У проксимальному відрізку нервового стовбура дистрофічні зміни аксонів були виражені значно менше, ніж в зоні шва та дистальній ділянці нервового волокна і за своїми морфологічними параметрами наближалися до норми, а в дослідах з імуносенсибілізацією та ТЕНТ — до параметрів контрольної групи.

Проведене електронномікроскопічне дослідження в групі тварин, яким в ушкоджений нерв було виконано ТЕНТ, переконливо показало, що в зоні шва та дистального відрізка нервового волокна, спостерігаються досить суттєві гіперпластичні процеси, які сприяють відновленню структурної цілісності нервових волокон, відбувається нормалізація мікроциркуляторного судинного русла, практично відсутні судини з явищами пристінкового тромбозу, а в більшій частині капілярів спостерігаються явища компенсаторної гіпертрофії ендотеліальних клітин з найбільшою виразністю цього процесу в маргінальній частині ендотеліоцитів при наявності значної мікропіноцитозної активності. Периваскулярний набряк в цій зоні був меншим, ніж в контрольній групі, де зшивання нерва відбувалося без ТЕНТ. В дистальній ділянці та в зоні шва нерва відмічалася гіперплазія і висока проліферативна активність шваннівських клітин, що є важливим показником відновлення ушкодженого нерва. Відростки шваннівських клітин проникали по периневральному простору, оточували окремі нервові волокна, а в цитоплазмі цих відростків спостерігалися внутрішньоклітинні органели та мікропіноцитозні бульбашки. По ходу нервових волокон спостерігалися гіпертрофовані шваннівські клітини з досить великим ядром, що займало більшу частину цитоплазми. В усіх вивчених відділах ушкодженого нерва спостерігалися різного ступеня вираженості регенераційні процеси з боку мієлінової оболонки з формуванням молодих мієлінових волокон, які були найвиразнішими в зоні шва та в дистальному відрізку ушкодженого нерва. Хоча в групі з сенсибілізацією та ТЕНТ показники і були дещо гіршими, вони за своєю картиною мало відрізнялися від групи, яка була контрольною.

Найгірша картина регенерації спостерігалася в групі тварин, яким перед втручанням проводили сенсибілізацію до АгПН, причому в основному це погіршення торкалося реакції елементів сполучної тканини, васкуляризації та процесів мієлінізації аксонів. У регенераційній невромі виявлялася грануляційна тканина, яка містила численні фібробласти, макрофагоцити, лімфоцити, плазмоцити, тканинні базофіли, а також новоутворені капіляри. Осьові циліндри, що регенерують були розташовані у складі невеликих пучків, більша частина волокон проходила косо, упоперек та рекурентно по відношенню до поздовжньої осі нерва. Вздовж мікросудин визначалася досить виражена лімфоїдно-клітинна інфільтрація. У великій кількості зустрічалися фіброцити та фібробласти, які розміщувалися не тільки біля судин, але й вздовж нервових волокон. Нервові волокна мали ознаки демієлінізації, спостерігалися численні напливи нейроплазми, у лемоцитах зменшувалася кількість вільних та фіксованих рибонуклеїнових гранул, що свідчило про понижену білоксинтезувальну функцію цих клітин. Базальна мембрана шваннівських клітин часто мала вогнища розволокнення і фрагментації. Загальна маса мієлінових волокон була дистрофічно зміненою, що проявлялося їх демієлінізацією та частковою фрагментацією, спостерігалося розволокнення мієліну. Відмічалася гетерогенність популяції наявних в периневральному просторі імунокомпетентних клітин. При цьому найчастіше такі клітини контактували за допомогою цитоплазматичних виростів між собою та зі сполучно-клітинними елементами, рідше — з мієліновими волокнами та шваннівськими клітинами. Клітини сполучнотканинного ряду відрізнялися високою функціональною активністю і продукували у міжклітинний простір значну кількість колагенових волокон.

Результати електронейроміографічного тестування функції

нервово–м'язового апарата в дослідних групах

Через 2 тижні після оперативного втручання у тварин контрольної групи відновлення швидкості проведення збудження по нерву становило приблизно 49,2%, за показником ЛП М-відповіді — приблизно 38,2%, амплітуда ПД нерва становила 40,1% від норми (рис.2). В групі тварин, яким виконувалася ТЕНТ ці показники були достовірно кращими — відповідно 61,3%, 51,6% та 52%. Звертає на себе увагу відносно краще, ніж в контрольній групі, відновлення функції рухових волокон.

Рис.2 Показники відновлення функції нервово-м'язового апарату через 14 діб після оперативного втручання

В групі тварин, яким перед оперативним втручанням проводилася сенсибілізація до АгПН, показники регенерації сідничного нерва були найгіршими (особливо це стосувалося рухових волокон). Вони відповідно становили: для швидкості проведення — 36,7% та 26,4%, для амплітуди потенціалу дії нерва — лише 29,9%.

При застосуванні методу ТЕНТ сенсибілізованим тваринам показники відновлення морфофункціонального стану ушкодженого нерва значно покращилися, і хоча за абсолютними числами це відновлення було гіршим, ніж в контрольній групі, але без вірогідної різниці (р ,1). В процентному відношенні швидкість проведення по нерву становила 47,9%, а за показником ЛП М-відповіді — 36,4%, амплітуда ПД нерва становила приблизно 38,9%.

Відновлення функціонального стану м'язів у цей термін дослідження в різних дослідних групах вірогідно не відрізнялося (р ,3) і становило від 19,4% до 21,5%, що можна пояснити більш повільним протіканням дегенеративно-регенеративних процесів в м'язових волокнах після їх денервації, порівняно з відновленням периферичних нервів.

Через 90 діб після проведеного реконструктивного мікрохірургічного втручання основні тенденції щодо відновлення функції нервово-м'язового апарата збереглися (рис.3). При цьому показники в групі тварин, яким проводилася ТЕНТ покращилися в ще більшій мірі — швидкість проведення імпульсу відновилася до 91,1%, а за показником ЛП М-відповіді — до 79,5%, амплітуда ПД нерва становила 86,5% від норми (в контрольній групі ці показники відповідно становили — 77,3%, 62,7% та 72,1%).

Рис.3 Показники відновлення функції нервово-м'язового апарату через 90 діб після оперативного втручання

Стосовно відновлення функціонального стану м'язового апарату, відмічено значне покращення його функцій (більше від теоретично очікуваного) в групі лабораторних тварин, яким проводилася ТЕНТ — 78,5% порівняно з 56,5% у контрольній групі, що не можна пояснити лише кількісно кращим відновленням в цьому випадку морфофункціонального стану периферичного нерва. Вірогідно, також мало місце краще відновлення трофічних функцій ушкодженого нерва.

Відновлення функцій нервово-м'язового апарату в групі тварин сенсибілізованих АгПН було незадовільним. За даними електрофізіологічного тестування усі показники були помітно гіршими (швидкість проведення по нерву відновилася лише до 52,6%, а за показником ЛП М-відповіді — всього до 39,1%, потенціал дії нерва склав тільки 44,4%), відновлення М-відповіді становило в цій групі 38,3%.

Однак, у тому випадку, коли сенсибілізованим тваринам під час мікрохірургічного зшивання нерва виконували трансплантацію фрагментів ембріонального спинного мозку деякі з отриманих результатів наближалися до контрольної серії (без вірогідної різниці) — швидкість проведення по нерву становила 76%, амплітуда ПД нерва – 69,9%, а показники відновлення функції рухових волокон та м'яза були навіть кращими (з вірогідністю р ,1), ніж у контролі, і становили відповідно 65,3% та 59,8%.

Таким чином при проведенні електрофізіологічного дослідження було достовірно відзначено збільшення швидкості та якості регенерації ушкоджених нервів при виконанні під час хірургічного втручання ТЕНТ. Так, амплітуда ПД нерва через 90 діб після операції була вищою у порівнянні з контрольною серією в середньому на 16,7%, а швидкість розповсюдження імпульсу по нерву на 15,4%, а по руховим волокнам майже на 20%. Що стосується груп тварин, яким перед ушкодженням нерва та хірургічним втручанням з використанням ТЕНТ була проведена сенсибілізація до АгПН, то ця різниця була особливо значною: ПД нерва був більшим приблизно на 36,5%, швидкість проведення по нерву на 40%, а по руховим волокнам на 41,5% у порівнянні з серією, де ТЕНТ не виконувалася. Таке більш швидке та повне відновлення морфофункціонального стану нерва призвело і до кращого відновлення м'язової функції: при трансплантації амплітуда М-відповіді була більшою від контрольних показників в середньому на 28%, а при трансплантації на фоні сенсибілізації у порівнянні з такими ж сенсибілізованими тваринами — приблизно на 36%.

Особливості розвитку імунних реакцій у експериментальних тварин при моделюванні порушеної цілісності сідничного нерва та його мікрохірургічного відновлення

Як показали імунологічні дослідження, ушкодження периферичного нерва та подальше хірургічне втручання з метою відновлення його цілісності викликає зміни в функціонуванні імунної системи, на фоні яких розвиваються нейроаутоімунні реакції клітинного та гуморального типу до білків периферичної нервової системи. Цілком вірогідно, що ці процеси приймають участь у репаративному гістогенезі ПНС, на що вказують вкрай незадовільні наслідки відновлення функції нервово-м'язового апарату у тварин, яким напередодні операції проводили сенсибілізацію до АгПН.

ТЕНТ з метою покращення регенерації периферичних нервів викликає досить стійке та тривале пригнічення функції Т- і В- лімфоцитів, нейтрофілів, порушення активності супресорів моноцитарно-макрофагального ряду, що, на нашу думку, є одним з механізмів зменшення реакції сполучнотканинного оточення та утворення грубого сполучнотканинного рубця в зоні шва нерва. Крім того, важливим є той факт, що ТЕНТ “на периферію” не тільки не призвела до розвитку аутоімунних реакцій, а навіть блокувала їх розвиток у тому числі й на фоні попередньо викликаної нейросенсибілізації (рис.4).

Рис.4 Зміни в імунному статусі прооперованих тварин через 14 діб після втручання по відношенню до інтактної групи.

В контрольній групі тварин на п'яту добу була достовірно пригнічена функціональна активність Т-лімфоцитів і підвищена активність супресорів моноцитарного ряду. До чотирнадцятої доби дослідження їх функція відновилася до нормальних значень. Функція В-лімфоцитів була достовірно пригнічена на п'яту добу після операції, спостерігалася клітинна сенсибілізація до АгПН та зростав рівень антитіл до ОБМ. На чотирнадцяту добу функція В-клітин все ще була зниженою, в той же час спостерігалося підсилення нейроімунних реакцій: клітинної сенсибілізації та рівня антитіл до ОБМ. В ранні терміни спостереження активність нейтрофілів майже не змінювалася, хоча чітко простежувалося пригнічення їх функції в присутності АгПН. Через два тижні після оперативного втручання активність нейтрофілів була значно пригніченою.

В групі тварин, яким під час реконструктивного хірургічного втручання виконували ТЕНТ функція Т-клітин не досить суттєво пригнічувалася лише на чотирнадцяту добу, при цьому порушувалася функція простагландинсинтезуючих супресорів. Пригнічення функції В- клітин, як і Т- лімфоцитів зростало до чотирнадцятої доби. Сенсибілізація до АгПН не була виявлена на п'яту добу та дорівнювала значенням інтактної групи через чотирнадцять діб після оперативного втручання. Рівень антитіл до ОБМ в усі терміни спостережень не перевищував цього показника в групі інтактних тварин. Пригнічення функції нейтрофілів зберігалося на протязі чотирнадцяти діб після операції, при цьому реакція нейтрофілів на АгПН була відсутня.

В групі тварин, яким оперативне втручання було виконане на тлі нейросенсибілізації до АгПН, на п'яту добу функція Т-клітин була посилена майже вдвічі, у порівнянні з групою інтактних тварин, і збільшилася на чотирнадцяту добу після операції. При цьому порушувалася функція супресорів моноцитарного ряду, хоча відносно в меншій мірі, і якщо на п'яту добу вона й була дещо підвищена, то на чотирнадцяту добу спостерігалося відносно значне зниження функції супресорів, що можливо являється свідченням зриву компенсаторних імунних механізмів. Також спостерігалося значне пригнічення функції В-лімфоцитів, яке також значно наросло у більш пізні терміни обстеження. Сенсибілізація до АгПН, як і очікувалося, була високою. Причому ці високі показники утримувалися на протязі всього терміну досліджень. Також на високому рівні знаходилися показники титру антитіл до ОБМ. Спостерігалася висока функціональна активність нейтрофілів, особливо через два тижні після хірургічного втручання, яка ще більше посилювалася в присутності АгПН.

У тих випадках, коли тваринам з попередньо проведеною сенсибілізацією під час операції виконували ТЕНТ, вже з п'ятої доби після втручання активність Т-лімфоцитів була дещо меншою, і на чотирнадцяту добу вона вірогідно не відрізнялася (р ,1) від показників інтактної та контрольної груп. Такий же приблизно характер змін мав місце і при дослідженні функції супресорів. Пригнічення функції В-лімфоцитів суттєво не змінювалося і на чотирнадцяту добу після операції не відрізнялося від групи тварин, яким виконували ТЕНТ без попередньої сенсибілізації. Показники клітинної нейросенсибілізації та рівня антитіл до ОБМ хоча й були підвищеними, але цей рівень був навіть меншим, ніж у контрольній групі, що було особливо помітно через два тижні після оперативного втручання. Що стосується функції нейтрофілів, то вона знаходилася на рівні показників інтактної групи, при цьому посилення активності в присутності АгПН практично не відбувалося.

Висновки

1. У дисертації наведене нове вирішення наукової задачі підвищення ефективності хірургічного лікування травматичних ушкоджень периферичних нервів шляхом використання алогенної трансплантації ембріональної нервової тканини; в умовах експерименту визначені основні механізми впливу нейротрансплантації на репаративний гістогенез периферичних нервів та організм реципієнта; обґрунтовані показання до застосування цього методу в нейрохірургічній практиці.

2. Розроблена експериментальна модель трансплантації ембріональної нервової тканини в ушкоджений сідничний нерв тварин при виконанні реконструктивних мікрохірургічних втручань дозволила вивчити вплив методу нейротрансплантації на репаративний гістогенез периферичного нерва і відновлення функції нервово-м'язового апарату, в тому числі при моделюванні нейросенсибілізації до антигенів периферичного нерва.

3. Комплекс досліджень, що був використаний для реєстрації впливу нейротрансплантації на репаративний гістогенез периферичних нервів в експерименті і включав комп'ютерну електронейроміографію, світлову та електронну мікроскопію, морфометричні та імунологічні дослідження дозволив отримати основні показники, що об'єктивно відображують процеси регенерації в периферичній нервовій системі, була виявлена достовірна кореляція між морфометричними та електрофізіологічними показниками регенерації периферичного нерва.

4. В експерименті встановлено, що трансплантація ембріональної нервової тканини спинного мозку в ділянку шва нерва покращує регенерацію ушкоджених периферичних нервів за електронейроміографічними показниками приблизно на 16%, а у випадку попередньої нейросенсибілізації — до 37%, причому відносно краще відновлюються рухові функції.

5. Позитивний вплив трансплантації ембріональної нервової тканини спинного мозку на репаративний гістогенез ушкоджених периферичних нервів проявляється в прискоренні росту аксонів, що проростають через ділянку регенераційної невроми та збільшенні їх кількості (щільності розташування); прискоренні процесів валлерової дегенерації та прибирання мієліну, зменшенні проявів ретроградної дегенерації нервового стовбура; підвищенні проліферативної активності шваннівських клітин, покращенні та прискоренні мієлінізації нервових волокон в процесі їх регенерації; покращенні мікроциркуляторного судинного русла та пригніченні явищ запалення в зоні ушкодження нерва, що сприяє утворенню менш щільного сполучнотканинного рубця.

6. Ушкодження периферичного нерва та подальше хірургічне втручання з метою відновлення його цілісності викликає зміни у функціонуванні імунної системи, на фоні яких розвиваються нейроаутоімунні реакції клітинного та гуморального типу до білків периферичної нервової системи. Між виразністю проявів процесів нейросенсибілізації до антигенів периферичного нерва та якістю регенерації ушкодженого периферичного нерва існує зворотна залежність — чим вище рівень сенсибілізації, тим гірше та повільніше протікає процес відновлення морфофункціонального стану нервово-м'язового апарату і навпаки.

7. Трансплантація ембріональної нервової тканини з метою покращення регенерації периферичних нервів викликає досить стійке та тривале пригнічення функції Т- і В- лімфоцитів, нейтрофілів, порушення активності супресорів моноцитарно-макрофагальної ланки, що є одним з механізмів зменшення реакції сполучнотканинного оточення. Трансплантації ембріональної нервової тканини при реконструктивних операціях на периферичних нервах не призводить до розвитку аутоімунних реакцій і навіть здатна блокувати їх розвиток на тлі попередньо викликаної нейросенсибілізації.

8. Враховуючи позитивний стимулюючий вплив на регенерацію периферичних нервів, особливості імунологічних змін, найбільш доцільним є використання методу трансплантації ембріональної нервової тканини у віддаленому періоді після травми та при повторних оперативних втручаннях на периферичних нервах, у випадку вираженої нейросенсибілізації до антигенів периферичного нерва, при виконанні аутопластики, при високих рівнях ушкодження периферичних нервів.

список опублікованих праць за темою дисертації

1. Цимбалюк В.І., Сулій М.М., Лузан Б.М., Носов А.Т., Чеботарьова Л.Л., Атанасов О.М. Експериментальне обґрунтування застосування трансплантації ембріональної нервової тканини при пошкодженнях периферичних нервівВісник наукових досліджень. — 1997. — №4-5. — С.40–47.

2. Цимбалюк В.І., Сулій М.М., Лузан Б.М., Носов А.Т., Чеботарьова Л.Л., Атанасов О.М., Сапон М.А. Вплив трансплантації ембріональної нервової тканини на регенерацію периферичних нервівБюлетень УАН. — 1998. — №7 — С.17–21.

3. Цимбалюк В.І., Сулій М.М., Лузан Б.М. Вивчення впливу трансплантації ембріональної нервової тканини на регенерацію ушкоджених периферичних нервівТрансплантологія. — 2000. — Т.1. — № . — С.268–269.

4. Цимбалюк В.І., Сулій М.М., Лузан Б.М., Сапон М.А. Стан та перспективи нейрохірургічної допомоги при травматичних ушкодженнях периферичної нервової системиУкр. мед. альманах. — 1999. — Т.2. — №3(додаток). — С.141-145.

5. Цимбалюк В.І., Сулій М.М., Лузан Б.М., Сапон М.А. Сучасний підхід до хірургічного лікування ушкоджень плечового сплетення Укр. мед. альманах. — 1999. — Т.2. — №3(додаток). — С.137-140.

6. Цымбалюк В.И., Сулий Н.Н., Лузан Б.Н.