Реферат на тему:

„Гель-електрофорез”

Гель-електрофорез.

Найкращий ефект розділення органічних макромолекул досягають за допомогою гель-електрофорезу. В якості носія використовують гелі з крохмалу, агарози, поліакриламіду та агарози - акриламіду. Високу роздільну здатність гель-носіїв пояснюють ефектом «молекулярного сита». Це пов’язано з пониженою дифузією частинок зразку в сітці гелю і розподільчою дією гель-проникаючої хроматографії. Структурно гелі складаються з хаотично переплетиних полімерних ланцюгів, які утворують ситоподібну структуру по всьому об'єму геля. Принцип дії молекулярного сита полягає в тому, що великі молекули будуть рухаються тим повільніше, чим менші пори в структурі гелю, розміри яких визначаються числом поперечних зшивок між полімерними ланцюгами.

Найбільш ефективними гель-носієми вважають поліариламідні гелі, які поєднують в собі рад властивостей:

1. Розмір пор може коливатись в широких межах.

2. Гелі можна формувати в каліброваних контейнерах (трубках і пластинах).

3. Вони характеризуються дуже низьким рівнем адсорбції і електроосмосу.

4. Їх можна застосовувати з різними буферами.

5. Процес розділення проходить дуже швидко.

6. Розділені речовини можна визначати за допомогою денсітометра. Поліакриламідні гелі отримують при співполімеризації акриламіду і метилен акриламіду в присутності системи вільнорадикальних каталізаторів. Мономери розчиняють в буфері, додають каталізатор і приготовлену суміш заливають у відповідні контейнері, в яких будуть проводити електрофорез. Процес полімеризації ( утворення гелю ) при необхідності прискорюють, опромінюючи контейнери ультрафіолетом. Змінюючи в буфері концентрацію акриламіду від 3 до 30% можна отримувати гелі з діаметром пор від 0,2 до 0,5 нм і таким чином регулювати ефект молекулярного сита.

Електрофорез в поліакриламідному гелі проводять або в колонках ( Мал.2.5.5. ) або на пластинах гелю (Мал.2.5.6). Колонку з полімеризованим гелем підєднюють до камер, які

Мал. 2.5.5

А В

Прилад для гель-електрофорезу на пластинах.

А -вид зпереду; В - вид збоку; 1 - пластина з гелем;

2 - буферні камери; 3 - зразок; 4 - електроди.

Мал..2.5.6.

заповнюють відповідним буфером. Суспензію зразку в насиченому розчині сахарози за допомогою мікропіпетки наносять на поверхню гелю і подають напругу. Після закінчення електрофорезу стовпчики гелю дістають із колонок і зафарбовують відповідним барвником для виявлення зон ( плям ) розділених компонентів зразку ( Мал.2.5.7). Для кількісного аналізу речовин зразку використовують в основному два методичні підходи.

Мал.2.5.7.

В першому випадку, вирізають відповідні ділянки гелю і екстрагують з нього речовини відповідним розчинником, після чого визначають їх кількість спектрофотометрично, флюориметрично або іншими інструментальними методами.В другому випадку, стобчики носія сканують денсітометром. Цей прилад вимірює інтенсивність світла, яке проходить через стовпчик носія при переміщенні його перпендикулярно до світлового пучка. Кількість світла, що пройшло через гелеподібне середовище, регіструється датчиком денсітометра. Причому, чим більша концентрація зафарбованої речовини, тим менше світла попадає на дитектор денсітометра. Якщо сигнал з денситометра посилати на самопишучий пристрій (або цифровий комп'ютерний аналізатор), то можна отримати серію піків ( денсітограму ), які будуть характеризувати місце розположення зон на стовбчику та кількість речовини в них.

Спеціальні електрофоретичні методи.

Диск-електрофорез.

Диск-електрофорез є видозміненим гель-електрофорезом на вертикальних колонках в поліакриламіді. Цей метод електрофорезу був розроблений для високоякісного розділення фракцій білкових препаратів. Особливість методу полягає в тому що:

1. В електрофоретичній колонці використовують гелі з різним розміром пор. Верхній шар гелю, який займає третину колонки, є крупно пористим і його називають концентраційним гелем. В нижній частині колонки формують дрібно пористий гель, який власне є робочим гелем. Такий градієнт розмірів пор дає можливість ефективно використовувати в процесі розділення явища молекулярного сита.

2. Для диск-електрофорезу підбирають такі буферні системи, які іонізуючи білкові молекули перетворюють їх в аніони. Тому для подачі напруги у верхній буферній камері розміщують катод, а в нижній - анод (Мал.2.5.8.). Електрофорез проводять при постійній величині електричного струму в межах 10 мА.

3. У верхній та ніжній буферних камерах використовують буферні системи з різним значенням рН. В нижній буферній камері величина рН на 2-3 одиниці вища ніж у верхній. Це приводить до виникнення градієнту рН вздовж електрофоретичної колонки і супроводжується різним ступенем іонізації білкових молекул в концентраційному та робочому гелі.

Електрофоретичну колонку, заповнену робочим і концентраційним гелями, поміщають в нижню камеру з буферною системою тріс-гліцину. На поверхню геля наносять мікропіпеткою зразок і наповняють буферною системою тріс-НСІ верхню камеру. Прилад закривають кришкою і подають напругу на електроди.