РЕФЕРАТ

на тему:

„Електронна мікроскопія ”

ЕЛЕКТРОННА МІКРОСКОПІЯ

Електронна мікроскопія – метод морфологічного дослідження об'єктів за допомогою потоку електронів, що дозволяють вивчити структуру цих об'єктів на макромолекулярному і субклітинному рівнях.

Після випуску першої промислової моделі електронного мікроскопа, що просвічує (трансмісійного), ЕМ пройшла великий шлях розвитку і дозволила перейти на якісно новий рівень вивчення матерії. ЕМ знайшла широке застосування в морфології, мікробіології, вірусології, біохімії, онкології, медичній генетиці, імунології. Завдяки ЕМ розкрита субмікроскопічна структура кліток, відкритий ряд невідомих раніше клітинних органелл, таких як лізосоми, рібосоми, ендоплазматічеській ретікулум, мікротрубочки, цитоськелет, структури, специфічні для окремих видів кліток. ЕМ дозволила зрозуміти багато тонких механізмів розвитку хвороб, зокрема на ранніх етапах їх виникнення, ще до появи чіткої клінічної симптоматики.

ЕМ все ширше застосовується для ранньої діагностики захворювань, а також для виявлення етіології інформаційних процесів. Її використовують в онкології для визначення гистогенеза пухлин, що має важливе значення в лікуванні і прогнозі онкологічного захворювання. У нефрології дослідження за допомогою ЕМ матеріалу, одержаного при пункционной біопсії, дозволяє виявити раніше морфологічні зміни структур пачок, діагностувати форму гломерулонефріта і т.п. При ЕМ пунктатов печінці вдається провести диференціальну діагностику гепатитів, гепатозов і інших захворювань печінки, визначити активність процесу і нерідко його етіологію.

Дослідження будови матерії на субклітинному і макромолекулярному рівнях стримуються можливостями роздільної здатності електронних мікроскопів. Використовування ЕМ в поєднанні з іншими методами, наприклад, з авторадіографією, гістохімічними, імунологічними, зумовило появу електронної авторадіографії, електронної гистохимії, імунної електронної мікроскопії (електронної іммуноморфологиі) і інших. Це дозволило значно розширити інформацію, одержувану за допомогою ЕМ, спостерігати структурний вираз перебігу біохімічних процесів в клітці, що, у свою чергу, підтвердило один з основних методологічних принципів сучасної біології – діалектична єдність структури і функції.

ЕМ вимагає спеціальної підготовки об'єктів вивчення, від якої значною мірою залежать можливості методу. Відповідно до цілей дослідження методика такої підготовки може бути різною. Проте неодмінною умовою для будь-яких електронно-мікроскопічних досліджень є фіксація тканин або мікробів з максимальним збереженням їх прижиттєвої будови. Існують два принципово різних способу фіксації: хімічний і фізичний, кожний з яких має різні варіанти.

У ЕМ, як правило, використовують хімічну фіксацію за допомогою фіксаторів, що володіють стабілізуючими властивостями. Універсального для будь-яких тканин фіксатора не існує, тому залежно від задачі конкретного дослідження застосовують відповідні фіксатори. При виборі хімічних фіксаторів виходять з їх здатності коагулювати білки (спирти, ацетон, деякі кислоти, солі важких металів і ін.) або стабілізувати ліпіди і гелі (чотириокис осмію, глутаровий альдегід, формалін, двухромовоксильний калій і ін.).

Для дослідження беруть біопсийний матеріал або матеріал від трупа людини або тварин незабаром після настання смерті. Існують оптимальні терміни узяття різних тканин і кліток, звичайно обчислювані хвилинами. Чим раніше тканині перешкодять у фіксатор, тим більше достовірні дані одержують про прижиттєву структуру кліток. Фіксатори володіють різною швидкістю проникнення в тканину: від цього залежить можлива величина об'єкту дослідження. Так, чотириокис осмію і глутаровий альдегід проникають в тканину на 0,1-0,5 мм приблизно за 1 - 1,5 години, але для деяких тканин воно може бути збільшене до 4 годин або до 20-30 мін. В окремих випадках допускається протягом одних діб. Найбільше поширення набула фіксація матеріалу в глутаровом альдегіді з подальшою дофіксацией в чотириокисі осмію. Глутаровий альдегід кращий, ніж чотириокис осмію фіксує білки, але гірше стабілізує ліпіди, що і обуславліваєт використовування обох фіксаторів як доповнюючих один одного.

Для виборчої фіксації окремих субклітинних структур використовують більш специфічні фіксатори (перманганат калія, двухромовокислий калій і ін.). Якість фіксації в значній мірі залежить від рН і осмотичного тиску фіксуючого розчину. Оптимальним є рН 7,2-7,4, що відповідає фізіологічним параметрам. Тому застосовують буферні розчини. Частіше застосовують фосфатні або какоділатний буфери. Фізіологічний осмотичний тиск створюють шляхом додавання осмотічеські активних речовин, наприклад сахарози або деяких солей.

Є декілька методів хімічної фіксації: перфузіонний, коли фіксатор вводять в потік крові, фіксація на місці, коли фіксатор вводять в тканину до її посічення, метод занурення посічених шматочків тканини у фіксатор. Для уповільнення аутолітічеськіх процесів, що протікають в посічених шматочків тканини до повної їх фіксації, останню проводять при температурі 2-5 градусів.

Після фіксації необхідно здійснити обезводнення тканини. Цей процес повинен бути відносно швидким, поступовим і разом з тим забезпечити максимально повне видалення води із зразка, що досягається проведенням належної дослідженню тканини через батарею спиртів або ацетонів висхідної концентрації (від 30 до 100%) протягом однієї години.

Наступним важливим етапом підготовки матеріалу для ЕМ є заливка (висновок) тканин в заливальні середовища з метою отримання блоку, що володіє оптимальним поєднанням твердості і еластичності, дозволяючим приготувати тонкий зріз тканини (товщиною не менше 100 нм), через який може пройти електронний промінь. Першими заливальними матеріалами були метілметакрілат і бутілметакрілат. В даний час вони майже не застосовуються, оскільки токсичні і легко переганяються під пучком електронів, що приводить до виражених артефактів і забруднення електронного мікроскопа. Найбільш ширше для заливки тканин використовують епоксидні смоли, в основному аралдіт і епон, часто вживані сумісно. Менш поширені поліефірниє смоли (вестопал), водорозчинні заливальні суміші, з яких частіше користуються глікольметакрілатом і дуркупаном. Проте, не одне заливальне середовище не є хімічно інертним і якоюсь мірою робить вплив на тканину: це необхідне враховувати при інтерпретації результатів мікрокопіювання.

Останніми роками широке застосування знайшла заливка в так звані компаунди, тобто в суміш певних речовин: основу (мономера), отвердітеля, додаючого полімеру,