що утворюється, міцність і твердість, пластіфікатора, забезпечуючого еластичність і пружність полімеру, ініціатора, діссациірующего з утворенням вільних радикалів, прискорювача, який, взаємодіючи з мономером, звільняє активних додаткових радикалів, і каталізатора, сприяючого початку реакції полімеризації. У практиці звичайно використовують компаунд, що складається з основи, отвердітеля, пластіфікатора і каталізатора, роль якого може виконувати прискорювач або ініціатор. Є достатньо велика кількість способів просочення тканини заливальними засобами. Процес просочення звичайно протікає при кімнатній температурі або в термостаті при температурі 30? протягом 48 годин. Потім шматочки тканини переносять в маркіровані желатинові капсули або спеціальні форми, наповнені заливальною сумішшю. Для полімеризації суміші капсули на 48 годин поміщають в термостат при температурі 60?. В результаті полімеризації утворюється блок, що володіє відповідними властивостями.
Для отримання ультратонких зрізів завтовшки 30-50 нм використовуються скляні або алмазні ножі. Алмазні ножі довговічніші скляних, але через високу вартість вони не набули широкого поширення.
До задньої сторони ножа прикріплюють спеціальну ванну і встановлюють на ультратом, у ванну наливають 10% розчин етилового спирту і 10% розчин ацетону на дистилюючій воді. У рухомому утримувачі ультратома закріплюють блок з тканиною. Різання блоку здійснюється за рахунок поступальної ходи стрижня утримувача, а під'їм і опускання утримувача щодо ріжучої кромки ножа забезпечуються електронною схемою. Звичайно на початку виготовляють так звані тонкі зрізи завтовшки 1 мкм, вивчаючи які, вибирають ділянку, що цікавить дослідника. Сорієнтіруя відповідним чином напівтонкий зріз і блок, проводять заточування блоку з таким розрахунком, щоб на вершині що утворився піраміди знаходилася необхідна ділянка. Потім виготовляють ультратонкие зрізи завтовшки 30-50 нм. З ванни зрізи переносять на металеві сітки.
Для констатації зрізів застосовують речовини з великою атомною вагою, такі як солі важких металів, природно розсіюючі електрони. Іони деяких з цих речовин можуть утворювати зв'язки з киснем і приєднаються до фосфатних груп нуклеїнових кислот. Інші, особливе уранілацетат, крім цього, діють як універсальні фарбники. Свинець зв'язується з комплексами тканини і осмієвими чинниками. Звичайно проводять контрастування ультратонких зрізів або поєднують контрастування шматочків і ультратонких зрізів тканини, після чого вивчають в електронному мікроскопі.
Хімічні методи фіксації і заливки матеріалу мають ряд недоліків. Так, при їх використовуванні відбуваються хімічні зміни макромолекулярної структури кліток: при фіксації і обезводненні кліток і тканини втрачають деякі речовини: при взаємодії тканини, фіксатора і заливального середовища може мінятися локалізація внутріклітинних структур. Тому інтенсивно розробляються фізичні методи приготування тканини для ЕМ і особливе гистохимії і цитохімії. Велика частина цих методів заснована на дуже швидкому заморожуванні шматочків тканини.
При використовуванні методу заморожування-висушування шматочки тканини поміщають в хладагенти (пропан, ізопентан або фреон), охолоджені до -150?, і в клітках миттєво припиняються обмінні процеси. При цьому в тканині не встигають утворюватися кристали льоду, і тому субклітинні структури не руйнуються, а вода переходить в склоподібний стан. Потім у високому вакуумі (10-6 –10-7 мм рт.ст.) відбувається сублімація, після чого в тканині спеціальним чином заливають заморожені метакрілати, аралдіт або вестопал В. Проте, не завжди вдається достатньо швидко рівномірно заморозити тканину, а, отже, повністю уникнути утворення кристалів льоду, які при підвищення температури ушкоджують внутріклітинні структури. Виникають і інші труднощі, що приводять до появи артефактів. Тому, частіше застосовують різновид цього методу: заморожування-заміщення. Після заморожування воду, що перейшла в склоподібний стан, видаляють, поміщаючи тканину в зневоднюючі речовини при низькій температурі. У цих умовах спирт і ацетон мало впливають на структуру кліток. Метод кріоськаливанія (заморожування-труїть) дозволяє уникнути виникнення хімічної реакції при обробці тканин. Фрагменти тканин заморожують в хладагенте із швидкістю перевищуючої 1000? у 1 з. Об'єкт поміщають у вакуумну камеру і тим або іншим способом розколюють або розривають. На поверхні ськола наносять платіноуглеродноє покриття (репліку). Потім репліку очищають від органічних залишків в розчині сильного окислювача, промивають у воді і поміщають на сіточку для електронної мікроскопії.
Для досліджень поверхні біологічних тканин використовують і метод відтіняє. Найбільше поширення набув метод приготування реплік шляхом напилення у вакуумній камері вуглецю на поверхню зразка тканин. Для контрастування репліки, що утворилася, на неї під гострим кутом напилюють електронно-щільні речовини (платину або платіноїрідієвий сплав). При цьому кількість атомів металу значно більше, на тій стороні контурів зразка, яка ближча до джерела напилення: при дослідженні в електронному мікроскопі вона виглядає неконтрастною. Протилежна поверхня контура має мало атомів металу: у електронному мікроскопі вона контрастна і як би відтіняє неконтрастну поверхню контура. Метод віддзеркалення дозволяє розрахувати висоту контурів досліджуваного об'єкту, оскільки відомий кут напилення, довжина тіні і збільшення, при якому вироблялося фотографування репліки в електронному мікроскопі.
Для вивчення поверхні ізольованих кліток і тканин служить скануюча (растрова) ЕМ. Однією з основних умовою приготування об'єкту для скануючої ЕМ є необхідність збереження відповідного поверхневого натягнення кліток щоб уникнути їх деформації. Поверхню тканини, що вивчається, промивають збалансованими ізотонічними забуференнимі сольовими розчинами або безбілковими культуральними середовищами з рН 7,3-7,4, підігрітими до температури 37?. Для фіксації звичайно застосовують ізотонічний розчин глутаровоальдегида з подальшим дофіксацией чотириокисом осмію. Тканину зневоднюють в спиртах або ацетонах, а потім висушують методами заморожування-висушування або переходу критичної крапки. Останній заснований на використовуванні такого фізичного явища як виникнення за певних умов критичного стану рівноваги пари і рідини. При цьому методі тканина опиняється в газовому середовищі (тобто висушеної), що дозволяє уникнути ушкоджувальної дії поверхневого натягнення. Для досягнення високих ступенів дозволи підвищують електропровідність об'єкту, напилюючи на нього важкі метали: золото,