УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН

БОЙКО МАРІЯ МИКОЛАЇВНА

УДК: 612.015.33:612.015.22:612.262] - 084

ПЕРЕТВОРЕННЯ ОКСИДУ АЗОТУ В ТКАНИНАХ ЩУРІВ

ЗА УМОВ ГІПОКСІЇ ТА ДІЇ ДИПЕПТИДУ КАРНОЗИНУ

03.00.04 – біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біохімії

Львівського національного університету імені Івана Франка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Великий Микола Миколайович,

Національний медичний університет

імені О.О. Богомольця Міністерства охорони здоров’я

України, професор кафедри біоорганічної, біологічної

та фармацевтичної хімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Калачнюк Григорій Іванович,

директор НДІ біотехнологічних основ

підвищення продуктивності тварин

Львівської державної академії

ветеринарної медицини імені С.З. Гжицького,

професор кафедри органічної і неорганічної хімії

кандидат біологічних наук

Федорович Дарія Василівна,

старший науковий співробітник відділу біохімічної генетики та біотехнології Інституту біології клітини НАН України

Провідна установа: Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, м. Київ

Захист відбудеться " 12 " грудня 2002 р. о 10 годині на з асіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин УААН: вул. Стуса, 38, м. Львів, 79034).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту біології тварин УААН за адресою: 79034, м.Львів, вул. Стуса, 38.

Автореферат розісланий " 11 " листопада 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради О. І. Віщур

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Більшість патологічних процесів у ссавців супроводжується гіпоксичним стресом. У його розвитку і перебігу виділяють оксидаційну й нітрозативну ланки. Нітрозативний стрес характеризується посиленою продукцією та пошкоджуючою дією оксиду азоту (II) (NO) і його вільнорадикальних похідних (Patel R. P., 1999; Abuja P. M., Albеrtini R., 2001). Головним шляхом синтезу NO у різних тканинах ссавців є ензиматичний за участю NO-синтаз (Горрен А. К. Ф., 1998; Меньщикова Е. Б., 2000) з використанням таких субстратів, як аргінін, креатин, карнозин, брадікінін (Palmer R. M., 1988; Дмитренко Н. П., 2001; Alaghband-Zaden J., 2001). Альтернативними способами утворення NO in vivo є відновлення нітрат/нітрит-аніонів до NO гемовмісними та Mo6+-умісними білками за гіпоксії (Реутов В. П., 1995; Nakamura M., 1996), біотрансформація нітриту до NO за умов тканинного ацидозу, реакція між аргініном та пероксидом водню (Проскуряков С. Я., 1999). Ці механізми об’єднані у метаболічний цикл NO (Реутов В. П., 1995). Залежно від умов утворення оксид азоту та його вільнорадикальні похідні виявляють регуляторні або цитотоксичні ефекти (Gryglevski R. J., 1986; Башкатова В. Г., 1998). Цитотоксична дія цих речовин полягає в інгібуванні активності окремих ензимів, зокрема внаслідок нітрозування функціональних груп у білках (Gryglevski R. J., 1986), пошкодженні компонентів дихального ланцюга, розщепленні ДНК, РНК, пошкодженні ліпідів (Arteel G. E., 1999). Тому актуальна є проблема пошуку речовин з активністю антиоксидантів, здатних запобігати метаболічним порушенням в організмі ссавців за умов гіпоксії.

Відомо, що дипептид карнозин (-аланіл-L-гістидин) і його гістидиновмісні аналоги мають властивості антиоксидантів (Владимиров Ю. А., 1998). Біологічна активність цих речовин зумовлена здатністю хелатувати йони зі змінною валентністю (Тромбли П. К., 2000), а також взаємодіяти з О2- за наявності йонів Cu2+ та Zn2+ (Гуляева Н. В., 1987; Lee J. W., 1999), гідроксильним радикалом (Kohen R., 1988), запобігати утворенню гіпохлорит-аніону за умов ішемії (Болдырев A. A., 1995). Тому карнозин може мати важливе значення у функціонуванні чутливих до гіпоксії тканин, які використовують вільнорадикальні сполуки як клітинні регулятори. Наприклад, у головному мозку пара вільних радикалів NO /О2- бере участь у регуляції мозкового кровообігу (Мжельская Т. И., 1998). Найвищу концентрацію карнозину у ссавців виявлено у мозочку та нюхових цибулинах (Margolis F. L., 1974). У цих відділах мозку також зафіксовано високий уміст NO-синтаз (Bredt D. S., Snyder S. H., 1994). Незважаючи на велику кількість публікацій, присвячених дослідженню карнозину, його значення у функціонуванні тканини головного мозку остаточно не з’ясоване, а ефекти дипептиду у процесі синтезу NO є досить суперечливими (Уразаев А. Х., 1999; Северина И. С., 2000; Alaghband-Zaden J., 2001). Дисертаційна робота присвячена дослідженню метаболічних взаємозв’язків між дипептидом карнозином і системами перетворення NO у нюхових цибулинах головного мозку та периферичній крові щурів за гіпоксії.

Мета i завдання дослідження. Метою роботи було обґрунтувати й експериментально підтвердити участь карнозину та Zn2+-карнозину у функціонуванні циклу оксиду азоту, зокрема у процесах перетворення NO за нітритредуктазним механізмом, який реалізується дезоксигемоглобіном (RHb). Для досягнення поставленої мети вирішували такі завдання:

·

·

·

·

·

·

Об’єкт дослідження – нітрозативний стрес за умов гіпоксії та дії гістидиновмісних дипептидів. Предмет дослідження – продукти анаеробного гліколізу та пов’язані з ними вільні амінокислоти, NO2-- та NO3--аніони як продукти перетворення NO; RHb як джерело синтезу NO за нітритредуктазним механізмом при гіпоксії.

Методи досліджень. Кількісна оцінка біохімічних показників оксидаційного та нітрозативного стресу in vivo та in vitro із застосуванням методів електронної спектрометрії, колориметрії, хроматографічного аналізу, біотестування для оцінки ефективності застосування карнозину і Zn2+-карнозину за умов гіпобаричної гіпоксії.

Наукова новизна отриманих результатiв. Уперше досліджено вплив карнозину і його похідного – Zn2+-карнозину – на перебіг нітрозативного стресу у нюхових цибулинах та крові щурів на моделі гіпобаричної гіпоксії. Встановлено, що карнозин та Zn2+-карнозин знижують вміст аніонів NO2-і NO3- у нюхових цибулинах головного мозку і крові щурів за умов гіпоксії. Виявлено підвищення нітритредуктазної активності RHb під впливом карнозину in vitro. На підставі аналізу адсорбційних спектрів різних лігандних форм Hb виявлено, що Zn2+-карнозин індукує гіперхромні ефекти в електронних спектрах RHb і нітрозогемоглобіну (HbNO), а також гіпохромний ефект у видимій області спектра оксигемоглобіну (HbO2). Досліджено зв’язування карнозину з молекулою Hb in vitro і виявлено, що в процесі такої взаємодії розщеплення карнозину не відбувається. На підставі отриманих результатів зроблено висновок про те, що карнозин і Zn2+-карнозин, знижуючи вміст продуктів перетворення NO – NO2- та NO3--аніонів у нюхових цибулинах і крові щурів за умов гіпоксії, гальмують розвиток нітрозативного стресу. Як досліджено, механізм дії карнозину у крові щурів за гіпоксичних умов полягає у його взаємодії з молекулою Hb, підвищенні нітритредуктазної активності RHb.

Практичне значення отриманих результатів. Дослідження фізіолого-біохімічних основ реакції організму ссавців на дію оксидаційного стресу сприяють пізнанню природи стійкості організму до гіпоксії та відкривають нові шляхи для її регулювання. Результати проведених досліджень обґрунтовують можливість використання природного антиоксиданта карнозину та його похідного Zn2+-карнозину для захисту тканини від пошкоджень за умов нітрозативного стресу, який розвивається під час гіпоксії різної етіології. Ці результати використовуються у навчальному процесі під час викладання спецкурсів з біохімії у Львівському національному університеті імені Івана Франка.

Особистий внесок здобувача. Автор виконав весь обсяг експериментальних досліджень, адаптував необхідні методики для застосування у досліджуваній моделі, статистично опрацював результати, провів пошук наукової літератури за темою дисертації. Планування досліджень, аналіз та інтерпретація отриманих результатів проведені за участю наукового керівника д-ра біол. наук, проф. М. М. Великого, канд. біол. наук, доц. В. М. Коробова та співавторів. Дослідження вмісту вільних амінокислот у тканинах щурів проведено спільно з науковим співробітником Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України О. І. Солодовою. В експериментах використано препарат Zn2+-карнозин, синтезований на кафедрі біоорганічної хімії Дніпропетровського університету і люб’язно наданий канд. біол. наук Г. Д. Зегждою.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження виконані на кафедрі біохімії Львівського національного університету імені Івана Франка в рамках наукових держбюджетних тем Бл 257Б “Низькомолекулярні природні метаболіти в корекції гіпоксичних станів організму” в 1997–1999 рр. (№ держреєстрації 0197U018113) та Бх 14Б “Регуляторна дія НАД та гістидиновмісних дипептидів у корекції метаболічних порушень при гіпоксії різної етіології” в 2000–2002 рр. (№ держреєстрації 0100U001443) (здобувач дослідив уміст пірувату і лактату, аніонів NO2- і NO3- у тканинах щурів, спектральні та псевдокаталітичні характеристики Hb, провів хроматографію на пластинках).

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи щорічно доповідалися на звітних наукових конференціях співробітників Львівського національного університету імені Івана Франка (1998–2000). Головні положення дисертації висвітлені на Міжнародному симпозіумі “Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems” (Kyiv, Ukraine, 2001), на 2-й та 3-й Парнасiвських конференцiях (Гданськ, Польща, 1998; Львів, 2000); на Міжнародній школі для молодих фізіологів “Membranes and Signalling” (Київ, 2000), на Міжнародній конференції “Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты” (Санкт-Петербург, Росія, 1999) на V Мiжнароднiй конференцiї “Биоантиоксидант” (Москва, Росiя, 1998); на XV з’їзді українського фізіологічного товариства (Донецьк, 1998); на Мiжнародному симпозiумi “Аминокислоты и их производные” (Гродно, Бєларусь, 1996).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 4 статті у фахових наукових виданнях, і 7 тез доповідей у матеріалах з’їздів та конференцій.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів дослідження та їх обговорення, висновків, а також списку використаних джерел (266 найменувань). Робота викладена на 127 сторінках, ілюстрована 13 рисунками і 4 таблицями.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження проведені на статевозрілих безпородних білих щурах-самцях масою 240–260 г, низькорезистентних до гіпобаричної гіпоксії (Березовський В. А., 1975). Використано 6 груп тварин: “контроль”, “гіпоксія”, “гіпоксія+карнозин”, “карнозин”, “гіпоксія+Zn2+-карнозин”, “Zn2+-карнозин”. Гостру гіпобаричну гіпоксію моделювали у проточній барокамері, де протягом 30 хв створювали умови розрідженого атмосферного повітря (170 мм рт. ст.), що відповідає висоті 11 000 м над рівнем моря (Лукьянова Л. Д., 1989). Виживання тварин в умовах барокамери проводили за Л. Д. Лук’яновою (1989). Щурам за 30 хв до гіпоксії вводили внутрішньоочеревинно водні розчини карнозину (доза: 20 мг/кг маси тіла тварини) (Гуляева Н. В., 1989) та Zn2+-карнозину (доза: 10 мг/кг маси тіла тварини). Після декапітації тварин нюхові цибулини головного мозку відпрепаровували за J. Glowinski, L. Iversen (1966) і заморожували їх у рідкому азоті; периферичну кров гепаринізували.

Для оцінки вмісту аніонів NO2- і NO3- гомогенати нюхових цибулин і плазму крові щурів депротеїнізували за допомогою NaOH та ZnSO4 (Somogui S., Nelson H., 1996). Уміст NO2--аніонів визначали за модифікованим методом Гріса (Green L. C., 1982), NO3--аніонів – за методом Коуза (Cawse P. A., 1967). Використано ензиматичні методи (із застосуванням лактатдегідрогенази) для визначення вмісту молочної (Hohorst H. J., 1970) і піровиноградної (Czok R., Lamprecht W., 1970) кислот у тканинах щурів.

Якісне і кількісне визначення вільних амінокислот проводили на автоматичному амінокислотному аналізаторі типу Т-339 (“Microtechna”, Чехословаччина) на сульфополістирольних іоноообмінних смолах (“Ostion LGANB”) в Li-цитратному буферному одноколонковому режимі.

Відмиті від плазми крові еритроцити щурів гемолізували, використовуючи 33 мМ К+/Na+-фосфатний буфер (рН 7,36). У гемолізатах визначали нітритредуктазну активність R-Hb. Ступінь деоксигенації Hb контролювали за його електронними адсорбційними спектрами після вакуумізації гемолізатів у сатураторі (Федорович І. П., Коробов В. М., 1996). Концентрація Hb у цих розчинах становила 7,5 мМ. Її визначали спектрофотометрично, використовуючи молярний коефіцієнт екстинкції для ціаноферигему 11 мМ-1 см-1 (Van Kampen E. I., Zijlstra W. G., 1961). Реакцію відновлення NO2--аніонів дезоксигемоглобіном ініціювали додаванням до гемолізату розчину NaNO2 (6 мМ) і реєстрували зростання оптичної густини розчину при 480 нм (Zijstra W. G., 1981). Для дослідження нітритредуктазної активності RHb in vitro до вакуумізованого гемолізату контрольних щурів вносили розчин карнозину (30 мМ), нітриту натрію (26 мМ).

Розчин мет-Hb, отриманого з кристалічного препарату Hb бика (“Reanal”, Угорщина), відновлювали до RHb за допомогою дітіоніту натрію (Храмцов В. В., 1996). Очистку розчину RHb від дітіоніту натрію та отримання HbO2 проводили гель-фільтрацією з використанням сефадексу G-25 “coаrse” (“Pharmacia”). Суміш карнозину (560 мкг/мл) і HbО2 (200 мкг/мл) у 33 мМ К+/Na+-фосфатному буфері (рН 7,36) витримували при кімнатній температурі. Через 30 хв HbО2 вилучали із середовища центрифугуванням з використанням мікроконцентраторів (“Centricon”, США) з пропускною здатністю мембрани 15 кДа. У безбілковому розчині визначали концентрацію гістидиновмісних сполук спектрофотометрично за реакцією Паулі (за М. Г. Остапець, Н. М. Романською, 1974). Стабільність карнозину в розчині з Hb перевіряли методом тонкошарової хроматографії на пластинках “Silufol” (Чехія) в середовищі етанол : аміак = 4 : 1 (Кондратьева Т. С., 1993).

Електронні адсорбційні спектри лігандних форм Hb реєстрували на спектрофотометрі “Specord M-40” (Німеччина). RHb і HbO2 отримували з кристалічного препарату Hb бика (“Reanal”, Угорщина) як описано вище. HbNO отримували унаслідок додавання до RHb нітриту натрію (6 мМ). Концентрація Hb становила 200 мкг/мл, карнозину – 30 мМ. Для досліджень використано карнозин виробництва Санкт-Петербурзького м’ясокомбінату (Росія).

Варіаційно-статистичне опрацювання одержаних результатів проводили, використовуючи критерій Ст’юдента, за допомогою комп’ютерної програми Origin.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Вплив карнозину і його комплексу з цинком на стійкість щурів до дії гострої гіпоксії. Стійкість тварин до дії гіпоксії можна визначити за такими параметрами: часом втрати пози, часом до зупинки дихання, часом відновлення активності після гіпоксії. У щурів, які перед гіпобаричною гіпоксією отримували карнозин і Zn2+-карнозин, виявили підвищення адаптації до нестачі кисню, порівняно з тваринами, яким не робили ін’єкцій цих дипептидів (рис. 1).

Виявлено вірогідне збільшення часу до зупинки дихання з 12010 с у контрольній групі тварин до 300±12 с у групах “гіпоксія+карнозин”, “гіпоксія+Zn2+-карнозин”. Тварини, що отримали перед гіпоксією карнозин і Zn2+-карнозин, швидше відновлювали функції дихання та руху після гіпоксії (36015 с і 34018 с відповідно), порівняно з групою “гіпоксія” (41025 с).

Рис. 1. Вплив карнозину і його комплексу з цинком на стійкість щурів до дії гострої гіпобаричної гіпоксії: 1 – втрата пози; 2 – зупинка дихання; 3 – відновлення активності після гіпоксії.

Отже, карнозин і Zn2+-карнозин сприяли виживанню тварин за умов гіпобаричної гіпоксії.

2. Аналіз розвитку гіпоксичного стресу у тканинах щурів за дії карнозину і Zn2+-карнозину за продуктами анаеробного гліколізу. Відомо, що за екстремальних умов існування організму в тканинах інтенсифікується анаеробний гліколіз, що робить їх певною мірою незалежними від забезпечення киснем і сприяє виживанню (Березовский В. А., 1978). За нормальних умов існує динамічна рівновага між диханням і анаеробним гліколізом, про що свідчить наявність у тканинах певної кількості лактату (Лелевич В. В., 2000). Однак глибокі порушення співвідношення між аеробним та анаеробним гліколізом можуть бути небезпечними для функціонування клітин унаслідок розвитку ацидозу та пов’язаних з ним метаболічних порушень (Ляпков Б. Г., Ткачук Е. Н., 1995).

За умов гострої гіпоксії у нюхових цибулинах головного мозку щурів зафіксовано збільшення вмісту лактату до 8,94±0,06 мкмоль на 1 г сирої тканини відносно контролю (3,86±0,05) та пірувату до 0,41±0,03 мкмоль на 1 г сирої тканини порівняно з контролем (0,25±0,06) (табл. 1). Введення тваринам карнозину до гіпоксії спричиняло вірогідне зменшення вмісту лактату та пірувату до 3,90±0,24 та 0,18±0,04 мкмоль на 1 г сирої тканини порівняно з відповідними показниками у тварин, які зазнавали гіпоксії. Ці величини наближалися до значень, визначених у контролі. Унаслідок введення Zn2+-карнозину перед гіпоксією виявлено зниження вмісту лактату до 1,60±0,20 мкмоль на 1 г сирої тканини, ніж за гіпоксії (8,94±0,06) на фоні незмінного (порівняно з гіпоксією) вмісту пірувату, який становив 0,44±0,03 мкмоль на 1 г сирої тканини. Такий ефект може бути зумовлений впливом Zn2+- карнозину на перебіг лактатдегідрогеназної реакції, рівновага якої під дією йонів Zn2+ зсувається до утворення пірувату (Ещенко Н. Д., 1990). Дослідження М. Р. Прокоп’євої та співавторів (1992) виявили, що в умовах цілісного організму введення карнозину перед фізичним навантаженням призводило до зменшення кількості лактату у головному, спинному мозку, м’язах. Автори пояснювали це можливістю “вимивання” молочної кислоти у кров.

Таблиця 1

Уміст пірувату і лактату у нюхових цибулинах головного мозку щурів (мкмоль на 1 г сирої тканини) та плазмі крові (мкмоль на мл) за умов гіпобаричної гіпоксії та попереднього введення карнозину і Zn2+-карнозину, (Mm, n=8)

Умови досліду | Нюхові цибулини | Плазма крові

Піруват | Лактат | Піруват | Лактат

Контроль | 0,25±0,06 | 3,86±0,05 | 0,13±0,02 | 2,59±0,10

Гіпоксія | 0,41±0,03* | 8,94±0,06* | 0,56±0,02* | 8,36±0,04*

Гіпоксія + карнозин | 0,18±0,04** | 3,90±0,24** | 0,26±0,01** | 6,10±0,18**

Гіпоксія + Zn2+-карнозин | 0,44±0,03 | 1,60±0,20** | 0,26±0,02** | 5,89±0,20**

Карнозин | 0,18±0,02 | 4,10±0,17* | 0,22±0,01 | 3,20±0,18

Zn2+-карнозин | 0,27±0,02 | 4,67±0,20* | 0,60±0,03* | 2,40±0,07

Примітка. * – різниця вірогідна порівняно з контролем, Р<0,05; ** – різниця вірогідна порівнянo з гіпоксією, Р<0,05.

У плазмі крові щурів в умовах гострої гіпобаричної гіпоксії зафіксовано вірогідне збільшення вмісту пірувату до 0,56±0,02 мкмоль на 1 мл плазми, порівняно з контролем (0,13±0,02) та лактату до 8,36±0,04 мкмоль на 1 мл плазми, порівняно з контролем (2,59±0,10) (див. табл.1). Введення щурам карнозину перед гіпоксією спричиняло зменшення вмісту пірувату до 0,26±0,01 мкмоль на 1 мл плазми крові та лактату до 6,10±0,18 мкмоль на 1 мл плазми крові порівняно з відповідними показниками у групи “гіпоксія”. Унаслідок введення Zn2+-карнозину також виявлено зменшення вмісту пірувату та лактату відповідно до 0,26±0,02 та 5,89±0,20 мкмоль на 1 мл плазми крові порівняно із значеннями, визначеними у тварин за гіпоксії. Отримані значення хоча і були нижчими, ніж за умов гіпоксії, але в декілька разів перевищували контрольні, що може свідчити про поповнення кількості молочної кислоти в крові унаслідок надходження лактату з інших тканин, у тому числі з головного мозку.

Зафіксоване в тканинах щурів за гіпоксії підвищення в кілька разів умісту лактату може сприяти розвитку ацидозу, наслідками якого є вивільнення або активація лізосомальних ензимів, гідролітичне руйнування клітин, порушення йонного транспорту в плазматичних мембранах (Ляпков Б. Г., Ткачук Е. Н., 1995), що, для тканини головного мозку, погіршуватиме перебіг процесів збудження і гальмування у нервових клітинах. Окрім того, під впливом зниження рО2 за умов гіпоксії індукується деполяризація плазматичних мембран, відкривання потенціалзалежних Са2+-каналів, а також відкривання в мембранах мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму так званих пор змінної проникності (permeability transition pores), що призводить до різкого збільшення внутрішньоклітинної концентрації йонів Са2+ (Ляпков Б. Г., Ткачук Е. Н., 1995). Це є передумовою для активації конститутивних NO-синтаз, гіперпродукції NO та його активних метаболітів, а також розвитку нітрозативного стресу. Окрім того, досліджено, що існує позитивна кореляція між умістом лактату в тканинах та активністю ензимів NO-синтаз (Sadamitsu D., 2001). Зменшення вмісту молочної кислоти в тканинах щурів у випадку введення карнозину і Zn2+-карнозину перед гіпоксією має важливе значення для запобігання розвитку ацидозу та пов’язаних з ним метаболічних порушень. Нагромадження пірувату за гіпоксії у нюхових цибулинах та плазмі крові піддослідних тварин свідчить про гальмування процесу його окиснення і може мати захисну дію. Про здатність кетокислот (а саме піровиноградної) захищати нейрони від токсичної дії Н2О2 зазначається у праці S. Desagher (1997).

Порушення енергетичного обміну в тканинах за гіпоксичних умов впливає на інтенсивність перетворення деяких амінокислот, метаболічно пов’язаних з циклом Кребса (Dawson T. M., 1950). Окрім накопичення піровиноградної кислоти, у нюхових цибулинах щурів за гіпоксії виявлено вірогідне зменшення вмісту глутамату на 22% та аспартату на 24%. Відомо, що за гіпоксії в мозку відбувається інтенсивна утилізація цих амінокислот як додаткового джерела енергії (Михайлов Г. А., 1971). Зростання на 130% умісту аланіну за цих умов розглядають як альтернативний анаеробний шлях перетворення для пірувату (Yoshino Y., Elloit K., 1970). Зафіксовано зниження вмісту аргініну на 75%, який в організмі ссавців, окрім реакцій синтезу креатину, орнітину, проліну, гуанідиномасляної, гуанідинопропіонової кислот (Кричевская А. А., Бондаренко Т. И. 1983), використовується як субстрат для ензиматичного синтезу NO різними ізоформами NO-синтаз (Palmer R. M., 1988). Карнозин і Zn2+-карнозин, введені щурам перед гіпоксією, не викликали вірогідних змін у вмісті досліджуваних амінокислот, порівняно з групою “гіпоксія”, за винятком змін умісту глутамату. Зафіксоване зниження вмісту цієї амінокислоти під дією карнозину може бути важливим для запобігання її нейротоксичної дії, пов’язаної з активацією NMDA-рецепторів і синтезом NO (Coyle J. T. and Puttfarcken P., 1993). Досліджено, що глутамат є нейромедіатором у нюхових цибулинах головного мозку і його ефекти регулюються карнозином (де Марчис С., 2000).

3. Вплив карнозину та його комплексу з цинком на вміст нітрит- і нітрат-аніонів у тканинах щурів за умов гіпоксії. Відомо, що за гіпоксії різної етіології в тканинах ссавців посилюється синтез NO (Elayan P., 2000). У щурів, що перебувають в барокамері, створюються умови для активації ферментів синтезу оксиду азоту. Зокрема, цьому сприяє тканинний ацидоз і зростання внутрішньоклітинної концентрації йонів Са2+ (Iadecola S. H., 1997). У нюхових цибулинах головного мозку щурів в умовах барокамери вміст NO2--аніонів зростає майже вдвічі і сягає 80,66±2,06 нмоль на г тканини порівняно з цим показником у контрольних тварин (40,56±1,35 нмоль на г тканини). Введення щурам розчинів карнозину і Zn2+-карнозину перед гіпоксією призводило до вірогідного зменшення концентрації NO2--аніонів відповідно до 15,30±1,30 та 14,66±1,26 нмоль на г тканини порівняно з гіпоксією (рис. 2).

Рис. 2. Уміст нітрит- та нітрат-аніонів у нюхових цибулинах головного мозку щурів за умов гіпобаричної гіпоксії та попереднього введення карнозину і Zn2+-карнозину (Mm, n=6): 1 – контроль, 2 – гіпоксія, 3 – гіпоксія+карнозин, 4 – гіпоксія+Zn2+-карнозин, 5 – карнозин, 6 – Zn2+-карнозин.

Примітка. * – різниця вірогідна порівняно з контролем (Р0,05), ** – різниця вірогідна порівняно з гіпоксією (Р0,05).

За умов гіпоксії концентрація NO3--аніонів вірогідно зростає до 27,06±0,64 мкмоль на г тканини порівняно з контролем (23,98±1,23 мкмоль на г тканини) (див. рис. 2). Унаслідок введення перед гіпоксією карнозину і Zn2+-карнозину концентрація NO3-–аніонів вірогідно знижується відповідно до 19,47±1,06 і 22,96±0,58 мкмоль на г тканини порівняно з досліджуваним показником за умов гіпоксії.

У плазмі крові щурів за гіпоксії вміст NO2--аніонів зростає до 20,460,17 мкмоль на мл плазми порівняно з цим показником у контрольних тварин (15,010,21 мкмоль на мл плазми) (рис. 3). У груп “карнозин+гіпоксія” та “Zn2+-карнозин+гіпоксія” в плазмі крові зафіксовано відповідне вірогідне зниження концентрації NO2--аніонів до 10,000,19 та 9,630,27 мкмоль на мл плазми порівняно з гіпоксією. Унаслідок введення тваринам розчину карнозину та Zn2+-карнозину концентрація NO2--аніонів не відрізняється від контрольної і становить 12,110,26 та 13,000,41 мкмоль на мл плазми відповідно. За умов гіпоксії концентрація NO3-аніонів вірогідно зростає до 101,396,17 мкмоль на мл плазми порівняно з контролем (58,164,03 мкмоль на мл плазми) (див. рис. 3). Унаслідок введення перед гіпоксією карнозину і Zn2+-карнозину концентрація NO3--аніонів вірогідно знижується відповідно до 49,354,13 та 67,396,76 мкмоль на мл плазми порівняно з досліджуваним показником при гіпоксії.

Отже, виявлені ефекти карнозину і Zn2+-карнозину щодо зменшення концентрації NO3-- та NO2--аніонів у нюхових цибулинах головного мозку та плазмі крові щурів за гіпоксії можуть свідчити про гальмування розвитку гіпоксичного стресу за нітрозативним механізмом у цих тканинах.

Рис. 3. Уміст нітрит- і нітрат-аніонів у плазмі крові щурів за умов гіпобаричної гіпоксії та попереднього введення карнозину і Zn2+-карнозину (Mm, n=6): 1–контроль, 2 – гіпоксія, 3 – карнозин+гіпоксія, 4 – Zn2+-карнозин+гіпоксія, 5 – карнозин, 6 – Zn2+-карнозин.

Примітка. * – різниця вірогідна порівняно з контролем (Р0,05), ** – різниця вірогідна порівняно з гіпоксією (Р0,05).

Це має важливе значення для запобігання метаболічним порушенням під дією реакційноздатних метаболітів NO. Отримані результати свідчать про залучення карнозину і Zn2+-карнозину в процеси перетворення NO в організмі ссавців і доповнюють уявлення про функціонування циклу оксиду азоту. В. П. Реутов (1995) з’ясував, що цикл оксиду азоту є регулятором спряженої взаємодії двох компонент утворення NO - NO-синтазної та нітритредуктазної.

4. Дослідження впливу карнозину і його комплексу з цинком на нітритредуктазну активність дезоксигемоглобіну. Згідно з уявленнями про функціонування циклу оксиду азоту в клітинах ссавців (Реутов В. П., 1995), продукти перетворення NO NO2- і NO3--аніони можуть піддаватися біотрансформації, а саме відновлюватися до оксиду азоту в процесі нітрит/нітратредуктазних реакцій. Нітритредуктазні реакції каталізують дезоксигемопротеїни: флавопротеїни і цитохромоксидази у мітохондріях, цитохром Р450 в ендоплазматичному ретикулумі, дихальні гемопротеїни – міоглобін та Hb. Донорами електронів в таких реакціях є НАДН(Н)+, НАДФН(Н)+, ФАДН2. У крові ссавців переважаючий гемопротеїн – Hb. Припускається, що швидкість відновлення NO2--аніонів, визначена в гемолізатах еритроцитів щурів, зумовлена активністю RHb. Ця ланка біотрансформації NO2- є досить потужною в умовах гіпоксії, оскільки дихальні гемопротеїни наявні в організмі ссавців у високих концентраціях.

Швидкість перетворення NO2--аніонів у вакуумованих гемолізатах еритроцитів крові щурів після гіпоксії вірогідно знижується порівняно з контролем (4,170,19 с-110-4) і становить 3,330,14 с-110-4 (рис. 4, а). У тварин, які перед гіпоксією отримували карнозин і Zn2+-карнозин, виявлено зниження нітритредуктазної активності в гемолізатах еритроцитів (3,060,14 і 3,060,11 с-110-4 відповідно), порівняно з величиною цього показника за гіпоксії (3,330,14 с-110-4). Визначено, що нітритредуктазна активність у гемолізатах крові щурів, які отримували карнозин і Zn2+-карнозин, є нижчою (відповідно 3,890,28 і 2,780,27 с-110-4), ніж у контролі. Водночас досліджено, що in vitro карнозин підвищує нітритредуктазну активність RHb (рис. 4, б).

За гіпоксичних умов у крові ссавців зменшується парціальний тиск кисню і зростає процентний уміст RHb (Коробов В. М., 2001), який не тільки відновлює NO2- до NO, а також зв’язує оксид азоту з утворенням Hb-Fe2+-NO. Існує два типи нітрозопохідних Hb – R- і T-конформери, які відрізняються за міцністю зв’язку залізо–ліганд і, відповідно, за часом життя в організмі (Archer S., Tristani-Firouzi M., 1995). Швидкість дисоціації NO в таких комплексах регулюється 2,3-біс-фосфогліцератом та інозитолгексафосфатом (Archer S., Tristani-Firouzi M., 1995). У крові щурів карнозин, підвищуючи нітритредуктазну активність RHb, впливає на інтенсивність нітрозилювання Hb і, можливо, визначає тип утворюваного Hb-Fe2+-NO-конформера.

Рис. 4. Швидкість перетворення нітрит-аніонів у вакуумованих гемолізатах крові піддослідних щурів (а) та in vitro за наявності дипептиду карнозину (б).

Водночас, зменшується частка Hb, здатного до відновлення NO2--аніонів, що може пояснити неоднозначні ефекти карнозину під час визначення нітритредуктазної активності RHb in vivo та in vitro. Резервований у вигляді HbNO оксид азоту може виконувати регуляторну функцiю на значно більших відстанях вiд мiсця його утворення, досягаючи з током кровi рiзних органiв (Коробов В. М., 2001). Гістидиновмісні дипептиди, сприяючи утворенню нiтрозильних комплексiв гемопротеїнів, можуть запобігати негативним наслідкам у випадку надмірного синтезу NO. Можна припустити, що здатність гістидиновмісних дипептидів змінювати нітритредуктазну активність RHb пов’язана з їхньою безпосередньою взаємодією з молекулою Hb.

5. Дослідження зв’язування карнозину з гемоглобіном. Для експериментального доведення взаємодії карнозину з Hb суміш цих речовин витримували при кімнатній температурі. Через 30 хв Hb вилучали із середовища центрифугуванням з використанням мікроконцентраторів з пропускною здатністю мембрани 15 кДа. У безбілковому фільтраті визначали концентрацію гістидиновмісних сполук і порівнювали її із початковою концентрацією карнозину в суміші. Визначено достовiрне зниження концентрацiї гiстидиновмiсних сполук з 0,56±0,01 мг/мл до 0,24±0,01 мг/мл після взаємодії з Hb, що свідчить про зв’язування карнозину з Hb. Для перевірки стабільності розчину карнозину проведений хроматографічний аналіз безбілкового фільтрату після інкубації Hb з карнозином. Результати наведені на рис. 5.

Рис. 5. Хроматограма гістидиновмісних сполук, розділених у шарі силікагелю після проведення діазореакції Паулі (скановане зображення):

1 – безбілковий фільтрат після інкубації карнозину з гемоглобіном; 2 – розчин карнозину (контроль); 3 – розчин гістидину (контроль).

Унаслідок хроматографічного аналізу визначено, що у безбілковому фільтраті не виявлено продуктів розпаду карнозину. Отже, в процесі взаємодії карнозину з гемоглобіном гідролізу дипептиду не відбувається.

6. Аналіз електронних адсорбційних спектрів окси-, дезокси- та нітрозогемоглобіну за наявності карнозину та Zn2+-карнозину. У процесі дослідження особливостей електронних адсорбційних спектрів різних лігандних форм гемоглобіну за наявності карнозину і Zn2+-карнозину in vitro зафіксовано гіперхромні ефекти у видимій області спектрів дезокси- та нітрозогемоглобіну під впливом Zn2+-карнозину (рис. 6). Zn2+-карнозин спричиняв гіперхромний ефект в області смуги Соре спектра RHb, а також гіпер- і батохромний ефекти в області смуги Соре HbNO (рис. 7).

Рис. 6. Типові електронні адсорбційні спектри окси-, дезокси та нітрозогемоглобіну (видима область) за наявності карнозину та Zn2+-карнозину.

Рис. 7. Типові електронні адсорбційні спектри окси-, дезокси та нітрозогемоглобіну (ультра-фіолетова область та ділянка смуги Соре) за наявності карнозину та Zn2+-карнозину.

Оскільки модифікації різними агентами білкового або гемового компонента Hb взаємозумовлюють зміни у різних ділянках спектра, за електронними спектрами не можна вірогідно визначити місце взаємодії карнозину з молекулою Hb. Можна припустити, що така взаємодія відбувається на рівні гему. Наприклад, для гемовмісної розчинної гуанілатциклази з тромбоцитів досліджено можли-вість утворення хелатного комплексу заліза гему і карнозину (Северина И. С., 1998). Вірогідна також можливість неензима-тичного карнозилювання білко-вого компонента гемоглобіну за карбонільними групами. Такий феномен був відкритий А. Р. Хіпкісом (2000) і розглядається сьогодні як один із механізмів захисту карнозином білків від утворення поперечних зшивок у процесі старіння.

ВИСНОВКИ

У дисертації теоретично узагальнено і по-новому вирішено проблему пошкоджуючої дії нітрозативного стресу на організм ссавців, а саме:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

(Дисертант брала участь у проведенні досліджень впливу карнозину на спектральні характеристики різних лігандних форм гемоглобіну; провела хроматографію на пластинках; брала участь в аналізі експериментальних даних, написанні статті та оформленні рисунків. Обговорення результатів проведено разом із співавторами).

2.

(Дисертант брала участь у проведенні досліджень вмісту вільних амінокислот у нюхових цибулинах головного мозку, статистичному опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні і перекладі статті. Обговорення результатів проведено спільно з наук. співроб. Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України О. І. Солодовою).

3.

(Дисертант провела дослідження, статистичне опрацювання експериментальних даних, брала участь в аналізі результатів досліджень, написанні статті).

4.

(Дисертант брала участь у проведенні досліджень, статистичному опрацюванні результатів, аналізі експериментальних даних, написанні статті).

5.

(Дисертант брала участь у проведенні досліджень, статистичному опрацюванні результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та перекладі тез доповіді).

6. Дудок К. П., Федорович А. М., Бойко М. М. Исследование антиоксидантных свойств карнозина в системе транспорта кислорода // V Междун. конф. “Биоантиоксидант”. – Москва. – (Россия). – 1998. – С.128 – 129.

(Дисертант брала участь у проведенні досліджень, статистичному опрацюванні результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та перекладі тез доповіді).

7. Korobov V., Krys’ko O., Bojko M. Role of carnosine in NO-cycle functioning in animals // 2nd-Parnas conf. – Gdansk (Poland). – 1998. – Р.18.

(Дисертант брала участь у проведенні досліджень, статистичному опрацюванні результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та перекладі тез доповіді).

8.

(Дисертант брала участь у проведенні досліджень, статистичному опрацюванні результатів, аналізі експериментальних даних, написанні тез доповіді).

9. Токарева Л. В., Великий Н. Н., Коробов В. Н., Зегжда Г. Д., Сибирная К. А., Голубий Е. М., Бойко М. Н., Крысько О. М. Антигипоксический эффект комплекса карнозина с цинком // Междун. конф. “Свободнорадикальные процессы: экологические, фармаколо-гические и клинические аспекты”. – Санкт-Петербург (Россия). – 1999. –С.45.

(Дисертант брала участь у проведенні досліджень, статистичному опрацюванні результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та перекладі тез доповіді).

10. Korobov V., Krys'ko O., Boyko M., Sokolyk N. Role of nitriс oxide in oxygen transport at hypoxic stress // 3-Parnas conf. – Lviv – 2000. – Р.120.

(Дисертант брала участь у проведенні досліджень, статистичному опрацюванні результатів, аналізі експериментальних даних, написанні та перекладі тез доповіді).

11.

(Дисертант брала участь у проведенні досліджень, статистичному опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та перекладі тез доповіді).

АНОТАЦІЯ

Бойко М. М. Перетворення оксиду азоту в тканинах щурів за умов гіпоксії та дії дипептиду карнозину – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю