Міністерство охорони здоров'я України

Одеський державний медичний університет

ЖУК МАКСИМ СЕРГІЙОВИЧ

УДК [612.81:612.8.02]:615.015

Фармакогенетичні особливості біокінетики екзогенних лігандів ГАМКА-рецептору

14.03.05 – фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Одеса – 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Фізико-хімічному інституті ім. О. В. Богатського НАН України

Науковий керівник: академік АМН України, доктор біологічних наук, професор Головенко Микола Якович, завідувач відділу фізико-хімічної фармакології Фізико-хімічного інституту ім. О. В. Богатського НАН України

офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Маслова Наталія Федорівна, завідувач лабораторії біохімічної фармакології Державного наукового центру лікарських засобів МОЗ та НАН України.

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Філіпова Тетяна Олегівна, професор кафедри мікробіології біологічного факультету Одеського національного університету ім. І. І Мечникова.

Провідна установа:

Інститут фармакології та токсикології АМН України, відділ нейрофармакології, м. Київ

Захист відбудеться „02„ липня 2002 року о 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 при Одеському державному медичному університеті МОЗ України (65026, м. Одеса, пров. Валіхівський, 2).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Одеського державного медичного університету МОЗ України (65026, Одеса, пров. Валіхівський, 3).

Автореферат розісланий „29„ травня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради к.мед.н. Соболєв Р.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В теперішній час накопичена значна кількість даних, що вказують на визначальну роль ГАМКА-медіаторної системи (ГАМКА-мс) як основної гальмівної структури ЦНС, що регулює ряд фізіологічних функцій та бере участь в деяких патологічних станах організму (Braestrup C. et al. 1983; Сhebib M., Johnston. G. 1999). Основні досліди при вивченні принципів взаємодії ГАМКА-рецептору з його лігандами виконані біохімічними та молекулярно-біохімічними методами (Olsen R.W. et al., 1984; Akaike N., 1985; Pellow S.,et al., 1984; “GABA: Receptors, transporters and Metabolism”, 1996. Комиссаров И.В. 2000). Але для вивчення процесів взаємодії ліків та організму, наслідком чого є фармакологічний ефект, необхідні дослідження як процесів біокінетики, так і молекулярно-біологічних та фізіологічних механізмів (Головенко М. Я., 1999). В основі вивчення принципів функціонування ГАМКА-мс в фізіологічних умовах лежать припущення про те, що модифікація хлорної провідності, яка викликається впливом ліків, врешті-решт віддзеркалюється на реєструємих показниках всього організму (фармакологічних ефектах) (Johnston D., Wu S.M.S. 1995; Wisden W., 1992.). Прикладні аспекти досліджень в даній області грунтуються на тому, що залежність між дозами ліків, кінетикою їхнього надходження у внутрішнє середовище організму та динамікою фармакологічних відповідей - нелінійні та мають істотні індивідуальні особливості. Одним з факторів, що впливають на параметри фармакодинаміки, є генетичні фактори та індивідуальна чутливість до препаратів. Вивчення динаміки дії лікарських засобів та їх фізіологічно активних метаболітів у взаємозв'язку з біокінетикою та молекулярно-біологічними дослідами in vitro та впливу модифікуючих факторів (наприклад, у тварин різних ліній, шляхів введення і т. ін.) дозволяють отримати поглиблені знання про механізми дії психотропних препаратів. Теоретичне моделювання функціонування ГАМКА-мс, при використанні результатів дії екзогенних лігандів in vivo можуть слугувати передумовою цілеспрямованого пошуку нових лікарських засобів, що корегують відповідні патологічні стани.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Матеріали дисертації є фрагментом роботи в рамках проектів НАН України: „Дослідження нових ефективних засобів лікування алкоголізму та наркоманії на основі вивчення зв'язку структура – механізм дії психофармакологічних речовин” (шифр теми: №1.02.05/203-92), „Розробка та впровадження в медичну практику нового снодійного та транквілізуючого препарату – циназепама” (шифр № 1.02.07/127-92), „Молекулярний дизайн, синтез, властивості психотропних, антитромботичних та противірусних засобів – похідних азотвмістних гетероциклів та пептидомиметіків” (шифр теми: 2.1.6.234, 1999-2001 р.р.).

Мета та завдання роботи. Визначення процесів функціонування in vivo ГАМКА-мс ЦНС в умовах взаємодії з її екзогенними лігандами та визначення взаємозв'язку їхніх фармакокінетичних та фармакодинамічних показників у тварин різних ліній.

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

1. Дослідити функціональні особливості ГАМКА-мс in vivo в умовах взаємодії мусцимолу, флюмазенілу, бенздіазепінів та етанолу, лігандів, що зв'язуються з різними субодиницями комплексу при змінному рівні ендогенного медіатору (ГАМК).

2. Розробити належний математичний апарат, що дозволяє аналізувати взаємодію екзогенних лігандів з ГАМКА-мс. Використати окупаційні (рівноважні) та динамічні (нерівноважні) рецепторно-лігандні моделі для опису механізмів дії феназепаму, мусцимолу, Ro 15-1788 та етанолу in vivo.

3. Вивчити взаємозв'язок параметрів фармакокінетики та фармакодинаміки феназепаму у мишей ліній СВА, C57BL/6, F1 та провести оцінку генетично залежних процесів утворення активного метаболіту 3-оксіпохідного цього препарату.

4. Дослідити фармакодинамічні особливості нового оригінального препарату циназепаму та визначити роль в цих процесах його метаболітів.

5. Вивчити кінетику процесів розподілу етанолу в організмі мишей з різною алкогольною мотивацією. Обґрунтувати кінетичну схему процесів розподілу етанолу при різних дозах та шляхах його введення.

6. Встановити час дії (фармакологічної та токсичної), а також терапевтичний індекс (ТІ) етанолу при його спільному введенні з мусцимолом. Розробити математичний апарат для визначення параметрів фармакокінетики та оптимізації фармакологічної дії, що ґрунтується на ТІ та часу тривалості ефектів.

Об'єкт дослідження – ГАМК-медіаторна система ЦНС у нормі та експериментальної патології у мишей нелінійних і ліній СВА, C57BL/6, F1.

Предмет дослідження – ефекти i біокінетика лігандів ГАМКА-мс.

Методи дослідження – інструментально-аналітичні: фармакокінетичні, фармакологічні, радіологічний; статистичнi, математичні.

Наукова новизна роботи полягає в тому, що в ній вперше:

1. Показано, що блокатор синтезу ГАМК – тіосемикарбазид (ТСК) змінює спрямованість фармакологічного ефекту агоніста ГАМК-рецептору мусцимолу;

2. Здійснено математичний аналіз механізмів взаємодії феназепаму, Ro 15-1788, етанолу та мусцимолу з ГАМКА-мс ЦНС in vivo на основі рівноважних та нерівноважних фармакологічних моделей;

3. Виявлені міжлінійні розбіжності в параметрах фармакокінетики та фармакодинаміки феназепаму та його основного активного метаболіту – 3-оксіпохідного. Показано, що залежність швидкості утворення 3-оксіфеназепаму в організмі залежить від генетики піддослідних тварин.

4. Досліджена фармакологічна активність нової пролікарської сполуки – циназепаму та показано, що його активний метаболіт (3-оксіпохідне) вносить визначальний внесок в її прояв. Протисудомна дія циназепаму зумовлена генетичними особливостями піддослідних тварин;

5. Структура кінетичної схеми процесів розподілу етанолу в організмі мишей з різною алкогольною мотивацією показала наявність швидкої (нульового порядку), що становить 0,17-4 год. та повільної (експоненційної) - 4-24 год. фаз та відсутність залежності від лінії тварин та модифікуючих факторів.

6. На основі аналізу параметрів фармакокінетики етанолу показане лінійне зростання концентрації в плазмі крові та мозку піддослідних тварин препарату та параболічне збільшення площі під його фармакокінетичною кривою в тест-тканині в залежності від введених доз, що визначає співвідношення між фармакологічним ефектом та токсичними наслідками вживання етанолу.

7. Здійснене математичне моделювання взаємозв'язку основного фармакологічного показника – терапевтичного індексу (ТІ) та часу тривалості фармакологічного та токсичного ефектів з урахуванням фармакокінетичних показників препарату. Продемонстрована придатність математичної моделі для оцінки біокінетики лігандів ГАМКА-мс – етанолу та мусцимолу.

Практичне значення одержаних результатів. Дослідження фармакокінетики та фармакодинаміки нового водорозчинного лікарського препарату – циназепаму, є частиною доклінічних досліджень першого етапу впровадження його в медичну практику.

Розроблені і модифіковані методи математичного аналізу фармакокінетичних даних, які можуть бути з успіхом використані в експериментальній і клінічній фармакології при визначенні взаємозв'язку вмісту ліків і їх метаболітів і кількісними показниками фармакологічного ефекту in vivo.

Розроблені математичні моделі механізмів взаємодії лігандів ГАМК-медіаторної системи є теоретичною передумовою для заданої цілями терапії модифікації ефектів вже відомих та розробки нових лікарських засобів.

Особистий внесок здобувача. Автором був здійснений інформаційний пошук, опрацьовані дослідні моделі, проведені експериментальні дослідження фармакокінетики и фармакодінамики екзогенних лігандів ГАМКА-мс. Виконано статистичну обробку результатів, проведено оформлення таблиць та графіків, сформульовані висновки роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися на:

Першому національному з'їзді фармакологів України (Полтава, 1995), Дев'ятій конференції молодих вчених з органічної хімії та біохімії (Prague, Czechia, 1995), Четвертій конференції "Focus on Epilepsy" (Ste-Adele, Canada, 1997), Шістнадцятій конференції з проблем нервової системи (Boston, USA, 1997), Другому європейському конгресу з фармакології (Budapest, 1999), 4-тій конференції Чеського товариства з нейронаук (Prague, October 26-27, 2001).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 11 робіт (з них 5 статей в наукових журналах, затверджених ВАК України, 6 тез доповідей – в збірниках наукових робіт).

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 146 сторінках машинопису, вона складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, трьох розділів власних досліджень, обговорення результатів досліджень, висновків та списку використаних джерел. Робота проілюстрована 28 рисунками та 11 таблицями. Бібліографія включає 184 джерел (42 вітчизняних та російськомовних, та 142 зарубіжних).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДОСЛІДЖЕННЯ

Матеріали та методи дослідження. В ході роботи використовувались мусцимол, флумазеніл, оксибутират натрію, феназепам, 3-оксіфеназепам, циназепам. Сполуки були синтезовані в ПНДЛ-5 Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова та Фізико-хімічному інституті ім. О.В. Богатського НАН України. Досліди були проведені на 1456-х мишах обох статей ліній СВА, C57BL/6 та F1 масою 15-25 г.

Досліджувані речовини вводилися внутрішньоочеревинно в 0,9% розчині NaCl або в емульсії Tween-80. Для визначення мінімальних ефективних доз (МЕД), що викликають показники судомного припадку, які реєструються в досліді: клоніко-тонічні судоми (ДКТС) та тонічну екстензію (ДТЕ), – тваринам внутрішньосудинно в хвостову вену вводили з швидкістю 0,01 мл за секунду розчини: бікукулін (Бк) (0,01%), пентилентетразол (Пт) (1%), на фоні попереднього введення різних доз бенздіазепінів, ГОМК, мусцимолу та етанолу за 30 хв. Ro 15-1788 і його нітропохiдне вводили внутрішньоочеревинно в дозах от 25 до 250 мг/кг за 60 хв. до внутрішньосудинного введення Пт.

Одночасно з реєстрацією протисудомної дії екзогенних лігандів проводили визначення вмісту їх метаболітів в головному мозку тварин. Безпосередньо після реєстрації судомної дії сполук тварин декапітували, відпрепаровували головний мозок та визначали загальний радіоактивний матеріал.

Фармакокінетику феназепаму вивчали на мишах самцях лінії СВА, C57BL/6, F1. 14С-феназепам вводили внутрішньоочеревинно в твіновій емульсії в дозі 14 мг/кг. Тварин декапітували через 0,5 1, 2, 3 та 6 годин після введення препарату. Визначали вміст вихідної сполуки та 3-оксіпохідного в плазмі крові, мозку та печінці мишей. Розділення феназепаму та його метаболітів проводили методом зонної радіохроматографії. 14С-етанол вводили експериментальним тваринам інтрагастрально та внутрішньосудинно в дозах 2 г/кг та 4 г/кг. Через 0,17, 0,33, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8 годин мишей декапітували та визначали вміст 14С-матеріалу в плазмі крові та головному мозку. Визначення проводили на сцинтиляційних лічильниках Rack-Beta (США). Обробка результатів досліджень проводилася з використанням програмного пакету "Statistics 5.0". Регресійний аналіз дослідних даних проводили згідно з модифікованим методом зважених середніх групових величин (Корніш-Боуден Е., 1979; Гланц С., 1998).

Модуляція екзогенними лігандами функцій ГАМКА-рецепторного комплексу in vivo

Вивчення функціональних змін системи під впливом екзогенних лігандів різних субодиниць рецепторного комплексу в умовах зміни фонового рівня ендогенної ГАМК дає можливість дослідити механізми його модуляції. Нами проведене дослідження функціональних особливостей ГАМКА-мс in vivo в умовах взаємодії мусцимолу (ГАМК-рецептор), флюмазенілу (бенздіазепіновий рецептор) та етанолу (місце зв'язування – Cl-іонофор) при зміні рівню ендогенного медіатору (введення ТСК та попередника ГОМК). ТСК, інгібуючи синтез ГАМК, викликає судомний припадок (табл. 1). Мусцимол в дозах 3 та 6 мг/кг у мишей викликав міоклонічні посмикування. Протисудомної дії мусцимолу по антагонізму з коразолом та бікукуліном не спостерігалося (Головенко М. Я. та спів., 1988), але на фоні введення ТСК був виявлений достовірний антиконвульсантний ефект (табл. 1). Тобто спостерігається зміна направленості ефекту мусцимолу на фоні зниження “фонового” рівню ГАМК, що досягається введенням ТСК.

Таблиця 1

Розподіл імовірності (Р) розвитку клоніко-тонічних судом (КС) та тонічної екстензії (ТЕ) у мишей при введенні мишам мусцимолу в дозі 3 мг/кг на фоні введення їм ТСК (10-25 мг/кг)

Доза ТСК, ТСК ТСК + мусцимол

мг/кг РКС РТЕ РКС РТЕ

10 0 0 0 0

12 0,67 0 0,17 0

14 0,83 0,67 0,33 0,17

16 0,83 0,83 0,50 0,17

18 1,00 0,83 0,83 0,17

20 1,00 1,0 0,83 -

25 1,00 1,0 1,0 0,83

30 - - 1,0 1,0

ЕD50 11,8±1,28* 14,4±1,38* 16,1±1,42* 19,4±1,35*

* Р Ј 0,05

ГОМК також достовірно знімала судомну дію ТСК. Для етанолу характерна не тільки протисудомна активність по всім показникам судомного припадку, але достовірне зниження летального ефекту ТСК (табл. 2). Це дозволяє припустити, що дія етанолу виявляється також при зниженні рівня ендогенної ГАМК і даний ліганд виявляє міметичні властивості.

Дослідження протисудомної дії мусцимолу та етанолу по тесту максимального електрошоку виявило достовірний фармакологічний ефект, що проявляється у відсутності тонічної екстензії та збільшенні відсотка тварин, що вижили.

Модифікація ефектів феназепаму похідними імідазобенздіазепінів. Проведене дослідження фармакологічної дії антагоніста БД-рецепторів - Ro 15-1788 та його нітропохідного в нормі та на фоні введення феназепаму та етанолу.

Таблиця 2

Розподіл імовірності (Р) розвитку клоніко-тонічних судом (КС), тонічної екстензії (ТЕ) та настання летального ефекту (ЛЕ) у мишей при введенні етанолу в дозах 3-6 мг/кг на фоні введення їм ТСК (6-20 мг/кг)

Показники припадку Доза ТСК мг/кг Р

контроль 6 г/кг етанолу 8 г/кг етанолу

КТС 6 0 0 -

7,5 0,42 0 0

10 0,75 0,58 0

12 0,83 - -

15 0,92 0,67 0

16 1 0,41 0,27

20 1 0,58 0,17

ТЕ мг/кг контроль 3 г/кг етанолу 6 г/кг етанолу

6 0 0 0

7,5 0,33 0,19 0

10 0,67 0,45 0,25

12 0,92 - -

15 1 0,67 0,33

16 1 0,42 0,18

20 1 0,42 0,25

ЛЕ мг/кг контроль 3 г/кг етанолу 6 г/кг етанолу

6 0 0 0

7,5 0,33 0,19 0

10 0,42 0,45 0,25

12 0,58 - -

15 0,92 0,58 0,33

16 1 0,58 0,18

20 1 0,75 0,25

6 - - -

Виявлено, що при низьких дозах (12,5 та 25 мг/кг) флюмазеніл не завдавав достовірного впливу на параметри залежності “доза – протисудомний ефект” феназепаму. Введення зростаючих доз (30-100 мг/кг) Ro 15-1788 та його нітропохідного призводило до достовірного зниження ефекту феназепаму, що досліджувався (рис. 1). Отже, досліджувані сполуки виявляють достовірну антагоністичну дію по відношенню до бенздіазепіну, що дозволяє припускати їхні конкурентні взаємовідношення за місце зв'язування на одному рецепторі. Виявлена нелінійність кривої залежності "доза-ефект" при спільному введенні феназепаму та високих доз Ro 15-1788.

Вивчення впливу Ro 15-1788 на протисудомний ефект етанолу при різних схемах введення виявило достовірні відмінності деяких показників від контролю лише в умовах високих доз Ro 15-1788 та етанолу. Отримані результати припускають, що Ro 15-1788 не істотно модифікує ефекти алкоголю.

Рис. 1. Зміна МЕД коразолу, що викликають ДКТС та ДТЕ у мишей при спільному введенні їм феназепаму та Ro 15-1788 в дозах 50 та 100 мг/кг.

Виявлена нелінійна форма кривої протисудомної дії феназепаму на фоні Ro 15-1788, судячи з усього, є наслідком прояву кооперативного ефекту взаємодії 1,4-бенздіазепінів та ГАМКА-мс.

Моделювання процесів функціонування рецепторно-іонофорних ансамблів in vivo. Математичне моделювання процесів взаємодії досліджуваних лігандів з ГАМК-медіаторною системою організму показало, що зміна ефекту на фоні східчастого підвищення (внаслідок накопичення) концентрації ГАМК в середовищі: після n-1 імпульсів його концентрація (А) складає SAn-1. Вона визначає величину рівноважного (фонового) ефекту (Ер), зумовленого процесами розпаду та утворення рецепторно-лігандного комплексу при t®Ґ:

,

де a - внутрішня активність комплексу,

k1, k2 - константи асоціації та дисоціації комплексу рецептор-медіатор,

R0 - загальна кількість рецепторів.

Його рівноважний вміст ([RA]) складає:

Наступний (n) імпульс концентрації медіатору (An) викликає (при t=0) чергове відхилення від стану рівноваги. Нерівноважний ефект (Eнр n) складає:

Сумарний ефект (Eнр.n+Eр,n-1) (при t=0) дорівнює:

Тобто, присутність в середовищі "фонового рівня" медіатора (SAn-1) призводить до зв'язування частини рецепторів, і тим самим зменшує значення нерівноважного ефекту, що викликається черговим підвищенням концентрації ГАМК. В умовах присутності в середовищі фонової концентрації агоніста (2Аі) утворюється рецепторно-лігандний комплекс [R2A], що визначає значення рівноважного (фонового) ефекту агоністу:

2Eф.i=2a([R2A]2k2 + R 2Ai2k1) =,

де 2a - внутрішня активність агоніста,

2Аі. - его концентрація,

2k1, 2k2 – константи асоціації та дисоціації комплексу рецептор-агонiст [R2A].

Нерівноважний ефект (Eн.i) концентраційного імпульсу медіатора складає при t=0:

1Eн.i = 1a1k11AiR0, а сумарний:

1Ен.i + 2Eф.i = 1a1k11AiR0 + (22k22a - 1a1k11Ai)

Тобто ефект зростає із збільшенням 2А при малих значеннях концентрації ендогенного агоніста (1Аі), стабільний при 1Аі=22a2k/1a1k та знижується при великих величинах Аі. При 2А®Ґ Ep.i”2a2k1R0, та вплив коливань концентрації ендогенного медіатора (1А) на сумарний ефект стає незначним.

Мусцимол – агоніст ГАМКА-мс (Раевский К.С., Георгиев В.П., 1986) його спорідненість з ГАМК-рецепторами в 4-5 разів перевищує спорідненість ендогенного ГАМК, внутрішня активність (вірогідність переходу в активну форму рецепторно-лігандного комплексу з низькою провідністю іонофору) також вища, аніж у ГАМК (Schudy R,E., Barker J.L. 1982). Однак in vivo сполука не виявляє протисудомної активності (Головенко Н. Я. и соав. 1988), окрім того, в дослідах відмічений субсудомний ефект. Це узгоджується з наведеною вище схемою при умові: 1А>22a2k2/1a1k1. Отже, в умовах дефіциту ГАМК, мусцимол може виявляти протисудомний ефект. Дійсно, в умовах попереднього введення ТСК, що викликає розвиток судомного припадку у мишей, відмічено достовірний антиконвульсивний ефект мусцимолу.

Припустимо, що існує величина ефекту (Ееф), що викликає фізіологічний стан, який реєструється (наприклад, клонічні судоми) (1Ееф=(1-а) 1Евих, а<1), тоді: :

1Аеф=(1-а)1Авих і для мусцимолу:

1Авих1a1k1>22a2k2>(1-a)1Aвих.1k11a,

де а - кількість зв'язаних рецепторів,

1Авих та 1Евих – вихідна концентрація та ефект медіатору.

Тобто, ефект нескінченно великої концентрації мусцимолу (ЕҐ= 22ak2R0) менше ефекту, що продукується концентраційним імпульсом ГАМК в нормальних умовах (1Авих.. Евих.=1a1k1Aвих.), але більший цієї величини в умовах дефіциту ГАМК (1Аеф = (1-а)1Авих.), зумовленого попереднім введенням ТСК і такого, що викликає розвиток КС.

Результати дослідження фармакологічних ефектів етанолу показали, що на фоні етанолу показники судомного припадку, що викликаються попереднім введенням ТСК мишам, необоротно (по бесконкурентному типу) блокується (табл. 2). Якщо припустити, що це є прояв постсинаптичного ГАМК-миметичного ефекту етанолу, який спостерігається in vitro, то можна стверджувати, що в умовах значного зниження концентраційного імпульсу ендогенного медіатору (1Енр.эф) рівноважний (фоновий) ефект етанолу (2Еф.i) забезпечує блокаду судомного стану, тобто 2Еф.i і 1Ееф.(п/с.еф) та 2Еф.i і1Евих (блокада судомного стану) таким чином:

(1-а)1Аисх.1a1k1 < 22k22a > 1Аисх.1a1k1.

Остання нерівність пояснює, чому етанол, на відміну від мусцимолу, як екзогенний ГАМК-міметик завдає снодійну, м'язорозслаблюючу, седативну дію (Буров Ю. В., Ведерникова Н. Н. 1985). Його фоновий ефект перевищує нерівноважний ефект концентраційного імпульсу ГАМК в синаптичній щілині.

Ro 15-1788 не має власної внутрішньої активності (2a=0), але змінює (модулює) внутрішню активність комплексу рецептора з медіатором ([1A2AR], 1a№1,2a), а також – параметри зв'язування медіатору (1А) з комплексом "рецептор-модулятор" [2AR].

Викладені моделі передбачають, що в процесі здійснення міжклітинної передачі концентраційний (синаптичний) імпульс медіатору формує в результаті взаємодії медіатору з постсинаптичною рецепторн-іонофорною системою сумарний фармакологічний ефект (Есум), що складається з нерівноважної (Енр) та рівноважної (фонової) складової (Еф) компоненти: Есум=Енр+Еф.

Ліганди, взаємодіючи з постсинаптичним рецепторним комплексом, змінюють умови впливу на нього концентраційного імпульсу ендогенного медіатору. При цьому вони можуть формувати фармакологічний ефект (агоністи), або власного ефекту не завдають, але, утворюючи рецепторно-лігандний комплекс, змінюють показники взаємодії медіатору з рецептором (модулятори).

Міжлінійні розбіжності фармакокінетики та фармакодинаміки феназепаму та його метаболітів у мишей. Одним з факторів, що впливають на параметри фармакокінетики та фармакодинаміки, є генетичні фактори та індивідуальна чутливість до препаратів. Раніш було показано, що швидкість метаболізму феназепаму, а, отже, і розбіжності в його фармакологічному ефекті різні (Серединин С.Б. 1981). Вивчення нами процесів розподілу феназепаму в організмі генетично відмінних одна від одної ліній мишей (СВА, C57BL/6, F1) показало, що у мишей лінії СВА в печінці спостерігається найбільша швидкість елімінації, найменша – у C57BL/6 (рис.2). Отже і середній час утримання (MRT) препарату в даному органі найменший у даної лінії мишей. Об'єм розподілу феназепаму в печінці у всіх досліджених ліній мишей однаковий, а кліренс найменший у C57BL/6. По інтегральному показнику загального вмісту препарату в даному органі була виявлена наступна залежність: AUCC57BL/6>AUCCBA=AUCF1

Визначення 3-оксіфеназепаму в органах та тканинах мишей показало, що для всіх досліджених органів та тканин мишей характерне збільшення вмісту 3-оксіфеназепаму в початкові періоди часу досліду та достовірні міжлінійні розбіжності між показниками його фармакокінетики. До 2-ї години досліду спостерігається досягнення стаціонарного рівня метаболіту та відсутність достовірних відмінностей між лініями мишей.

Рис. 2. Зміна вмісту 14С-феназепаму в печінці (а), головному мозку (б) та плазмі крові (в) в організмі мишей різних ліній при його введенні в дозі 14 мг/кг.

Процеси розподілу феназепаму в організмі мишей описуються кінетичною схемою, де екскреція та біотрансформація вихідної сполуки представлені сумою процесів першого порядку та процесом нульового порядку біотрансформації вихідного препарату в метаболіт (рис. 3).

У СВА зниження рівню феназепаму та наростання концентрації 3-оксіпохідного в плазмі крові, головному мозку та печінці проходило з достовірно більшою швидкістю, ніж у мишей лінії C57BL/6.

Рис. 3. Кінетична схема процесів розподілу феназепаму (Сt) та його метаболіту (M)

Швидкість збільшення концентрації 3-оксіфеназепаму в печінці мишей лінії F1 була середньою між такими значеннями у двох батьківських ліній, в головному мозку та плазмі крові достовірних розбіжностей між одною з батьківських ліній (C57BL/6) виявлено не було. Фармакодинаміка феназепаму у мишей різних ліній (C57BL/6, BALB/c, CBA) показала, що протисудомний ефект феназепаму гіперболічно зростає в залежності від введеної дози речовини. Визначення параметрів ЕDmax, d50 досліджуваних ефектів показало, що найбільший максимальний ефект та d50 спостерігалися у лінії BALB/c, найменші – у СВА. Дослідження залежності "концентрація-ефект" виявило ті ж закономірності. Виявлене лінійне збільшення концентрації 14С-продуктів в головному мозку мишей всіх ліній залежно від зростаючих доз феназепаму. Дані результати відповідають вищенаведеним дослідженням та обумовлені розбіжностями у швидкості біотрансформації феназепаму в організмі різних ліній.

При вивченні динаміки ефектів і концентрацій 14С-феназепаму в головному мозку мишей різних ліній показано, що фаза надходження завершується у всіх досліджуваних ліній мишей на протязі 30 хв., потім відмічена лінійна елімінація препарату. У мишей ліній C57BL/6, CBA зміна рівню вмісту 14С-феназепаму на протязі 30-180 хвилин перебігає з рівними початковими швидкостями та однаковим середнім рівнем концентрації препарату. Зміна МЕД коразолу на протязі досліджуваного часового інтервалу виявило розбіжності у швидкості зміни ефекту. Для всіх ліній характерна двофазна залежність "час-ефект", що відповідає концентраційній кривій. Для мишей лінії СВА та C57BL/6 протисудомний ефект феназепaму є концентраційно-центральним.

Порівняльний аналіз взаємозв'язку процесів фармакодинаміки та фармакокінетики нового транквілізатора – циназепама та його метаболіта – 3-оксіфеназепама в організмі дослідних тварин. Проведено порівняльний аналіз взаємозв'язку процесів фармакодинаміки та фармакокінетики нового транквілізатора – циназепаму у мишей. Раніше було показано, що основний шлях біотрансформації циназепаму – це утворення 3-оксіфеназепаму, його ступінь перетворення в активний метаболіт складає близько 80%. Тропність метаболіту до бенздіазепінових рецепторів вище, ніж вихідного. Це дозволяє віднести дану сполуку до цікавого та перспективного для використання класу препаратів – проліків. Спектр та динаміку фармакологічної дії проліків визначає нелінійний (ферментативний) процес утворення активного метаболіту. Нами запропоновані математичні моделі, що описують біокінетику проліків. Показано, що для проліків даного ряду, що з постійною швидкістю перетворюються в фізіологічно активні метаболіти, такий показник вираженості фармакологічного ефекту як EDmax не залежить від введеної дози. Площу під фамакокінетичною кривою метаболіту, що утворюється з пролікарської сполуки, введеної у деякий дозі, аналогічна площі під фармакокінетичною кривою, що формується безпосереднім введенням метаболіту в організм в тій самій дозі. Це дозволяє керувати тривалістю ефекту шляхом зміни режиму дозування та демонструє перспективність використання проліків, як сполук з керованою тривалістю дії.

Вивчення впливу генетичного статусу мишей на показники фармакодинаміки циназепаму показало, що для лінії СВА характерне швидке зростання протисудомного ефекту та досягнення стаціонарного рівня вже при низьких дозах. Подальше збільшення доз препарату, що вводяться, не призводило до зміни EDmax ефекту. У C57BL/6 спостерігалося майже лінійне зростання ефекту в інтервалі доз 2-7 мг/кг. При більш високих дозах препарату (7-14 мг/кг) спостерігався, як і для СВА, стаціонарний рівень протисудомної дії. Відмітною особливістю даної залежності у C57BL/6. є більш високий EDmax порівняно з таким показником у лінії СВА (він перевищує його в 1,6 рази). Нелінійні миші, генетично найбільш близькі до лінії мишей СВА, наближаються за характеристикою ефекту, що реєструється, до даної лінії. Разом з тим, у них EDmax значно вищий за такий показник у СВА. Використання для аналізу відносних величин ефекту (МЕДдосл./МЕДконт) (рис. 4) продемонструвало зберігання аналогічної тенденції у зростанні ефекту, максимально можливий ефект спостерігався у нелінійних мишей, найбільш низький показник – у СВА. Це є свідоцтвом високої чутливості нелінійних мишей до дії бікукуліну.

Рис. 4. Зміна відносних величин (МЕДдосл./МЕДконт) бікукуліну, що викликають КТС та ТЕ, у мишей при введенні їм циназепаму.

Порівняння фармакодинамічних параметрів залежності "доза-концентрація-протисудомний ефект" при введенні мишам 14С-мічених циназепаму та 3-оксіфеназепаму (табл. 3) показало, що максимальні ефекти обох препаратів не мають достовірних розбіжностей. Це може свідчити про істотний внесок у фармакологічний ефект циназепаму його метаболіту. В той же час, дози 3-оксіфеназепаму, що викликають 50% ефект (d50), на порядок менші такої величини для циназепаму (табл. 3).

Подальше вивчення кінетики вмісту препаратів в головному мозку мишей виявило істотні розбіжності між циназепамом та 3-оксіфеназепамом.

Таблиця 3

Параметри протисудомної активності циназепаму та 3-оксіфеназепаму при їхньому введенні мишам в дозі 1,4 мг/кг

циназепам

Параметр KTC ТЕ

ЕDmax 1,652±0,056 2,412±0,096

d50 0,717±0,038 0,603±0,0442

3 -оксіфеназепам

ЕDmax 1,248±0,960 2,161±0,542

d50 0,047±0,0216 0,039±0,0161

Для 14С-циназепаму характерна нелінійна залежність концентрації загального радіоактивного матеріалу та суми вільних метаболітів в головному мозку мишей залежно від доз, що вводяться, що зумовлено, в першу чергу, нелінійністю ферментативних процесів перетворення циназепаму в метаболіти в організмі мишей. Для 3-оксіфеназепаму характерне лінійне зростання загальної радіоактивності від дози препарату в інтервалі досліджених доз. Протисудомні ефекти циназепаму та його метаболіту є концентраційно-центральними.

Раніше було показано, що аліфатичні спирти є сполуками з ГАМК-міметичними якостями, тому нами були проведені дослідження фармакокінетики та фармакодинаміки 14С-етанолу в організмі мишей ліній, що віддають йому перевагу (C57BL/6) та не віддають (СВА) в умовах вільного вибору, та у їхніх гібридів (F1). Обгрунтована структура кінетичної схеми розподілу етанолу в організмі піддослідних тварин. Показаний перебіг в організмі мишей двох паралельних процесів елімінації 14С-етанолу – ферментативного (нульового порядку) та експоненційного. Спосіб введення та лінія мишей не впливали на виявлені закономірності процесу елімінації етанолу. Нами було показано, що швидкооборотні ефекти етанолу лінійно визначаються рівнем вмісту алкоголю в головному мозку, а оцінка ряду складних ефектів етанолу, включаючи цитотоксичний, найбільш строго корелює з площею під фармакокінетичною кривою фізіологічно активної речовини. Для процесів розподілу етанолу в організмі дослідних тварин характерне нелінійне збільшення площі під його фармакокінетичною кривою в тест-тканині в залежності від введених доз. Це може визначати співвідношення між фармакологічним ефектом та токсичними наслідками вживання етанолу.

Однією з головних задач сучасної фармакології є оптимізація фармакологічної дії лікарських речовин, яка дозволяє досягнути ефекту при найменшій вираженості побічної дії препарату. Однією з основних характеристик ліків є їхній терапевтичний індекс (ТІ). Нами розглянуті можливості оптимізації режимів введення ліків на основі визначення ТІ, настання та тривалості терапевтичної (tтер) та токсичної (tтокс) дії з урахуванням фармакокінетичних схем розподілу препарату. В якості дослідної моделі нами обрані наступні показники: час настання та тривалості міорелаксації (фармакологічний ефект, зумовлений взаємодією з ГАМКА-мс), "бокове положення" (відсутність рефлексу перевертання, подібна до коматозного стану, викликаного високими дозами етанолу) у мишей при дії етанолу в рамках одночастинної кінетичної схеми розподілу. Розраховано, що ТІ спирту дорівнює 1,18. Максимальна тривалість фармакологічної дії складає 133,67 хвилин. Величина (tтер.- tтокс.) для етанолу є величиною постійною. MRT ефектів достовірно не відрізняються (рис. 5).

Рис. 5. Залежність тривалості (DТ) ефектів міорелаксації (терапевтичної дії) та "бокового положення" (токсичної дії) у мишей від дози введеного етанолу (а) на фоні введення мусцимолу (б).

Введення мусцимолу змінює фармакологічну дію етанолу на організм піддослідних тварин, збільшуючи їхній ТІ та максимальний інтервал міорелаксуючої дії. Таким чином, показані можливості застосування фармакокінетичного аналітичного апарату до аналізу фармакодинамічних дослідних даних та можливості оптимізації режимів введення.

Висновки

У дисертації наведене експериментальне та теоретичне вирішення важливої наукової задачі сучасної фармакології - вивчення процесів функціонування in vivo ГАМКА-медиаторної системи ЦНС в умовах взаємодії з її екзогенними лігандами та визначення взаємозв'язку їхніх фармакокінетичних та фармакодинамічних показників у тварин різних ліній.

1. Розроблені математичні моделі та здійснено фармакологічний аналіз взаємодії екзогенних лігандів ГАМКА-мс ЦНС in vivo. Показана застосованість рівноважних кінетичних моделей для оцінки взаємодії феназепаму, Ro 15-1788 та судомних агентів та нерівноважних (в умовах зміни концентрації ендогенного медіатору) для аналізу ефектів етанолу та мусцимолу.

2. Дослідження та моделювання функціональної активності ГАМКА-мс при різному рівні ендогенного медіатору показало зміну спрямованості ефекту мусцимолу: в нормі викликає міоклонічні посмикування, а на фоні зниження рівню ГАМК, що досягається за рахунок введення ТСК, він завдає протисудомний ефект. Дія етанолу характеризується не тільки протисудомною активністю, але й достовірним зниженням летального ефекту, викликаного введенням ТСК.

3. Параметри фармакокінетики феназепаму в організмі мишей ліній СВА, С57ВL/6 та F1 виявляють достовірні відмінності: найбільша швидкість елімінації препарату з печінки, плазми крові та головного мозку спостерігалася у СВА, найменша – у С57ВL/6. По інтегральному показнику загального вмісту препарату в даному органі була виявлена наступна залежність: AUCC57BL/6>AUCCBA=AUCF1.

4. Елімінація феназепаму представлена сумою процесів першого порядку, а біотрансформація феназепаму в 3-оксіметаболіт – процесом нульового порядку. У мишей лінії СВА зниження рівню феназепаму та збільшення концентрації 3-оксіпохідного в плазмі крові, головному мозку та печінці проходило із більшою швидкістю, ніж у C57BL/6, після досягнення ним стаціонарного рівня.

5. Найбільш висока протисудомна дія феназепаму (ЕD50,max та d50, С50) спостерігалося у лінії BALB/c, найменша – у СВА, що відповідало розбіжностям швидкостей біотрансформації препарату в організмі тварин. Для мишей лінії СВА та C57BL/6 цей ефект є концентраційно-центральним. Концентрація 14С-продуктів в головному мозку мишей всіх ліній в залежності від доз феназепаму зростала лінійно.

6. Високий протисудомний ефект циназепаму залежить від генетичних особливостей дослідних тварин та зумовлений швидкістю його перетворення в активний метаболіт.

7. Процес елімінації етанолу складається із швидкої (нульового порядку) (0,17-4 год.) та повільної (експоненційної) (4-24 год.) фаз та не залежить від лінії тварин, що мають різну алкогольну мотивацію.

8. Для процесів розподілу етанолу та його метаболітів в організмі дослідних тварин характерне лінійне зростання концентрації в плазмі крові та мозку та нелінійне (параболічне) збільшення площі під їхньою фармакокінетичною кривою в тест-тканині залежно від введених доз. Це визначає співвідношення між фармакологічним ефектом та токсичними наслідками вживання етанолу.

9. Розроблено математичний апарат, що взаємопов'язує параметри фармакокінетики та показника фармакологічної дії (терапевтичного індексу) етанолу та мусцимолу.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Зіньковський В.Г., Головенко М.Я., Жук М.С. Міжлінійні відмінності фармакодинаміки феназепаму у мишей // Ліки. - 1996.- № 4. -С. 45-50.

2. Жук М.С., Зиньковский В.Г., Головенко Н.Я., Жук О.В., Федорова Е.А., Василинин Г.Б. Оценка быстрообратимых эффектов этанола и фармакокинетический прогноз. // Бюлл. эксперим. биологии и мед. - 1997.- № 6.-С. 673-676.

3. Головенко М.Я., Зіньковський В.Г., Жук М.С. Часова організація нейронних процесів у моделюванні особливостей механізмів та динаміки фармакологічних ефектів психотропних препаратів// Нейрофізіология. - 1999.- т.32.-№4.-С. 343-344.

4. Головенко Н.Я., Жук М.С., Зиньковский В.Г., Копаница М.В., Жук О.В. Фармакокинетика этанола у мышей с различной алкогольной мотивацией // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2001.- № 9.-С. 281-284.

5. Жук М.С. Обругрунтування підходів до оптимізації дії ліків на основі їх терапевтичних індексів та показників фармакокінетики // Одеський медичний журнал. - 2001. № 6.- С. 17-20

6. Жук М.С., Копаниця М.В., Станкевіч О.О. Аналіз нелінійних процесів фармакокінетики етанолу в організмі мишей // Тез. докл. Першого національного з'їзду фармакологів України. “Сучасні проблеми фармакології”. - 1995. -С. 62-63.

7. Zhuk M.S., Chekhovsky V.P., Silantiev S.A. Kinetic-dynamic modelling of tranquillizers and ethanol // Abst. IX conference on organic chemistry & biochemistry of young scientists. - 1995. - P.37.

8. Zhuk M.S., Zinkovsky V.G., Silantiev S.A., Zhuk O.V. Search for antiepileptic drugs on the basis of modelling of pharmacodynamics of GABA-mediator system // International Conference “focus on epilepsy IV” Canada, Montreal, August 26-29, -1997, -P.32

9. Zhuk M, Tokar G., Silantiev S. Modelling of the effects of GABAA and glycine receptor ligands on the dynamics of paroxysmal states and the neural network's stability//J. of Neurochemistry, v. 69.- Suppl. 1997. (Joint Sixteenth Biennial Meeting of the International Society for Neurochemistry. Boston. USA. July 20-26, -1997. P. S217.

10. Ivanova N.V., Tokar G.A., Sivachenko A.V., Zhuk M.S., Silantiev S.A, Sliskiy A.V. A comparative study of the anticonvulsant action of ethanol //2nd European congress of pharmacology. Budapest, Hungery, 3-7 July, -1999, p. 215s

11. Zhuk M. Modelling interaction of enogenic ligands GABAA-system in normal and pathological states.//Fourth conference of the Chech neuroscience society. Prague, October 26-27, -2001, p. 78.

АНОТАЦІЇ

Жук М. С. Фармакогенетичні особливості біокінетики екзогенних лігандів ГАМКА-рецептору. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук із спеціальності 14.03.05 – фармакологія. – Одеській державний медичний університет МОЗ України, Одеса, 2002.

Дисертація присвячена експериментальному вивченню та математичному моделюванню процесів взаємодії in vivo екзогенних лігандів ГАМК-рк. Було досліджено функціональні особливості ГАМК-рк in vivo в умовах взаємодії екзогенних лігандів різних субодиниць (мусцимолу, флюмазенілу, етанолу) при змінному рівні ендогенного медіатору. Описано механізми дії in vivo феназепаму, мусцимолу, Ro 15-1788 та етанолу з використанням фармакологічних моделей. Вивчений взаємозв'язок параметрів фармакокінетики та фармакодинаміки феназепаму, нової пролікарської сполуки - циназепаму та їх 3-оксіпохідного у мишей різних ліній (CBA, C57BL/6, F1). Фармакокінетика етанолу в організмі мишей не залежать від лінії тварин та модифікуючих факторів. Розроблен аналітичний апарат для визначення взаємозв'язку фармакокінетики лікарських сполук та терапевтичного індексу. Продемонстрована придатність математичної моделі для оцінки біокінетики етанолу та мусцимолу.

Ключові слова: ГАМКА-медиаторна система, фармакологічні ефекти лігандів, генетичні фактори, фармакокінетика, математичне моделювання.

Жук М.С. Фармакогенетические особенности биокинетики экзогенных лигандов ГАМКА-рецептора. – Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 14.03.05 – фармакология. – Одесский государственный медицинский университет МЗ Украины, Одесса 2002.

Диссертация посвящена изучению процессов функционирования in vivo ГАМК-медиаторной системы ЦНС в условиях воздействия модуляторов данной системы во взаимосвязи с их параметрами фармакокинетики и фармакодинамики в организме экспериментальных животных разных линий.

Исследованы функциональные особенности ГАМК-рк in vivo в условиях взаимодействия экзогенных лигандов различных субъединиц (мусцимола, флюмазенила и этанола) при изменяющемся уровне эндогенного медиатора (введения блокатора - и предшественника синтеза ГАМК g-оксибутирата). Показано выраженное судорожное действие тиосемикарбазида, противосудорожный эффект g-оксибутирата и мусцимола на фоне введения тиосемикарбазида и изменение направленности эффекта мусцимола: на фоне снижения “фонового” уровня ГАМК, достигаемого введением тиосемикарбазида, мусцимол оказывает противосудорожный эффект. для этанола характерна не только противосудорожная активность по всем показателям судорожного припадка, но достоверное снижение летального эффекта тиосемикарбазида. Это позволяет предполагать, что действие этанола проявляется и при снижении уровня эндогенного ГАМК и является миметическим.

Описаны механизмы действия in vivo феназепама, мусцимола, Ro 15-1788 и этанола с использованием оккупационных и динамических фармакологических моделей.

Изучена взаимосвязь параметров фармакокинетики и фармакодинамики феназепама и его 3-оксипроизводного у мышей различных линий (СВА, C57BL/6 и F1). Отмечена зависимость скорости окисления феназепама и параметров фармакокинетики от линии мышей. исследована фармакодинамика нового пролекарства циназепама и его активного метаболита -3-оксипроизводного в зависимости от генетических особенностей экспериментальных животных.

Сравнительный анализ фармакодинамики циназепама и его активного метаболита свидетельствует о существенном вкладе в фармакологический эффект циназепама его метаболита. Спектр и динамику фармакологического действия циназепама определяет нелинейный (ферментативный) процесс образования активного метаболита. Предложены математические модели, описывающие биокинетику пролекарств данного типа и показано, что путем изменения режима дозировок пролекарства можно управлять продолжительностью их действия.

Фармакокинетика этанола, как ГАМК-миметика, в организме мышей с различной алкогольной мотивацией описывается кинетической схемой, где процессы распределения включают два параллельных процесса: элиминации 14С-этанола - ферментативного (нулевой порядок) и экспоненциального. Скорость снижения содержания 14С-продуктов в интервале быстрой фазы не зависит от вводимой дозы и уровней содержания 14С-этанола