НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМiЯ НАУК уКРАЇНИ

iНСТИТУТ ФІЗІОЛОГiЇ ім. акад. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

Кузнєцов Ігор Ернестович

УДК 616.825.4 : 612.46

ФУНКЦІОНАЛЬНА ДИНАМІКА
ОСМОСЕНСИТИВНОЙ НЕЙРОННОЙ СИСТЕМИ ПРЕОПТИЧНОГО/ПЕРЕДНЬОГО ГІПОТАЛАМУСА

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ –2002

Дисертація є рукописом.

Робота виконана на кафедрі фізіології Донецького державного медичного університету ім. М. Горького (Міністерство Охорони здоров’я України)

Науковий консультант:

— академік АМН України,
доктор медичних наук, професор

Казаков Валерій Миколайович,

завідувач кафедрою фізіології,

ректор Донецького державного
медичного університету ім. М. Горького.

Офіційні опоненти:

— доктор біологічних наук, професор
Макарчук Микола Юхимович,
завідувач кафедрою фізіології людини та тварин
Київського Національного університету ім. Т. Шевченко

— доктор медичних наук, професор

Колесник Юрій Михайлович,

завідувач кафедрою патологічної фізіології

Запорізького державного медичного університету.

— доктор біологічних наук, професор

Косенко Анатолій Федорович,

професор кафедри фізичного виховання

Київського Національного університету ім. Т. Шевченко.

Провідна установа: Київський Національний медичний університет
ім. О.О. Богомольця

Захіст відбудеться “21” травня 2002 р. о 1400 годині на засіданні спеціалізованої вченої Ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (252024, Київ, вул. О.О. Богомольця, 4).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту.

Автореферат розісланий “ 20 ” квітня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої Ради

доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Марина

Вступ. Пластичність — фундаментальна властивість нервових систем хребцевих і деяких безхребетних, яка пов’язана із модифікацією нейронних мереж дорослих тварин під впливом сигналів, що оброблюються у цих мережах [Hebb, 1949; Malenka a. Nicoll, 1993; Воронін, 2000]. Вивчення феномену пластичності in vivo традиційно пов’язане з вищими функціями мозку (утворення умовних рефлексів, пам’ять, навчання і т.д.) [Ng et al. , 1996; Turrigiano, 1999; Кришталь та ін., 2000]. На сьогодні аналіз змін синаптичної ефективності, як правило, проводиться in vitro (тобто фактично на модельних системах) із використанням синхронної стимуляції якогось компактного нервового шляху і реєстрації постсинаптичних феноменів у нейронах досліджуваної мережі. Подібний підхід має певну перевагу з огляду на можливість прямого аналізу результатів контрольованих впливів (фармакологічних або інших) у компонентах мережі (у тому числі на мембранному і на молекулярному рівнях). Однак, штучно обмежений характер об’єкта досліджень і втрата більшості аферентних проекцій в процесі підготовки подібних препаратів істотно лімітують використання результатів експериментів in vitro для пояснення механізмів системної діяльності мозку.

При дослідженні синаптичної пластичності як in vivo, так і in vitro зміни властивостей нейронних мереж, як правило, викликалися застосуванням дискретних високоінтенсивних (в амплітудному, частотному і/або часовому аспектах) стимулів. Останнім часом, однак, з’ясувалося, що і тривалі зміни тих або інших параметрів гомеостазу (тобто низькоінтенсивні недискретні впливи, наприклад, зрушення водно-сольового балансу), здатні істотно модифікувати властивості відповідних нейронних мереж, залучених до регуляції цих параметрів [Hatton, 1997; Poulain et al., 1997]. Це явище, яке вперше було досліджене в гіпоталамусі, одержало назву функціонально обумовленої пластичності, або функціональної динаміки (ФД) [Theodosis et al. , 1998; Hussy et al. , 2000].

Введення даного терміну виявилося деякою мірою парадоксальним у двох відношеннях. Насамперед, даний феномен був виявлений у структурі, яка представляє собою вищий центр гомеостатичної вегетативної (у широкому розумінні цього терміна) регуляції. Підкірковим структурам взагалі, і гіпоталамусу зокрема при дослідженні пластичності раніше не приділялося значної уваги, можливо з тієї причини, що регуляція вісцеральної сфери a priori сприймалася як сукупність автоматичних (відносно ригідних) процесів. Крім того, основний виявлений експериментальний факт — зміна характеру нейроно-гліальних взаємовідносин — стосувався структурних перебудов [Laming et al., 2000; Garcia-Segura, 1996], а висновок про функціональні зміни синаптичної передачі в нейронних мережах гіпоталамуса робився лише посередньо [Hatton, 1997].

Таким чином, найважливішою передумовою для проведення нашої роботи з’явилася відсутність системних нейрофізіологічних досліджень ФД нейронних мереж, що контролюють гомеостатичні процеси.

Актуальність теми. Робота присвячена виявленню закономірностей структурних і функціональних перебудов нейронної мережі преоптичного/переднього гіпоталамуса (ПО/ПГ), причетної до підтримки водно-електролітного балансу які виникають при фізіологічних зрушеннях Na+/осмотичного гомеостазу. Характерною рисою дослідження є системний підхід — аналіз функціональної динаміки (ФД) досліджуваної нейронної мережі в цілому на основі оцінки електрофізіологічних і морфологічних властивостей досить репрезентативних популяцій осмосенситивних нейронів ПО/ПГ. Вибір даної нейронної мережі пов’язаний з тією обставиною, що осмосенситивні нейрони ПО/ПГ є найменш вивченою частиною розподіленої церебральної системи, яка контролює водно-електролітний баланс. До останнього часу в центрі уваги знаходилися лише сенсорні та еферентні/ефекторні ланки цієї системи: хемосенситивні нейрони циркумвентрикулярних органів антеровентральної стінки III-го мозкового шлуночка і нейросекреторні нейрони супраоптичного (СОЯ) і паравентрикулярного (ПВЯ) ядер гіпоталамуса [Rowland, 1998]. Нейрофізіологічним же властивостям інтегративної інтернейронної ланки центральної системи осморегуляції, істотною частиною якої (як буде показано нижче) є нейрони ПО/ПГ, до цього часу не приділялося належної уваги.

Руйнування перивентрикулярної зони ПО/ПГ викликає адипсію, зниження діурезу, пригнічення питної поведінки, яка виникає у відповідь на гіперосмію і значне зменшення дипсогенної реакції, що викликається ангіотензином. Іншими словами, локальне руйнування ПО/ПГ приводить до різких порушень водно-електролітного балансу організму і відповідних компонентів поведінки [Andersson et al., 1965; Fitts, 1991, Thunhorst, 1997]. Крім того, були отримані дані про те, що серед нейронів ПО/ПГ певна частина являє собою осмосенситивні одиниці [Boulant a. Silva, 1984]; в той же час існують підстави думати, що суттєвою особливістю нейронів даної структури є полімодальний характер їхніх входів.

Вважалося цілком імовірним, що клітини ПО/ПГ організовані в досить складну мережу, яка містить в собі як релейні одиниці, так і гальмівні нейрони [Jourdain et al., 1999]. Аксони нейронів цієї мережі спрямовані, головним чином, до дендритів нейронів СОЯ і ПВЯ, де утворюють близько половини гальмівних і більше чверті збуджуючих входів до нейросекреторних клітин цих ядер, які являють собою еферентні/ефекторні одиниці гіпоталамічної системи осморегуляції. Таким чином, нейронна мережа ПО/ПГ може бути охарактеризована як інтернейронний інтегративний компонент даної системи.

Сукупність накопичених до теперішнього часу даних свідчить про те, що нейронна мережа ПО/ПГ грає суттєву роль у регуляції водно-електролітного балансу. Разом з тим, на момент початку нашого дослідження: (1) характеристики і функціональне значення осмосенситивних нейронів (ОСН) ПО/ПГ не були остаточно визначені; (2) систематичний опис електрофізіологічних властивостей ОСН цієї ділянки гіпоталамуса був відсутній; (3) динаміка нейрофізіологічних характеристик осмосенситивних нейронів ПО/ПГ, що пов’язана зі змінами функціонального навантаження на Nа+/осморегулюючу систему, не була безпосередньо досліджена; (4) порівняльний морфометричний аналіз різних зон ПО/ПГ не проводився; дані про морфологічні зміни нейронів ПО/ПГ при різноспрямованому функціональному навантаженні були обмежені відомостями про модифікацію нейроно-гліальних відношень. Крім того, існуючи методи створення функціонального навантаження на Nа+/осморегулюючу систему, які були використані в попередніх дослідженнях, в тому чи іншому ступені не відповідали вимогам фізіологічної адекватності, що надало підставу для розробки нами оригінальної моделі індукції зрушень водно-електролітного балансу у експериментальних тварин. Слід вважати, що з’ясування цих питань може виявитися досить важливим як у фундаментальному теоретичному, так і в практичному аспектах. Усе вище згадане і визначає актуальність даної роботи.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота виконувалась як фрагмент теми: “Центральні механізми регуляції гомеостазу”. Тема запланована і виконувалася на кафедрі фізіології Донецького державного медичного університету ім. М. Горького під керівництвом академіка АМН України В.М. Казакова в 1997-2000 роках (№ держреєстрації 0100 U 000051).

Мета і задачі дослідження.

Мета представленої роботи — описати функціональну динаміку аферентних і інтегративних властивостей осмосенситивних нейронів переднього/преоптичного гіпоталамуса (ПО/ПГ), проаналізувати можливі механізми модифікації нейрофізіологічних властивостей цих нейронів при різноспрямованих функціональних навантаженнях, визначити роль ПО/ПГ в розподіленій церебральній системі, яка контролює водно-електролітний обмін, і оцінити ступінь морфологічних перетворень клітинних елементів ПО/ПГ за умов функціонального навантаження.

Задачі дослідження:

1. Розробити експериментальну модель індукції різноспрямованих зрушень водно-сольового гомеостазу (експериментальної гіпер- і гіпонатріємії). Проаналізувати адекватність, специфічність і часову динаміку зрушень, які індукувалися.

2. Провести порівняльний морфологічний і морфометричний аналіз різних зон ПО/ПГ у контрольній і експериментальних групах. Оцінити виразність і специфічність структурних змін ПО/ПГ за умов різноспрямованих функціональних навантажень на Na+/осморегулюючу систему.

3. Відпрацювати процедуру ідентифікації осмотичної чутливості нейронів ПО/ПГ на підставі кількісних критеріїв.

4. Описати характеристики фонової імпульсної активності (ФА) осмосенситивних нейронів ПО/ПГ в контрольних умовах.

5. Використовуючи досить широкий набір різномодальних стимулів (тест-впливів) провести систематичний аналіз нейрофізіологічних властивостей осмосенситивних нейронів ПО/ПГ в контрольних умовах.

6. Надати характеристику модифікацій осмотичної чутливості нейронів ПО/ПГ за умов експериментальної гіпер- і гіпонатріємії.

7. Проаналізувати зміни характеристик ФА осмосенситивних нейронів ПО/ПГ у гіпер[Na+]- і гіпо[Na+]-групах в порівнянні з контролем.

8. Визначити ступінь модифікації реакцій осмосенситивних нейронів ПО/ПГ на різномодальні тест-впливи за умов функціональних навантажень на Na+/осморегулюючу систему.

Наукове значення і новизна отриманих результатів.

Вперше на рівні характеристик і реакцій окремих нейронів преоптичного/переднього гіпоталамуса (ПО/ПГ) безпосередньо досліджені прояви функціональної динаміки (ФД) нейронної мережі, яка причетна до регуляції водно-електролітного балансу, за умов відповідних функціональних навантажень.

Показано, що цю мережу можна розглядати як інтернейронну інтегративну ланку розподіленої системи осморегуляції; значна частина нейронів даної мережі є осмосенситивними одиницями, але в той же час вони здатні реагувати на неосмотичні впливи і низхідні впливи від структур лімбічної кори.

Запропонована оригінальна модель створення тривалих протилежних зворотних змін водно-сольового балансу у експериментальних тварин з використанням фармакоіндукованих зрушень в системі підтримки Nа+/осмотичного гомеостазу; визначений ступінь адекватності такої моделі і часові рамки її застосування.

Вперше проведено диференційний морфометричний аналіз клітинних елементів ПО/ПГ. Показано, що стани експериментальної гіпер- і гіпонатріємії призводять до специфічних змін гістологічних характеристик нейронів ПО/ПГ.

З використанням запропонованого кількісного критерію показано, що більш 2/3 нейронів ПО/ПГ проявляють високу чутливість до мінімальних зрушень осмолярності в басейні а. саrоtis. Виділено типи імпульсних реакцій нейронів ПО/ПГ на гіпер- і гіпоосмотичну стимуляцію та описані характеристики цих реакцій.

Описано часову структуру фонової активності (ФА) осмосенситивних нейронів ПО/ПГ. Вперше показано, що зрушення Nа+/осмотичного гомеостазу призводять до специфічних перетворень спектра середніх частот ФА; цей феномен названий нами як “селектування частот”.

Виділено два основних типи ФД нейронної мережі ПО/ПГ — активуючий й обмежувальний. Вперше показано, що при створенні різноспрямованих функціональних навантажень на систему осморегуляції ФД нейронної мережі ПО/ПГ у відношенні як гіпер-, так і гіпоосмотичної стимуляції є обмежувальною, що проявляється у зниженні загальної реактивності нейронів мережі і збільшенні індексу гальмування — ІГ (відношення кількості нейронів з первинними гальмовими й активаційними реакціями). Аналогічні прояви ФД виявлені відносно низхідних впливів, які надходять від кортикальних структур лімбічної системи (тенденція до функціональної ізоляції від низхідних кортико-гіпоталамічних впливів). Продемонстровано, що стосовно деяких неосмотичних тест-впливів (термічних і глюкозних) можливим є прояв активуючого типу ФД (пов’язаного зі збільшенням загальної реактивності нейронів ПО/ПГ), в основному за умов гіпонатріємії. Таким чином, обмежувальний тип ФД за умов зрушень водно-сольового балансу явно переважає.

Вперше запропонована гіпотетична схема зміни ефективності синаптичних зв’язків між нейронами ПО/ПГ, що лежать в основі простежених проявів ФД доної мережі.

Теоретичне та практичне значення роботи. Отримані в роботі результати і їх інтерпретація мають фундаментальне теоретичне значення, оскільки з’ясування принципів модифікації нейронних мереж при зміні умов їх функціонування є одним із ключових питань сучасної нейробіології. Отримані дані можуть викликати особливий інтерес спеціалістів у галузях нормальної і патологічної фізіології та теорії керування, оскільки прямому дослідженню піддана ФД нейронної мережі, яка причетна до контролю гомеостатичних параметрів, а саме контролю водно-електролітного гомеостазу.

Принциповими особливостями проведеного дослідження є системний підхід; комплексний опис морфологічних та електрофізіологічних властивостей популяцій нейронів, ідентифікованих за функціональною ознакою в експериментах in vivo; особлива увага до інтегративних функцій досліджуваної мережі у відношенні аферентних впливів різної модальності і з’ясування характеру модифікації властивостей даної мережі за умов дії адекватних функціональних навантажень (гіпер- або гіпонатріємії), що не виходять за фізіологічні межі.

Виявлені деякі нові фізіологічні феномени, які вимагали визначення шляхом введення нових термінів (ФД активуючого й обмежувального типів, селектування частот фонової імпульсної активності). Запропоновано оригінальну концепцію механізмів ФД нейронної мережі ПО/ПГ за умов функціональних навантажень і гіпотетичну схему синаптичних механізмів таких модифікацій.

Одним із аспектів практичного значення роботи є розробка оригінальної експериментальної фармакологічної моделі створення протилежних зворотних зрушень водно-сольового гомеостазу. Подібний методичний підхід, а також ряд використаних у роботі прийомів аналізу одержаних даних, можуть широко використовуватися в близьких за напрямком експериментальних дослідженнях.

Результати роботи та їх інтерпретація можуть бути використані в клінічній практиці під час аналізу патогенезу вісцеральних порушень, які спостерігаються при дистоніях, діенцефальному синдромі та неврозах.

Дані проведеного дослідження можуть бути використані в навчальному процесі при вивченні курсів нормальної і патологічної фізіології.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок автора складається у визначенні мети і задач роботи, проведенні експериментальних досліджень й аналізу отриманих результатів, у формулюванні основних положень і висновків. У дисертації не використовуються ідеї і розробки, що належать співавторам опублікованих робіт.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що увійшли до цієї роботи, були представлені на: XIV і XV з’їздах фізіологів України (Київ, 1994; Донецьк, 1998); I і II з’їздах Європейського фізіологічного товариства (Маастріхт, 1995; Прага, 1999); XXXIII Всесвітньому конгресі фізіологічних наук (Санкт-Петербург, 1997); науковій конференції, присвяченій 100-річчю кафедри нормальної фізіології СПбДМУ (Санкт-Петербург, 1998), I установчій і II конференціях Українського товариства нейронаук (Київ, 1998; Донецьк, 2001); міжнародних конференціях: “Механізми функціонування вісцеральних систем” (Санкт-Петербург, 1999, 2001); міжнародній конференції: “Basic and Applied Thermophysiology” (Мінськ, 2000); XVIII з’їзді Російського фізіологічного товариства (Казань, 2001).

Публікації. Результати дисертації опубліковані у 27 статтях у вітчизняних і закордонних наукових журналах, 25 тезах і збірках наукових праць, матеріалах з’їздів і конференцій.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи досліджень. Загальний принцип проведення експериментів був такий: (1) в експериментах на тваринах (кішки) створюються фізіологічні умови трьох стандартних типів: контрольні та пов’язані з різноспрямованими функціональними навантаженнями на Na+/осморегулюючу систему (умови гіпер- і гіпонатріємії); (2) дані біохімічних досліджень крові і сечі служать показником ступеня зміни фізіологічних умов; оцінюється також неспецифічний, пов’язаний з дією експериментальних впливів, стресорний компонент, що дає можливість судити про адекватність використаної моделі; (3) описуються в морфологічному і електрофізіологічному аспектах властивості популяції осмосенситивних нейронів ПО/ПГ, які спостерігаються в тих чи інших умовах; (4) контролюється (відповідно до біохімічних і морфологічних показників) зворотність змін, що спостерігаються. Основна частина даної роботи присвячена аналізу електрофізіологічних проявів ФД мережі осмосенситивних нейронів ПО/ПГ; біохімічні і морфологічні дані можуть розцінюватися як в певній мірі допоміжні.

Модель створення функціонального навантаження на систему Na+/осморегуляції. Експерименти проведені на 23 безпородних дорослих кішках обох статей вагою 2,5-3,2 кг. Відбиралися здорові тварини, яких розміщували у віварії за умов стандартного температурного режиму і фотоперіодичності. Стандартизований корм і дистильована вода були доступні ad libitum. Через три доби первинної адаптації тварин з нормальним ритмом фізіологічних відправлень розміщували в стандартних метаболічних клітках напівзакритого типу. Визначали добове споживання води і їжі, об’єм сечі, що виділяли тварини, концентрації Na+, K+ і кортизолу в плазмі крові й сечі; розраховували добову екскрецію визначених іонів і глюкокортикоїду (ГК). Концентрацію Nа+ і К+ вимірювали за допомогою полум’яної фотометрії (аналізатор рідин ПАЖ-1, “Аналитприбор”, Україна), концентрацію кортизолу визначали радіоімунологічним методом з використанням комерційних наборів фірми “ImmunoTech” (Франція) і лічильника гамма-імпульсів “Gamma” (Угорщина). Похибка пробоприготування не перевищувала 3%.

Тварини були розподілені на три групи: контрольну (n=5) і дві експериментальні (n=9), яким вводили дезоксикортикостерону ацетат (ДОКСА) або 7?-ацетилспіронолактон (АСЛ). Ін’єкцію ДОКСА виконували підшкірно (0,05% масляний р-н) в дозі 50 мкг/кг щодня протягом трьох днів. АСЛ вводили перорально через зонд (0,5 мл р-ну) у дозі 1 мг/кг. Тварини контрольної групи отримували підшкірні ін’єкції 0,1 мл розчинника (олії) чи піддавалися пероральному введенню 0,5 мл 0,9% р-ну NaCl. Узяття крові у тварин та усі вищезгадані маніпуляції здійснювалися в інтервалі між 8 і 9 г ранку.

Морфологічні дослідження. Використовувалася стандартна процедура підготовки тварин (див. вище). Обстежено 5 експериментальних груп, кожна з яких містила по 5 тварин: контрольна, ДОКСА-, АСЛ-, ДОКСА/відновлення- і АСЛ/відновлення-групи. По завершенню підготовки тварин виводили з експерименту летальною дозою нембуталу, вилучали головний мозок, виділяли ділянку ПО/ПГ і фіксували її за Шабадашем протягом 24 г. Відповідно до загальногістологічних методів здійснювали дегідратацію, просвітлення і заливку матеріалу в парафін. З парафінових блоків готували гістологічні зрізи товщиною 5±1 мкм, які фарбували толуїдиновим синім за Нісслем. На серійних гістопрепаратах визначали топографію відповідних 5-ти зон ПО/ПГ, у кожній з яких підраховували відносну кількість різних типів нервових і гліальних клітин. Диференціацію різних типів гліоцитів виконували відповідно до рекомендацій А. Хем, Д. Кормак (1983). За допомогою оптичного мікроскопа (Olympus BX-40), обладнаного цифровою фотокамерою, з використанням відповідних комп’ютерних програм (Olympus DP-Soft) визначали площі поперечних перерізів нейронів, присутніх на препаратах (враховувалися тільки перикаріональні перерізи), та розраховували умовні діаметри цих клітин, тобто діаметри кіл, рівновеликих площам їхніх перерізів [Василенко та ін., 1984]. Розраховували також нейроно-гліальне відношення (НГВ) — середнє значення відношення кількості нейронів до кількості гліоцитів в 10-ти полях зору в кожній зоні на серійних препаратах. Обробку одержаних числових даних проводили за допомогою пакету прикладних комп’ютерних програм статистичного аналізу Statistica 5,0 (StatSoft, США).

Електрофізіологічні дослідження. Експерименти проведені на 33 безпородних дорослих кішках обох статей масою 2,5-3,2 кг із використанням змішаного наркозу (кетамін, 25 мг/кг та інгаляція N2O, 75 об.%). Тварини склали три групи: контрольну (n=9) і дві експериментальні групи — з гіпер- і гіпонатріємією (гіпер[Na+]- і гіпо[Na+]-групи відповідно, n=12). Оперативна підготовка включала венесекцію і катетеризацію v. femoralis, введення Т-подібного трійника в a. carotis dextra, трахеостомію, дренування великої потиличної цистерни шляхом розсічення membrana atlantooccipitalis posterior, трепанацію черепа, оголення кори головного мозку і часткову аспірацію тканини лівої півкулі до дна латерального шлуночка.

Введення мікроелектродів для позаклітинного відведення від нейронів ПО/ПГ виконувалося під кутом 72° до горизонтальної стереотаксичної площини через контралатеральну півкулю мозку. Для захисту кінчика мікроелектрода використовувався протектор — піпетка більшого діаметра з незалежним від руху мікроелектрода переміщенням, через яку подавався реєструючий мікроелектрод. В якості мікроелектродів використовували скляні мікропіпетки, заповнені 2,0 М р-ном NaCl (опір 10-20 МОм). Короткострокові зрушення осмолярності плазми крові у внутрішньомозковому кровотоці викликалися шляхом інфузій в іпсилатеральну a. carotis 0,1-0,4 мл 3,0% або 0,1-0,5 мл 0,2% р-ну NaCl (гіпер- і гіпоосмотичні впливи відповідно). Темп інфузій складав 50 мкл/с. Контроль волюм-ефекту здійснювався шляхом введення таких же об’ємів 0,9% р-ну NaCl. Інтервал між інфузіями складав не менше 4 хв (звичайно 8-10 хв). Сумарний об’єм розчинів, що вводилися в одному експерименті, не перевищував 15 мл. Для проведення досліджень був використаний оригінальний комп’ютеризований апаратний комплекс, розроблений в нашій лабораторії [Казаков та ін., 1998-2001]. Процедура реєстрації реакцій нейрона на осмотичну стимуляцію запускалася в тому випадку, якщо його ФА мала стаціонарний характер; програма реєстрації містила в собі чотири фази: 30 с — фон, 3-5 с — стимуляція, 30 с — період післядії, 30 с — відновлення.

Подразнення ніжки гіпофізу для антидромної ідентифікації нейронів СОЯ, які утворюють проекції в нейрогіпофіз (нейросекреторних еферентних/ефекторних одиниць гіпоталамуса), виконували електричним струмом силою біля 100 мкА через біполярні ніхромові електроди (діаметр 100 мкм, міжелектродна відстань 1,0 мм). Застосовувалися одиночні, парні і пачкові (3-5 стимулів) подразнення прямокутними імпульсами тривалістю 50 мкс. Електрична стимуляція кортикальних ділянок здійснювалася схожими стимулами через біполярні вольфрамові електроди (міжелектродна відстань 0,8 мм), які розташовували в дорсальному гіпокампі (ділянка СА3), периамігдалярній, передній цингулярній (поле 24) і префронтальній (поле 8) ділянках кори мозку. Стандартна інтенсивність стимуляції кожної кортикальної ділянки відповідала двом порогам виникнення викликаного потенціалу в даній зоні.

Для оцінки температурної чутливості нейронів використовували локальну і генералізовану термостимуляцію шкіри, яка не призводила до змін ректальної температури. Локальна стимуляція проводилася шляхом нагрівання чи охолодження шкіри подушечки контралатеральної передньої кінцівки за допомогою оригінального термостимулятора (на базі термоелектричної батареї Пельтьє) [Казаков та ін. 1998-2001]. Величина підвищення чи зниження температури поверхні термоелементу відносно фонового рівня, який стабілізували, лежала в межах від -7 до +7°С; загальна тривалість впливу звичайно не перевищувала 45 с, крутизна наростання (спаду) температури дорівнювала 0,5°С/с. Генералізована термостимуляція виконувалася шляхом охолодження всієї шкірної поверхні, крім голови, за допомогою прокачування води різної температури через спеціальний теплообмінний кожух, що покривав тіло тварини.

Чутливість нейронів до підвищення системного кров’яного тиску (СКТ) визначалася за зміною частоти розрядів клітин на фоні фармакоіндукованої пресорної реакції. Короткострокові підвищення СКТ викликали введенням у v. femoralis 0,002%-го р-ну фенілефрину (0,33-1,30 мкг/кг). Збільшення СКТ, яке вимірювали в a. сarotis за допомогою електронного манометра, відносно вихідних значень (14,7-17,3 кПа) досягало 3,9-6,7 кПа, тобто, відповідало 25-40%-му приросту.

Статистичний аналіз імпульсної активності (ІА) нейронів складався з побудови частотограм (гістограм середньої частоти в 1-секундних бінах), гістограм розподілу тривалостей міжімпульсних інтервалів (МІІ) і аутокорелограм МІІ. Вірогідність розходжень значень середніх частот ІА нейронів, які розраховували до, під час стимуляції й у період післядії, визначалася за допомогою критерію U (Вілкоксона-Манна-Уітні); розходження вважалися значущими при PU<0,05. Вірогідність розходжень між розподілами тривалості МІІ у зазначені фази визначалася за допомогою критерію ?2. Використовували пакет прикладних програм Statistica 5,0 (StatSoft, США). Розходження вважалися достовірними при р<0,05.

Гістологічну верифікацію локалізації подразнюючих і реєструючого електродів проводили на серійних фронтальних зрізах головного мозку. Зрізи товщиною 90-100 мкм виготовляли за допомогою заморожуючого мікротома з заморожених блоків досліджуваних ділянок мозку, які фіксували у 10% р-ні нейтрального формаліну, фотографували і накладали на карту відповідного фронтального розрізу з атласу Рейнозо-Суареца (1961).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Експериментальна модель. Введення ДОКСА не приводило до достовірних змін діурезу, однак концентрація електролітів у сечі та їх екскреція істотно змінювалися. Концентрація К+ ([К+]) і його екскреція зростали, а концентрація Na+ ([Na+]) та екскреція іона із сечею знижувалися, причому зміни цих параметрів ставали достовірними з 3-го дня введення ДОКСА. На максимумі змін середні значення [К+] в сечі і величина екскреції цього іона перевищували вихідні значення на 46,8% і 44,3% відповідно, а негативні зрушення концентрації та екскреції Na+ складали 60,9% і 69,2% відповідно.

[Na+] у плазмі крові кішок, що отримували ДОКСА, збільшувалася (у максимумі реакції на 4,3% вище від середнього вихідного значення), але ці зміни не досягали рівня вірогідності (р>0,05) через істотну варіабельність індивідуальних значень. [К+] у плазмі крові змінювалася значніше — достовірне зниження розвивалося з 3-ї доби введення ДОКСА і складало в середньому 9,6%. Слід, однак, відзначити, що цей ефект був нетривалим.

Введення АСЛ у дозі 1 мг/кг приводило до достовірного збільшення діурезу та інтенсивності екскреції Na+, а також до зменшення екскреції К+ в результаті зниження його концентрації в сечі. Ефект введення АСЛ розвивався відносно повільно, і зміни досліджуваних показників ставали достовірними лише на 4-5 добу. Середнє значення діурезу в даний момент перевищувало вихідну величину на 36,2%. [К+] у сечі знижувалася в порівнянні з вихідним значенням в середньому на 60,4%, тоді як [Na+] — менше (на 16,4%). В результаті інтенсивність екскреції К+ знижувалася в середньому на 31,6%, а Na+ — збільшувалася на 57,3%. Зміни [Na+] і [К+] у плазмі крові мали протилежний характер і схожу динаміку; ці зрушення досягали максимуму на 6-7 день після початку введення препарату. В цей момент зниження [Na+] у плазмі (у середньому —5,8%) ставало достовірним (р<0,05). Приріст [К+] на 6-й день досягав 6,3% (p<0,05). Екскреція кортизолу у порівнянні з вихідними значеннями зростала в середньому на 23,1%; максимальний приріст концентрації цього ГК у плазмі крові складав 47,9%.

З огляду на те, що осмолярність плазми на 95% визначається [NaCl], особлива увага була приділена змінам [Na+], середні значення якої в контрольній групі дорівнювали 152,8±5,8 мМ. На максимумі реакції в ДОКСА-групі відповідні величини складали 158,4±11,2 мМ, а в АСЛ-групі — 144,3±12,1 мМ. Абсолютні зрушення [Na+] склали, таким чином, +5,6 мМ (3,9%) і –8,5 мМ (5,9%), що дозволяє говорити про помірну гіпернатріємію в ДОКСА- і гіпонатріємію в АСЛ-групі. Крім того, зміни [Na+] були цілком зворотними (до 5–6-го дня в ДОКСА-групі і до 8-9-го — в АСЛ-групі). Отримані дані свідчать, що розроблена нами модель створення функціональних навантажень на систему регуляції водно-сольового гомеостазу може вважатися досить адекватною протягом 3-4-ї доби після початку введення ДОКСА і 5-6-ї доби після початку введення АСЛ. В дані моменти екскреторна функція нирок стосовно Na+, К+ і води істотно змінюється, і [Na+] та [К+] у плазмі крові протягом деякого часу помітно відрізняються від вихідних рівнів. Разом з тим, як позитивні, так і негативні зрушення [Na+] і [K+], як правило, не перевищують 10% вихідних значень цих параметрів. Оскільки зрушення [Na+] і [K+] в обох експериментальних групах різноспрямовані, а вміст води в плазмі також змінюється максимально на декілька відсотків, зміни осмолярності плазми у тварин обох груп не досягають патологічних значень.

Істотною характеристикою адекватності експериментальних моделей, подібних до нашої, є ступінь їх зв’язку зі стресом. Оцінка стресогенності за рівнем ГК (кортизолу) у плазмі крові показала, що значення даного показника в ДОКСА- і АСЛ-групах зростали в середньому приблизно у 1,3-1,5 рази. Це цілком природно, оскільки стрес і, відповідно, приріст секреції кортизолу і його рівня в крові супроводжує будь які маніпуляції з тваринами. Згідно з загальновизнаним поглядом, виражений стрес супроводжується 5-10-разовим підвищенням концентрації ГК у плазмі. Таким чином, за умов нашої моделі зрушення [Na+] і [К+] у плазмі виникали на фоні стресових реакцій слабкого чи середнього ступеня. Це дозволяє вважати, що зрушення функціональної активності досліджуваних нейронних мереж, залучених до регуляції водно-сольового обміну, є достатньо специфічними.

Морфологічні дослідження різних зон фронтального перерізу ПО/ПГ показали, що як у групі контролю, так і в групах з експериментальною гіпер- і гіпонатріємією нейрони досліджуваної структури характеризуються вираженим поліморфізмом. Серед нейроцитів у всіх трьох групах спостерігалися клітини з різними рівнями базофільності ядра — “світлі” і “темні” нейрони. В цих двох групах в свою чергу міг бути виділений ряд підгруп залежно від відносного об’єму цитоплазми, рівномірного чи нерівномірного характеру розподілення в ній хроматофільної субстанції, об’єму, інтенсивності забарвлення і текстури ядра. Відомо, що особливості забарвлення за Нісслем корелюють з різними функціональними особливостями нервових клітин. Оскільки даний метод виявляє специфічну органелу нейроцита — хроматофільну субстанцію, то характер її забарвлення є морфологічним відображенням функціонального стану нейронів (тривала активація приводить до зниження вмісту і змін тинкторіальних властивостей тигроїду, кількість якого відновлюється в стані спокою). Розповсюдженою є думка про те, що “темні” клітини є неактивними чи резервними одиницями, а “світлі” — активно функціонуючими [Леонтович, 1978]. При цьому клітини з полярно диференційованою цитоплазмою (за рахунок нерівномірного реагування хроматофільної субстанції) вважаються активно функціонуючими, а зменшення відносного об’єму цитоплазми може свідчити про вступ клітин у фазу загасання своїх функцій. Певна частина “темних” нейроцитів з ознаками каріо- і цитопікнозу, можливо, є нейронами, в яких почалися апоптичні зміни.

Результати наших експериментів показали, що зрушення в стані систем осморегуляції приводять до помітних змін відносної кількості нейронів з різними типами забарвлення за Нісслем. Найбільш загальним феноменом виявилося те, що стан і гіпер-, і гіпонатріємії звичайно корелював з помітним збільшенням відносного числа “світлих” нейронів у ПО/ПГ. Зміни в різних зонах ПО/ПГ характеризувалися певною специфікою. Це дозволяє припустити, що глобальним ефектом зрушень Na+/осмотичного гомеостазу у відношенні нейронів ПО/ПГ є збільшення кількості нервових елементів з підвищеним рівнем метаболізму, причому незалежно від напрямку гомеостатичних зрушень.

Іншим морфологічним феноменом, який супроводжував експериментальні зрушення Na+/осмотичного гомеостазу, є зміна розмірів нейронів ПО/ПГ. І в цьому випадку характер змін даного параметра мало в чому залежав від напрямку змін осмолярності плазми. Фактично єдиною різницею було те, що стан гіпернатріємії супроводжувався неспецифічним зростанням умовного діаметру нейроцитів у всіх п’ятьох досліджуваних зонах ПО/ПГ, тоді як при гіпонатріємії схожі зміни обмежувалися лише латеральними відділами даної структури.

Наші вимірювання показали наявність в латеральних ділянках ПО/ПГ двох різних за розмірами популяцій нейронів — дрібних і великих. Збільшення розмірів нейронів за умов зрушень Na+/осмотичного гомеостазу в значно більшому ступені стосувалася дрібних нейронів: в даних умовах популяція таких клітин зменшувалась чи навіть взагалі зникала, і бімодальні за умов контролю розподіли трансформувалися в унімодальні чи наближались до них. Нам поки важко запропонувати які-небудь обґрунтовані функціональні інтерпретації описаної вище морфологічної феноменології. Імовірно, це є відображенням уже згаданої вище активації внутрішньоклітинних метаболічних процесів за умов зміненого (у будь-який бік!) Na+/осмотичного гомеостазу.

Були також проаналізовані зміни нейроно-гліального відношення (НГВ). У групі контролю НГВ у всіх досліджуваних зонах мало однаковий порядок і коливалося від 0,52 до 0,74. Умови гіпернатріємії приводили до істотного підвищення (на 24,5-43,5%) НГВ в медіальному і дорсальному відділах ПО/ПГ; у центральній частині даний параметр трохи зменшувався (на 11,3%), а в зоні СОЯ залишався практично без змін. За умов гіпонатріємії зміни НГВ у всіх зонах фронтального перерізу ПО/ПГ були інваріантними — цей параметр зменшувався (особливо помітно — у латеральних і вентральних ділянках, на 36,5-62,3%).

У двох спеціальних серіях морфологічних досліджень (по 5 тварини у кожній) вилучення морфологічного матеріалу виконувалось не по завершенню циклу введення ДОКСА чи АСЛ, а через чотири доби після закінчення досліду. Виміри і розрахунки, аналогічні описаним вище, показали, що більшість аналізованих морфологічних характеристик клітинних елементів практично поверталися до контрольних значень чи виявляли певну тенденцію в такому напрямку. Зазначені обставини підтверджують, що використана нами модель створення різноспрямованих зрушень іонних співвідношень і осмотичного тиску електролітів плазми є досить адекватною. Зрушення, які моделювались, були реактивними, цілком зворотними і не викликали розвитку яких-небудь довгострокових патологічних змін у тканинах головного мозку.

Нейрофізіологічні дослідження. Стабільне відведення ІА вдалося здійснити від 357 нейронів ПО/ПГ. Частота ФА цих нейронів складала 0,1–25,1 с-1, хоча в більшості клітин (228/357, 64%) частота не перевищувала 5,0 с-1. З аналізу були виключені 106 клітин через: (1) нестаціонарний характер ФА — 34; (2) особливо низької їх частоти (< 0,2 с-1) — 19; (3) нестабільності відведення під час стимуляції чи в період післядії — 53. За повними програмами були проаналізовані реакції 251 нейронів ПО/ПГ (у гіпер[Na+]-групі — 94; у гіпо[Na+]-групі — 83 і в контрольній — 74).

Осмотична чутливість нейронів ПО/ПГ. Належність нейронів ПО/ПГ до системи підтримки Na+/осмотичного гомеостазу визначалася за їх реакціями, які розвивалися у відповідь на короткострокове підвищення чи зниження осмотичного тиску в басейні a. carotis. Порогові інтенсивності осмотичних впливів відповідають інфузіям 0,1-0,2 мл 0,2% та 3,0% р-нів NaCl. Критерієм для ідентифікації нейронів ПО/ПГ як осмосенситивних була зміна частоти розрядів їх ФА як мінімум на 35%. Латентні періоди (ЛП), виразність і тривалість реакцій нейронів ПО/ПГ, які викликалися короткостроковими зрушеннями осмотичного гомеостазу суттєво варіювали. Ми поділили такі реакції на два основні види — монофазні (“чисто” активаційні чи гальмівні) і двофазні (активація, що змінюється гальмуванням чи, навпаки, активація після гальмування). Відповідно нами враховувалися чотири типи реакцій нейронів ПО/ПГ на осмотичну стимуляцію (А-, Г-, АГ- і ГА-типи).

У контрольній групі при гіпоосмотичній стимуляції істотні зміни частоти розрядів (>35%) виникали у 46 з 74 обстежених нейронів ПО/ПГ (62%); при гіперосмотичній стимуляції — у 54 з 74 (73%), тобто індекси загальної реактивності при обох впливах були досить близькі. За літературними даними в експериментах in vitro близько 55% нейронів ПО відповідало на зміну осмолярності в суперфузаті при порогових значеннях порядку 15 мосмол [Nakashima et al., 1985]. Повідомлялося також, що до 60% термосенситивних нейронів переднього гіпоталамусу відповідали в умовах in vivo на зміну осмолярності плазми крові в гепатопортальній частині судинного русла з приблизно таким самим порогом реакцій [Koga et al., 1987]. Таким чином, істотна частина нейронів ПО/ПГ (більш 2/3) є осмосенситивними одиницями, які з великою імовірністю можуть розглядатися в якості елементів розподіленої нейронної мережі, що залучена до регуляції водно-сольового балансу. Оскільки, як згадувалося вище, одиниці, що були ідентифіковані як еферентні/ефекторні нейрони, виключалися нами з аналізу, усі нейрони досліджених груп є компонентами аферентної інтегративної ланки системи осморегуляції.

Необхідно особливо відзначити, що в контрольній групі двофазних реакцій на осмотичні впливи не спостерігалося. Найбільш частими виявилися монофазні активаційні реакції (А-тип), що при обох видах впливів і в усіх обстежених структурах зустрічалися в 38,5% тестів (інфузій гіпер- чи гіпоосмотичного р-нів). Монофазне гальмування (Г-тип) спостерігалося рідше — у 29,1% інфузій. Співвідношення гальмівних і збуджувальних реакцій при гіпер- і гіпоосмічній стимуляції істотно відрізнялося. У першому випадку переважало збудження (11/43, що відповідає індексу гальмування, ІГ=0,26). В другому — значно частіше спостерігалися гальмівні реакції (32/14, ІГ=2,29). Локалізація осмосенситивних нейронів характеризувалася помітною специфікою: нейрони, які реагували на гіперосмотичні впливи, практично були відсутні в латеральних ділянках ПО/ПГ, де локалізувалася основна частина нейронів, що відповідали на гіпоосмотичні впливи. Нейрони з монофазними активаційними реакціями на інфузії гіпоосмотичного р-ну були відсутні в медіальному (паравентрикулярному) відділі ПО/ПГ. Крім того, в зоні СОЯ відзначалося значне скупчення елементів, що відповідали монофазними активаційними реакціями на введення обох тест-розчинів.

У групі контролю гіперосмотична стимуляція, як правило, посилювала ІА ОСН, а гіпоосмотична стимуляція — викликала гальмівні реакції. У 58% досліджених ОСН реєструвалися протилежні реакції на інтракаротидні інфузії 0,2% і 3,0% р-нів NaCl. Ці дані в цілому узгоджуються з результатами інших дослідників [Nakashima et al., 1985; Hori, 1991].

ЛП реакцій на інфузії гіпотонічного р-ну були помітно коротшими, ніж ЛП відповідей на інфузії гіпертонічного р-ну (найчастіше порядку 5 с). ЛП реакцій на гіпотонічний вплив групувався навколо двох мод (1-2 і 3-4 с). Характерно, що в зоні СОЯ, на відміну від латеральних і медіальних зон ПО/ПГ, була присутня значна кількість елементів, які відповідали на осмотичні впливи з мінімальним ЛП.

Таким чином, досить висока реактивність нейронів ПО/ПГ стосовно зрушень осмотичного гомеостазу, наявність моносенсорних осмосенситивних елементів з одного боку, і виражена конвергенція гіпер- і гіпоосмотичних входів на тих самих елементах з іншого, а також різноманітність форм реакцій і особливості локалізації ОСН свідчать про те, що ПО/ПГ має специфічну чутливість до змін осмотичного гомеостазу в басейні a. carotis. Ці особливості досить переконливо доказують, що дана діенцефальна ділянка бере активну участь в регуляції водно-сольового балансу.

Характеристики ФА осмосенситивних нейронів ПО/ПГ. Середня частота ФА досліджених нейронів контрольної групи варіювала дуже значно (межі 0,1-21,4 с-1), хоча у більшості нейронів (51/74, тобто 69%) її значення не перевищували 5,0 с-1. Усереднене для всієї контрольної групи значення середніх частот ФА складало 5,9 с-1. У різних осмосенситивних нейронів ПО/ПГ виявлялася одиночна, групова чи пачкова активність, проте слід зазначити, що тенденція до групування імпульсів у ФА була очевидною майже в усіх випадках.

Більш ніж у половини (50-55%) досліджених осмосенситивних нейронів ПО/ПГ у контрольній групі чіткої періодичності ФА не виявлялось. В інших нейронах спостерігалася або низькочастотна модуляція ІА з періодом від 2 до 10 с, яка визначалася за флуктуаціями частотограм, або більш високочастотне групування імпульсів, що проявлялося в періодичності аутокорелограм (період порядку десятків мс).

Реакції осмосенситивних нейронів ПО/ПГ на неосмотичні стимули. Осмосенситивні нейрони ПО/ПГ характеризувалися високою реактивністю у відношенні до неосмотичних вісцеральних (температурних, глюкозних і пресорних) впливів, а також до електричної стимуляції ряду кортикальних структур, які входять до складу лімбічної системи мозку. Реакції осмосенситивних нейронів ПО/ПГ на вісцеральні впливи носили пороговий і дозозалежний характер. Значущі зміни