УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ

Ксьонз Ігор Миколайович

УДК 619:579.882.11

Застосування полімеразної ланцюгової реакції для діагностики хламідіозу свиней

16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Харків – 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Полтавському філіалі Інституту ветеринарної медицини УААН

Науковий керівник доктор ветеринарних наук, старший науковий співробітник Стегній Борис Тимофійович, Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, директор, завідувач лабораторії біотехнології та клінічної біохімії

Офіційні опоненти:

доктор ветеринарних наук, старший науковий співробітник

Білокінь Віктор Степанович

Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, головний науковий співробітник лабораторії біотехнології та клінічної біохімії

доктор ветеринарних наук, професор

Бортнічук Володимир Андронович

Національний аграрний університет, професор кафедри мікробіології і вірусології

Провідна установа:

Кримський державний аграрний університет, кафедра мікробіології і вірусології, Міністерство аграрної політики України, м. Сімферополь

Захист відбудеться “ 14_”__листопада__ 2002 р. о “_13_” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 при Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: м.Харків, вул.Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий “_11_”__жовтня__ 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради ______________________Бабкін А.Ф.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Впровадження нових високочутливих та точних лабораторних методів діагностики хламідіозу свиней у практичну роботу лабораторій ветеринарної медицини є однією з умов контролю благополуччя свинарських господарств щодо даного інфекційного захворювання.

Аналіз джерел вітчизняної та закордонної літератури показує, що найбільш поширеними методами лабораторної діагностики хламідіозу свиней є виділення та культивування збудника на курячих ембріонах або лабораторних тваринах, морфологічні методи виявлення хламідій та застосування серологічних реакцій. Всі ці методи не є достатніми і об'єктивний діагноз можна поставити лише комплексно з урахуванням епізоотичної ситуації і результатів патологоанатомічних досліджень [Хазіпов Н.З., і ін., 1984; Бортнічук В.А., 1991; Обухов И.Л., 1996; Малохатько Л.,1998.]. В останні роки в діагностику інфекційних захворювань тварин і людини, у тому числі і хламідіозу, впроваджуються новітні методи, такі як імуноферментний аналіз (ІФА) та ДНК-технології, зокрема полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) [Обухов І.Л., 1996; Домейка М.А., 1986; Нікуліна В.Г. і ін.,1993; Караваєв Ю.Д. і ін., 1999; Thierie D. et al., 1992; Papp J.R., Erlich H.A., 1989; Shewen P.E., 1996.].

Діагностика хламідіозу свиней за методом ПЛР забезпечує швидку і точну постановку діагнозу на будь-яких стадіях захворювання та виявлення тварин-хламідієносіїв, що є одною з найважливіших складових в системі заходів щодо своєчасної ліквідації джерел хламідійної інфекції в свинарських господарствах та недопущення її розповсюдження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилася згідно з завданнями державної тематики науково-дослідних робіт Полтавського філіалу Інституту ветеринарної медицини Української академії аграрних наук, номер державної реєстрації 0197U012760 “Розробити та удосконалити засоби діагностики та профілактики хламідіозу свиней” (1996-2000 рр) та 0101U002306 “Вивчити патогенез, удосконалити комплекс заходів діагностики, профілактики і боротьби з хламідіозом тварин” (2001-

2005 рр). Автор є одним із провідних виконавців цих тематик.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи є науково-експериментальне обгрунтування застосування методу ПЛР для діагностики хламідіозу свиней з використанням наборів реагентів, призначених для діагностики хламідіозу людини, розробка методів відбору та попередньої обробки досліджуваних проб від свиней різних статевих та вікових груп для цього діагностичного методу з метою одержання стабільних результатів, розробка ефективних схем оздоровчих заходів при вказаній інфекції, впровадження даних розробок у ветеринарну практику.

Для досягнення мети необхідно було вирішити такі задачі: визначити принципову можливість застосування ПЛР-методу для діагностики хламідіозу свиней з використанням праймерів та інших реагентів ПЛР-набору, призначеного для діагностики хламідіозу людини, при випробуванні в експериментальних та виробничих умовах; розробити методи відбору та попередньої обробки проб патологічного матеріалу від аборт-плодів, загиблих та забитих свиней для проведення діагностики хламідіозу ПЛР-методом; розробити методи відбору та попередньої обробки проб клінічного матеріалу від свиней для прижиттєвої діагностики хламідіозу ПЛР-методом; розробити схеми лікувально-оздоровчих заходів від хламідіозу свиней з контролем їх ефективності методом ПЛР; розробити рекомендації по застосуванню методу ПЛР для діагностики хламідіозу свиней.

Об'єкт дослідження – хламідіоз свиней.

Предмет дослідження – молекулярно-генетична тест-система для виявлення збудника хламідіозу свиней.

При виконанні даної роботи нами застосовувались такі методи лабораторних досліджень, як реакція зв'язування комплементу (РЗК), культивування хламідій на курячих ембріонах та лабораторних білих мишах, мікроскопічні дослідження мазків та мазків-відбитків і безпосередньо полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні застосовано, науково та експериментально обгрунтовано діагностику хламідіозу свиней методом полімеразної ланцюгової реакції з використанням наборів реактивів, призначених для діагностики хламідійних інфекцій людини.

В експериментальних умовах відтворено хламідіоз на поросятах-гнотобіотах з контролем розвитку інфекційного процесу за допомогою загальноприйнятих методів лабораторної діагностики та ПЛР.

Встановлено значну перевагу ПЛР в порівнянні з загальноприйнятими методами лабораторної діагностики хламідіозу свиней щодо індикації збудника хвороби.

Розроблено і запропоновано методи відбору проб клінічного та патологічного матеріалу від свиней різних вікових та статевих груп для ПЛР-аналізу.

Розроблено і відпрацьовано ефективні схеми лікувально-оздоровчих заходів від хламідіозу свиней при застосуванні методу ПЛР для контролю їх ефективності.

Практичне значення одержаних результатів. В результаті проведених досліджень теоретично і експериментально обгрунтована доцільність застосування ПЛР для діагностики хламідіозу свиней усіх статево-вікових груп на будь-якій стадії розвитку хвороби, в тому числі на ранніх стадіях захворювання, при латентному перебігові та для виявлення хламідієносіїв, що має особливе значення для племінних господарств.

На підставі лабораторних та господарських дослідів доведено принципову можливість використання методу полімеразної ланцюгової реакції з використанням наборів реактивів, призначених для діагностики хламідійних інфекцій людини, з метою ефективної лабораторної діагностики хламідіозу свиней.

За матеріалами досліджень розроблені “Методичні рекомендації по діагностиці хламідіозу свиней методом полімеразної ланцюгової реакції з застосуванням набору фірми “Літех”, які затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України. До Держдепартаменту ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України подано низку пропозицій до проекту “Інструкції по заходах з профілактики і ліквідації хламідіозу сільськогосподарських тварин”.

Запропоновані і впроваджені схеми лікувально-оздоровчих заходів від хламідіозу свиней в 6 господарствах Полтавської та Дніпропетровської областей.

Особистий внесок здобувача Експериментальні дослідження, аналіз отриманих результатів та їх узагальненя виконані автором особисто. Освоєння і опрацювання методу ПЛР для діагностики хламідіозу свиней проведені в творчій співдружності з фахівцями лабораторії генетики Інституту свинарства ім. О.В. Квасницького УААН.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були повідомлені та обговорені на: - І міжвузівській конференції молодих вчених і аспірантів “Інфекційна патологія молодняку сільськогосподарських тварин і птиці”, 9-11 червня 1999 р., м.Суми; - Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених “Стан та перспективи розвитку ветеринарної науки”, 6-7 жовтня 1999 р., м.Харків; - Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених “Проблеми патології тварин та шляхи їх вирішення”, 11 жовтня 2000 р., м.Київ; - III Міжнародній конференції "Біоресурси та віруси", 11-15 вересня 2001 року, м.Київ; - ІІ Всеукраїнській науково-практичній конференції ветеринарних патологів, 21–24 листопада 2001 р., м.Київ; - засіданнях вченої ради Інституту ветеринарної медицини УААН (1997-2002 рр), м.Київ; - міжлабораторному засіданні ІВМ УААН , 13 вересня 2001 р, м.Київ.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 робіт, з них 5 (3 одноосібних) статей у фахових наукових виданнях .

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 145 сторінках комп'ютерного тексту. Вона містить 28 таблиць, 27 рисунків і складається зі вступу, огляду літературних джерел та вибору напрямків досліджень, матеріалів та методів досліджень, результатів власних досліджень, висновків, списку використаних літературних джерел, який нараховує 105 джерел, з них 75 іноземних, та додатків.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

На захист виносяться наукові дані, одержані здобувачем за останні 5 років. Робота виконувалась на базі Полтавського філіалу Інституту ветеринарної медицини УААН, лабораторії генетики Інституту свинарства ім. О.В.Квасницького УААН, лабораторій біотехнології і клінічної біохімії та вивчення хворб великої рогатої худоби Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, лабораторії вірусології Полтавської обласної лабораторії ветеринарної медицини та 10 сільськогосподарських підприємств різних форм власності Полтавської та Дніпропетровської областей.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). В основі методу ПЛР лежить комплементарна добудова ДНК - мішені, обмеженої специфічними праймерами, що здійснюється in vitro за допомогою ферменту ДНК-полімерази.

При застосуванні нами ПЛР для діагностики хламідіозу ДНК-мішенню є фрагмент ДНК хламідії, праймерами – олігонуклеотиди, комплементарні ділянкам генів, що кодують 16S рPHK, які мають універсальну довжину для усіх видів хламідій [Pollard D.R. et al.,1989, Kaltenboeck B. et al., 1993, Meijer A., 2000, Башмакова М.А. і співавт., 2001].

Полімеразна ланцюгова реакція складається з трьох основних етапів: виділення ДНК із біопроби, безпосередньо ПЛР (ампліфікації) та реєстрації результатів за допомогою електрофорезу.

Реєстрація результатів ПЛР-аналізу. Першим етапом є розподіл продуктів ампліфікації методом горизонтального електрофорезу, другим - аналіз результатів електрофорезу, тобто читання електрофореграми. В усіх зразках повинна виявлятися смуга, відповідна за рухливістю внутрішньому контролю розміром 308 пар нуклеотидів, яка вказує на те що ампліфікація пройшла нормально. В позитивних контролях повинна виявлятися смуга розміром 501 пара нуклеотидів, а в негативних контролях смуга на рівні позитивного контролю повинна бути відсутня (поява смуги в негативному контролі свідчить про контамінацію компонентів набору).

В досліджуваних пробах відсутність смуги суто на рівні позитивного контролю свідчить про відсутність даного збудника в пробі (негативний результат). Наявність смуги, відповідної за електрофоретичною рухливістю позитивному контролю, вказує на наявність хламідії в даній пробі (позитивний результат).

Реакцію зв'язування комплементу проводили за загальноприйнятою методикою з застосуванням хламідійного і контрольного антигенів; хламідійної (позитивної) і контрольної (негативної) сироваток; комплементу; гемолізину; досліджуваних сироваток; 2,5% суспензії еритроцитів барана.

Виділення та культивування хламідій на курячих ембріонах та білих мишах. Для зараження 6-7-денних курячих ембріонів (КЕ) та білих мишей із патологічного та клінічного матеріалу готували 10-20% суспензії на фізрозчині з шматочків головного мозку, легень та паренхіматозних органів аборт-плодів, загиблих та вимушено забитих тварин, сперми, тощо з додаванням стрептоміцину (0,1 г/см3). Для наступних пасажів використовували 10% суспензії з біоптатів білих мишей та КЕ попереднього пасажу без додавання антибіотика, дотримуючись стерильності на усіх етапах роботи.

Курячі ембріони заражали в жовткові міхури, білих мишей - інтраназально, інтраперитоніально та інтрацеребрально.

Мікроскопічні дослідження. Для мікроскопічних досліджень на хламідіоз готували мазки з проб сперми, мазки-відбитки з тканин головного мозку, легень, селезінки, печінки та нирок аборт-плодів, загиблих або вимушено-забитих свиней та лабораторних білих мишей і з жовткових міхурів КЕ, на яких культивувались суспензії досліджуваних матеріалів, які забарвлювали за Стемпом. Також досліджувались гістологічні препарати тканин органів поросят-гнотобіотів при експериментальному відтворенні хламідіозу.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Визначення рівня гомології нуклеотидних послідовностей гена, що кодує 16S рибосомальної РНК Сhlamydia trachomatis, Сhlamydia suis та Сhlamydiophila psittaci

Для застосування ПЛР в діагностиці хламідіозу свиней наш вибір зупинився на наборі реагентів для виявлення ДНК C. trachomatis “Полімік” НВФ “Літех”. Такий вибір зумовлений, перш за все, тим, що в указаному наборі підібрана система праймерів на ділянку гена, що кодує 16S рРНК, який є найбільш консервативним для усіх видів збудника хламідіозу. Цей факт був підтверджений шляхом порівняльного аналізу секвенованих послідовностей нуклеїнових кислот гена, який кодує 16S рРНК C. trachomatis та C. suis і C. psittaci, оскільки саме C. suis і С. psittaci найчастіше виступають інфекційними чинниками хламідіозу свиней. Секвеновані послідовності вказаних нуклеїнових кислот одержані з бази даних Gen Bank (США).

Установлено, що на 1545 нуклеотидних послідовностей гена, який кодує 16S рРНК

C. suis, налічується 105 замін відносно цього гена C. trachomatis та C. psittaci (рис. 1), що свідчить про рівень гомології 93,2 %. Це вказує на те, що цей ген за своєю структурою дійсно є досить консервативним для різних видів збудника цього захворювання, і відповідно пара праймерів, підібрана на фрагмент цьго гена, з високим рівнем вірогідності є не лише специфічною суто для C. trachomatis, а також універсальною для інших видів збудника хламідіозу. А тому вказаний набір “Полімік” на наш погляд є цілком придатним для його використання для діагностики хламідіозу свиней.

tgagaatttgatcttggttcagattgaacgctggcggcgtggatgaggcatgcaagtcgaacggaacggttttatagctgtttagtggcggaagggttagtaatgcatagataatttgtctttaacttgggaataacggttggaaacggccgctaataccgaatgtggcgctatttaggcatctagatggtgttaaagaaggggatcttaggacctttcggttaaaggggagtctatgtgatatcagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgatgacgtctaggcggattgagagattggccgccaacactgggactgagacactgcccagactcctacgggaggctgcagtcgagaatctttcgcaatggacggaagtctgacgaagcgacgccgcgtgtgtgatgaaggctctagggttgtaaagcactttcgcctgggaataagagaaggcggttaatacccgtcggatttgagcgtactaggtaaagaagcaccggctaactccgtgccagcagctgcggtaatacggagggtgctagcgttaatcggatttattgggcgtaaagggcgtgtaggcggaagagtaagttggttgtcaaatctcggggctcaaccccgaatcggcatctgatactatttttctagagggtagatggagaaaagggaatttcacgtgtagcggtgaaatgcgtagatatgtggaagaacaccagtggcgaaggcgcttttctaatttatacctgacgctaaggcgcgaaagcaaggggagcaaacaggattagataccctggtagtccttgccgtaaacgatgcatacttgatgtggatggtctcaaccccatccgtgtcggagctaacgcgttaagtatgccgcctgaggagtacactcgcaagggtgaaactcaaaagaattgacgggggcccgcacaagcagtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaaggaccttacctgggtttgacatgcatatgaccgcggcagaaatgtcgttttccgcaaggacatatgcacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgccgtgaggtgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcgttagttgccagcacttagggtgggaactctaacgagactgcctgggttaaccaggaggaaggcgaggatgacgtcaagtcagcatggcccttatgcccagggcgacacacgtgctacaatggccagtacagaaggtagcaagatcgtgagatggagcaaatccttaaagctggccccagttcggattgtagtctgcaactcgactacatgaagtcggaattgctagtaatggcgtgtcagccataacgccgtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacatcatgggagttggttttaccttaagtcgttgactcaacccgcgagggggagaggcgcccaaggtgaggctgatgactaggatgaagtcgtaacaaggtagccctaccggaaggtggggctggatcacctcctttt

Рис. 1 Секвеновані послідовності гена, що кодує 16S рРНК Сhlamydia suis.

Примітка: жирними літерами (a, c, g, t) позначені нуклеотиди генів, що кодують 16S рРНК трьох видів збудника хламідіозу, послідовності яких є відмінними.

Індикація збудника хламідіозу в препаратах біологічної промисловості методом полімеразної ланцюгової реакції

Окрім порівняльного аналізу секвенованих послідовностей гена трьох видів хламідій, що кодує 16S рибосомальної РНК, на який розроблена система праймерів в наборі “Полімік” для виявлення ДНК хламідій людини, виробництва НВФ “Літех”, нами була проведена робота по індикації хламідій в препаратах біологічної промисловості методом полімеразної ланцюгової реакції з використанням вказаного діагностикуму.

Ця робота проводилась з метою на експериментальному рівні довести або спростувати можливість використання набору реагентв “Полімік”, призначеного для діагностики хламідіозу людини, у ветеринарній практиці, оскільки досліджувані матеріали напевно містять збудники саме хламідіозу тварин чи орнітозу птахів, а не людини.

При дослідженні двох специфічних (в різних титрах розведення) і двох контрольних хламідійних антигенів для РЗК (біофабричного виробництва) виявлено ДНК хламідій в специфічних та не виявлено в контрольних. Детекція ДНК хламідій в розведеннях специфічного хламідійного антигену (граничний титр 1:40) мала місце в титрах від 1:40 до 1:40000 (рис. 2), а в розведеннях специфічного хламідійного антигену (граничний титр 1:128) - в титрах від 1:128 до 1:1024000

(рис. 3), що свідчить про високу чутливість методу.

(зображення рис. 2, 3)

При дослідженні двох специфічних і двох контрольних орнітозних алергенів виявлено ДНК хламідій в обох специфічних при відсутності в контрольних, що свідчить про специфічність цього методу, а також набору реагентів “Полімік”. Термін постановки ПЛР і отримання результатів складав 4 – 4,5 години.

Таким чином, результати досліджень специфічних та контрольних хламідійних антигенів для РЗК і орнітозних алергенів для внутрішньошкірної проби, в першу чергу, свідчать про те, що набори реагентів “Полімік”, призначені для діагностики хламідійних інфекцій людини методом ПЛР-аналізу, є придатними для виявлення хламідій в пробах від тварин і свиней зокрема. Ділянка гена, що кодує 16S рибосомальної РНК хламідії, на який підібрана система праймерів у вказаному наборі, дійсно є універсальною для різних видів збудника хламідіозу, а не суто специфічною для Сhlamydia trachomatis, оскільки досліджувані нами препарати біологічної промисловості напевно містили в собі ДНК хламідій тих видів, що викликають саме хламідіоз тварин.

Лабораторний дослід по експериментальному відтворенню хламідіозу свиней на поросятах-гнотобіотах

В даному досліді нами були використані 6 поросят-гнотобіотів, одержаних в умовах лабораторії гнотобіології і вірусології ПФІВМ УААН шляхом стерильної гістеротомії від свиноматки з господарства, благополучного за інфекційними хворобами свиней і хламідіозу зокрема.

Поросята були розділені на дослідну (n=4) і контрольну (n=2) групи в окремі стерильні бокси з оптимальним мікрокліматом (t 36°С, вологість повітря 50-55 % ).

Починаючи з восьмого дня життя, протягом чотирьох днів трьох поросят дослідної групи заражали супернатантом 10% суспензій, приготовлених з органів білих мишей та жовткових міхурів курячих ембріонів, на яких пасажували хламідії. Матеріал поросятам вводили раз на добу перорально в дозі 5 см3 та дворазово інтраназально в дозі 0,5 см3 на кожну ніздрю. Четверте порося, яке не піддавали зараженню, утримувалось серед інфікованих (контактне).

Клінічний стан поросят дослідної та контрольної груп протягом досліду був у межах фізіологічної норми і не мав принципової різниці.

Дослідження сироваток крові поросят-гнотобіотів на хламідіоз методом РЗК як від поросят дослідної, так і контрольної груп дали негативні результати.

Не було виявлено і суттєвих змін на патологоанатомічних розтинах поросят, які виведені з досліду на 30 добу життя.

При проведенні патологогістологічних досліджень матеріалу інфікованих поросят-гнотобіотів спостерігали набряк мозкової тканини, потовщення стінок кровоносних судин та розширення навколосудинних просвітів головного мозку; розширення міжальвеолярних перетинок та потовщення стінок кровоносних судин легень, в той час як в тканинах селезінки, печінки та нирок усіх шістьох поросят, що використовувались в експерименті, ніяких змін виявлено не було.

В мазках-відбитках, приготовлених з тканин головного мозку трьох та з легеневої тканини одного поросяти-гнотобіота дослідної групи, які заражалися хламідійним матеріалом, було виявлено скупчення елементарних тілець (ЕТ).

Виявлено поодинокі включення ЕТ на мазках-відбитках, приготовлених з тканин головного мозку “контактного” поросяти-гнотобіота.

В мазках-відбитках з тканин головного мозку та легень поросят-гнотобіотів контрольної групи та з тканин селезінки, печінки та нирок усіх шістьох поросят ЕТ виявлено не було.

При зараженні лабораторних білих мишей та 6-7-добової інкубації курячих ембріонів, супернатантантом 10% суспензій матеріалу від інфікованих поросят-гнотобіотів дослідної групи вже в другому пасажі було виявлено скупчення ЕТ хламідій в мазках-відбитках з тканин головного мозку білих мишей та жовткових міхурів курячих ембріонів.

В мазках-відбитках з головного мозку і легень білих мишей та жовткових міхурів курячих ембріонів, яким вводили супернатант 10% суспензій, приготовлених з мозку, легень та паренхіматозних органів “контактного” та “контрольних” поросят-гнотобіотів, ЕТ хламідій не виявлено.

Результати досліджень проб біоптатів експериментально заражених поросят-гнотобіотів та “контактного” за методом ПЛР були позитивними на хламідіоз ( рис. 4).

(зображення рис. 4)

Результати досліджень матеріалу від поросят-гнотобіотів з досліду по експериментальному відтворенню хламідіозу за загальноприйнятими методами (РЗК, культуральний, гістологічний і мікроскопічний) та ПЛР-аналізу свідчать про те, що практично неефективним на початку розвитку інфекційного процесу в організмі є метод РЗК, а найефективнішим метод ПЛР-аналізу (табл. 1).

Таблиця 1

Порівняння результатів дослідження проб матеріалу від поросят-гнотобіотів різними діагностичними методами

Інвентарний № тварини Результати діагностики хламідіозу

Гістологічний метод Мікроскопічний метод (дослідження мазків-відбитків) Культу-ральний метод РЗК ПЛР

1 + + + - +

2 + + + - +

4 + + + - +

5 - + - - +

6 (контроль) - - - - -

7 (контроль) - - - - -

Примітка: (+) – позитивний результат; (-) –негативний результат.

Застосування ПЛР-аналізу для прижеттєвої діагностики хламідіозу свиней

З метою перевірки можливості застосування методу ПЛР-аналізу для діагностики хламідіозу свиней, перш за все, була розроблена і відпрацьована методика відбору проб клінічного матеріалу. Для цього були випробувані проби сперми, фекалій, зскрібки з слизової оболонки головки статевого члену і прямої кишки кнурів, зскрібки з слизової оболонки вагіни свиноматок і свинок та абортивний матеріал.

Зскрібки з слизових оболонок відбирали за допомогою одноразових мультизондів “Medscand”, “Акцелон” і “DNC Med”, призначених для взяття зскрібків з слизових оболонок статевих шляхів людини (дані мультизонди дають можливість захоплювати глибокі шари епітелію при мінімальному травмуванні слизової). Як з'ясувалось, вони виявились найбільш придатними для індикації хламідій в досліджуваному матеріалі. Також цілком придатними для виділення ДНК і проведення ПЛР є супернатанти відцентрифугованих 20 % суспензій сперми і 10 % суспензій внутрішніх органів аборт-плодів або загиблих чи забитих свиней та надосадова рідина, одержана при відмивці фекалій, тоді як цільна сперма для проведення ПЛР-аналізу – непридатна. При дослідженні цільної сперми, не на усіх доріжках електрофореграми виявляється смуга розміром 308 пар нуклеотидів, яка за електрофоретичною рухливістю відповідає внутрішньому контролю реакції, а це свідчить про те, що такі проби містять речовини, які інгібують ампліфікацію. В даному випадку ми вважаємо, що таким чинником може бути надмірна кількість геномної ДНК сперми. А відповідно такі результати не можна вважати достовірними.

При дослідженні за методом ПЛР 28 зскрібків з слизової оболонки статевого члену кнурів-плідників станції штучного осіменіння дослідного господарства Інституту свинарства УААН ім. О.В. Квасницького отримано 18 позитивних та 10 негативних результатів на хламідіоз. Причиною дослідження тварин вказаної станції штучного осіменіння стали аборти (особливо серед перевіряємих свиноматок) та народження мертвих або нежиттєздатнх поросят після осіменіня спермою цих плідників. Поряд з цим, серед кнурів-плідників відмічались поліартрити та кровотечі з препуцію.

Одночасно досліджувались проби сперми від трьох ПЛР-позитивних на хламідіоз кнурів та одного від ПЛР-негативного, з яких було приготовлено мазки, які забарвлювали за методом Стемпа, а також 20% суспензії, супернатант яких культивувався в п'яти послідовних пасажах на білих мишах (по 4 миші на кожну пробу) та курячих ембріонах (по 4 КЕ на кожну пробу).

В мазках із сперми на жодному з препаратів елементарних тілець хламідій не виявлено.

При дослідженні мазків-відбитків, приготовлених з головного мозку та легень мишей починаючи з третього пасажу матеріалу від кнурів, позитивних на хламідіоз при дослідженні методом ПЛР, виявляли множинні включення елементарних тілець хламідій. При дослідженні мазків-відбитків з жовткових міхурів КЕ скупчення ЕТ були виявлені вже в першому пасажі матеріалу від ПЛР-позитивних тварин.

При дослідженні 11 сироваток крові кнурів-плідників вказаної станції штучного осіменніня за методом РЗК з хламідійним антигеном як в розведенні 1:5, так і в розведенні 1:10 отримані негативні результати.

Наступним етапом роботи було дослідження клінічних проб від свиноматок та свинок. З метою з'ясування можливості застосування методу ПЛР-діагностики хламідіозу у цієї статевої групи свиней нами спочатку було досліджено вагінальні зскрібки від 12 свиноматок, що належали ПСП “Броварки”, та від 14 свиноматок, що належали агрофірмі “Граніт” Глобинського району Полтавської області.

На свинофермах цих господарств протягом останніх двох років у свиноматок реєструвалися аборти, народження мертвого та нежиттєздатного молодняку і масові ендометрити, пневмонії у поросят, а також фімози та кровотечі з препуцію у кнурів-плідників.

Методом ПЛР-аналізу вказаних проб від свиноматок ПСП “Броварки” було виявлено 10 позитивних і 2 негативних, а з проб від свиноматок агрофірми “Граніт” було виявлено 7 позитивних і 7 негативних результатів на хламідіоз.

Також на хламідіоз за методом ПЛР-аналізу досліджувались вагінальні зскрібки від 15 свиноматок та 14 ремонтних свинок, що належали агрофірмі “Ковалівка” Шишацького району Полтавської області. На цій свинофермі у весняному турі опоросів відмічалось народження слабких поросят живою масою до 700 г з нерозвиненим смоктальним рефлексом. Летальність серед новонароджених досягала 50%. Реєструвались також аборти та мертвонародження. Через 3 місяці, в наступному турі опоросів, серед свиноматок відмічались масові аборти.

При дослідженні сироваток крові від 6 свиноматок, які абортували, в Полтавській державній обласній лабораторії ветеринарної медицини було виключено лептоспіроз та бруцельоз. Разом з тим, усі проби сироваток в РЗК з хламідійним антигеном дали позитивний результат.

При дослідженні на хламідіоз ПЛР-методом вагінальних зскрібків від 15 свиноматок агрофірми “Ковалівка”, що абортували (включаючи 6 серопозитивних на хламідіоз) всі проби виявились позитивними (рис. 5), а від 14 ремонтних свинок виявлено 11 позитивних і 3 негативних результати( рис. 6).

(зображення рис. 5, 6)

Проведено дослідження на хламідіоз ПЛР-методом 40 клінічних проб від 8 кнурів-плідників, 26 свиноматок та 6 ремонтних свинок СТФ ТОВ “Агрофірма ім.Горького” Новомосковського р-ну Дніпропетровської області (дана свиноферма протягом двох років була стаціонарно неблагополучною по хламідіозу). При цьому було виявлено 17 позитивних і 23 негативних результати.

Клінічними пробами від кнурів плідників, які використовувались для парування природним способом, були проби фекалій та зскрібки з слизової оболонки прямої кишки. Слід зазначити, що на електрофореграмах при ампліфікації проб від одних і тих же кнурів смуги (501 пара нуклеотидів), які за електрофоретичною рухливістю відповідають фрагменту ДНК хламідій, відповідні доріжкам з ампліфікатом зскрібків, були більш інтенсивними, ніж на доріжках з ампліфікатом проб фекалій. Такі результати свідчать про те, що обидва способи відбору проб від кнурів є придатними для дослідження методом ПЛР-діагностики хламідіозу. Проте, перевагу слід віддавати відбору зскрібків, оскільки, на нашу думку, інтенсивніше свічення смуг, відповідних фрагменту ДНК хламідій, свідчить про більш високу концентрацію збудника у пробах.

Методом ПЛР-діагностики хламідіозу нами досліджено 100 клінічних проб від свиней племінних свиноферм господарств Великобагачанського району Полтавської області: 50 проб зскрібків від 22 кнурів-плідників і 28 свиноматок свиноферми ПАФ “Україна” та 50 проб зскрібків від 28 кнурів і 22 свиноматок ферми ТОВ “Довіра”

При цьому від тварин свиноферми ПАФ “Україна” було виявлено 22 позитивних і 28 негативних і від свиней ферми ТОВ “Довіра” - 44 позитивних і 6 негативних результатів на хламідіоз.

Також було проведено дослідження на хламідіоз ПЛР-методом 30 проб матеріалу від свиней, що належали СВК “Батьківщина” Котелевського р-ну Полтавської області. На даній свинофермі протягом останніх п'яти – шести років відмічалися аборти у свиноматок в другій половині поросності (частіше серед перевіряємих), народження мертвих та нежиттєздатних поросят з слаборозвинутим смоктальним рефлексом і вагою 500 – 700 г; масова загибель порсят перших днів життя з ознаками ураження шлунково-кишкового тракту.

Із досліджених вказаних 30 проб методом ПЛР-діагностики хламідіозу одержано 20 позитивних (від 6 кнурів, 12 свиноматок, аборт-плода і трупу новонародженого поросяти) і 10 негативних результатів. В мазках-відбитках з тканин органів патматеріалів виявлені включення елементарних тілець. За результатами трьох пасажів культивування патматеріалу на лабораторних білих мишах, за паталогоанатомічними змінами та виявленням елементарних тілець хламідій у мазках відбитках з тканин головного мозку, легень,селезінки та нирок був підтверджений діагноз на хламідіоз .

З метою з'ясування стану благополуччя щодо хламідіозу нами було проведено дослідженя 102 проб клінічного матеріалу за методом ПЛР від репродуктивного свинопоголів'я племінних свиноферм СПОП “Нива” та ВАТ “Гадяцьке бурякогосподарство” Гадяцького району Полтавської області.

Після проведення ПЛР-аналізу 102 досліджуваних проб клінічного матеріалу від 46 основних і 43 перевіряємих свиноматок та 13 кнурів-плідників позитивних результатів на хламідіоз не виявлено, що в свою чергу свідчить про благополуччя указаних племінних свиноферм щодо цієї інфекції.

Отже результати десяти польових дослідів по діагностиці хламідіозу у свиней господарств Полтавської та Дніпропетровської областей, в першу чергу, вказують на те, що метод ПЛР-діагностики безперечно слід застосовувати для ефективної і оперативної прижеттєвої діагностики хламідіозу свиней, оскільки даний діагностичний тест має ряд суттєвих переваг перед загальновживаними лабораторними методами діагностики цього захворювання. Це, перш за все, висока чутливість, яка забезпечує, на відміну від усіх інших методів, виявлення хворих на ранніх стадіях, у латентному перебігу захворювання та свиней-хламідієносіїв; висока специфічність аналізу, однозначність одержаних результатів, індивідуальність постановки діагнозу, невибагливість до умов при транспортуванні досліджуваних проб до лабораторії, швидкість одержання результатів та практично відсутність ризику інфікування персоналу лабораторії в процесі аналізу. До того ж термін отримання результатів діагностики за методом ПЛР не перевищкє 4 – 4,5 години.

Розробка і оцінка ефективності лікувально-оздоровчих заходів від хламідіозу свиней за результатами ПЛР-аналізу

Нами розроблялись та впроваджувались схеми лікувально-оздоровчих заходів, ефективність яких оцінювалась за результатами ПЛР.

Так усім 39 кнурам, що утримувались на станції штучного осіменіння свиней дослідного господарства Інституту свинарства ім. О.В.Квасницького УААН, з метою оздоровлення від хламідіозу внутрішньом'язово, однократно в дозі з розрахунку 1 см3 (200000 ОД) на 10 кг живої маси тварини вводили антибіотик тетрациклінового ряду пролонгованої дії “Окситетрациклін 200”.

Через місяць після проведення антибіотикотерапії від 10 тварин знову було відібрано зскрібки з слизової оболонки пеніса для дослідження на хламідіоз методом ПЛР-аналізу, в результаті чого виявлено 1 негативний і 9 позитивних результатів, що свідчить про неефективність однократного застосування тетрациклінового антибіотика.

Після проведення антибіотикотерапії репродуктивному свинопоголів'ю СТФ агрофірми “Ковалівка” Шишацького р-ну Полтавської області пролонгованим тетрацикліном “Oxy-100” (двократно з 7-денним інтервалом) та згодовуванні кормового антибіотика “Біовіт 80” усім статевовіковим групам свиней через 45 діб було досліджено вагінальні зскрібки від позитивно реагуючих за ПЛР до лікування 5 свиноматок та 5 ремонтних свинок. При повторному дослідженні на хламідіоз за методом ПЛР-аналізу усі 10 проб були негативними (рис. 7), що свідчить про ефективність такої схеми лікувально-оздоровчих заходів.

(зображення рис.7)

В ТОВ “Агрофірма ім.Горького” Новомосковського р-ну Дніпропетровської області протягом двох років після постановки науковцями ІЕКВМ УААН діагнозу на хламідіоз антибіотики тетрациклінового ряду “Оксітетрациклін 200” або “Tetravet L.A.” вводили внутрішньом'язово в дозі з розрахунку 1 см3 (200000 ОД) на 10 кг живої маси свиноматкам та свинкам під час парування та за 15 діб до опоросу, кнурам-плідникам один раз на 2 місяці, новонародженим поросятам на 1, 7, 14, 21 та 31 день життя, Щорічно свиноматки та кнури-плідники і новонароджені поросята на 37 день життя щепились антихламідійною вакциною виробництва Сумської біофабрики. Після припинення застосування такої схеми лікувально-профілактичних заходів кожного разу виникало загострення хвороби, що проявлялось абортами у свиноматок та народженням мертвих та нежиттєздатних поросят. Для оздоровлення поголів'я зазначеної свиноферми нами застосована схема оздоровчих заходів яка базувалася на трикратному введенні, з інтервалом 5-7 діб, одночасно всьому свинопоголів'ю ферми пролонгованого тетрацикліну “Oxy-100”(який раніше не застосовувався), згодовуванні разом з концкормами антибіотика “Біовіт 80” (протягом місяця, починаючи з початку санації) та проведенні не рідше двох разів на місяць дезінфекції свинарських приміщень.

При повторному досліджені відібраних 40 клінічних проб від 27 кнурів (5 з них досліджувались до оздоровлення) та 23 свиноматок через 53 доби після завершення оздоровчих заходів ПЛР-методом отримано негативний результат на хламідіоз, що вказує на високу ефективність застосованої схеми оздоровчих заходів.

Схема оздоровлення від хламідіозу з застосуванням тетрацикліну “Оху-100” випробувана на свинопоголів'ї племферм ПАФ “Україна” та ТОВ “Довіра” Великобагачанського р-ну Полтавської області.

Через 73 доби, після завершення лікувальних заходів повторно відібрано 20 проб зскрібків від 6 кнурів і 14 свиноматок племсвиноферми ТОВ “Довіра”. При цьому позитивних результатів дослідження на хламідіоз не виявлено. Між тим, після завершення оздоровчих заходів через 116 діб повторно досліджено 25 зскрібків від 16 кнурів і 9 свиноматок племсвиноферми ПАФ “Україна”, серед яких 9 тварин знову були позитивними на хламідіоз (24 тварини досліджувались до оздоровлення, при цьому було виявлено 14 позитивних результів). Такі результати свідчать про недостатню ефективність оздоровчих заходів, що пояснюються в першу чергу застосуванням відмінної від запропонованої нами схеми антибіотикотерапії, а саме - препарат “Oxy-100” ін'єктували у вказаних дозах троєкратно, але не з 5 – 7-денним інтервалом, а підряд на протязі 3 діб. Взв'язку з цим були додатково проведені оздоровчі заходи за розробленою нами схемою троєкратного застосування тетрацикліну пролонгованої дії з 5 – 7-денним інтервалом повторно досліджено 9 проб, від указаних свиней через 36 діб. Результати ПЛР-аналізу на хламідіоз цього разу були негативними.

Отже результати польових дослідів по оздоровленню від хламідіозу свиней шести сільськогосподарських підприємств свідчать про те, що розроблені нами схеми 2 – 3 –кратного застосування пролонгованих тетрациклінів з 5 – 7-денним інтервалом є достатньо ефективними. В той же час результати цих дослідів підтверджують, що метод ПЛР-аналізу може застосовуватись не лише для оперативної експрес-діагностики хламідіозу, а й для контролю ефективності проведених лікувально-оздоровчих заходів.

ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведено нове вирішення проблем лабораторної діагностики хламідіозу свиней. Існуючі насьогодні методи недостатньо ефективні, що в значній мірі пов'язано з їх низькою чутливістю і специфічністю, тривалістю та трудомісткістю проведення досліджень.

Впровадження методу ПЛР для діагностики хламідіозу в практику лабораторій ветеринарної медицини дає можливість постановки точного діагнозу на дане захворювання за короткий час (4 – 4,5 год) при дослідженні проб клінічного або патологічного матеріалу, відібраного від свиней усіх вікових і статевих груп в будь-якій стадії розвитку інфекційного процесу, включаючи латентний перебіг, а також виявлення хламідієносіїв.

2. Порівняльним аналізом секвенованих послідовностей нуклеїнових кислот гена, який кодує 16S рибосомальної РНК Chlamydia trachomatis, Chlamydia suis і Сhlamydiophila psittaci, виявлено рівень гомології ? 93 %, що свідчить про консервативність вказаного гена для різних видів збудника хламідіозу.

3. Дослідженням специфічних та контрольних хламідійних антигенів для РЗК і орнітозних алергенів для внутрішньошкірної проби, 6 проб патологічного матеріалу від поросят-гнотобіотів з досліду по експериментальному відтворенню хламідіозу та 530 проб біоматеріалу від 442 свиней різних вікових та статевих груп встановлено, що для діагностики хламідіозу свиней за методом ПЛР є придатним набір реагентів “Полімік”

ТУ-9398-405-17253567-96 виробництва Московської науково-виробничої фірми “Літех”, призначений для діагностики хламідійних інфекцій людини, в якому підібрана система праймерів, комплементарних ділянкам генів, що кодують 16S рибосомальної РНК хламідії.

4. Дослідження специфічних та контрольних хламідійних антигенів для РЗК і орнітозних алергенів для внутрішньошкірної проби свідчать про високу чутливість і специфічність методу ПЛР. Індикація ДНК хламідій відбувається в розведеннях специфічних антигенів у 1000 – 8000 разів вищих за граничний титр розведень в РЗК при відсутності в контрольних препаратах.

5. Порівняння результатів досліджень на хламідіоз проб клінічного матеріалу від інфікованих свиней за загальновживаними методами і результатами ПЛР свідчать, що чутливість РЗК складає ? 27 %, методу виділення і культивування хламідій на білих мишах та курячих ембріонах ? 90 %, мікроскопічного ? 70 % в порівнянні з результатами ПЛР, які прийняті за 100 %.

6. Встановлено, що для прижиттєвої діагностики хламідіозу за методом ПЛР придатні зскрібки з слизової оболонки статевих органів або прямої кишки та супернатант 10–20 % відцентрифугованих супензій сперми, зависі фекалій, а від загиблих та забитих свиней і аборт-плодів - супернатант відцентрифугованих 10 % суспензій з біоптатів (шматочки головного мозку, легень, селезінки, печінки та нирок) на фізіологічному розчині.

7. В експерименті по штучному відтворенню хламідіозу на поросятах-гнотобіотах встановлено, що розвиток інфекції протікає без прояву клінічних ознак (температура тіла і показники загального аналізу крові знаходяться в межах фізіологічної норми) та видимих патологоанатомічних змін в органах. Разом з тим, гістологічними дослідженнями встановлено що хламідії викликають набряк мозкової тканини, потовщення стінок кровоносних судин та розширення навколосудинних просвітів головного мозку, розширення міжальвеолярних перетинок та потовщення стінок кровоносних судин легень.

8. На основі розроблених схем лікувально-оздоровчих заходів при хламідіозі свиней і контролю їх ефективності по індикації збудника за методом ПЛР встановлено, що високий терапевтичний ефект забезпечує 2-3-кратне внутрім'язове введення антибіотиків тетрациклінового ряду пролонгованої дії з інтервалом в 5 – 7 діб.

9. За результатами впровадження методу ПЛР для виявлення хламідій у свиней розроблені “Методичні рекомендації по діагностиці хламідіозу свиней методом полімеразної ланцюгової реакції з застосуванням набору фірми “Літех”, які затверджені Головою Державного департаменту ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України.

Перелік наукових робіт опублікованих за темою дисертації

1. Ксьонз І.М. Застосування методу полімеразної ланцюгової реакції для діагностики хламідіозу у кнурів-плідників // Вісник СДАУ. – Суми – 1999.- Вип. 4. - С. 113-115.

2. Ксьонз І.М. Експериментальне відтворення хламідіозу свиней на поросятах-гнотобіотах // Міжвідомч. темат. наук. зб. “Ветеринарна медицина”. - Харків: ІЕКВМ УААН.- 1999.- Вип. 76. - С. 68-71.

3. Ксьонз І.М. Хламідійна інфекція свиноматок та альтернативний метод її діагностики // Вісник ПДСІ. – Полтава. - 2000.- Вип. 5. - С. 41-42.

4. Ксьонз І.М., Балацький В.М., Метлицька О.І. Експрес-метод діагностики хламідіозу свиней // Тваринництво України. - 2000.- № 11. - 12.- С. 21.

Дисертант приймав безпосередню участь в модифікації, випробуванні та впровадженні методу ПЛР для діагностики хламідіозу свиней.

5. Ксьонз І.М. Полімеразна ланцюгова реакція як альтернативний метод діагностики хламідійних інфекцій свиней // Матер. Всеукр. наук.-практ. конф. молод. вчених “Проблеми патології тварин та шляхи її вирішення”. – К., ІВМ УААН.- 2000.- С. 25-29.

6. Настенко В.Д., Гавшин О.О., Хандкарян В.М., Ксьонз І.М., і ін. Новий біотехнологічний метод діагностики хламідіозу свиней та його переваги // Ветеринарна медицина України – 2001.- №3.- С. 36-37.

Дисертант провів дослідження по діагностиці хламідіозу свиней за методом ПЛР і загальноприйнятими лабораторними методами.

7. Ксьонз І.М. Застосування полімеразної ланцюгової реакції для діагностики інфекційних захворювань на прикладі ПЛР-аналізу хламідіозу свиней // Тези ІІІ Міжнарод. конф. “Біоресурси та віруси”. – К..- 2001. – С. 31.

8. Ксьонз І.М., Настенко В.Д., Курман А.Ф. і ін. Методи відбору проб для ПЛР-аналізу хламідіозу свиней // Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини. – Харків, ХДЗВА. -2001. – Вип. 9 (33). - Част. 1. – С. 113–118.

Дисертант розробив і випробував методи відбору проб для діагностики хламідіозу свиней за ПЛР-методом.

Ксьонз І.М. Застосування полімеразної ланцюгової реакції для діагностики хламідіозу свиней. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія. Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, Харків, 2002.

В дисертації викладено результати досліджень по застосуванню та науково-експериментальному обгрунтуванню методу полімеразної ланцюгової реакції для діагностики хламідіозу свиней з застосуванням