МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

КРЕСЮН ВАЛЕНТИН ВАЛЕНТИНОВИЧ

УДК: 616.45 - 001. 1/3: 616.36

механізми стрес-індукованих

уражень печінки

14.03.04 – патологічна фізіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Одеса – 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Одеському державному медичному університеті МОЗ України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Напханюк Володимир

Клеонтійович, Одеський державний медичний університет

МОЗ України, завідувач кафедри гістології, ембріології та цитології

Офіційні опоненти:

Доктор медичних наук, професор Колеснік Юрій Михайлович, Запорізький державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри патологічної фізіології

Доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України Макулькін

Руслан Федорович, Одеський державний медичний університет МОЗ України,

професор кафедри загальної та клінічної патологічної фізіології

Провідна установа: Інститут геронтології АМН України, відділ патофізіології та імунології,

м. Київ

Захист вiдбудеться „2”линня 2002 року о 13 годині на засіданні спецiалiзованої вченої ради Д 41.600.01 при Одеському державному медичному університеті МОЗ України (65026, м. Одеса, пров. Валіховський, 2).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Одеського державного медичного університету (65026, м. Одеса, пров. Валіховський, 3).

Автореферат розісланий “31” травня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

к. мед. н. Соболєв Р.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Однією з найбільш важливих і у той же час складних проблем сучасної медичної науки є дослідження патогенетичних механізмів соматичних захворювань, у розвитку яких провідну роль відіграє дія на організм різних за своїм походженням стресових факторів (И.Г. Акмаєв, 1997; Н.М. Коломиец, 1997). Негативні емоції, психічна перенапруга, неврози, як відомо, лежать в основі багатьох захворювань внутрішніх органів (Г.В. Брюхин, Г.И. Михайлова, 1999; Н.К. Занков, 1999). Особливої актуальності проблема стресових уражень набула у зв'язку з наслідками аварії на ЧАЕС. Це обумовлено тим, що у більшості учасників ліквідації наслідків аварії та жителів навколишньої зони емоційний стрес розвивався на фоні дії на організм зовнішнього та внутрішнього опромінення в малих дозах. При цьому, реєстрація біологічних ефектів променевого ураження, як правило, не виявлялась (Б.Б. Мороз, Ю.Б. Десневой, 1999). Тому є підстави вважати, що соматичні зрушення у цих умовах є перш за все наслідком тривалого емоційного стресу, викликаного сукупністю причин, серед яких важливе місце посідає відчуття тривоги у зв'язку із загрозою опромінення (Л.Н. Маслова, Е.В. Науменко, 1997). З іншого боку, іонізуюча радіація, як і кожний активний фактор зовнішнього середовища, здібна викликати неспецифічну стресову реакцію, явища стресу і загального адаптаційного синдрому (В.А. Барабой, И.Н. Брекман, 1992). Існуюча думка про те, що радіаційний фактор у низьких дозах не визначає характер соматичних зрушень (И.К. Коломийцева, 1995), очевидно, не може бути безумовною тому, що особливості перебігу емоційного стресу на фоні тривалої дії іонізуючої радіації в низьких дозах до кінця невідомі і потребують подальшого дослідження. Викладене особливо стосується стану так званих “критичних метаболічних систем”, які несуть відповідальність за забезпечення життєво необхідних функцій організму на всіх рівнях його організації та збереження генетичної інформації. На жаль, у великому різноманітті існуючих даних літератури про дію стресових факторів (Т.І. Коледа та ін., 1995; В.И. Астраускас, 1990; И.Н. Алексеева, 1994) майже не висвітлюються механізми впливу цих факторів на реакції посттрансляційної модифікації геномних структур клітин, синтез білка, РНК і ДНК та стан систем, регулюючих зазначені процеси. Вирішенню саме цих проблем і присвячена дисертаційна робота.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт Одеського державного медичного університету і є фрагментом теми “Розробка шляхів направленої регуляції метаболічних процесів у поколіннях опромінених тварин” (№ держреєстрації 0196U017677). Дисертант є співвиконавцем фрагменту цієї теми.

Мета дослідження. З'ясувати патофізіологічні механізми змін процесів посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки за умов дії стресових факторів та розробити можливі шляхи їх фармакокорекції.

Завдання дослідження:

1. Вивчити особливості перебігу реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки за фізіологічних умов.

2. Встановити закономірності змін активності реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки за умов тривалої депривації сну і у післястресовому періоді.

3. З'ясувати механізми впливу тривалого g-опромінення у сумарній дозі 1,0 Гр на активність реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки.

4. Вивчити механізми змін активності реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки за умов тривалої депривації сну у радіаційно уражених щурів.

5. Встановити ефективність та особливості впливу гептралу на активність реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки за умов тривалої депривації сну, тривалого g-опромінення у сумарній дозі 1,0 Гр та їх комбінованій дії.

Об'єкт дослідження: експериментальні моделі стрес-індукованих уражень печінки.

Предмет дослідження: реакції посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки при стрес-індукованих ураженнях та їх фармакокорекції.

Методи дослідження: патофізіологічні, біохімічні, біофізичні, радіоімунні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. На підставі проведених експериментальних досліджень вперше визначено, що за фізіологічних умов активність реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки має особисту характеристику для кожного процесу та для кожного окремо взятого білку. Вперше доведено, що безперервна чотирьохдобова депривація сну викликає стійку дезінтеграцію активності реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки, внаслідок чого змінюються як сама активність, так і послідовність цих реакцій. Отримані результати досліджень дозволили грунтовно довести, що найбільш глибокої дезінтеграції за умов стресу зазнає активність реакцій метилювання та АДФ-рибозилювання, фізіологічна послідовність яких не відновлюється навіть на 14 добу по завершенні дії стресового фактору. Вперше встановлено, що тривале тотальне g-опромінення у сумарній дозі 1,0 Гр викликає хвилеподібні зміни активності реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину, які за ступенем дезінтеграції значно переважають аналогічні показники за умов депривації сну, і при цьому найбільш істотних змін зазнають процеси ацетилювання, фосфорилювання та метилювання.

Вперше встановлені характерні особливості змін активності реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину після депривації сну у радіаційно уражених щурів та визначено, що найбільш глибокій дезінтеграції у цьому випадку зазнають процеси модифікації гістонів Н2В, Н3, Н4, міцно і лабільно зв'язаних з ДНК негістонових білків, що призводить до порушень синтезу РНК і ДНК та зрушень матричної активності хроматину. Вперше на підставі проведених досліджень доведена ефективність використання гептралу за умов дії кожного окремо взятого чиннику та при їх комбінації.

Отримані результати досліджень розкривають раніше невідомі механізми патофізіологічних змін у геномних структурах печінки за умов дії різних за потужністю та тривалістю стресових чинників, а з'ясовані механізми впливу на них гептралу, являють важливий внесок у висвітлення патогенезу соматичних зрушень та можливі шляхи їх корекції за умов хронічного стресу.

Практичне значення одержаних результатів. Практичне значення роботи полягає у тому, що результати проведених експериментальних досліджень у значній мірі розширюють і поглиблюють уявлення про патогенез соматичних зрушень за умов хронічного стресу. Вони переконливо доказують, що однією із основних причин порушень білок-синтезуючої функції печінки при стресових ушкодженнях є зміни активності реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки, які викликають зниження матричної активності хроматину, зменшення синтезу і виходу із ядер клітин печінки мРНК та гальмування синтезу ДНК.

Встановлено, що введення гептралу у значній мірі послаблює негативний вплив стресових факторів на посттрансляційні модифікації білків хроматину ядер клітин печінки, зменшує їх дезінтеграцію на всіх етапах експерименту і у більшості випадків відновлює функціональну спроможність зазначених реакцій до фізіологічного рівня. Одержані результати дозволяють рекомендувати досліджуваний препарат, як патогенетичний засіб у комплексній профілактиці та лікуванні соматичних хвороб стресового походження.

Положення і висновки роботи впроваджені в навчальний процес і використовуються при читанні лекцій та на практичних заняттях кафедр гістології, ембріології та цитології, медичної хімії, нормальної фізіології, загальної та клінічної патологічної фізіології, загальної та клінічної фармакології Одеського державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Автором виконано патентно-інформаційний пошук, визначено мету та задачі дослідження, методичні підходи, відпрацьовано моделі, розроблено алгоритм, згідно якого виконано дослідження на експериментальному матеріалі. Проведено статистичну обробку отриманих результатів, оформлено таблиці та рисунки, сформульовано висновки роботи, опубліковано основні положення дисертації.

Апробація результатів дослідження. Основні положення дисертаційної роботи оприлюднені на VII міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні досягнення валеології та спортивної медицини” (Одеса, 2001); республіканській науково-практичній конференції “Лекарства человеку” (Харків, 2001); республіканській науково-практичній конференції “Проблеми екстремальної та військової медицини” (Київ, 2001); на ІІ Національному з'їзді фармакологів України (Дніпропетровськ, 2001). Результати дисертаційної роботи також доповідались на спільному засіданні кафедр гістології, ембріології та цитології, загальної та клінічної патологічної фізіології, загальної та клінічної фармакології, медичної хімії Одеського державного медичного університету.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 10 наукових робіт, із яких 6 статей у фахових наукових журналах і у 4 тезах доповідей матеріалів конференцій та конгресів.

Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на сторінках машинопису. Вона складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, трьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів власних досліджень, висновків та списку використаних джерел. Робота ілюстрована 30 таблицями та 4 рисунками, які займають 26 повних сторінки. Список використаної літератури містить 236 джерел, з яких 126 вітчизняних і російськомовних та 110 іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Дослідження проведені на 480 щурах-самцях лінії Вістар масою тіла 180-200 г. Тварини утримувались на стандартному раціоні віварію Одеського державного медичного університету. У відповідності до мети та задач дослідження всі експериментальні тварини були розподілені на слідуючі групи: 1) інтактні тварини (контроль); 2) тварини з відтвореним стресом; 3) тварини у післястресовому періоді; 4) тварини після тривалого g-опромінення; 5) g-опромінені тварини, у яких викликали стрес методом депривації сну; 6) тварини після депривації сну на фоні введення гептралу; 7) радіаційно уражені тварини, яким вводили гептрал; 8) радіаційно уражені тварини після депривації сну на фоні введення гептралу. У якості моделі хронічного стресу нами обрано метод тривалої (на протязі 4-х діб) депривації сну (D.Jouvet et al., 1964). Опромінення тварин проводили за слідуючих технічних умов: Ра=107 рад/хв, поле 20х20 см, ВПД=75 см, сумарна доза 1,0 Гр, разова доза 0,1 Гр, час експозиції 6 с, інтервал між опроміненням 72 год, кількість повторностей 10. До експерименту тварин 2-ї групи брали на 1, 2, 3 і 4 добу депривації сну; 3-ї групи – через 1, 7 та 14 діб по завершенню чотирьохдобової депривації сну; 4-ї групи – через 1, 2, 3, 4, 5, 7 і 14 діб по завершенні дії радіаційного чинника; 5-ї групи (з комбіновою дією) в строки аналогічні 3-й групі; 6, 7 і 8-ї груп – відповідно до термінів груп з відтвореною патологією, яким уводили гептрал внутрішньоочеревинно із розрахунку 5 мг/кг маси тварини за слідуючою схемою: за 12 год до депривації сну, а потім кожну добу на протязі 7 діб; опроміненим щурам препарат вводили за 12 год до завершення g-опромінення і потім кожний день на протязі 12 діб.

Об'єктом досліджень була печінка. Ядра із клітин печінки виділяли за методом Р.О. Роgo (1967) із ядер клітин печінки отримували хроматин (C.S. Teng et al., 1979). Шляхом обробки очищеного хроматину отримували лабільно та міцно зв'язані з ДНК негістонові білки (С.Р.Уманский, 1975). Гістони екстрагували 0,25 N H2SO4, осаджували ацетоном, промивали етанолом, ліофілізували. Індивідуальні гістони вилучали фракціонуванням сумарних гістонів методом гельфільтрації на біогелі Р-60, сефадексі G-100 (S. Panhyim et al., 1969). Сумарні гістонові білки отримували з очищеного хроматину за методом К.Босток і Е.Сампер (1981). Для дослідження реакцій модифікації білків хроматину in vivo експериментальним тваринам внутрішньоочеревинно (із розрахунку на 100 г маси) вводили: при дослідженні фосфорилювання – 6,0 МБК NaH232РO4 за дві години до декапітації, ацетилювання – 6,0 МБК14СН3СООNa за 1,5 год до декапітації; АДФ-рибозилювання – 8,0 МБК 3Н-рибози за 2 год до декапітації; метилювання – 8,0 МБК 3Н-метилметіоніну за 1,5 год до декапітації. Електрофорез гістонів проводили за методом S. Panhyim, R. Chalkley (1969). Забарвлені гелі сканували на спектрофотометрі Specord-UV-Vis. Концентрацію білку визначали по G. Desoye (1980). Підрахунок радіоактивності у зонах гелю проводили за методом V.J. Aloye (1979). Обробку результатів досліджень виконували методами варіаційної статистики за допомогою програми “Primer Biostatistics” (США, 1998) з використанням критерію Ст'юдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Внаслідок проведених досліджень було встановлено, що активність реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки за фізіологічних умов має різні значення для різних білків (рис. 1). Так, активність ацетилювання гістонів у фізіологічних умовах змінюється у слідуючій послідовності: міцно зв'язані з ДНК негістонові білки (мНГБ) >

Рис. 1 Активність реакцій модифікації білків хроматину ядер клітин печінки.

H2B > лабільно зв'язані з ДНК негістонові білки (лНГБ) > Н4 > H2A > H1. Така послідовність специфічна і характерна, як відомо, для ацетилаз А і Е, які приймають участь тільки в модифікації гістонів, зв'язаних з нуклеосомами (D. Gallvitz, I. Sures, 1992; R.L. Garcea, B.M. Alberts, 1990). Можливо, це можна пояснити відмінностями в активності ацетилюванні вільних гістонів і гістонів у складі хроматину. З'ясовано, що у фізіологічних умовах різні білки хроматину ядер клітин печінки фосфорилюються також неоднаково. Активність реакцій фосфорилювання визначається слідуючим чином: мНГБ > лНГБ > Н1 > H2B > H3 > H2A > H4. Така висока активність фосфорилювання НГБ є, очевидно, підтвердженням думки про те, що специфічна регуляція активності геному у більшій ступені залежить від негістонових білків, ніж від гістонів (R. Knipers, R. Bohme, 1988). Що стосується реакцій метилювання, то їх активність має слідуючу закономірність: лНГБ > мНГБ > H3 > H4 > H2A > H2B > H1. Виявлена закономірність активності метилювання підтверджує існуючі дані про те, що більш всього метильних груп акцептують гістони Н3 і Н4, і менше всього Н2А, Н2В і Н1 (V.G. Allfrey, 1984). Проведені дослідження також дозволили встановити, що активність реакцій АДФ-рибозилювання має також різні значення і змінюється у слідуючій послідовності: мНГБ > лНГБ > H1 > H3 > H2A > H2B > H4. Ці дані підтверджують існуючі відомості про те, що основним акцептором АДФ-рибози серед гістонів є гістон Н1 (N. Berger, J. Ahams, 1988), так як у ньому модифікуються переважно 2-й і 16-й залишки глутамінової кислоти.

Встановлено, що за умов депривації сну активність ацетилювання сумарних гістонів на протязі всього експерименту, за включенням останньої доби, є вірогідно нижчою за рівень показників контролю. На 1-у добу депривації активність ацетилювання гістонів Н1, Н2А і Н2В вірогідно посилюється, а гістонів Н3 і Н4 – пригнічується. Це свідчить про те, що уже навіть на 1-у добу спостерігаються зміни матричної активності хроматину (J. Bohm, 1990; H.Fukusima, K. Ota, 1980). На 2-у добу активність ацетилювання гістонів Н2В та Н4 є нижчою за рівень контролю, а всіх останніх вірогідно вищою за нього. На 3-ю добу експерименту відбувається різке пригнічення активності ацетилювання гістона Н3 та посилення її у гістона Н2В як по відношенню до попереднього терміну, так і контролю. Найбільш глибоких змін зазнає процес ацетилювання індивідуальних гістонів на 4-у добу депривації сну. При цьому, активність гістонів Н1, Н2А та Н4 пригнічується, а гістонів Н2В та Н3 – активується. Що стосується активності ацетилювання лНГБ і мНГБ, то вона на протязі 4 діб є вірогідно вищою за контроль. Виключення у цьому випадку складає тільки ацетилювання мНГБ, інтенсивність яких на 2-у добу є нижчою за рівень контролю.

На 1-у добу розвитку стресу спостерігається також зниження активності фосфорилювання більшості індивідуальних гістонів, виключення складає гістон Н2А, активність фосфорилювання якого є вищою за контроль. Паралельно підвищується активність фосфорилювання сумарних гістонів, лНГБ та мНГБ в порівнянні з контролем. Наслідком зазначених зрушень можуть бути зміни ДНК-білкових взаємодій, що, як відомо, залежать від інтенсивності фосфорилювання (R.Knippers, R.Bohme, 1988). Крім цього, зниження активності фосфорилювання гістону Н1 сприяє посиленню його властивості викликати конформаційні зміни у ДНК. У подальшому (2-3 доба) спостерігається глибоке пригнічення активності фосфорилювання сумарних гістонів, більшості індивідуальних гістонів, лНГБ та мНГБ порівняно з контролем. Виключення складають тільки гістони Н2А і Н3, активність фосфорилювання яких вища за останній. На 4-у добу дезінтеграція процесів ще більше посилюється. У післястресовому періоді спостерігається тільки тенденція до нормалізації цих процесів.

На 1-у добу депривації сну зареєстровані суттєві зміни метилювання. Так, активність метилювання більшості білків хроматину ядер клітин печінки зазнає досить значного пригнічення. Виключення складають тільки гістони Н1, Н4 і мНГБ, активність метилювання яких є вищою за рівень контролю відповідно на 54,0, 86,7 і 38,7 %. У подальшому спостерігається активація метилювання гістонів Н1, Н4, мНГБ та сумарних гістонів на фоні низької активності цих реакцій у всіх інших білків. На 4-у добу відзначається посилення активності метилювання гістонів Н1 і Н4 більш, ніж у 2 рази порівняно з контролем на фоні дуже низької активності метилювання сумарних гістонів, гістонів Н2В, Н3 і мНГБ. На протязі 14 діб після дії стресового фактору активність метилювання більшості білків хроматину не відновлюється до фізіологічного рівня, за виключенням гістону Н2В.

Стрес викликає суттєві зміни і АДФ-рибозилювання. Так, активність більшості індивідуальних гістонів на 1 добу є вірогідно вищою за рівень контролю, за виключенням гістону Н3, АДФ-рибозилювання якого є нижчим за останній. Достовірно нижчою за контроль є також і активність АДФ-рибозилювання сумарних гістонів та лНГБ. На 2-3 добу спостерігається повна дезінтеграція процесів АДФ-рибозилювання як гістонових, так і негістонових білків. Очевидно, це є свідченням глибоких зрушень функцій хроматину, які залежні від АДФ-рибозилювання (H. Okayama, 1983; M.Valee, 1999). На 4 добу стресу – виснаження, спостерігається різке пригнічення активності реакцій АДФ-рибозилювання гістону Н4, лНГБ та мНГБ і водночас посилення активності цих процесів у всіх останніх гістонів. Особливо високою є активність рибозилювання гістонів Н1 та Н3, яка перевершує контроль майже в 2 рази.

Оскільки циклічні нуклеотиди являються детермінуючим фактором активності посттрансляційної модифікації білків хроматину, доцільно було вивчити динаміку зміни їх вмісту. Дослідження показали, що депривація сну викликає істотне зменшення вмісту цАМФ та збільшення вмісту цГМФ на всіх етапах дослідження, за виключенням останньої доби, коли їх вміст відновлюється до рівня контролю (рис. 2).

Рис. 2 Вміст циклічних нуклеотидів у печінці (в %) за умов стресу (1-4 доба) та

у післястресовому періоді (5-18 доба); * - Р > 0,05 відносно контролю

У радіаційно уражених тварин активність ацетилювання індивідуальних гістонів носить хвилеподібний характер, що узгоджується з даними літератури (Б.Б. Мороз, Ю.Б.Дешевой, 1999). Порівняльний аналіз активності ацетилювання окремих фракцій гістонів на різних етапах експерименту показав різноспрямованість змін, в першу чергу, гістону Н1. Ацетилювання гістонів Н3 і Н4, на протязі всього експерименту, також носять коливальний характер. Майже на протязі всього експерименту досить на високому рівні відбувається і ацетилювання лНГБ і мНГБ. Виключення складає ацетилювання мНГБ на 2 та 5 добу, коли вони є нижчими за контроль.

Інтегральним показником посттрансляційної модифікації білків хроматину є їх фосфорилювання. Проведені дослідження показали, що тривале g-опромінення також суттєво знижує рівень фосфорилювання гістонів і негістонових білків. Особливо слід зазначити зміни активності фосфорилювання гістону Н1, у зв'язку з його участю у формуванні структур хроматину вищого порядку (S.V. Shlyapnikov, A.A. Arutyunova, 1995). З'ясовано, що припроменевому ураженні фосфорилювання гістону Н1 пригнічується майже в усі терміни досліджень, за виключенням останньої доби, де воно майже не відрізняється від контролю.

Поряд з цим встановлено, що g-опромінення також викликає хвилеподібні зміни метилювання гістонів та негістонових білків хроматину. Так, метилювання гістону Н1 на протязі всього експерименту, за виключенням 5-ї доби, є значно вищим за контроль. Метилювання сумарних гістонів на початку дослідження є нижчим за контроль, а починаючи з 2-ї доби

посилюється. Максимальні зміни відзначаються на 3-ю добу. У значній мірі, починаючи з 1-ї доби, пригнічується метилювання гістону Н2А, але на 5-у добу спостерігається його активація, а потім нове пригнічення. Починаючи з 2-ї доби, аналогічно змінюється метилювання гістону Н4. Такі різноспрямовані зрушення активності метилювання білків хроматину ядер клітин печінки є свідченням порушень матричної активності, яка знаходиться у тісному взаємозв'язку з метилюванням (R.A. Gjerset, H. Biesmann, 1996).

Стресорні фактори впливають також на процеси АДФ-рибозилювання. Згідно отриманих даних АДФ-рибозилювання індивідуальних гістонів, за виключенням гістону Н3, в період 1-2 доби експерименту посилюється. У той же час опромінення викликає прогресуюче пригнічення АДФ-рибозилювання сумарних гістонів, за виключенням 7 доби. АДФ-рибозилювання лНГБ та мНГБ теж змінюється хвилеподібно. Такі зміни можуть мати для клітини критичне значення, так як відомо, що АДФ-рибозилювання білків хроматину виконує універсальну роль регулятора багатьох метаболічних процесів у клітині (E. Kun, A.D. Romaschin, 1980).

Результати дослідження свідчать і про те, що тривале g-опромінення у сумарній дозі 1,0 Гр призводить до стійкого зниження вмісту цАМФ у печінці на протязі всього часу експерименту, і паралельно з цим до збільшення кількості цГМФ. Ці факти підтверджуються існуючими даними літератури (Y. Kuroda, E. Hashimoto, 1989) і в значній мірі висвітлюють виявлені зрушення процесів АДФ-рибозилювання (рис. 3).

Рис. 3 Вміст циклічних нуклеотидів у печінці (в %) за умов тривалого тотального

г-опромінення; Р < 0,05 порівняно з контролем в усіх випадках

Слідуюча серія експериментів була присвячена дослідженню сумісної дії стресорних факторів на посттрансляційну модифікацію білків. Депривація сну у г-опромінених щурів викликає різкі та різноспрямовані зміни активності реакцій ацетилювання більшості білків хроматину. Неоднозначних змін за цих умов зазнають також і процеси фосфорилювання. Так, починаючи з 1-ї доби експерименту, відбувається різке посилення активності фосфорилювання як гістонів, так і негістонових білків, за виключенням гістону H2В, рівень фосфорилювання якого є дуже низьким. На 4-у добу депривації сну у опромінених тварин активність фосфорилювання майже усіх білків знаходиться на дуже низькому рівні. Що стосується реакцій метилювання, то їх активність у індивідуальних гістонів вже на 1-у добу експерименту різко пригнічується (за виключенням гістону Н2В), а негістонових білків – посилюється. Максимальні зміни активності реакцій метилювання спостерігаються на 4-у добу і відновлення їх до рівня контролю не відбувається навіть на кінець експерименту. Підтвердженням глибоких зрушень у геномних структурах клітин печінки за умов депривації сну на фоні опромінення є активність реакцій АДФ-рибозилювання, яка, починаючи з 1-ї доби, найбільш виразних змін зазнає у гістонів Н1 і Н2А. Зі збільшенням терміну депривації сну ці порушення посилюються і відновлення їх до значень контролю не відбувається навіть по закінченню експерименту.

Поряд з цими змінами посттрансляційної модифікації білків за умов депривації сну в опромінених щурів, виявлені і досить істотні зрушення вмісту та співвідношення цАМФ і цГМФ. Якщо в перші дні експерименту вміст цГМФ підвищується, то в наступному він є нижчим за контроль. Вміст цАМФ з початку і до кінця залишається суттєво нижчим контролю.

Отже, депривація сну у г-опромінених щурів, призводить до більш стійких та глибоких змін активності реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину та вмісту циклічних нуклеотидів, які по своєму характеру та виразності є більш глибокими і стійкими ніж за умов дії кожного окремо взятого фактору.

Проведені дослідження свідчать, що стресорний вплив на організм різних факторів, і особливо їх сумісна дія, призводять до значних порушень активності процесів посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки. Останні не можуть не впливати на різні функції печінки і, в першу чергу, білок-синтезуючої. Очевидно, що це і є одним із факторів ризику до розвитку стрес-індукованих соматичних розладів.

Звичайно, що це потребує пошуку та обґрунтуванню застосування фармакологічних засобів, які б впливали на виявлені розлади патогенетичного ланцюга. Виходячи з цього, ми вирішили дослідити ефективність гептралу, дія якого, за сучасними уявленнями, пов'язана з аденілатциклазною системою. З іншого боку, переконливим доказом доцільності використання гептралу за умов дії стресових факторів було те, що реакції посттрансляційної модифікації білків хроматину є цАМФ-залежними.

Внаслідок проведених досліджень встановлено, що за умов депривації сну на фоні введення гептралу вміст циклічних нуклеотидів відновлюється до рівня контролю, починаючи з 1-ї доби після завершення дії стресового фактору. Ефективною, хоча і дещо в меншій мірі, є дія гептралу в опромінених тварин. При сумісній дії досліджуваних факторів препарат у значно меншій мірі впливає на вміст циклічних нуклеотидів, проте достовірно вирівнює їх до контролю.

При відтворенні стресу на фоні завчасного введення гептралу, починаючи з 4-ї доби, спостерігається відновлення активності ацетилювання до рівня інтактних тварин (рис. 4). Ефективним є введення гептралу і радіаційно ураженим тваринам. При цьому, активність ацетилювання нормалізується на 5-у добу по завершенні опромінення. При сумісній дії двох факторів на фоні введення гептралу відбувається зниження активності ацетилювання на 1 і 4-у добу експерименту, а починаючи з 5-ї доби, вона повертається на рівень близький до контролю. Активність реакцій метилювання при депривації сну на фоні введення гептралу відновлюється до фізіологічного рівня через добу після завершення дії стресового фактора. Враховуючи, що

Рис. 4 Вплив гептралу на активність реакцій ацетилювання білків хроматину ядер клітин печінки за умов дії стресових факторів.

Позначки: - на фоні введення гептралу; - неліковані тварини.

опромінення викликає глибокі зрушення активності метилювання, ефективність гептралу у цих тварин є нижчою, ніж за умов стресу, але достатньо високою порівняно з нелікованими.

Ефективність гептралу є найменшою при сумісній дії двох факторів, але навіть у цьому випадку чітко відновляється тенденція до нормалізації активності метилювання. Позитивним є вплив гептралу і на активність реакцій АДФ-рибозилювання. При цьому, необхідно підкреслити, що як за умов дії кожного окремо взятого фактору, так і при їх комбінації, на фоні введення гептралу активність АДФ-рибозилювання нормалізується ще задовго до кінця експерименту. Подібних змін зазнає і активність реакцій фосфорилювання, причому як за умов дії окремих факторів, так і при їх сумісній дії. При введенні препарату в усіх випадках відбувається суттєва нормалізація фосфорилювання.

Отже, гептрал, активуючи аденілатциклазу, збільшує вміст цАМФ у цитоплазмі клітин печінки, яка активує цАМФ-залежні протеїнкінази та аутофосфорилювання, і сприяє збільшенню внутрішньоядерної цАМФ. Внаслідок цього відбувається відновлення активності і стабілізація реакцій посттрансляційної модифікації до рівня, що забезпечує синтез білка в цитоплазмі.

Таким чином, внаслідок досліджень з'ясовано, що в основі порушень білок-синтетичної функції печінки за умов дії різних стресових факторів лежать різкі зміни активності реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер її клітин та їх послідовності, пусковим механізмом чого є зрушення вмісту і співвідношення циклічних нуклеотидів. Підтвердженням цього є ефективність введення гептралу, дія якого опосередкована аденілатциклазною системою. Позитивний вплив гептралу на білок-синтетичну функцію печінки за умов дії на організм різних стресових чинників надає підстави для використання його у комбінованій терапії та запобіганні соматичних розладів при стресовій патології.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі наведено узагальнення і нове вирішення наукової задачі, яка полягає у розкритті патофізіологічних механізмів порушень посттрансляційної модифікації гістонових та негістонових білків хроматину ядер клітин печінки за умов депривації сну, тривалого g-опромінення та сумісного впливу цих факторів. На підставі проведених досліджень вперше доведено, що курсове введення гептралу сприяє відновленню послідовності змін активності реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину, які порушуються внаслідок дії стресових факторів. Отримані результати мають істотне значення для розуміння патогенезу соматичних розладів та можливостей їх запобігання за умов дії стресових чинників різного походження.

1. За фізіологічних умов активність реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки у щурів має свою характерну особливість для кожної реакції та кожного окремо взятого білка. Послідовність активності даних реакцій була слідуючою: ацетилювання – мНГБ > Н2В > лНГБ > Н4 > Н2А > Н1; метилювання – лНГБ > мНГБ > Н3 > Н4 > Н2А > Н2В > Н1; АДФ-рибозилювання – мНГБ > лНГБ > Н1 > Н3 > Н2А > Н2В > Н4; фосфорилювання – мНГБ > лНГБ > Н1 > Н2В > Н3 > Н4. Активність реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки, у зазначеній послідовності, забезпечує стаціонарне функціонування геномних структур клітин печінки.

2. Чотирьохдобова депривація сну викликає стійку дезінтеграцію активності реакцій посттрансляційної модифікації як гістонів, так і негістонових білків хроматину ядер клітин печінки, при цьому змінюється активність та послідовність цих реакцій. Найбільш глибоких зрушень зазнають реакції метилювання та АДФ-рибозилювання білків хроматину, відновлення функціональної активності яких не відбувається навіть через 14 діб після завершення дії стресового фактору, що може призвести до структурних змін кор нуклеосом.

3. Тривале тотальне g-опромінення у сумарній дозі 1,0 Гр призводить до більш виражених, а саме головне – хвилеподібних змін активності реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки, які за своєю глибиною значно перевершують аналогічні показники після депривації сну. Поряд з порушенням метилювання, яке відбувається і при стресі, найбільш суттєво змінюється також активність реакцій ацетилювання та фосфорилювання гістонів та негістонових білків, значення яких достовірно відрізняється від контролю на протязі всього експерименту. Це свідчить про порушення міжнуклеосомних взаємовідносин.

4. У радіаційно уражених щурів депривація сну на протязі чотирьох діб викликає більш глибокі зрушення активності та послідовності реакцій модифікації білків хроматину ядер клітин печінки, ніж дія кожного окремо взятого чинника. Характерним для цього ураження є різкі перепади активності досліджуваних реакцій від дуже високих до дуже низьких значень на протязі всього експерименту. При цьому найбільших зрушень зазнають процеси посттрансляційних модифікацій гістонів Н2В, Н3, Н4, мНГБ і лНГБ, які можуть викликати зміни структури хроматину.

5. За умов депривації сну курсове введення гептралу сприяє стабілізації процесів посттрансляційної модифікації білків хроматину у динаміці експерименту, а починаючи з 7 доби після завершення дії стресового фактору, відновлює більшість показників до рівня контролю. Найбільш ефективно гептрал впливає на ацетилювання, фосфорилювання та АДФ- рибозилювання гістонів Н1, Н2А, Н3 та Н4, дещо у меншій мірі – на метилювання, активність якого для більшості білків на кінець експерименту відновлюється до контролю.

6. Введення гептралу в незначній мірі усуває дезінтегруючу дію тривалого g-опромінення у сумарній дозі 1,0 Гр на реакції посттрансляційної модифікації гістонів та негістонових білків, але його ефективність є значно нижчою, ніж за умов депривації сну. Тільки на кінець експерименту з'являється тенденція до нормалізації досліджених процесів.

7. Використання гептралу за умов депривації сну у радіаційно уражених тварин сприяє зниженню процесів дезінтеграції реакцій посттрансляційної модифікацій білків хроматину і відновленню структури гістонів у корі нуклеосом на всіх етапах дослідження. Незважаючи на те, що відновлення активності цих процесів до фізіологічного рівня не відбувається, позитивним є те, що на кінець експерименту відновлюється їх послідовність на новому, дещо нижчому за контроль стаціонарному рівні.

8. Стресові фактори, як кожний окремо, так і сумісно, викликають зменшення вмісту цАМФ та різноспрямовані зміни вмісту цГМФ. Глибина та напрямок виявлених зрушень залежать від характеру стресового чиннику та терміну, що пройшов після ураження. Введення гептралу сприяє нормалізації вмісту цАМФ та цГМФ, що в свою чергу, позитивно впливає на активність реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину і, зокрема, фосфорилювання – універсального біологічного процесу, завдяки якому відбувається регуляція взаємодії цих реакцій у єдиному механізмі забезпечення матричної активності хроматину, синтезу і виходу із ядер мРНК.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Кресюн В.В., Напханюк В.К. Активність реакцій фосфорилювання гістонів та негістонових білків хроматину ядер клітин печінки за умов стресу і після стресового періоду // Одеський медичний журнал. – 2000. - № 5. – С. 7-10.

2. Кресюн В.В., Напханюк В.К. Вплив стресу на активність реакцій метилювання гістонів та негістонових білків ядер клітин печінки // Одеський медичний журнал. – 2001. - №1. – С. 22-25.

3. Кресюн В.В., Напханюк В.К. Вміст циклічних нуклеотидів у печінці щурів та його корекція за умов стресу // Ліки. – 2001. - № 5.- С. 60-63.

4. Кресюн В.В. Активність реакцій АДФ-рибозилювання хроматину ядер клітин печінки за умов депривації сну у радіаційно уражених щурів // Одеський медичний журнал.– 2001.- № 5.– С. 19-21.

5. Кресюн В.В. Стан реакцій метилювання білків хроматину ядер клітин печінки за умов депри-вації сну в радіаційно уражених щурів // Одеський медичний журнал.– 2001. - № 6.– С. 38-41.

6. Кресюн В.В., Напханюк В.К. Вплив тривалого g-опромінення у дозі 1,0 Гр на АДФ-рибозилювання білків хроматину ядер гепатоцитів // Вісник морської медицини.– 2001.- № 4.– С. 98-102.

7. Кресюн В.В. Вплив гептралу на стан системи циклічних нуклеотидів печінки за умов сумісної дії g-опромінення та депривації сну // Вісник Вінницького держ. мед. ун-ту.– 2002.- Т. 6.- № 1.– С. 178.

8. Кресюн В.В., Напханюк В.К. Фармакокорекція реакцій фосфорилювання гістонів та негістонових білків хроматину ядер клітин печінки щурів за умов стресу // Матер. международной науч.-практ. конференции “Лекарства – человеку”. – Харьков, 2000. – С. 52-53.

9. Кресюн В.В., Напханюк В.К. Реакції модифікації білків хроматину ядер клітин печінки за умов депривації сну радіаційно уражених щурів // Праці VII міжнародн. наук.-практ. конференції “Сучасні досягнення валеології та спортивної медицини”. – Одеса, 2001. – С. 178-179.

10. Кресюн В.В., Напханюк В.К. Використання гептралу для корекції метаболічних зрушень за умов стрес-індукованого ураження печінки щурів // Матер. ІІ Націон. з'їзду фармакологів України “Фармакологія 2001 – крок в майбутнє”. – Дніпропетровськ, 2001. - С. 136.

АНОТАЦІЯ

Кресюн В.В. Механізми стрес-індукованих уражень печінки. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.04 – патологічна фізіологія. - Одеський державний медичний університет МОЗ України, Одеса, 2002.

Дисертація присвячена дослідженню реакцій посттрансляційних модифікацій білків хроматину ядер клітин печінки, вмісту циклічних нуклеотидів у печінці за умов тривалої депривації сну, тривалого g-опромінення у сумарній дозі 1,0 Гр і сумісної дії цих факторів та впливу на ці процеси курсового введення гептралу. Встановлено, що стрес-індуковані ураження печінки викликають досить глибокі і стійкі зміни реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки та вмісту у печінці циклічних нуклеотидів. Глибина та напрямок виявлених зрушень реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину та вмісту циклічних нуклеотидів залежать від стресового фактору, терміну його дії та виду білків хроматину. Такі зрушення можуть свідчати про зміни транскрипції, процесингу, синтезу РНК і ДНК. Виявлено, що найбільш суттєві зміни досліджених процесів відбуваються при сумісній дії тривалого g-опромінення та депривації сну.

Встановлено, що гептрал сприяє ослабленню дії стресових факторів на процеси посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки, усуваючи їх дезінтеграцію і відновлюючи їх визначений стаціонарний рівень.

Ключові слова: стрес, g-опромінення, хроматин, ацетилювання, фосфорилювання, метилювання, АДФ-рибозилювання, корекція.

АННОТАЦИЯ

Кресюн В.В. Механизмы стресс-индуцированных поражений печени. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.04 – патологическая физиология. – Одесский государственный медицинский университет, МЗ Украины, Одесса, 2002.

Диссертация посвящена исследованию активности реакций посттрансляционной модификации белков хроматина ядер клеток печени, содержания циклических нуклеотидов в печени при четырехсуточной депривации сна, после длительного тотального g-облучения, их совместного действия и влияния на эти же процессы курсового введения гептрала.

На основании проведенных исследований установлено, что изменения активности реакций посттрансляционной модификации гистонов и негистоновых белков хроматина ядер клеток печени имеют свои характерные особенности на каждой стадии развития хронического стресса и в послестрессовом периоде. Экспериментально доказано, что длительная депривация сна приводит к наиболее существенным нарушениям активности реакций метилирования.

Длительное g-облучение в суммарной дозе 1,0 Гр приводит к стойкой дезинтеграции активности реакций посттрансляционной модификации гистонов и негистоновых белков хроматина ядер клеток печени на всех этапах эксперимента. При этом