КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Решетнік Євдокія Миколаївна

УДК 612.35+591.132.5

РЕГУЛЯТОРНИЙ ВПЛИВ ЕНКЕФАЛІНІВ ТА ЇХ СИНТЕТИЧНИХ АНАЛОГІВ НА ЖОВЧОСЕКРЕТОРНУ ФУНКЦІЮ

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

Автореферат дисертації на здобуття

наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ-2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у НДІ фізіології імені академіка Петра Богача біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор Рибальченко Володимир Корнійович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач відділу цитофізіології біологічного факультету

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор, член-кореспондент АПН України

Шевчук Віктор Григорович,

Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, завідувач кафедри нормальної фізіології

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Шаповал Людмила Миколаївна,

Інститут фізіології імені О.О. Богомольця НАН України, провідний науковий співробітник

Провідна установа:

Львівський національний університет імені Івана Франка

Захист відбудеться “16” вересня 2002 р. о “16” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 при Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03022, Київ-22, пр. акад. Глушкова, 2, ауд.215.

Поштова адреса: 01033, Київ, вул. Володимирська, 64, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “15” серпня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Т.Л. Давидовська

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Встановлено, що на функціональний стан печінки впливають ендогенні опіоїдні пентапептиди лей- і мет-енкефалін та їх синтетичні аналоги [Масюк, 1996; Костенко і співавт., 1998; Sverko et al., 1993; Olson et al., 1996; Bergasa et al., 1997; Vaccarino et al., 2000].

Енкефаліни змінюють метаболізм вуглеводів, стимулюючи глікогеноліз і посилюючи синтез глюкози з пірувату в дослідах in vivo та в ізольованих гепатоцитах щурів [Hothi et al., 1988, 1989]. Разом з тим показана здатність енкефалінів перешкоджати процесам глікогенолізу та попереджати гіперглікемію, викликану адреналіном. Крім того, опіоїдні пептиди істотно змінюють секрецію катехоламінів, кортизолу, низки інших гормонів, які впливають на метаболізм вуглеводів, що свідчить про можливість їх участі в регуляції вуглеводного обміну [Громов, 1992].

Виявлені ефекти опіоїдних пептидів на білковий обмін в клітинах печінки. Стимуляція центральних мю-опіоїдних рецепторів відображається на інтенсивності тканевого білкового синтезу. Так, інтрацеребровентрикулярне введення синтетичного пептиду DAGO ([D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-енкефалін) знижує рівень синтезу білка у клітинах печінки [Hashiguchi et al., 1997]. Разом з тим відзначається, що аналог дерморфіну А10, агоніст мю-опіоїдних рецепторів, збільшує кількість ДНК-синтезуючих гепатоцитів, що вказує на посилення процесів регенерації в печінці при дії опіоїдних пептидів [Гончарова и соавт.,1997].

Природні енкефаліни і їх синтетичні аналоги впливають також на інтенсивність процесів перекисного окислення ліпідів у тканині печінки, виявляючи переважно антиоксидантну дію [Тимошин и соавт., 1991; Короткина и соавт., 1992; Слепушкин, 1997]. Виявлені гепатопротективні властивості синтетичного аналогу лей-енкефаліну даларгіну, зокрема за умов холестазу, які пов'язують з його антиоксидантними властивостями [Короткина и соавт., 1992; Колотилов та співавт., 1995]. Встановлено, що при холестатичних захворюваннях печінки в плазмі крові підвищується концентрація ендогенних опіоїдних пептидів, що свідчить про тісний функціональний взаємозв'язок між гепатобіліарною і опіоїдною системами і роль останньої у розвитку патології [Swain et al., 1994; Bergasa et al., 1995].

Дослідженнями, проведеними в Київському університеті, встановлено, що секреторна функція печінки змінюється під впливом різних доз енкефалінів при їх внутрішньопортальному введенні [Масюк, 1996]. Зарубіжними авторами показано, що секреція жовчі пригнічується при введенні в шлуночки мозку опіоїдних пептидів та їх синтетичних аналогів [Bergasa et al., 1997, 1999]. Отже, енкефаліни змінюють інтенсивність секреції жовчі при введенні їх у кровоносне русло і при внутрішньомозковому введенні.

Перелічені факти свідчать, що енкефаліни здатні впливати на функціональний стан гепатоцитів, однак, недослідженою лишається проблема можливих механізмів впливу енкефалінів та їх синтетичних аналогів на жовчосекреторну функцію печінки. Вважається, що регуляторний вплив енкефалінів опосередкований мембранними рецепторами, які локалізовані своїми пептид-зв'язуючими центрами як на зовнішній, так і внутрішній стороні плазматичної мембрани клітин [Громов, Криворотов, 1991; Громов, 1992; Wittert et al, 1996]. Енкефаліни, як і інші регуляторні пептиди, взаємодіють з ліпідами плазматичної мембрани, що не може не впливати на конформацію їх молекул і, як наслідок, на прояв їх ефектів [Островська і співав., 1998; Рибальченко, Островська, 1998]. Вищевикладене є обгрунтуванням мети й завдань роботи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у науково дослідному інституті фізіології імені академіка Петра Богача біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка в рамках науково-дослідницької теми “Дослідження внутрішньоклітинних механізмів регуляції функціонального стану гепатобіліарної системи”, № держреєстрації 0197U003102.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи – встановити можливі шляхи реалізації регуляторного впливу енкефалінів та їх синтетичних аналогів на секреторну функцію печінки. Для досягнення поставленої мети вирішувались такі завдання:

1. Вивчити особливості впливу блокаторів опіоїдних рецепторів стадолу, адренорецепторів – фентоламіну і кальцієвих каналів - верапамілу на секреторну функцію печінки щурів;

2. Дослідити інтенсивність секреції жовчі печінкою щурів, її хімічний склад при дії лей- і мет-енкефалінів та даларгіну і Љ-77- синтетичних аналогів опіоїдних пептидів за умов блокади опіоїдних рецепторів, адренорецепторів і кальцієвих каналів гепатоцитів;

3. Встановити особливості ефектів синтетичного аналогу лей-енкефаліну – даларгіну на жовчосекреторну функцію ізольованої перфузованої печінки щурів;

4. З'ясувати можливі механізми ефектів енкефалінів на секреторну функцію печінки щурів.

Об'єкт дослідження – жовчосекреторна функція печінки щурів.

Предмет дослідження – рівень секреції жовчі та її основних органічних компонентів (жовчних кислот і ліпідів) під впливом опіоїдних біорегуляторів.

Методи дослідження. Регуляторний вплив енкефалінів та їх синтетичних аналогів на жовчосекреторну функцію досліджували у гострих спробах на щурах та на їх ізольованій перфузованій печінці. Тонкошаровою хроматографією визначали вміст основних органічних компонентів жовчі – жовчних кислот і ліпідів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше досліджена жовчосекреторна функція печінки у щурів під впливом опіоїдних пептидів – лей- і мет-енкефалінів та їх синтетичних аналогів – даларгіну і пептиду Љ-77 за умов блокади опіоїдних рецепторів, адренорецепторів та кальцієвих каналів плазматичної мембрани. Отримані дані свідчать про складні механізми впливу цих регуляторів на метаболічні процеси в гепатоцитах, результатом чого є зміни швидкості секреції і хімічного складу жовчі. Довготривалість таких змін в дослідах in vivo та гальмуючий вплив даларгіну на секреторну функцію ізольованої печінки свідчать як про опосередкованість ефектів досліджуваних біологічно активних речовин завдяки нервовій і гуморальній регуляції, так і про безпосередній їх вплив на гепатоцити. При цьому специфічні ефекти мет- і лей-енкефалінів реалізуються переважно через дельта- і мю-типи опіоїдних рецепторів, про що свідчить усування стадолом гальмівного впливу енкефалінів на жовчосекреторну функцію.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлені закономірності змін секреторної активності печінки при дії лей- і мет-енкефалінів, синтетичного аналогу лей-енкефаліну – даларгіну за умов блокади опіоїдних рецепторів поглиблюють і розширюють знання про механізми регуляції секреції жовчі. Експериментами на цілісній тварині і ізольованій печінці віддиференційовані прямі і опосередковані ефекти енкефалінів. Дані про вплив даларгіну на секреторну функцію печінки на фоні дії стадолу становлять практичний інтерес, оскільки зазначені препарати широко застосовуються в лікувальній практиці. Результати дисертації впроваджені в навчальний процес біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка при читанні спецкурсів “Фізіологія ендокринної системи” та “Мембранологія” і загального курсу з нормальної фізіології Медичного інституту Української асоціації народної медицини.

Особистий внесок здобувача полягає у формулюванні мети і основних завдань роботи (за участю наукового керівника), у підборі та обробці даних літератури, виконанні експериментальної частини дисертації, статистичній обробці результатів, оформленні ілюстрацій, а також аналізі та інтерпретації одержаних результатів.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені і обговорені на Всеросійській науковій конференції з міжнародною участю, присвяченій 150-літтю з дня народження академіка Івана Петровича Павлова (Санкт-Петербург, 1999); 2-й об'єднаній Всеросійській і Всеармійській науковій конференції “Санкт-Петербург – Гастро-2000” (Санкт-Петербург, 2000); ІІ Всеукраїнському з'їзді гастроентерологів (Дніпропетровськ, 2000); Конгресі гепатологів України (Київ, 2000); Всеукраїнській науковій конференції “Актуальні проблеми гастроентерології” (Київ, 2001).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 наукових робіт, з яких 5 статей у фахових наукових виданнях, 3 тез доповідей на конференціях.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 145 сторінках машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків. Список використаних джерел літератури містить 235 найменувань, з них 107 українською та російською мовами, 128 – англійською мовою. Робота ілюстрована 37 рисунками і 8 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень

Досліди проведені у гострих спробах з використанням тіопенталового наркозу (5мг/100г) на 135 білих щурах - самцях масою 170 – 230 г. Для дослідження функції жовчовиділення використали розробки [Масюк, 1996; Долгова, 1997; Тукаєв, 1999]. Після лапаротомії і канюлювання загальної жовчної протоки реєстрували вихідний рівень жовчовиділення, який визначали шляхом збору чотирьох перших 15-хвилинних порцій жовчі і з яким порівнювали дані отримані після внутрішньопортального введення регуляторних сполук.

У ворітну вену інфузували у вигляді розчинів сполуки в розрахунку на 100 г маси тіла тварини: стадол (Apothecon, США) - 10 мкг, верапамілу гідрохлорид (фіноптін) (Orion, Фінляндія) - 50 мкг, фентоламіну гідрохлорид (Гегюжес пірмойн, Литва) - 25 мкг, лей-енкефалін (Інститут органічного синтезу АН Латвії) - 0,1 і 1,0 мкг, мет-енкефалін (Інститут органічного синтезу АН Латвії) - 0,1 і 1,0 мкг, синтетичний опіоїдний пептид Љ-77 – 1,0 мкг (Інститут органічного синтезу АН Латвії), даларгін (підприємство “Биолек” ХФ А/Т “Октамед”, Харків) - 0,1 і 1,0 мкг. Час інфузії – 30 хвилин. Швидкість інфузії – 50 мкл/хв.

Перфузію ізольованої печінки щурів проводили за методом [Синельник та співавт., 1999]. Після лапаротомії канюлювали загальну жовчну протоку і ворітну вену та ізолювали печінку. Даларгін інфузували безпосередньо у ворітну вену впродовж 20 хвилин, створюючи його концентрацію в судинному руслі печінки тотожну тій, що утворюється при його введенні у гострих спробах в дозі 1 мкг на 100 г маси тіла тварини.

Жовчні кислоти і ліпіди жовчі визначали тонкошаровою хроматографією за методами [Ростовцев, Резник, 1982; Петровский и соавт., 1986; Весельский и соавт., 1990].

Статистичну обробку даних проводили з використанням критерію Стьюдента за допомогою сучасної комп'ютерної техніки. Різницю між контролем і дослідом вважали достовірною при Р<0,05.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив стадолу – блокатора опіоїдних рецепторів на інтенсивність секреції жовчі печінкою щурів та на спектр жовчних кислот і ліпідів жовчі. З метою визначення регуляторного впливу опіоїдних пептидів на жовчосекреторну функцію печінки доцільно було провести дослідження ефектів енкефалінів та їх синтетичних аналогів за умов блокади опіоїдних рецепторів стадолом. Тому перш за все було досліджено вплив стадолу на секрецію жовчі та її органічних компонентів.

У тварин контрольної групи впродовж 4,5 годин досліду достовірно не змінюється швидкість секреції жовчі, жовчних кислот і ліпідів жовчі. Стадол у дозі 10 мкг/100 г істотно не змінює впродовж трьох годин після інфузії швидкість секреції жовчі, яка коливається у межах 1,56 - 1,65 мкл*г-1печінки*хв.-1. В той же час впродовж третьої години після завершення інфузії стадолу підвищується секреція таурохолевої кислоти на 22,1%, таурохенодезоксихолевої та тауродезоксихолевої кислот - на 28,8% і глікохолевої кислоти - на 18,1% (P<0,05). Рівень секреції холевої кислоти зростає під час другої – третьої дослідних годин на 17,0% (P<0,05). Слід підкреслити також наявність прямого кореляційного зв'язку між рівнем секреції жовчі і секрецією жовчних кислот, зокрема таурохолевої кислоти (коефіцієнт кореляції r=0,68, P<0,02) і таурохенодезоксихолевої та тауродезоксихолевої кислот (r=0,73, P<0,01) при дії стадолу. Ці результати узгоджуються з даними інших авторів про прямий зв'язок між секрецією жовчі і таурокон'югатів жовчних кислот та з точкою зору на жовчні кислоти як основні органічні компоненти, що визначають швидкість секреції жовчі [Boyer, Nathanson, 1999].

Стадол пригнічує секрецію тригліцеридів впродовж першої години досліду на 21,7% (P<0,05) та холестерину під час другої години після інфузії на 21,5% (P<0,05). Впродовж третьої години підвищується інтенсивність секреції ефірів холестерину на 32,6% (P<0,05).

За даними літератури стадол впливає переважно як агоніст на каппа-опіоїдні рецептори та як антагоніст на дельта- і мю-рецептори [Лихванцев и соавт., 1994; Чиченков, 1994; Чурюканов, 1998; Ho et al., 1997; Garwer et al., 1997; Wongchanapai et al., 1998]. Ймовірно, ефекти стадолу на жовчосекреторну функцію, пов'язані з його дією на опіоїдні рецептори.

Вплив лей- і мет-енкефалінів та синтетичних опіоїдних пептидів даларгіну і Љ-77 на інтенсивність секреції жовчі печінкою щурів за умов блокади опіоїдних рецепторів стадолом. Попередньо нами було встановлено, що енкефаліни та їх синтетичні аналоги переважно пригнічують секрецію жовчі. Лей-енкефалін у дозі 0,1 мкг/100 г пригнічує секрецію жовчі на 31,4% (P<0,01), а при дозі 1,0 мкг/100 г секреція жовчі посилюється на 23,2% (P<0,05). Отже, лей-енкефалін виявляє протилежні ефекти залежно від дози пептиду. Мет-енкефалін у дозі 0,1 мкг/100 г пригнічує секрецію жовчі печінкою щурів на 16,7% (P<0,05), а в дозі 1,0 мкг/ 100 г на 31,9% (P<0,01).

За умов послідовного введення стадолу і лей-енкефаліну або мет-енкефаліну в досліджуваних дозах швидкість секреції жовчі достовірно не змінюється впродовж усього досліду.

Результати досліджень секреторної функції печінки при дії синтетичних аналогів енкефалінів даларгіну та Љ-77 (N-трифторацетил-лізил-гліцил-n-нітро-фенілаланіл-амід ацетатдигідрат) свідчать, що, незалежно від застосованої дози, вони знижують швидкість секреції жовчі. Стадол усуває ці ефекти, прикладом чого є результати досліджень, представлених на рис.1: послідовна інфузія стадолу (10,0 мкг/100 г) і даларгіну в дозах 0,1 і 1,0 мкг/100 г достовірно не змінює секреції жовчі впродовж трьох годин досліду. Це свідчить про те, що регуляторний вплив енкефалінів на швидкість секреції жовчі реалізується за участю дельта- і мю-типів опіоїдних рецепторів.

Секреція жовчних кислот з жовчю при дії лей-енкефаліну, мет-енкефаліну і даларгіну за умов блокади опіоїдних рецепторів. Мет-енкефалін в дозі 0,1 мкг пригнічує секрецію жовчних кислот. На фоні стадолу мет-енкефалін (0,1 мкг/100 г) підвищує інтенсивність секреції таурокон'югатів і пригнічує секрецію глікохенодезоксихолевої і глікодезоксихолевої кислот так само, як і вільних жовчних кислот (табл.1). Послідовна інфузія стадолу (10,0 мкг/100 г) та мет-енкефаліну (1,0 мкг/100 г) значно підсилює секрецію таурокон'югатів (табл.1). Секреція глікохолевої кислоти не змінюється, а глікохенодезоксихолевої і глікодезоксихолевої кислот вільних жовчних кислот знижується (табл.1).

Таблиця 1.

Інтенсивність секреції жовчних кислот (мкг/г печінки/хв, M±m) та її відносні зміни порівняно з вихідним рівнем (контроль) (%) після внутрішньопортальної інфузії стадолу і мет-енкефаліну.

Час досліду Жовчні кислоти

ТХК ТХДХК+ ТДХК ГХК ГХДХК+ ГДХК ХК ХДХК+ ДХК

Стадол (10мкг/100г) + мет-енкефалін (0,1мкг/100г)

Контроль 2,74±0,03 1,76±0,07 1,93±0,03 0,20±0,01 0,34±0,03 0,14±0,01

Інфузія І 2,83±0,08 1,79±0,12 1,83±0,15 0,18±0,02 0,31±0,03 0,13±0,01

Інфузія ІІ 3,24±0,12 18,2%*** 1,87±0,14 1,69±0,17 0,18±0,02 0,30±0,02 0,11±0,01 -22%***

І година 3,37±0,06 23,2%**** 2,01±0,10 1,73±0,07 0,16±0,01 -18,7%**** 0,24±0,01 -30,6%*** 0,09±0,001 -36,6%****

ІІ година 3,76±0,11 37,4%**** 2,63±0,11 49,0%**** 2,20±0,18 0,18±0,01 0,26±0,01 -24,7%** 0,10±0,001 -29,3%****

ІІІ година 3,56±0,18 30%*** 2,26±0,2 28,2%* 1,88±0,18 0,19±0,01 0,27±0,01 -22,2%* 0,10±0,05 -26,8%****

Стадол (10мкг/100г) + мет-енкефалін (1мкг/100г)

Контроль 2,76±0,04 1,39±0,02 2,24±0,07 0,45±0,01 0,53±0,04 0,22±0,02

Інфузія І 2,84±0,30 1,34±0,02 2,09±0,05 0,40±0,03 0,47±0,01 0,21±0,01

Інфузія ІІ 3,13±0,24 1,48±0,04 2,15±0,14 0,38±0,02 0,44±0,03 0,20±0,01

І година 3,66±0,24 32,6%*** 1,71±0,02 23,5%**** 2,12±0,05 0,31±0,01 -31,7%**** 0,44±0,02 0,16±0,004 -27,8%***

ІІ година 3,62±0,30 31,3%* 1,80±0,08 30%*** 2,00±0,04 0,27±0,01 -39,6%**** 0,43±0,05 0,15±0,01 -32,3%***

ІІІ година 3,54±0,23 20,4%** 1,86±0,07 34,1%**** 1,97±0,07 0,28±0,03 -38,1%**** 0,37±0,04 -29,4%* 0,15±0,01 -30,8%***

Примітки: *-P<0,05, **-P<0,02, ***-P<0,01, ****-P<0,001; ТХК-таурохолева, ТХДХК-таурохенодезоксихолева, ТДХК-тауродезоксихолева - таурокон'югати жовчних кислот; ГХК-глікохолева, ГХДХК-глікохенодезоксихолева, ГДХК-глікодезоксихолева – глікокон'югати жовчних кислот; ХК-холева, ХДХК-хенодезоксихолева, ДХК-дезоксихолева – вільні жовчні кислоти.

Встановлено, що лей-енкефалін у дозі 0,1 мкг/100 г знижує, а в дозі 1,0 мкг/100 г не змінює секрецію як вільних, так і кон`югованих жовчних кислот. Після інфузії стадолу (10,0 мкг/100 г) та лей-енкефаліну (0,1 мкг/100 г) достовірно секреція жовчних кислот не змінюється. Отже, попереднє введення стадолу усуває пригнічуючий вплив лей-енкефаліну в цій дозі на секрецію жовчних кислот.

Синтетичний аналог лей-енкефаліну даларгін в обох застосованих дозах достовірно знижує інтенсивність секреції як кон`югованих, так і вільних жовчних кислот. Даларгін в меншій дозі пригнічує секрецію таурокон'югатів на 38,1% (P<0,05), глікокон'югатів на 32,3% (P<0,05), вільних жовчних кислот на 23,1% (P<0,05). Даларгін в більшій дозі знижує секрецію таурокон'югатів на 28,3% (P<0,02), глікокон'югатів на 30,4%(P<0,05), вільних жовчних кислот на 25% (P<0,05). За умов послідовної внутрішньопортальної інфузії стадолу (10,0 мкг/100 г) і даларгіну (0,1 мкг) лише секреція хенодезоксихолевої і дезоксихолевої кислот знижується на 25,0% (P<0,05). При послідовному введенні стадолу і даларгіну в дозі 1,0 мкг/100 г підвищується секреція таурохолевої кислоти впродовж третьої години досліду на 38,4% (P<0,01), а таурохенодезоксихолевої і тауродезоксихолевої - впродовж другої і третьої години після інфузії на 22,6% (P<0,05) і 39,2% (P<0,01) відповідно. Інтенсивність секреції глікохолевої кислоти підсилюється на 20,7% наприкінці досліду.

Отримані результати свідчать, що підсилення секреції таурокон'югатів жовчних кислот після послідовної інфузії стадолу і мет-енкефаліну в обох застосованих дозах відбувається одночасно з пригніченням секреції вільних жовчних кислот, що свідчить про інтенсифікацію процесів кон'югації вільних жовчних кислот (табл.1). Можливо, зменшення рівня секреції вільних жовчних кислот частково обумовлене пригніченням їх синтезу в гепатоцитах. Фізіологічне значення утворення кон'югованих жовчних кислот полягає в тому, що вони більш розчинні, ніж вільні жовчні кислоти, завдяки чому значно зростає швидкість їх секреції з жовчю. Слід відзначити також, що секреція таурокон'югатів зростає при дії даларгіну в дозі 1 мкг/100 г за умов блокади опіоїдних рецепторів, однак це підвищення не супроводжується пригніченням секреції вільних жовчних кислот. Вплив енкефалінів та їх аналогів на клітину реалізується завдяки їх зв'язуванню з відповідними опіоїдними рецепторами [Dhawan et al., 1996]. Виходячи з цього і отриманих нами даних слід припустити, що даларгін, як і природні лей- і мет-енкефаліни реалізує свою гіпохолеретичну дію за участю рецепторного апарату гепатоцитів. Проте, відмінність у секреції жовчних кислот при інфузії самого стадолу та за умов спільної дії блокатора і опіоїдних пептидів може свідчити про залучення інших, не опосередкованих рецепторами механізмів дії енкефалінів на секрецію жовчних кислот.

Секреція ліпідів з жовчю під впливом лей-енкефаліну, мет-енкефаліну і даларгіну на фоні блокади опіоїдних рецепторів. Лей-енкефалін в дозі 0,1 мкг/100 г знижує швидкість секреції фосфоліпідів жовчі на 23,3% (P<0,05), холестерину – на 19,4 (P<0,05) і 21%(P<0,05), вільних жирних кислот – на 18,9 (P<0,05) і 20,3% (P<0,05) впродовж першої – третьої годин досліду. Лей-енкефалін в дозі 1,0 мкг/100 г посилює секрецію холестерину на 28,1% (P<0,02) і його ефірів на 46,3% (P<0,02), фосфоліпідів на 26,8% (P<0,05), вільних жирних кислот на 39,8% (P<0,05), тригліцеридів на 38,6% (P<0,05).

Після послідовного введення стадолу (10,0 мкг/100 г) і лей-енкефаліну (0,1 мкг/100 г) швидкість секреції всіх ліпідів зростає: фосфоліпідів на 25,6% (P<0,02), тригліцеридів на 33,3% (P<0,001), холестерину на 38,0% (P<0,05) під час другої години після інфузії, а секреція ефірів холестерину збільшується впродовж третьої години досліду на 26,3% (P<0,05), секреція вільних жирних кислот підвищується впродовж першої – третьої годин досліду на 35,1 (P<0,05) і 43,2% (P<0,05). При введенні лей-енкефаліну в дозі 0,1 мкг/100 г на фоні блокади опіоїдних рецепторів виявлений прямий кореляційний зв'язок між секрецією таурохолевої кислоти і фосфоліпідів жовчі (r = 0,91, P<0,01).

Послідовна інфузія стадолу (10,0 мкг/100 г) та лей-енкефаліну (1,0 мкг/100 г) підсилює секрецію холестерину на 20,2% (P<0,05), в першу годину досліду і ефірів холестерину на 21,9 (P<0,05) і 23% (P<0,05) впродовж другої і третьої годин після завершення інфузії. За таких умов досліду швидкість секреції тригліцеридів посилюється в першу годину досліду на 25% (P<0,05), а в подальшому знижується впродовж другої і третьої годин на 27,3 (P<0,05) та 30,2% (P<0,05).

При внутрішньопортальній інфузії мет-енкефаліну в дозі 0,1 мкг/100 г спостерігається зниження секреції фосфоліпідів, холестерину і вільних жирних кислот. Секреція ефірів холестерину і тригліцеридів достовірно не змінюється. Мет-енкефалін при збільшенні дози до 1,0 мкг/100 г істотно пригнічує секрецію ліпідів жовчі: секреція фосфоліпідів зменшується на 32,9% (P<0,02), холестерину – на 27,9% (P<0,05), а ефірів холестерину на 31,2 (P<0,05), тригліцеридів - на 30,1% (P<0,05), вільних жирних кислот - на 32,1% (P<0,05).

При внутрішньопортальній інфузії стадолу (10,0 мкг/100 г) і мет-енкефаліну в дозі 0,1 мкг/100 г посилюється секреція вільних жирних кислот, фосфоліпідів і ефірів холестерину жовчі, а швидкість секреції тригліцеридів при цьому знижується (табл.2).

Таблиця 2.

Інтенсивність секреції ліпідів (мкг/г печінки/хв, M±m) та її відносні зміни порівняно з вихідним рівнем (контроль) (%) після внутрішньопортальної інфузії стадолу і мет-енкефаліну.

Час досліду Ліпіди

ФЛ ХС ЕХС ВЖрК ТГ

Стадол (10мкг/100г) + мет-енкефалін (0,1мкг/100г)

Контроль 0,74±0,02 0,43±0,02 0,09±0,01 0,12±0,01 0,06±0,004

Інфузія І 0,77±0,01 0,38±0,01 0,10±0,01 0,11±0,01 0,05±0,01

Інфузія ІІ 0,81±0,03 0,39±0,02 0,11±0,01 0,14±0,01 0,03±0,01 -45,9%***

І година 0,84±0,01 0,42±0,02 0,12±0,01 28,4%** 0,13±0,01 0,02±0,01 -62,2%****

ІІ година 1,08±0,07 47,1%*** 0,49±0,05 0,15±0,01 65,1%**** 0,17±0,01 42,7%*** 0,03±0,01 -45,9%***

ІІІ година 1,05±0,03 41,9%*** 0,48±0,03 0,14±0,01 54,1%**** 0,16±0,01 34,3%**** 0,04±0,006 -35,1%***

Стадол (10мкг/100г) + мет-енкефалін (1мкг/100г)

Контроль 0,90±0,02 0,63±0,01 0,17±0,001 0,18±0,01 0,04±0,004

Інфузія І 0,89±0,08 0,60±0,05 0,15±0,01 0,18±0,02 0,03±0,01

Інфузія ІІ 1,15±0,11 28,9%* 0,64±0,04 0,11±0,02 -36,9%*** 0,23±0,02 29%* 0,03±0,01

І година 1,25±0,12 39,7%* 0,74±0,02 18,1%*** 0,10±0,01 -40,9%*** 0,23±0,02 29%* 0,04±0,01

ІІ година 1,15±0,10 28,1%* 0,70±0,04 0,13±0,01 -25,1%*** 0,24±0,02 34,6%* 0,04±0,01

ІІІ година 0,91±0,01 0,63±0,02 0,16±0,01 0,21±0,003 16,1%*** 0,05±0,003 22,7%*

Примітки: *-P<0,05, **-P<0,02, ***-P<0,01, ****-P<0,001; ФЛ-фосфоліпіди, ХС-холестерин, ЕХС-ефіри холестерину, ВЖрК-вільні жирні кислоти, ТГ-тригліцериди.

При введенні мет-енкефаліну в дозі 0,1 мкг за умов блокади опіоїдних рецепторів стадолом виявлений прямий кореляційний зв'язок між швидкістю секреції таурохолевої кислоти і фосфоліпідів (r = 0,93, P<0,01) та холестерину (r = 0,69, P<0,02). Це дозволяє припустити, що збільшення секреції ліпідів пов'язане з посиленням секреції таурохолевої кислоти.

Послідовне внутрішньопортальне введення стадолу (10,0 мкг/100 г) та мет-енкефаліну (1,0 мкг/100 г) підсилює секрецію фосфоліпідів, вільних жирних кислот і тригліцеридів та пригнічує секрецію ефірів холестерину (табл.2).

Після послідовної інфузії стадолу і мет-енкефаліну в дозі 1,0 мкг/100 г швидкість секреції фосфоліпідів прямо корелює з швидкістю секреції таурохолевої кислоти (r = 0,66, P<0,02). Прямий кореляційний зв'язок встановлений також між секрецією холестерину і таурохолевої кислоти (r = 0,73, P<0,01).

Даларгін в дозах 0,1 і 1,0 мкг/100 г пригнічує секрецію всіх досліджуваних ліпідів жовчі і це зниження за напрямком і величиною співпадає зі змінами секреції жовчних кислот. Послідовна внутрішньопортальна інфузія стадолу (10,0 мкг/100 г) і даларгіну (0,1мкг/100 г) не змінює інтенсивності секреції ліпідів. В той же час послідовна інфузія стадолу (10,0 мкг/100 г) і даларгіну (1,0 мкг/100 г) посилює секрецію більшості ліпідів жовчі. Інтенсивність секреції фосфоліпідів і холестерину збільшується на 43,6% (P<0,05) і на 60,7% (P<0,05), відповідно. Підвищення рівня секреції ефірів холестерину на 22,6% (P<0,05) та вільних жирних кислот на 35,1% (P<0,05) спостерігається лише впродовж другої години досліду.

При застосуванні даларгіну в дозі 1,0 мкг/100г на фоні блокади опіоїдних рецепторів стадолом виявлена пряма кореляційна залежність між секрецією таурохолевої кислоти і фосфоліпідів (r = 0,77, P<0,01), холестерину (r = 0,67, P<0,02) та ефірів холестерину (r = 0,79, P<0,01), що узгоджується з уявленнями про жовчні кислоти, і, зокрема, таурохолеву кислоту, як основні визначники секреції ліпідів жовчі [Coleman, Rahman, 1992, Boyer, Nathanson, 1999].

Таким чином, енкефаліни і даларгін при блокаді опіоїдних рецепторів значно змінюють секрецію ліпідів жовчі, переважно підвищуючи її рівень.

Жовчосекреторна функція печінки при дії енкефалінів та даларгіну за умов блокади кальцієвих каналів верапамілом. Верапаміл, блокатор потенціалзалежних Са2+-каналів L-типу в клітинах електрозбудливих та скорочувальних тканин, також здатен блокувати рецептор-керовані Са2+ -канали незбудливих тканин, в тому числі печінки [Авдонин, Ткачук, 1994; Pozzan et al., 1994; Grune et al., 1997]. Оскільки іони кальцію істотно впливають на рівень секреції жовчі та її складових [Масюк та співавт., 1994] з метою з'ясування можливих механізмів регуляторного впливу енкефалінів ми дослідили динаміку змін секреції жовчі печінкою щурів в умовах послідовної внутрішньопортальної інфузії верапамілу (50,0 мкг/ 100 г) і опіоїдних пептидів (1,0 мкг/100 г).

Верапаміл в застосованій дозі знижує швидкість секреції жовчі та всіх досліджуваних жовчних кислот. Після завершення інфузії верапамілу і лей-енкефаліну секреція вільних жовчних кислот і глікокон'югатів пригнічується: глікохолевої - на 30,4% (P<0,05), глікохенодезоксихолевої та глікодезоксихолевої – на 35,2% (P<0,05), холевої кислоти - на 54,1% (P<0,05), хенодезоксихолевої і дезоксихолевої - на 28,9% (P<0,05). Швидкість секреції таурохолевої кислоти зростає впродовж першої години після завершення інфузії на 27,2% (P<0,05), а таурохенодезоксихолевої і тауродезоксихолевої кислот - на 35,4% (P<0,05). Однак, наприкінці досліду секреція таурокон'югатів виявляється зниженою на 23,1% (P<0,01).

При інфузії верапамілу і мет-енкефаліну швидкість секреції глікохолевої кислоти знижується впродовж досліду на 47,3% (P<0,01), а глікохенодезоксихолевої і глікодезоксихолевої на 39,7% (P<0,01). Секреція холевої кислоти пригнічується на 47% (P<0,02), хенодезоксихолевої і дезоксихолевої на 27,1% (P<0,05), а таурохолевої кислоти на 42,2 (P<0,01) впродовж досліду. Рівень секреції таурохенодезоксихолевої і тауродезоксихолевої кислот знижується впродовж другої – третьої годин після закінчення інфузії на 26,5 (P<0,05) і 32,8% (P<0,05).

При введенні верапамілу і даларгіну швидкість секреції жовчі впродовж другої і третьої годин досліду перевищує вихідний рівень секреції жовчі на 26,2 (P<0,05) та 21,7% (P<0,05). При послідовній інфузії верапамілу і даларгіну секреція таурохолевої кислоти посилюється на 27,8% (P<0,02) уже під час інфузії даларгіну, і надалі зростає на 41% (P<0,02). Швидкість секреції глікохолевої кислоти підвищується на 32,9% (P<0,05) впродовж усього досліду, а вільних жовчних кислот на 40% (P<0,05).

Відсутність специфічних ефектів енкефалінів на інтенсивність секреції жовчі за умов блокади кальцієвих каналів клітин печінки верапамілом свідчать про важливу роль іонів кальцію в реалізації ефектів енкефалінів на секреторну функцію печінки.

Жовчосекреторна функція печінки при дії енкефалінів та даларгіну за умов блокади адренорецепторів фентоламіном. Для перевірки припущення про можливе опосередкування ефектів опіоїдних пептидів на жовчосекреторну функцію симпатичною нервовою системою досліджували вплив даларгіну на секрецію жовчі при блокаді a-адренорецепторів фентоламіном. Секреція жовчі при внутрішньопортальному введенні фентоламіну (25,0 мкг/100 г) посилюється на 16% (P<0,05). Тобто, за умов блокади a-адренорецепторів фентоламіном усувається пригнічуючий вплив на жовчосекреторну функцію відповідних адренергічних механізмів регуляції. Даларгін (1,0 мкг/100 г) на фоні блокади a-адренорецепторів фентоламіном пригнічує секрецію жовчі на 30% (P<0,05). Отже, пригнічуючий ефект даларгіну на швидкість секреції жовчі не усувається за умов блокади a-адренорецепторів фентоламіном. Тобто до реалізації гіпохолеретичного впливу цього пептиду не залучені опосередковані a-адренорецепторами механізми регуляції жовчосекреторної функції симпатичною нервовою системою. Це може бути одним з доказів прямої дії опіоїдних пептидів на клітини печінки та їх жовчосекреторну активність.

Секреторна функція ізольованої перфузованої печінки щурів при дії синтетичного аналога лей-енкефаліну даларгіну. З метою віддиференціювання прямих ефектів опіоїдних пептидів на секрецію жовчі гепатоцитами і опосередкованих нервовою системою та залученням каскаду регуляторних пептидів досліджували дію даларгіну в умовах перфузії ізольованої печінки через ворітну вену. Слід зазначити також, що в умовах такого досліду фактично відсутній “протоковий компонент” жовчі, оскільки при перфузії через ворітну вену секреція жовчі здійснюється фактично за участю лише гепатоцитів [Синельник та співавт., 1999].

Можливість забезпечення певної концентрації жовчних кислот у перфузійному середовищі та порівняння змін їх секреції з такими за відсутності жовчних кислот у перфузаті надає змогу виявити вплив регуляторної сполуки на процеси транспорту жовчних кислот гепатоцитами з кровоносного русла в жовчні каналікули.

У відсутності жовчних кислот в перфузійному середовищі даларгін достовірно не змінює об'ємної швидкості секреції жовчі. При одночасному введенні в перфузійне середовище холевої кислоти в концентрації, що дорівнює середній сумарній концентрації жовчних кислот у крові щурів - 7Ч 10-5 М [Boyer, Nathanson, 1999] та інфузії даларгіну холеретична дія жовчної кислоти менш виражена порівняно з контролем (рис.2).

Зменшення холеретичної дії холевої кислоти під впливом даларгіну спостерігається впродовж години після закінчення його внутрішньопортальної інфузії і складає в середньому 42,6% (P<0,05) порівняно з контролем (рис.2). Під впливом даларгіну в той же час зменшується інтенсивність секреції жовчних кислот з жовчю на 37,6% (P<0,05) через 30 хвилин після закінчення інфузії препарату.

Результати досліджень показують, що під впливом даларгіну пригнічуються процеси транспорту жовчних кислот через плазматичні мембрани гепатоцитів. Можна припустити, що цей вплив реалізувався на рівні каналікулярних мембран, транспорт жовчних кислот через які є лімітуючим їх надходження у жовч. Отримані дані свідчать про пряму пригнічуючу дію даларгіну на секрецію жовчі гепатоцитами, яка є складовою частиною його впливу на жовчосекреторну функцію печінки.

ВИСНОВКИ

1. Опіоїдні пептиди здійснюють переважно гальмівний вплив на жовчосекреторну функцію, який реалізується через дельта- та мю-опіоїдні рецептори плазматичних мембран клітин печінки. Регуляція жовчоутворення опіоїдними пептидами здійснюється, зокрема, за рахунок дії на процеси утворення і транспорту органічних компонентів жовчі.

2. Блокада мю- і дельта-опіоїдних рецепторів стадолом усуває ефекти лей- і мет-енкефалінів та їх синтетичних аналогів на секрецію жовчі.

3. Внутрішньопортальна інфузія мет-енкефаліну і даларгіну на фоні блокади опіоїдних рецепторів стимулює секрецію таурокон'югатів та пригнічує секрецію вільних жовчних кислот, що є наслідком активації процесів кон'югації вільних жовчних кислот.

4. В реалізації ефектів енкефалінів на секреторну функцію печінки важлива роль належить іонам кальцію, що підтверджується отриманими даними про відсутність специфічного впливу енкефалінів на секрецію жовчі і жовчних кислот за умов блокади кальцієвих каналів верапамілом.

5. Блокада a-адренорецепторів фентоламіном не усуває пригнічюючого впливу даларгіну на швидкість секреції жовчі.

6. Пригнічення даларгіном секреції жовчі і жовчних кислот ізольованою печінкою щурів, тобто за відсутності нейро-гуморальних впливів на жовчосекреторну функцію, свідчить про безпосередню дію даларгіну на гепатоцити.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Масюк Т.В., Решетнік Є.М. Можливі механізми дії енкефалінів на секреторну функцію печінки // Вісник Київського університету. Проблеми регуляції фізіологічних функцій. – 1999. – Випуск 4. – С.74-78.

2. Решетнік Є.М., Долгова О.М., Весельський С.П., Каплуненко М.О. Секреція жовчі та її основних органічних компонентів під дією стадолу і даларгіну. // Збірник наукових праць співробітників КМАПО ім. П.Л. Шупика. – 2000. – Випуск 9. – С.484-487.

3. Решетнік Є.М., Долгова О.М., Весельський С.П. Вплив стадолу та даларгіну на жовчосекреторну функцію печінки. // Вісник Київського університету. Проблеми регуляції фізіологічних функцій. – 2000. – Випуск 6. – С.28-31.

4. Долгова О.М., Решетнік Є.М., Весельський С.П. Вплив природного опіоїдного пептиду лей-енкефаліну та його синтетичного аналогу даларгіну на жовчосекреторну функцію печінки в умовах блокади опіоїдних рецепторів. // Міжвідомчий збірник Гастроентерологія. – 2000. – Випуск 30. – С.139-145.

5. Тукаєв С.В., Решетнік Є.М., Весельський С.П., Каплуненко М.О. Екскреторна функція печінки при дії фізіологічно активних сполук, які реалізують свій вплив через систему кальцію. // Вісник Київського університету. Проблеми регуляції фізіологічних функцій. – 2001. – Випуск 7. – С.19-21.

6. Решетник Е.Н., Масюк Т.В., Долгова Е.Н. Участие опиоидных рецепторов в регуляции секреторной функции энкефалинами. // Всероссийская научная конференция с международным участием, посвященная 150-летию со дня рождения академика Ивана Петровича Павлова. Материалы конференции – 1999. – Санкт-Петербург. – С.269.

7. Долгова Е.Н., Решетник Е.Н., Весельский С.П., Лященко П.С., Каплуненко Н.А. Влияние опиоидных пептидов на секрецию желчи и спектр желчных кислот в условиях блокады опиоидных рецепторов. // Гастробюлетень. – 2000. – N 1-2. – С.31. (Материалы 2-й объедененной всероссийской и всеармейской научной конференции “Санкт-Петербург – Гастро-2000”).

8. Решетнік Є.М., Долгова О.М., Масюк Т.В., Рибальченко В.К. Можливі шляхи реалізації впливу природних енкефалінів та їх синтетичних аналогів на жовчосекреторну функцію печінки. // Тези доповідей Всеукраїнської наукової конференції “Актуальні проблеми гастроентерології”. – 2001. –Київ. – С.41.

АНОТАЦІЯ

Решетнік Є.М. Регуляторний вплив енкефалінів та їх синтетичних аналогів на жовчосекреторну функцію. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за фахом 03.00.13 – фізіологія людини і тварин, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2002.

Дисертаційна робота присвячена вивченню ефектів енкефалінів та їх синтетичних аналогів на секреторну функцію печінки. Дослідженнями у гострих спробах на щурах та на ізольованій печінці цих тварин із застосуванням методу тонкошарової хроматографії встановлені регуляторні ефекти енкефалінів та їх синтетичних аналогів на інтенсивність секреції жовчі та її компонентів. Показано, що специфічні, переважно гіпохолеретичні ефекти, лей- і мет-енкефалінів та аналогу лей-енкефаліну даларгіну усуваються за умов блокади опіоїдних рецеторів стадолом. Зміни інтенсивності секреції жовчних кислот і ліпідів при сумісному послідовному введенні блокатора опіоїдних рецепторів стадолу і енкефалінів не співпадають за величиною та напрямком з ефектами самого блокатора. Це свідчить, що регуляторні ефекти енкефалінів та їх синтетичних аналогів на інтенсивність секреції жовчі та її компонентів опосередковані як нервовими і гуморальними механізмами, так і мембранними рецепторами за участю ліпідного матриксу плазматичної мембрани. Аналіз динаміки секреції жовчі та її органічних компонентів при дії енкефалінів та їх синтетичних аналогів за умов блокади опіоїдних рецепторів, адренорецепторів та кальцієвих каналів у гострих спробах та у дослідах на ізольованій перфузованій печінці щурів свідчать про безпосередній вплив досліджених регуляторних пептидів на гепатоцити.

Ключові слова: енкефаліни, даларгін, стадол, секреція жовчі, жовчні кислоти, ліпіди.

АННОТАЦИЯ

Решетник Е.Н. Регуляторное влияние энкефалинов и их синтетических аналогов на желчесекреторную функцию. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13. – физиология человека и животных. – Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2002.

Диссертационная работа посвящена изучению эффектов энкефалинов и их синтетических аналогов на секреторную функцию печени. Исследованиями в острых опытах на крысах и на изолированной печени крыс с использованием метода тонкослойной хроматографии установлены регуляторные эффекты энкефалинов и их синтетических аналогов (синтетический аналог лей-энкефалина гексапептид даларгин, синтетический опиоидный пептид Љ-77 (N-трифторацетил-лізил-гліцил-n-нітро-фенілаланіл-амід ацетатдигідрат)) на секрецию желчи и ее компонентов. Показано, что специфические, преимущественно гипохолеретические, эффекты лей- и мет-энкефалинов и даларгина устраняются в условиях блокады опиоидных рецепторов. Изменения интенсивности секреции желчных кислот и липидов при совместном введении блокатора опиоидных рецепторов стадола и энкефалинов не совпадают по величине и направлению с таковыми при инфузии самого стадола, что указывает на существенную роль безрецепторных механизмов действия этих регуляторных соединений на желчесекреторную функцию. Это указывает на то, что регуляторные эффекты энкефалинов и их синтетических аналогов на скорость секреции желчи и ее органических компонентов опосредованы как нервными и гуморальными механизмами, так и мембранными рецепторами с участием липидного матрикса плазматической мембраны. Предполагается, что регуляторные эффекты лей-и мет-энкефалинов реализуются преимущественно через дельта- и мю- опиоидные рецепторы, о чем свидетельствует устранение стадолом их влияния на желчесекреторную функцию. Поскольку эти рецепторы могут быть локализованы на цитоплазматической стороне плазматической мембраны, не исключено опосредование действия энкефалинов через липиды мембранного матрикса. Возможно, первичным механизмом эффектов энкефалинов на гепатоцит является взаимодействие и инкорпорация в липидный матрикс плазматической мембраны. Полученные данные о динамике секреции желчи и ее органических компонентов при действии энкефалинов и их синтетических аналогов в условиях блокады опиоидных рецепторов и адренорецепторов в острых опытах и в опытах на изолированной перфузированной печени крысы подтверждают предположение о непосредственном влиянии энкефалинов и их синтетических аналогов на клетки печени, в частности, на процессы биотрансформации, синтеза и транспорта основных органических компонентов желчи – желчных кислот и липидов.

Ключевые слова: энкефалины, даларгин, стадол, секреция желчи, желчные кислоты, липиды.

SUMMARY

Reshetnik E.M. Regulatory effects of enkephalines and its synthetic analogues on bile secretory function. – Manuscript.

The dissertation for scientific degree of candidate of the biological science in speciality 03.00.13. – Physiology of Human and Animal. – Taras Shevchenko Kyiv National University, Kyiv, 2002.

The results of liver secretory function at the enkephalines and its synthetic analogues action are presented in the manuscript and 8 publications. In dissertation it was used different models of experiments and different endogenous and synthetic opioid peptides to study the problem of enkephalines regulation of the liver secretory function. It seems that the hypocholeretic effects of leu- and met-enkephalines are opioid receptor mediated. The character of bile