МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ім. О.О.Богомольця

Грекова Світлана Петрівна

УДК: 616-006-002.4:616.621.31+618.2/3

Вплив прогестеронУ та 17-естрадіолу на

функціональну активність фактора НЕКРОЗУ пухлин

03.00.09. – імунологія (біологічні науки)

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті педіатрії, акушерства та гінекології АМН України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

Чернишов Віктор Павлович

Інститут педіатрії, акушерства та гінекології АМН України,

завідувач лабораторії імунології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

Алексєєва Ірина Миколаївна

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

завідувач відділом імунології та цитотоксичних сироваток

доктор біологічних наук,

Сидоренко Світлана Павлівна,

Інститут експериментальної патології, онкології та

радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України

завідувач лабораторії сигнальних каскадів клітин

Провідна установа: Інститут фтизіатрії і пульмонології ім. Ф.Г. Яновського АМН

України, м. Київ

Захист відбудеться “19” лютого 2004 року о 15-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.003.02 Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця МОЗ України (01023, м. Київ, вул. Шовковична, 39/1, Центральна міська лікарня, корпус 2).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця (м. Київ, вул. Зоологічна, 1)

Автореферат розісланий “15” грудня 2003 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук, професор С.Г. Свирид

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ.

Актуальність теми. Однією з найбільш актуальних проблем репродукції є вивчення складної взаємодії багатьох факторів імунної та нейроендокринної систем у перебігу генеративних процесів.

В останні роки проводиться все більше досліджень, присвячених участі ефекторних механізмів імунної системи (як клітин, так і розчинних факторів) у процесах репродукції (розвитку домінантного фолікула, дозріванні яйцеклітини, циклічних змінах ендометрія, імплантації, децидуалізації, розвитку ембріона та фізіологічному перебігу вагітності) [Cannon J.G. 1998., Hunt J.S. et.al. 1998, Kutteh W.H. 1999, Terranova P.F., Montgomery Rice V. 1997]. В результаті вивчення цих складних процесів стало очевидним, що для їх розвитку необхідна тісна нейроендокриноімунна взаємодія [Абрамов В.В. и соавт. 1996, Бабичев В.Н. 1995.].

Однією зі зв’язуючих ланок під час даної взаємодії з боку імунної системи можуть бути цитокіни – група білків, що секретуються та впливають на ріст і розвиток клітин. Ці розчинні фактори, основними продуцентами яких є Т-лімфоцити та макрофаги, відіграють роль міжклітинних медіаторів при імунній відповіді та інших фізіологічних і патологічних процесах в організмі. Майже для всіх цитокінів характерна так звана плейотропна дія, оскільки вони поліфункціональні молекули, які діють більше, ніж на одну клітину-мішень, і стимулюють у різних мішенях процеси росту, диференціювання, експресії певних поверхневих антигенів тощо [Возианов А.Ф. и соавт. 1998, Несмеянова В.А. 1997]. Тому саме завдяки впливу цих розчинних факторів можлива взаємодія клітин імунної системи та інших тканин і органів (зокрема ендокринної системи).

Фактор некрозу пухлин (ФНП) є одним із цитокінів, який має плейотропну активність і здатний впливати не тільки на клітини імунної системи, а й регулювати ріст, диференціювання та метаболізм різних типів клітин (в тому числі і клітин новоутворень). Умовно біологічну активність ФНП можна окреслити трьома основними напрямками: 1) участь у запрограмованій клітинній загибелі (ініціація та стимуляція апоптозу); 2) вплив на ріст та диференціювання різних типів клітин; 3) регуляція ремоделінгу позаклітинного матрикса та експресії молекул адгезії та інтегринів. Встановлено, що ФНП здатний безпосередньо впливати на процеси репродукції [Aggarwal B. et.al. 1996, Fiers W. 1991, Rink L. et.al. 1996].

У дослідах in vitro з’ясовано, що жіночі статеві стероїдні гормони здатні модулювати синтез прозапальних цитокінів (зокрема ФНП) імунокомпетентними клітинами. Доведено, що прогестерон та естроген у фізіологічних концентраціях пригнічували продукцію ФНП клітинами моноцитарного походження [Chao T., 1995, Wilder R.L. et.al. 1999]. Однак не менш важливою складовою дії жіночих статевих гормонів є їх здатність безпосередньо впливати на ефекти цитокінів.

Оскільки ФНП активно бере участь у процесах репродукції, дослідження здатності прогестерона та естрогена, як одних із основних регуляторів цих процесів, модулювати його функціональну активність є актуальним для розуміння механізмів взаємодії розчинних факторів імунної та ендокринної систем.

Згідно з цим була сформульована мета і завдання дослідження.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводилися за тематикою науково-дослідної роботи Інституту педіатрії, акушерства та гінекології АМН України і пов’язані з комплексною темою “Патогенез та терапія передчасного переривання вагітності при пізньому гестозі” (Державний реєстраційний номер 0199U000310). Дисертант в комплексній темі виконував окремі фрагменти.

Мета дослідження. Метою дослідження було вивчити ефекти фактора некрозу пухлин під впливом жіночих статевих стероїдних гормонів (прогестерону та 17-естрадіолу).

Задачі дослідження:

1. Дослідити вплив ФНП на проліферативну активність лімфоцитів периферичної крові людини під дією прогестерону, 17-естрадіолу та їх комбінації. Для порівняння дослідити вплив інших прозапальних цитокінів (ІЛ-1, ІЛ-1) на проліферативну активність лімфоцитів периферичної крові людини під дією вищезазначених гормонів.

2. Встановити можливі механізми впливу жіночих статевих стероїдних гормонів на ефекти ФНП відносно лімфоцитів периферичної крові.

3. Оцінити ефект прогестерону, 17-естрадіолу та їх комбінації на цитотоксичну активність ФНП проти клітинної лінії L929.

4. Оцінити вплив жіночих статевих стероїдних гормонів на ФНП-стимульовану експресію молекул адгезії лейкоцитами периферичної крові.

Об’єкт та предмет досліджень. Для дослідження ефектів ФНП під впливом жіночих статевих стероїдних гормонів було використано окремі популяції лейкоцитів периферичної крові здорових донорів, лінію людської Т-клітинної лейкемії Jurkat, лінію мишиної фібросаркоми L929.

Методи досліджень: імунологічні – методи культури клітин (дослідження проліферації лімфоцитів периферичної крові людини та клітин лінії Jurkat, оцінка цитотоксичної активності ФНП), імуноферментний аналіз (встановлення вмісту ФНП та його розчинних рецепторів в супернатантах культур лімфоцитів та клітинної лінії Jurkat), проточна цитометрія (оцінка експресії рецепторів ФНП на поверхні лімфоцитів периферичної крові та клітинах лінії Jurkat, молекул адгезії на поверхні лейкоцитів периферичної крові людини); статистичні - тест Колмогорова - Смирнова, параметричний t тест Стьюдента, t тест Стьюдента у парних вибірках, параметричний непарний тест (однонаправлений ANOVA з додатковим t тестом).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що комбінація прогестерону (2 мкг/мл) та 17-естрадіолу (0.2 мкг/мл) значною мірою знижувала стимулюючий вплив ФНП на проліферацію лімфоцитів, хоча окремо прогестерон блокував його повністю, а 17-естрадіол не мав вираженої дії. До того ж під впливом прогестерону ФНП навіть пригнічував анти-CD3-опосередковану проліферацію лімфоцитів. Доведено, що ефект комбінації прогестерону та 17-естрадіолу був специфічним відносно даного цитокіну, оскільки він не проявлявся щодо інших прозапальних цитокінів (ІЛ-1, ІЛ-1).

З’ясовано, що під впливом комбінації прогестерону та 17-естрадіолу спостерігалось значне зниження експресії рецепторів ФНП I та II типу на поверхні анти-CD3-активованих Т-лімфоцитів (як CD4+, так і CD8+) периферичної крові, та відповідне підвищення розчинних форм рецепторів в супернатантах культур лімфоцитів. Це свідчить про можливий механізм блокади дії цього цитокіна стосовно активованих лімфоцитів з боку комбінації жіночих статевих гормонів. Вперше експериментально визначено, що на неактивованих Т-лімфоцитах (як CD4+, так і CD8+) комбінація прогестерону та 17-естрадіолу сприяє синтезу рецептора ФНП II типу de novo, оскільки спостерігалось підсилення його експресії на поверхні клітин та збільшення розчинної форми в супернатанті.

На підставі експериментальних даних доведено, що прогестерон і 17-естрадіол мали протективний ефект відносно клітинної лінії L929 при цитотоксичному впливі ФНП. Цей ефект не залежав від часу інкубації (протягом однієї або трьох діб), але збільшувався при підвищенні дози жіночих статевих стероїдних гормонів. Незалежно від часу інкубації прогестерон мав більш сильний протективний ефект порівняно з 17-естрадіолом. При комбінації гормонів не спостерігалося синергізму дії між ними.

Отримано нові наукові знання про вплив жіночих статевих стероїдних гормонів на експресію молекул адгезії на поверхні лейкоцитів периферичної крові. Прогестерон та 17-естрадіол інгібували нестимульовану експресію CD54 на моноцитах і гранулоцитах, крім того 17-естрадіол – експресію CD69 на моноцитах і лімфоцитах. Встановлено, що прогестерон знижував ФНП-стимульовану експресію CD54 і CD11b на гранулоцитах і CD69 на лімфоцитах, і тим самим частково блокував прозапальні ефекти цього цитокіну. Однак, дія комбінації прогестерону і ФНП була синергічною щодо зниження експресії CD62L.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Дослідження впливу окремих жіночих статевих стероїдних гормонів та їх комбінації (який у більшості проведених експериментів пригнічував ефекти ФНП) ймовірно може бути основою для подальшого вивчення супресивних властивостей гормонів щодо дії цитокіну на клітини та має теоретичне значення для встановлення детальніших особливостей регуляції дії гормонів і прозапальних цитокінів.

Отримано результати, що свідчать про супресивну роль комбінації прогестерону та 17-естрадіолу на вплив ФНП щодо проліферації лімфоцитів. Ці дані мають фундаментальне значення для розуміння загальних механізмів імуносупресії з боку жіночих статевих стероїдних гормонів під час вагітності.

Встановлення ефекту шедінгу рецепторів ФНП обох типів з поверхні лімфоцитів під дією прогестерону, 17-естрадіолу та їх комбінації може мати як суто теоретичне значення для визначення механізмів взаємодії гормонів і цитокінів, так і практичне значення для оцінки впливу зазначених гормонів на імунокомпетентні клітини.

Дані, що свідчать про протективний ефект прогестерону та 17-естрадіолу на клітини лінії L929, можуть бути використані в подальших дослідженнях резистентності деяких видів пухлин, що продукують гормони, до цитотоксичного впливу ФНП.

Встановлення впливу жіночих статевих стероїдних гормонів на експресію певних молекул адгезії на поверхні клітин периферичної крові дає можливість оцінити модулюючу дію гормонів на розвиток локальних запальних процесів і процесів перебудови тканин.

Особистий внесок здобувача. Автором здійснено науковий пошук та обгрунтування напрямку досліджень. Обрано моделі для дослідження ефектів ФНП і оцінки впливу прогестерону та 17-естрадіолу. Весь обсяг експериментальних досліджень, статистичну обробку одержаних результатів та їх аналіз, формулювання основних положень роботи та оформлення дисертаційної роботи було здійснено самостійно.

Апробація результатів дисертації. Основні положення і результати дисертації було повідомлено та обговорено на: III Українській конференції молодих вчених (Київ, січень 2002), засіданні Одеського дискусійного клуба з питань фармакотерапії гаметогенезу (Одеса, січень 2002), 8-му Міжнародному конгресі Альпійсько-Адріатичного товариства репродуктивної імунології (Веймар, Німеччина, вересень 2002), конференції молодих вчених Інститута педіатрії, акушерства та гінекології АМН України (Киів, червень 2003), школі-семінарі “Актуальні питання проточної цитометрії” (Київ, жовтень 2003).

Публікації. Основні положення дисертації викладено в 7 наукових публікаціях (у зарубіжних та у вітчизняних виданнях, затверджених ВАК України), які повністю відображають матеріали дисертаційної роботи (5 статей, 2 тези конференцій).

Обсяг і структура дисертації. Дисертація побудована за загальноприйнятим планом і складається зі вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали та методи дослідження”, трьох розділів власних досліджень, обговорення результатів досліджень, висновків, списку використаної літератури, який містить 215 джерел (23 кирилицею та 192 латиницею). Дисертація викладена на 128 сторінках комп’ютерного друку (із них основного тексту – 108 сторінок). Ілюстрована 5 таблицями, 30 рисунками.

ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Досліджено основні ефекти ФНП під впливом жіночих статевих стероїдних гормонів. Для вивчення експресії рецепторів ФНП обох типів, впливу ФНП на проліферативну активність лімфоцитів, стимуляції поверхневої експресії молекул адгезії було використано лейкоцити периферичної крові здорових донорів та лінію людської Т-клітинної лейкемії Jurkat. Для визначення цитотоксичної активності ФНП було використано лінію мишиної фібросаркоми L929 (класичний біотест для визначення активності ФНП). Лінію мишиної фібросаркоми L929 і лінію людської Т-клітинної лейкемії Jurkat отримали із клітинної колекції Інституту цитології РАН (Санкт-Петербург, Росія). Зразки гепаринізованої периферичної крові отримали від 12 постійних здорових донорів з Київської міської станції переливання крові. Щоб усунути вплив ендогенних жіночих стероїдних гормонів, використовували зразки крові від донорів-чоловіків. В усіх експериментах, якщо це не оговорено окремо, використовували прогестерон у концентрації 2 мкг/мл і 17-естрадіол у концентрації 0.2 мкг/мл. При комбінації гормонів використовували одночасне додавання 2 мкг/мл прогестерону і 0.2 мкг/мл 17-естрадіолу.

Проліферативну активність лімфоцитів периферичної крові людини визначали в суспензії виділених мононуклеарних клітин периферичної крові, які активували анти-CD3 антитілами, в присутності розчинів цитокінів (ФНП, ІЛ-1, ІЛ-1), прогестерону, 17-естрадіолу чи їх комбінації, за включенням 3Н-метил-тимідину.

Поверхневу експресію молекул адгезії лейкоцитами периферичної крові визначали в зразках крові методом 3-кольорової проточної цитометрії на приладі FACScan, використовуючи FACScan Research software, за допомогою мкАт (“Becton Dickinson”, США). Для відмежування лімфоцитів від гранулоцитів, моноцитів, дебриса, нелізованих еритроцитів зразки інкубували з анти-CD45-PerCP і анти-CD-14-FITC мкАт. Як контроль зв’язування антитіл використовували IgG1-FITC+IgG2-PE. Для специфічного фарбування використовували антитіла - CD54-PE, CD11b-PE, CD62L-PE, CD69-PE. Аналіз результатів проводили в програмі Lysis з вирахуванням середньої інтенсивності флуоресценції (СІФ) клітин за логарифмічною шкалою каналів флуоресценції (СКФ – середній канал флуоресценції). При обробці результатів СІФ переводили до показника лінійної інтенсивності флуоресценції (ЛІФ) за допомогою формули ЛІФ=2(СІФ/17).

Цитотоксичний ефект ФНП на клітини L929 оцінювали за втратою адгезивних властивостей клітинами лінії L929 (Aggarwal В.В. 1985) у тесті з кристалічним фіолетовим з деякими модифікаціями методики. За допомогою комп’ютерної програми для аналіза даних Titersoft II (“Flow laboratories Ltd.”, Rickmansworth, UK) розраховували значення половини максимальної інгібуючої концентрації ФНП.

Експресію рецепторів ФНП лімфоцитами периферичної крові та клітинами лінії Jurkat оцінювали за допомогою мкАт проти рецепторів ФНП I та II типів (ФНПР1 та ФНПР2) на проточному цитометрі FACScan з використанням програм Research software та Lysis (“Becton Dickinson”, USA). Як контроль зв’язування використовували контрольні мкАт аналогічні за ізотипом IgG до мкАт проти ФНПР1 та ФНПР2. При обробці результатів середню інтенсивність флуоресценції (СІФ) переводили до показника лінійної інтенсивності флуоресценції (ЛІФ) за допомогою формули ЛІФ=2(СІФ/17).

Визначення ФНП та його розчинних рецепторів в супернатантах культур лімфоцитів периферичної крові та клітин лінії Jurkat проводили за допомогою імуноферментного аналізу з використанням мкАт з коопераційними властивостями проти ФНП (Водяник М.О. 2001) та моноклональних антитіл проти ФНПР1 та ФНПР2. Концентрації ФНП та його рецепторів розраховували за калібрувальною кривою стандартів за допомогою комп’ютерної програми для аналізу даних Titersoft II (“Flow Laboratories Ltd.”, Rickmansworth, UK).

Статистична обробка результатів. Для статистичного аналізу результатів використовували наступні методи: 1) тест Колмогорова - Смирнова для перевірки нормального розподілу даних; 2) параметричний t тест Стьюдента для виявлення достовірних відмінностей (при р<0.05) між середніми значеннями у вибірках з нормальним розподілом даних; 3) t тест Стьюдента для виявлення достовірних відмінностей (при р<0.05) у парних вибірках; 4) параметричний непарний тест (однонаправлений ANOVA з додатковим t тестом) для виявлення статистично достовірних відмінностей між середніми значеннями більше ніж трьох вибірок з нормальним розподілом даних.

Результати досліджень, їх аналіз та узагальнення

Одним із завдань даної роботи було встановити дію прогестерону та 17-естрадіолу на ефект проза-пальних цитокінів щодо проліферації лімфоцитів периферичної крові.

В експериментах при додаванні різних доз прозапальних цитокінів максимальний ефект костимуляції проліферації анти-CD3-активованих лімфоцитів, які були виділені з периферичної крові, для ФНП становив 28 %, для ІЛ-1 і – 63% і 34% відповідно (рис. 1).

Для ІЛ-1 значення костимуляції проліферації при додаванні цитокіна не були статистично достовірними завдяки великому стандартному відхиленню в межах цього конкретного експерименту. В подальшому для зручності викладання матеріалу значення показників проліферації лімфоцитів під впливом як самих цитокінів, так і комбінації зі стероїдними гормонами будуть представлені у вигляді відсотків костимуляції.

Встановлено, що прогестерон (2 мкг/мл) пригнічував стимулюючий вплив ФНП на проліферацію лімфоцитів. Активність цитокіну нейтралізувалася повністю і спостерігався зворотний ефект, коли даний прозапальний фактор навіть пригнічував анти-CD3-індуковану проліферацію лімфоцитів (рис. 2). Однак достовірні відмінності при дії прогестерона порівняно з контролем було встановлено тільки за низьких доз ФНП (0.1 та 0.5 нг/мл) – 25% та 16%, відповідно. Гормон 17-естрадіол (0.2 мкг/мл) не мав вираженого ефекта на костимуляцію проліферації лімфоцитів фактором некрозу пухлин.

У разі комбінованого впливу прогестерону та 17-естрадіолу на стимулюючий ефект ФНП спостерігався домінуючий ефект прогестеро-ну (особливо при низьких дозах цитокіну). У дозі 0.1 нг/мл ФНП пригнічуюючий вплив комбінації жіночих статевих стероїдних гормонів становив 21 %, а в дозі 0.5 нг/мл ФНП – 30 %.

Для порівняння впливу жіночих статевих стероїдних гормонів на активність прозапальних цитокінів поряд з ФНП в експериментах були використані ІЛ-1 та ІЛ-1. Завдяки великому стандартному відхиленню в межах експерименту при вивченні костимулюючої проліферативної активності ІЛ-1 не встановлено статистично достовірних впливів з боку жіночих статевих стероїдних гормонів. Прогестерон посилював костимулюючу дію ІЛ-1 при дозі цитокіну 2.5 нг/мл (на 42%) (рис. 3). Гормон 17-естрадіол також посилював костимулюючу проліферативну активність ІЛ-1 при дозі 2.5 нг/мл на 33%. При впливі комбінації жіночих статевих стероїдних гормонів та ІЛ-1 спостерігався синергізм їх дії (78%).

Щоб зрозуміти механізми впливу жіночих стероїдних статевих гормонів на ефекти ФНП, було досліджено рівень експресії рецепторів ФНП обох типів на лімфоцитах периферичної крові під впливом гормонів. Прогестерон та 17-естрадіол не мали значного впливу на експресію ФНПР1 на неактивованих лімфоцитах (як CD4+, так і CD8+). Комбінація гормонів значно знижувала експресію ФНПР1 на поверхні неактивованих CD8+ лімфоцитів периферичної крові (експресія знижувалася до 0), але не мала статистично значимого впливу на його експресію на поверхні неактивованих CD4+ лімфоцитів. У разі використання анти-CD3 антитіл для активації лімфоцитів відбувалася втрата поверхневих рецепторів ФНПР1 за рахунок їх шедінгу (з англ. shedding – зкидання), тому не було можливості визначити вплив жіночих статевих стероїдних гормонів на його експресію.

Прогестерон та комбінація жіночих статевих стероїдних гормонів посилювали рівень експресії ФНПР2 на неактивованих лімфоцитах (CD4+ і CD8+), а 17-естрадіол посилював її лише на поверхні неактивованих CD8+ лімфоцитів. Окремо гормони мали незначний модулюючий вплив на експресію ФНПР2 на лімфоцитах, які були активовані анти-CD3 антитілами. Однак комбінація гормонів значно знижувала експресію ФНПР2 на активованих лімфоцитах (CD4+ і CD8+) (рис. 4, 5).

Для вивчення механізму зниження експресії рецепторів ФНП на поверхні лімфоцитів периферичної крові було досліджено вміст його розчинних рецепторів у супернатантах культур лімфоцитів, які було використано в експерименті. Встановлено, що під впливом комбінації жіночих статевих стероїдних гормонів спостерігається значне підвищення вмісту розчинних рецепторів ФНП I та II типів у супернатантах культур як активованих, так і неактивованих лімфоцитів периферичної крові. Окремо прогестерон та 17-естрадіол підвищували вміст розчинних рецепторів I та II типу в супернатантах анти-CD3-активованих лімфоцитів. Вміст розчинного ФНПР1 у супернатантах культур неактивованих лімфоцитів периферичної крові під дією комбінації жіночих статевих стероїдних гормонів становив у середньому 278 пг/мл порівняно зі 176 пг/мл у зразках без гормонів; вміст ФНПР2 становив 480 і 127 пг/мл відповідно (рис. 6, 7). Більшою мірою ефект шедінгу рецепторів ФНП з поверхні клітин проявився при анти-CD3-активації. Вміст розчинного ФНПР1 у супернатантах культур лімфоцитів при впливі комбінації гормонів становив у середньому 594 пг/мл порівняно з 438 пг/мл у зразках без гормонів (рис.6). Вміст ФНПР2 становив 2.567 і 1.907 нг/мл відповідно (рис. 7). При цьому і прогестерон, і 17-естрадіол самі по собі статистично достовірно сприяли шедінгу обох типів рецепторів з поверхні лімфоцитів. Очевидно, що при комбінації гормонів спостерігався синергізм їх дії щодо поверхневих рецепторів ФНП.

Ефект зниження експресії рецепторів ФНП на поверхні Т лімфоцитів можливий завдяки двом механізмам: під дією комбінації гормонів блокується експресія рецепторів ФНП на поверхні лімфоцитів (тобто їх синтез de novo) або спостерігається шедінг рецепторів з поверхні клітин. При дії на неактивовані Т лімфоцити жіночі статеві стероїдні гормони сприяють синтезу ФНПР2 de novo та його шедінгу. Стосовно експресії першого типа рецептора ФНП на поверхні неактивованих та активованих лімфоцитів (як CD4+, так і CD8+) можна відмітити яскраво виражений шедінг під впливом комбінації жіночих статевих стероїдних гормонів.

Можна передбачити, що жіночі статеві стероїдні гормони викликають підсилення експресії ФНПР2 на неактивованих лімфоцитах периферичної крові, і в такий спосіб певним чином стимулюють ці клітини для подальшої відповіді на ФНП. Проте водночас гормони пригнічують експресію ФНПР1 на поверхні неактивованих лімфоцитів, проявляючи своєрідний захисний ефект проти можливих проявів активності ФНП, пов’заних з патологічними процесами. При активації лімфоцитів комбінація жіночих статевих стероїдних гормонів сприяє шедінгу обох типів рецепторів ФНП, захищаючи тим самим даний тип клітин від надмірної активації та розвитку подальшого каскаду запальної реакції внаслідок дії ФНП.

В експериментах з використанням клітинної лінії Jurkat отримано аналогічні дані щодо впливу жіночих статевих стероїдних гормонів на експресію поверхневих рецепторів ФНП та вмісту розчинних рецепторів в супернатантах культур клітин.

Таким чином, прогестерон та 17-естрадіол можуть модулювати ефекти ФНП на лімфоцити периферичної крові через дію на експресію його рецепторів на поверхні клітин.

Наступним завданням нашої роботи було виявити вплив прогестерону та 17-естрадіолу на цитотоксичну активність ФНП. Для дослідження ефекту жіночих стероїдних статевих гормонів на життєздатність клітинної лінії L929 протягом короткого відрізка часу (24 год) було проведено експеримент з використанням інгібітора трансляції циклогексиміду (25 мкг/мл).

Прогестерон і 17-естрадіол знижували кількість життєздатних клітин лінії L929 на 25% і 6% відповідно порівняно зі зразком без гормонів. Передінкубація протягом 24 год з прогестероном і 17-естрадіолом мала захисний ефект на життєздатність клітин лінії L929 під впливом ФНП. Додавання 20 мкг/мл прогестерону призводило до підвищення кількості живих клітин в діапазоні доз ФНП від 12.5 до 100 пг/мл (для 17-естрадіолу результати статистично недостовірні) (Табл. 1).

Таблиця 1. Цитотоксична дія ФНП на клітини лінії L929 під впливом прогестерону (20 мкг/мл) та 17-естрадіолу (2 мкг/мл) за наявності циклогексиміду (оптична густина зразків).

Дози ФНП

0 пг/мл | 3 пг/мл | 12,5 пг/мл | 25 пг/мл | 50 пг/мл | 100 пг/мл | 25 нг/мл

К | 0.9450.084 | 0.7340.055 | 0.3490.022 | 0.2520.014 | 0.1730.012 | 0.1440.010 | 0.1390.011

Р | 0.7110.066*** | 0.6670.074 | 0.5180.077*** | 0.4400.083*** | 0.3180.071* | 0.2530.062 | 0.1490.019

Е | 0.8900.105$$$ | 0.8200.117$ | 0.4340.071 | 0.3380.040 | 0.2390.041 | 0.1950.029 | 0.1410.017

Примітка. Дані отримані в 4 незалежних експериментах з 3 повторами в межах кожного. К – контроль без гормонів, Р - прогестерон, Е – 17-естрадіол. Для оцінки статистичної достовірності був використаний параметричний непарний тест (односпрямований ANOVA з додатковим t тестом). * - р<0.05, *** - р<0.001 порівняно з контролем; $ - p<0.05, $$$ - p<0.001 порівняно з впливом прогестерона.

У межах кожного ряду (контроль, прогестерон, 17-естрадіол) всі дані за наявності різних доз ФНП достовірно (р<0.001) відрізнялися від таких при 0 пг/мл. Прогестерон мав сильніший протективний ефект порівняно з 17-естрадіолом. Половина максимальної інгібуючої концентрації для самого лише ФНП становила 6.2 пг/мл, для ФНП за наявності 20 мкг/мл прогестерону - 23.5 пг/мл (р<0.05), для ФНП за наявності 2 мкг/мл 17-естрадіолу - 8.2 пг/мл.

Для того, щоб оцінити довготривалий вплив жіночих статевих стероїдних гормонів на цитотоксичну активність ФНП, було проведено експеримент протягом 72 год без наявності в культуральному середовищі циклогексиміду. Гормони та ФНП додавали до культурального середовища одночасно. Жіночі стероїдні статеві гормони самі по собі та в комбінації не мали вираженого впливу на кількість клітин лінії L929 після 72 год інкубації. Прогестерон, 17-естрадіол та їх комбінації у високих і низьких концентраціях мали протективний ефект на життєздатність клітин під впливом цитотоксичної активності ФНП (статистично достовірно в діапазоні ФНП 50-100 пг/мл) (Tабл. 2).

Таблиця 2. Цитотоксична дія ФНП на клітини лінії L929 під впливом прогестерону, 17-естрадіолу та їх комбінації (оптична густина зразків та половина максимальної інгібуючої концентрації (IC50)).

Гормони | Дози ФНП |

IC50,

пг/мл

0 пг/мл | 50 пг/мл | 100 пг/мл | 200 пг/мл | 25 нг/мл

Контроль | 1,4960,139 | 0,8260,145 | 0,5200,087 | 0,4510,077 | 0,1140,009 | 51,6

Прогестерон,

2 мкг/мл | 1,2800,173 | 0,9030,114 | 0,8330,053** | 0,7360,071* | 0,1260,010 | 267,0*

Прогестерон,

20 нг/мл | 1,3110,257 | 1,1640,088** | 0,8730,053*** | 0,6120,032 | 0,1160,008 | 143,4*

17-естрадіол,

0.2 мкг/мл | 1,4080,217 | 1,1750,151** | 0,8510,062*** | 0,6130,029 | 0,1120,011 | 122,9*

17-естрадіол,

2 нг/мл | 1,4680,171 | 1,2030,075*** | 0,8630,115*** | 0,5990,036 | 0,1110,007 | 116,6*

Прогестерон,

2 мкг/мл і 17-естрадіол,

0.2 мкг/мл | 1,3240,146 | 1,1510,197* | 0,9210,141*** | 0,7140,053 | 0,1270,012 | 190,3*

Прогестерон, 20 нг/мл і 17-естрадіол,

2 нг/мл | 1,4640,180 | 1,3520,070*** | 0,9030,117*** | 0,7000,088 | 0,1140,011 | 126,0*

Примітка. Дані отримано в 3 незалежних експериментах з 4 повторами в межах кожного. Для оцінки статистичної достовірності було використано параметричний непарний тест (однонаправлений ANOVA з додатковим t тестом). * - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 порівняно з контролем.

Вищі концентрації прогестерону, 17-естрадіолу та їх комбінації мали сильніший ефект порівняно з меншими концентраціями, особливо ця різниця відчувається у дозі ІС50 (половина максимальної інгібуючої концентрації). Хоча статистично достовірних різниць між оптичною густиною високих і низьких концентрації в межах кожного гормонів або певних комбінації не встановлено. Протективний ефект прогестерону був більш виражений порівняно з 17-естрадіолом, та при комбінації гормонів внесок прогесторону в сумарний ефект більш значимий. У межах кожного ряду (контроль, прогестерон в обох концентраціях, 17-естрадіол в обох концентраціях, їх комбінація) всі результати за наявності різних доз ФНП достовірно (р<0.05) відрізнялися від значень при 0 пг/мл.

Отримані результати свідчать, що прогестерон і 17-естрадіол мають захисний ефект при цитотоксичному впливі ФНП на клітинну лінію L929. Цей ефект проявився як при 24 годинній передінкубації, так і протягом 3-х добової інкубації з жіночими статевими стероїдними гормонами. Незалежно від часу інкубації прогестерон мав більш сильний протективний ефект порівняно з 17-естрадіолом. Пригнічення дії ФНП жіночими статевими стероїдними гормонами було дозозалежним.

Ще одним із завданнь даної роботи було оцінити вплив жіночих статевих стероїдних гормонів на ФНП-стимульовану експресію молекул клітинної адгезії лейкоцитами периферичної крові. Концентрація ФНП становила 2,5 нг/мл, прогестерону - 2 мкг/мл та 17-естрадіолу - 0,2 мкг/мл.

При вивченні експресії молекул адгезії на поверхні лейкоцитів периферичної крові під дією прогестерону та 17-естрадіолу було досліджено окремі популяції клітин (лімфоцити, моноцити та гранулоцити). Показники життєздатності клітин і пропорційний склад окремих популяції лейкоцитів залишалися незмінними під час інкубації з жіночими статевими гормонами та ФНП.

ФНП значно посилював експресію CD54 (ICAM-1) на моноцитах і гранулоцитах периферичної крові (на 198 та 312%, відповідно) (рис. 8). Водночас відсоток моноцитів і гранулоцитів, що експресують дану молекулу адгезії, залишався незмінним під впливом стероїдних гормонів та ФНП і становив приблизно 100 % (табл. 3). Тобто підсилення експресії CD54 під дією ФНП відбувалося за рахунок збільшення щільності молекули адгезії на поверхні моноцитів і гранулоцитів. Під дією ФНП підвищувався відсоток позитивних за цим маркером лімфоцитів, однак лінійна інтенсивність його флуоресценції залишалася незмінною. Прогестерон і 17-естрадіол викликали зниження експресії ICAM-1 на моноцитах і гранулоцитах при незмінному відсотку позитивних за цим маркером клітин. Комбінація стероїдних гормонів з ФНП не впливала на рівень експресії CD54 порівняно з дією лише ФНП, окрім впливу на гранулоцити, коли прогестерон викликав достовірне зниження експресії цього маркера (на 16%) порівняно з дією ФНП (рис. 8). Оскільки відсоток CD54-позитивних клітин залишався незмінним, то зниження експресії відбувалося внаслідок зменшення щільності молекули адгезії на поверхні гранулоцитів. Таким чином, прогестерон пригнічував здатність ФНП підвищувати експресію CD54.

Під впливом ФНП також підсилювався рівень експресії іншої молекули адгезії, CD11b, на лейкоцитах периферичної крові (для лімфоцитів, моноцитів, гранулоцитів на 14%, 37%, 143%, відповідно) (рис. 9), при незмінному відсотку позитивних за цим маркером лейкоцитів (табл. 3).

Таблиця 3. Кількість антиген-позитивних лейкоцитів периферичної крові (%) під впливом ФНП (2,5 нг/мл), прогестерону (2 мкг/мл), 17-естрадіолу (0,2 мкг/мл).

Молекули

адгезії | Контроль | ФНП | Прогестерон | ФНП і прогестерон | 17-естрадіол | ФНП і 17-естрадіол

CD54

Лімфоцити | 56,314,8 | 64,217,0* | 59,818,0 | 62,814,0* | 50,62,8 | 57,252,5

Моноцити | 98,13,8 | 96,86,4 | 100 | 100 | 97,73,3 | 100

Гранулоцити | 92,07,5 | 97,43,1 | 95,93,1 | 98,02,4 | 93,22,7 | 96,11,0

CD11b

Лімфоцити | 27,86,8 | 25,86,9 | 27,27,2 | 25,54,0 | 23,63,3 | 23,52,1

Моноцити | 96,14,5 | 96,86,4 | 98,72,7 | 100 | 97,43,7 | 95,46,5

Гранулоцити | 99,001,4 | 97,92,9 | 97,82,6 | 98,42,1 | 95,60,1 | 96,81,6

CD62L

Лімфоцити | 66,312,2 | 67,411,6 | 67,710,1 | 67,012,5 | - | -

Моноцити | 19,65,7 | 9,95,3* | 15,111,9 | 13,85,5 | - | -

Гранулоцити | 77,812,9 | 57,020,9 | 83,16,7 | 54,018,9 | - | -

CD69

Лімфоцити | 4,51,4 | 7,30,5* | 2,80,3 | 7,70,6* | 3,30,1 | 9,60,7*

Моноцити | 25,52,0 | 19,214,4 | 17,26,9 | 24,319,3 | 22,46,8 | 23,517,6

Гранулоцити | 33,414,1 | 61,31,8* | 23,28,1 | 65,14,1* | 22,10,3 | 70,72,1*

Примітка. * - Р<0,05 порівняно з контролем за t-тестом Стьюдента для виявлення достовірних відмінностей між середніми значеннями в парних вибірках.

Прогестерон і 17-естрадіол не впливали на нестимульовану експресію цієї молекули адгезії. Проте прогестерон достовірно знижував експресію CD11b на гранулоцитах, які були стимульовані ФНП (рис. 9). Це, як і у випадку CD54, відбувалось внаслідок зменшення щільності молекули адгезії на поверхні гранулоцитів.

Експресія молекули адгезії CD62L не знижувалася під впливом ФНП на лімфоцитах і моноцитах, а статистично достовірна інгібіція спостерігалася лише на гранулоцитах (на 82%) (Рис. 10). Це відповідало зна---чному зниженню кількості позитивних за цим маркером моноцитів і сталій кількості позитивних лімфоцитів та гранулоцитів (табл. 3). Таким чином, під впливом ФНП зменшувалася саме щільність цього маркера на гранулоцитах. Під дією прогестерону не змінювалася нестимульована експресія CD62L на всіх типах клітин і відсоток позитивних за цією молекулою клітин (рис. 10). Під дією комбінації прогестерону і ФНП відбувалася додаткова інгібіція рівня експресії CD62L на гранулоцитах порівняно з впливом лише ФНП (табл. 3). У цьому випадку прогестерон підсилював вплив ФНП на CD62L.

Дія ФНП підсилювала експресію на гранулоцитах активаційного маркера CD69, що також виконує функції молекули адгезії, з відповідним збільшенням відсотка позитивних за цією молекулою гранулоцитів і лімфоцитів (Табл. 3).

Гормон 17-естрадіол значно пригнічував нестимульовану експресію CD69 на моноцитах та лімфоцитах, а прогестерон не мав на неї значного впливу (рис. 11). Водночас під дією жіночих стероїдних гормонів недостовірно знижувався відсоток CD69 позитивних клітин (табл. 3). Однак на лімфоцитах під дією прогестерону спостерігалось зниження на 12 % ФНП-стимульованої експресії CD69 (рис. 11).

Таким чином, ФНП проявляв прозапальні властивості, статистично достовірно підсилюючи експресію молекул адгезії CD54 на гранулоцитах і моноцитах, CD11b на всіх типах клітин, CD69 на гранулоцитах та знижуючи експресію CD62L на гранулоцитах. Прогестерон та 17-естрадіол пригнічували нестимульовану експресію CD54 на моноцитах і гранулоцитах, а 17-естрадіол інгібував нестимульовану експресію CD69 на моноцитах і лімфоцитах внаслідок зниження щільності молекул адгезії на поверхні клітин. Прогестерон знижував ФНП-стимульовану експресію CD54 та CD11b на гранулоцитах і CD69 на лімфоцитах за рахунок зменшення щільності цих молекул на поверхні клітин, і тим самим частково блокував прозапальну активність цього цитокіну. Під дією комбінації прогестерону та ФНП відбувалася додаткова інгібіція експресії CD62L на гранулоцитах порівняно з впливом лише ФНП, і в такий спосіб гормон підсилював функціональну активність ФНП. Як результат, прогестерон та 17-естрадіол, завдяки модуляції експресії молекул адгезії на поверхні клітин периферичної крові, можуть приймати участь в регулюванні локальної адгезії та активації лейкоцитів.

Таким чином, під впливом прогестерону (2 мкг/мл), 17-естрадіолу (0.2 мкг/мл) чи їх комбінації пригнічуються або цілком блокуються основні ефекти фактора некрозу пухлин (стимуляція проліферативної активності лімфоцитів периферичної крові, цитотоксична активність проти клітин лінії L929, стимуляція експресії молекул адгезії лейкоцитами крові). Ймовірно, в такий спосіб жіночі статеві стероїдні гормони здатні проявляти імуносупресивні властивості, спрямовані на нейтралізацію ефектів прозапальних цитокінів, пов’язаних з патологічними процесами в організмі.

ВИСНОВКИ

В дисертації наведено дослідження функціональної активності фактора некрозу пухлин під впливом прогестерону та 17-естрадіолу, завдяки чому встановлені певні особливості дії цього прозапального цитокіна на клітини під впливом жіночих статевих стероїдних гормонів:

1. Прогестерон повністю блокував стимулюючий вплив фактора некрозу пухлин на проліферативну активність лімфоцитів периферичної крові людини, а 17-естрадіол не мав вираженого впливу на нього. При комбінації жіночих статевих стероїдних гормонів спостерігалась значна інгібіція стимулюючого ефекту ФНП на проліферацію лімфоцитів периферичної крові. Вплив гормонів був специфічним відносно даного цитокіну, оскільки він не проявлявся щодо інших прозапальних цитокінів (ІЛ-1 і ).

2. Під впливом комбінації прогестерону та 17-естрадіолу спостерігалось значне зниження експресії рецепторів ФНП I та II типу на поверхні анти-CD3-активованих Т-лімфоцитів (як CD4+, так і CD8+) периферичної крові, та відповідне підвищення розчинних форм рецепторів в супернатантах лімфоцитів. Це свідчить про можливий механізм блокади функціональної активності цього прозапального цитокіна стосовно активованих лімфоцитів з боку комбінації жіночих статевих гормонів.

3. На неактивованих Т-лімфоцитах (як CD4+, так і CD8+) вплив комбінації прогестерону та 17-естрадіолу сприяє синтезу рецептора ФНП II типу de novo, оскільки під дією гормонів спостерігалось підсилення його експресії на поверхні клітин та збільшення розчинної форми в супернатанті.

4. Прогестерон і 17-естрадіол мають протективний ефект на клітинну лінію L929 при цитотоксичному впливі ФНП. Цей ефект не залежить від часу інкубації, але захисний вплив збільшується при підвищенні дози жіночих статевих стероїдних гормонів. Незалежно від часу інкубації прогестрон мав сильніший протективний ефект порівняно з 17-естрадіолом.

5. Прогестерон знижував ФНП-стимульовану експресію CD54 і CD11b на гранулоцитах і CD69 на лімфоцитах, що проявлялося у зменшенні щільності цих молекул на поверхні клітин, чим частково блокував прозапальну активність цитокіну. Комбінація прогестерону і ФНП була синергічною щодо інгібіції експресії CD62L на гранулоцитах, і тим самим гормон посилював дію цитокіна.

6. Вплив прогестерону (2 мкг/мл), 17-естрадіолу (0.2 мкг/мл) чи їх комбінації на ефекти фактора некрозу пухлин найчастіше має супресивний характер. Комбінація прогестерону та 17-естрадіолу пригнічує стимуляцію цитокіном проліферативної активності лімфоцитів периферичної крові та цитотоксичну активність фактора проти лінії L929. Окремо гормони знижують експресію молекул адгезії, що індукована фактором некрозу пухлин, а також його цитотоксичну дію проти клітин лінії L929.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. C. П. Грекова, М.О. Водяник, В.П. Чернишов “Вплив прогестерону та естрогену на ефект костимуляції проліферації прозапальними цитокінами”// Фізіологічний журнал. - №4. – 2002.- С. 63-67.

2. S.P. Grekova, M.A. Vodyanik, V.P. Chernyshov “ Effect of progesterone and 17-estradiol on the cytotoxicity mediated by tumor necrosis factor” // Experimental Oncology. – Vol. 3. – 2002. - Р. 228-230.

3. В.П. Чернишов, М.О. Водяник, C. П. Грекова “Експресія молекул адгезії лейкоцитами периферичної крові під впливом жіночих стероїдних гормонів”. // Фізіологічний журнал. – №6. –2002. - С.46-53.

4. Чернышов В.П., Водяник М.А., Грекова С.П. “Локализация и функциональная активность фактора некроза опухолей в органах и тканях репродуктивной системы женщины.” // Здоровье женщины.- №1. - 2003. – С.26-28.

5. Чернышов В.П., Водяник М.А., Грекова С.П. “Локализация и функциональная активность фактора некроза опухолей в органах и тканях репродуктивной системы женщины. (Часть 2)” // Здоровье женщины.- №2. - 2003. – С.52-55.

6. С.П. Грекова, М.O. Водяник. Вплив прогестерона і естрогена на костимулюючий проліфераційний ефект прозапальних цитокінів.// Тези доповідей III Української конференції молодих вчених.- 2002. - С.38-39.

7. S.P. Grekova, M.A. Vodyanik, V.P. Chernyshov „ Effect of progesterone and 17-estradiol on the proinflammatory cytokines costimulatory proliferative activity”//Am. J Reprod. Immunol. – Vol.48, N.3. – 2002. - Р. 147.

АНОТАЦІЯ

Грекова Світлана Петрівна. Вплив прогестерону та 17-естрадіолу на функціональну активність фактора некрозу пухлин. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за фахом 03.00.09 – імунологія (біологічні науки) – Національний медичний університет ім.. О.О. Богомольця, Київ, 2003.

В дисертації наведено дослідження ефектів фактора некрозу пухлин під впливом прогестерону та 17-естрадіолу, завдяки чому встановлені певні особливості дії комбінації прозапального цитокіна та жіночих статевих стероїдних гормонів на клітини. В результаті проведених експериментів встановлено, що при дії комбінації жіночих статевих стероїдних гормонів спостерігалась значна інгібіція стимулюючого впливу ФНП на проліферацію лімфоцитів периферичної крові, водночас 17-естрадіол (0.2 мкг/мл) не мав вираженого ефекту, а прогестерон (2 мкг/мл) повністю блокував стимуляцію