КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

САНАГУРСЬКИЙ Дмитро Іванович

УДК: 577.352.5:593.711:597.551.2-131

ТРАНСМЕМБРАННИЙ БІОЕЛЕКТРОГЕНЕЗ:

МОДИФІКУЮЧІ ВПЛИВИ НА НЬОГО,

СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ АНАЛІЗ І МОДЕЛІ

03.00.02 – біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Львівському національному університеті ім.

Івана Франка Міністерства освіти і науки України

Науковий консультант:

доктор біологічних наук, професор

Клевець Мирон Юрійович

Львівський національний університет ім. Івана Франка,

завідувач кафедри фізіології людини і тварин

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор

Зима Валентин Леонідович

Київський національний університет ім. Тараса Шевченка,

професор кафедри біофізики

доктор біологічних наук, професор

Стойка Ростислав Степанович

Інститут біології клітини НАН України,

завідувач відділу регуляції проліферації клітин

доктор біологічних наук

Шуба Ярослав Михайлович

Інститут фізіології імені О.О. Богомольця НАН України,

провідний науковий співробітник відділу

загальної фізіології нервової системи

Провідна установа

Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна

Міністерства освіти і науки України

Захист відбудеться " 26 " листопада 2003 року о 14.00 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного університету

імені Тараса Шевченка (Київ, пр. академіка Глушкова, 2,

біологічний факультет, ауд. 215)

Поштова адреса: 01033, м. Київ – 33, вул. Володимирська, 64, Київський

національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського

національного університету імені Тараса Шевченка

(01033, м. Київ – 33, вул. Володимирська, 58)

Автореферат розісланий " 16 " жовтня 2003 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Цимбалюк О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Важливим напрямком досліджень сучасної біофізики є вивчення процесів трансмембранного біоелектрогенезу: з’ясування його природи, фізико-хімічних механізмів генерації електричної активності, функціонального значення та практичного застосування біоелектрогенезу. Вважають, що ці процеси тісно спряжені з ферментативними та транспортними системами, фізичними та хімічними впливами на мембрану, передачею зовнішніх сигналів у клітину, регуляцією енергетики, синтезом біомакромолекул та розвитком організму (Гудвін, 1978, Костюк П.Г., 1978, Костюк П.Г., Крышталь О.А., 1981). Через динаміку електрофізіологічних показників клітин у період раннього ембріогенезу тварин можна виявити зміни їх функціонального стану (Гойда, 1993). Тому актуальним є дослідження впливу негативних чинників на мембранний потенціал клітин, що може бути прогностичним біофізичним показником життєздатності живих об’єктів.

Відомо, що у період дроблення бластомерів біоелектричні та метаболічні процеси змінюються в коливному режимі синхронно з клітинними поділами (Ротт, 1987, 1989, Lloyd et al., 1982, 1992, Гойда, 1993, Бродский, 1998, 2000, 2002). Проблеми часових залежностей між динамікою клітинних процесів, що супроводжують клітинні цикли на ранніх стадіях ембріогенезу тварин та закономірності їх часової організації в цей період остаточно не з’ясовані.

Для з’ясування динамічних взаємозалежностей між фізико-хімічними та метаболічними процесами у ранньому розвитку тварин, їх системної організації, перспективним є використання математичного моделювання складних систем.

Тому актуальними є дослідження процесів трансмембранного біоелектрогенезу в ранньому ембріогенезі, з’ясування фізико-хімічних механізмів генерації мембранних потенціалів, вивчення впливу негативних чинників, зокрема, катіонів важких металів, на ці явища, а також, пошук часових причинно-наслідкових залежностей між мембранним біоелектрогенезом та метаболічними перетвореннями у ранньому ембріогенезі зародкових об’єктів, та побудова на основі цього узагальнюючих структурно-функціональних моделей для опису поведінки біосистем на різних рівнях їх організації.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана згідно з наступними науковими темами кафедри біофізики і математичних методів у біології Львівського національного університету імені Івана Франка: № держреєстрації 0197U018079 “Закономірності та тенденції розвитку гідробіоценозів антропофікованих водойм Західного регіону України і їх біологічний моніторинг”, № держреєстрації 0194U029962 “Частотний аналіз та моделювання коливань мембранозв’язаних процесів у ранньому ембріогенезі тварин при різних екологічних ситуаціях”, № держреєстрації 0196U023018 “Дослідження динаміки біоелектричних параметрів мембран зародків тварин за різних умов інкубації з використанням комп’ютерного моделювання”,
№ держреєстрації 0102U003573 “Вплив іонів важких металів на електрогенез клітин в ранньому ембріогенезі.”

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було дослідження процесів трансмембранного біоелектрогенезу (на моделі зародкових клітин в’юна та епітеліально-м’язових клітин ектодерми гідри): з’ясування фізико-хімічних механізмів їх генерації, вивчення впливу негативних чинників, зокрема, катіонів важких металів, на ці процеси, а також, математичний аналіз часових причинно-наслідкових взаємозв’язків між процесами біоелектрогенезу та енергозабезпечувальними процесами у ранньому ембріогенезі зародкових об’єктів і побудова на основі цього структурно-функціональних моделей для опису поведінки біосистем на різних рівнях їх організації.

Для досягнення поставленої мети у роботі розв’язували такі завдання:

Дослідження впливу катіонів важких металів на трансмембранний потенціал (ТМП) та активність Na+, K+-АТФ-ази) у зародків в’юна на стадії дроблення.

Оцінка особливостей коливної динаміки ТМП в ранньому ембріогенезі в’юна за умов впливу катіонів важких металів.

Електронно-мікроскопічне дослідження ультраструктури бластомерів зародків в’юна, інкубованих у нормальному середовищі та за наявності катіонів важких металів.

Аналіз динаміки електричних параметрів клітин ектодерми прісноводної гідри при дії блокаторів ГАМК- та глютаматних рецепторів для з’ясування їх наявності та ролі в регуляції пачкової електричної активності (ПЕА) цих клітин.

Дослідження впливу катіонів свинцю, ртуті та магнію на електричну активність клітин ектодерми гідри Hydra oligactis P.

Оцінка особливостей динаміки біоелектричних, енергозабезпечувальних і мембрано-транспортних процесів та аналіз часових співвідношень між ними у ранньому ембріогенезі в’юна.

Співставлення часових взаємозв’язків між динамікою біоелектричних, енергозабезпечувальних і мембрано-транспортних процесів у ранньому ембріогенезі в’юна та шпорцевої жаби.

Створення математичних моделей трансмембранного біоелектрогенезу на ранніх стадіях розвитку тварин з використанням різних підходів.

Об’єктом дослідження були динаміка біоелектричних, енергозабезпечувальних та мембрано-транспортних процесів зародків прісноводної риби в’юна Misgurnus fossilis L. і шпорцевої жаби Xenopus laevis D. протягом перших годин їх ембріонального розвитку та клітин ектодерми прісноводної гідри Hydra oligactis P.

Предметом дослідження були механізми впливу катіонів важких металів на динаміку трансмембранного потенціалу зародків в’юна, електричну активність клітин ектодерми гідри Hydra oligactis P.; глютаматні та ГАМК- рецептори клітин ектодерми гідри, зміни в часі електрофізіологічних параметрів та показників енергетичного метаболізму в ранньому ембріогенезі в’юна та шпорцевої жаби; структурно-функціональні схеми та моделі.

Методи дослідження. Для виконання поставлених завдань використовували методи мікроелектродної техніки, спектрофотометрії, електронної мікроскопії, а також, статистичні методи досліджень (автокореляційний, крос-кореляційний та спектральний аналіз) та методи математичного моделювання.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено подібність у характері змін біоелектричних і фізико-хімічних показників (ТМП та активності Na+, K+-АТФ-ази) за умов впливу різних концентрацій катіонів важких металів у ранньому ембріогенезі в’юна: дозозалежна деполяризація мембрани бластомерів супроводжується зниженням активності мембранної Na+, K+-АТФ-ази. Електронно-мікроскопічними дослідженнями виявлені значні ультраструктурні зміни органел бластомерів в’юна при дії катіонів важких металів. Показано часову залежність між параметрами коливної динаміки ТМП та морфогенезом зародків в’юна інкубованих у присутності катіонів важких металів: амплітуда та частота коливань ТМП значно зменшується, відбувається сповільнення розвитку зародків. Морфогенетичним аналізом виявлено суттєве відставання в розвитку личинок в’юна та появу в них різних аномалій.

З’ясовано, що солі, які містять катіони Pb2+ та Hg2+, інгібують спонтанну електричну активність клітин ектодерми гідри, а під дією катіонів Mg2+ відбувається гіперполяризація мембрани та збільшення амплітуди потенціалу дії.

Вперше одержано електрофізіологічні докази наявності ГАМК- та глютаматних рецепторів на плазматичній мембрані епітеліально-м'язових клітин ектодерми прісноводної гідри та з’ясовано їх роль в регуляції пачкової електричної активності цих клітин. Показано, що ГАМК-рецептори відповідають за процеси гальмування, а глютаматні рецептори за процеси збудження досліджуваних клітин.

Встановлена подібність часових взаємозв’язків між динамікою біоелектричних, енергозабезпечувальних і мембрано-транспортних процесів у ранньому ембріогенезі в’юна та шпорцевої жаби, що свідчить про універсальність змін зазначених процесів у тварин з різною будовою зародків та типом дроблення бластомерів. Отримано нові дані про принципи часової організації клітинних процесів у ранньому ембріогенезі зародків холоднокровних тварин.

Запропоновано новий підхід до моделювання змін мембранного потенціалу на ранніх стадіях ембріогенезу в’юна, де диференціальні рівняння описують згасаючі власні коливання. Вперше запропоновано математичну модель процесів раннього ембріогенезу тварин, яка базується на новому класі динамічних моделей. За цією моделлю зроблено опис найбільш суттєвих процесів розвитку зародків в’юна на основі виявлених достовірних причинно-наслідкових залежностей між динамікою біоелектричних та метаболічних параметрів ембріональних об’єктів. Вперше проведено узагальнення функціональних взаємодій між названими процесами на молекулярному та вищих рівнях організації біосистем з використанням тріадних структур.

Практичне значення одержаних результатів. Дисертаційна робота спрямована на поглиблення фундаментальних досліджень процесів трансмембранного біоелектрогенезу, впливів, що його модифікують, з використанням системного підходу, статистичних методів, структурно-функціонального аналізу та різних підходів математичного моделювання. Одержані результати поглиблюють уявлення про механізм передачі збудження між нервовими та епітеліальними клітинами кишковопорожнинних, про механізми збудження та гальмування пачкової електричної активності клітин ектодерми прісноводної гідри; про закономірності часової організації клітинних процесів на стадії дроблення в ранньому ембріогенезі холоднокровних тварин; про вплив катіонів важких металів на електричну активність зародків в’юна, на ультраструктуру бластомерів зародків та на електричну активність клітин ектодерми гідри. Апробовані в роботі статистичні методи можуть бути застосовані також для аналізу динаміки фізико-хімічних характеристик клітин та біосистем з метою діагностики та прогнозування їх функціонального стану при дії різних чинників.

Математичні моделі можна використати для дослідження впливу зовнішнього середовища на динаміку ТМП (модель динаміки ТМП на ранніх стадіях ембріогенезу тварин), для оцінки балансу регуляторних субстратів у бластомерах на протязі досліджуваного інтервалу часу розвитку (модель розвитку ембріона в'юна). Розроблені моделі повинні знайти свій подаль-ший розвиток і конкретизацію при плануванні та проведенні досліджень регуляції раннього ембріогенезу тварин. Розглянутий у даній роботі підхід опису структурно-функціональних тріадних взаємодій між елементами біосистем на різних рівнях організації дозволяє дослідити відомі у біології феномени, які частково вивчені експериментально, наприклад, ферментативний каталіз, екологічні системи, і давати їм аналітичну оцінку.

Результати дослідження впроваджені у навчальний процес у Львівському національному університеті імені Івана Франка, вони використовуються при викладанні загального курсу біофізики, спецкурсів з фізико-хімічних методів дослідження та біофізики мембран, а також, у загальному курсі зоології безхребетних. Результати дослідження впливу важких металів на живі об’єкти використовуються для токсикологічної оцінки біологічно-активних речовин у фармакологічних та токсикологічних лабораторіях Державного науково-дослідного контрольного інституту ветпрепаратів та кормових добавок Міністерства аграрної політики України. Отримані результати також можуть бути використані в навчальному процесі при викладанні спецкурсів з електрофізіології, біології розвитку та математичних методів у біології у вищих навчальних закладах.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок здобувача полягає у формуванні й обґрунтуванні напрямків досліджень, у плануванні всього обсягу експериментальної частини дисертації, підборі методів досліджень, аналізі та обговоренні одержаних результатів, а також, у формуванні висновків результатів досліджень.

Автором особисто розроблено всі представлені в роботі моделі (динаміки трансмембранного потенціалу в ранньому ембріогенезі тварин) та проведено опис структурно-функціональних взаємодій між процесами на різних рівнях організації біосистем.

Апробація результатів дисертації. Матеріали результатів дисертації були представлені на: на VII Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1997), ІІ-му з’їзді Українського біофізичного товариства (Харків, 1998), виїзній нараді Президії Українського біофізичного товариства за темою "Біофізика XXI століття" (Львів, 2001), 4-тій міжнародній Парнасівській конференції “Molecular mechanisms of cell activation: biological signals and their target enzymes” (Вроцлав, 2002), ІІІ-му з’їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002), на міжнародній конференції пам’яті І.В. Шостаковської (Львів, 2002), щорічних наукових конференціях біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка (1997-2003 рр.) та на наукових семінарах кафедри біофізики та математичних методів у біології (Львів, 1997-2003 рр.).

Публікації. Головні положення дисертаційної роботи відображені в 40 публікаціях, серед яких 28 статей у фахових наукових виданнях, що визнаються положеннями ВАК України, та 12 тез доповідей на наукових конференціях та з’їздах.

Структура дисертації. Рукопис дисертації складається із вступу, 4-х розділів (огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати досліджень, обговорення результатів дослідження), висновків, списку використаних джерел (723 найменування) та 3 додатків. Робота викладена на 365 сторінках, ілюстрована 13 таблицями і 120 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми, сформульовано мету, завдання та методи досліджень, розкрито наукову новизну та практичне значення роботи, зазначено особистий внесок здобувача та апробацію результатів дисертації.

У першому розділі систематизовано та узагальнено результати літературних джерел, проаналізовано експериментальні дані про електрофізіологічні показники мембран зародків тварин, механізми біоелектрогенезу зародкових об’єктів, про особливості динаміки біоелектричних і метаболічних показників у ранньому ембріогенезі тварин, взаємозв’язки між їх динамікою, про електричні властивості клітин кишковопорожнинних тварин. Крім того, проаналізовано дані про вплив катіонів важких металів на електричні параметри мембран різних об’єктів, розглянуто ембріотоксичну та тератогенну дію катіонів металів.

Другий розділ присвячений матеріалам і методам дослідження: тут описано об’єкти дослідження, наведено методи і матеріал дослідження, що використані у роботі.

Неперервну реєстрацію трансмембранного потенціалу клітин протягом
6-7 год розвитку зародків в’юна здійснювали на спеціально зібраній біофізичній установці (Гойда, 1993) з використанням мікроелектродної техніки (Костюк, Крышталь, 1981; Магура, 1981; Первис, 1983). Цим же методом, за допомогою скляних мікроелектродів з опором (10 ± 2)?106 Ом, проводили відведення ТМП та спонтанної електричної активності епітеліально-м'язових клітин ектодерми прісноводної гідри Hydra oligactis Pallas. Активність Na+, K+–АТФ-ази в гомогенаті клітин зародків в’юна визначали спектрофотометричним методом (Прохорова, 1982) за різницею активностей у відсутності оуабаїна та при його додаванні. Вміст неорганічного фосфату [Рн] визначали за методом Фіске-Суббароу (Прохорова, 1982).

Розчини хлоридів двовалентних катіонів нікелю, кобальту, марганцю, цинку, кадмію та олова у концентраціях від 10–6 М до 10-4 М виготовляли на основі фізіологічного розчину для холоднокровних – розчину Гольтфретера.

Гідру культивували в акваріумі при температурі середовища 18-20°С. Для роботи відбирали дорослих особин віком до 7 днів. Культуральне середовище містило (ммоль/л): NaCl - 30, КС1 – 1.0, СаСl2 - 1,5, MgCl2 –0.25, NaHCO3 –1.0, ЕДТА – 0.25 (Loomis, Lenhoff, 1976; Kass-Simon, Diesi, 1977). При дослідженні ГАМК- і глютаматних рецепторів у регуляції електричної активності епітеліально-м'язових клітин прісноводної гідри були використані: блокатор NMDA-репепторів – D-2-аміно-5-фосфонопентанат (D1-APV), блокатор АМРА-рецепторів - 6-ціано-нітроквіноксалін-2,3-діон (CNQX) та блокатор ГАМК-рецепторів бікукулін (у концентраціях 5, 10, 15 мкмоль/л). При дослідженні змін електричної активності клітин ектодерми гідри під впливом катіонів свинцю, ртуті та магнію використовували розчини хлоридів цих катіонів у концентраціях від 0.001 до 2.5 мкМ.

Електронно-мікроскопічні дослідження проводили за допомогою електронного трансмісійного мікроскопа ПЕМ-100 (Сумське акц. тов-во “Selmi”). Зрізи готували на ультрамікротомі УМТП-6 (Сумське акц. тов-во “Selmi”); фіксацію зразків здійснювали за загальноприйнятими методиками (Luft, 1961; Reynolds, 1963).

Кількісну оцінку параметрів динаміки біоелектричних, енергозабезпечувальних і мембрано-транспортних процесів (від 60 до 385 хв) протягом раннього ембріонального розвитку зародків в’юна та шпорцевої жаби проводили з застосовуванням методів аналізу часових рядів (Хованова, Хованов, 2000): автокореляційного, крос-кореляційного та спектрального аналізу.

Математичний аналіз проводили з використанням пакету прикладних програм STATGRAРНICS, зокрема, програм з розділу TIME SERIES PROCEDURES, завдяки яким, також, оцінено достовірність результатів спектрального аналізу з використанням підпрограми INTEGRATED PERIODOGRAM. Перевірку достовірності результатів кореляційного аналізу проводили за таблицею граничних значень коефіцієнтів кореляції, які гарантують заданий рівень значимості (p < 0.05, p < 0.01), залежно від обсягу сукупності (Деркач із співавт., 1977).

Результати досліджень обробляли статистично використовуючи критерій t-Стьюдента та з використанням програмного забезпечення MathCAD, Microsoft Excel.

У третьому та четвертому розділах роботи викладено результати дослідження та їх обговорення. Третій розділ складається з чотирьох основних частин. Перша з них присвячена вивченню впливу катіонів важких металів на електричні параметри зародків в’юна, друга – вивченню динаміки електричної активності клітин ектодерми гідри, третя – дослідженню динаміки метаболічних і біоелектричних показників зародків в’юна та шпорцевої жаби на стадії дроблення. Четверта частина присвячена опису запропонованих нами моделей.

На першому етапі ми досліджували зміни ТМП зародків в’юна в період дроблення бластомерів за наявності в інкубаційному середовищі хлоридів таких металів, як нікель, кобальт, цинк, марганець та олово в концентраціях від 10-6 до 10-4 М. (рис. 1-6). За наявності в інкубаційному середовищі катіонів нікелю, марганцю, та кадмію в концентрації 10-5-10-6 М відбувається загальна деполяризація мембрани, а також, зменшення амплітуди та збільшення періоду коливань ТМП. Ці зміни були більш виражені внаслідок збільшення концентрації металів в інкубаційному середовищі. Період коливань ТМП збільшувався в 1,5 - 2,0 рази і в 1,5 - 2,0 рази зменшувалась частота поділу бластомерів. Це збігалося з даними візуального спостереження за зародками: тварини, яких інкубували за наявності у середовищі катіонів важких металів, розвивались набагато повільніше, ніж контрольні особини, і, крім того, мали певні вади розвитку. Амплітуда коливань ТМП також значно зменшувалась внаслідок впливу катіонів важких металів: за наявності катіонів нікелю, олова в концентрації 10-5 М (рис.1 і 3) – в 2,0 - 2,5 рази, а катіонів марганцю та цинку (концентрація 10-5) – в 1,5 - 2 рази (рис.5 і 4). Наявність катіонів важких металів у менших концентраціях приводила до менш виражених змін амплітуди та періоду коливань.

Отримані нами результати вимірювання активності Na+, K+-активованої, Mg2+-залежної АТФ-ази показали, що вплив катіонів досліджуваних важких металів в концентраціях 10-6 – 10-4 М веде до залежного від концентрації зменшення її активності.

Таке зменшення активності згаданих АТФ-аз спостерігалось як після першого поділу – на стадії 2 бластомерів (рис. 7), так і в кінці періоду дроблення бластомерів – на стадії 10-го поділу. Причому на більш ранніх стадіях дроблення бластомерів зменшення активності Na+, K+–АТФ-ази при дії катіонів важких металів було менш виражено.

На всіх досліджуваних стадіях активність Na+, K+–АТФ-ази змінювалась найменше внаслідок впливу катіонів кобальту та марганцю. З’ясовано, що найсуттєвіше зниження активності Na+, K+–АТФ-ази спостерігалось при дії катіонів нікелю та кадмію – тобто, за тих самих впливів, за яких відбувалось найбільш виражене зменшення абсолютних значень ТМП (рис. 7).

Для більш якісної характеристики змін активності Na+, K+–АТФ-ази плазматичної мембрани зародків в’юна за умов впливу катіонів важких металів було розраховано коефіцієнт інгібування І0,5. (Цей коефіцієнт показує, дія якої концентрації катіонів металу веде до зменшення активності ферменту на 50 %). Значення коефіцієнту інгібування І0,5 для досліджуваних металів на різних стадіях розвитку представлені у таблиці 1.

Найменші значення цього коефіцієнту, як видно з таблиці, характерні для катіонів нікелю та кадмію, що свідчить про їх найбільший вплив на активність Na+, K+-АТФ-ази мембран зародків в’юна.

Одержані результати щодо інгібування Na+,K+–АТФ-ази катіонами важких металів у значній мірі підтверджуються змінами ультраструктури бластомерів зародків в’юна, які були інкубовані в присутності катіонів вказаних важких металів.

Вплив катіонів важких металів викликав появу ультраструктурних змін органел бластомерів зародків в’юна (рис. 8).

Зокрема, за цих умов, спостерігалось пошкодження мітохондріальних мембран та крист. У деяких випадках мембрани та кристи мітохондрій були повністю зруйновані й утворювали суцільні ліпопротеїдні ділянки. У цитоплазмі спостерігалася підвищена кількість первинних лізосом, що може бути пов’язане із великою кількістю органел, ушкоджених внаслідок впливу катіонів важких металів.

У випадку впливу катіонів нікелю та цинку виявлено гіпертрофію комплексу Гольджі. Також, мало місце зменшення хвилястості плазматичної мембрани в порівнянні з контролем, розрідження гіалоплазми, набряк органел.

Спектральний аналіз динаміки ТМП показав зменшення частоти коливань потенціалу у всіх випадках впливів катіонів досліджуваних металів. Найсуттєвіше збільшення періоду коливань спостерігалось внаслідок впливу катіонів нікелю, олова та кадмію, найменш виражене – при дії катіонів кобальту. Оскільки тривалість періоду коливань потенціалу співпадає з тривалістю клітинного циклу зародків в’юна, збільшення періоду свідчить про сповільнення розвитку зародків.

Цей висновок підтверджується візуальним спостереженням за розвитком личинок в’юна на більш пізніх стадіях розвитку за допомогою бінокулярного мікроскопу. Личинки в’юна у віці 10 діб, які розвивались за наявності в інкубаційному середовищі катіонів досліджуваних важких металів в концентрації 10-5 М, мали аномалії розвитку, що спостерігались приблизно в 25-30 % личинок. Це співпадає з даними, які були одержані на личинках Xenopus laevis (Plowman, Peracha et al., 1991; Sunderman, Plowman, Hopfer, 1991; Plowman, Grbac-Ivankovic et al., 1994 ). Помітним було відставання у розвитку цих личинок у порівнянні з контролем: вони мали менші розміри тіла та залишки жовткового міхура. Крім того, у них мали місце суттєві вади розвитку, а саме – викривлення та перекручення хребта, деформація кісток черепа та збільшення розмірів голови (можливо, гідроцефалія), значний набряк черевної порожнини, недорозвинені плавці, зябра, вусики. Личинки були малорухливими, а їх серцебиття сповільненим.

Отже, зародки в’юна Missgurnus fossilis L. є досить чутливими до сторонніх впливів, зокрема, динаміка їх трансмембранного потенціалу суттєво змінюється внаслідок дії таких речовин, як гормони (Гойда, 1993), поліпептидні фактори росту (Гойда, Ротт, Санагурский, 1981), антибіотики (Гойда, 1993; Бойко, Санагурский, 2000), катіони важких металів (Бойко, Санагурський, 2000). Виходячи з цього, можна вважати, що зародки в’юна є зручною та адекватною тест-системою для вивчення впливу різних фармакологічних, хімічних і біологічних чинників на живі об’єкти.

На другому етапі досліджували електричну активність клітин ектодерми гідри. Аналіз електричної активності клітин ектодерми прісноводної гідри за умов нормального культурального середовища показав, що вони генерують електричну активність у вигляді серій пачкової електричної активності (ПЕА) (n = 7). При цьому мембранний потенціал спокою (МПС) становив -35,7 ± 2 мВ, амплітуда потенціалу дії (ПД) становила 19,4 ± 0,5 мВ, кількість ПД в середньому була 7 в пачці, тривалість пачки була 35 мс, а міжпачковий інтервал тривав 140 ± 0,3с.

Слід зазначити, що серії ПЕА співпадають у часі зі ступінчатими скороченнями клітин ектодермального шару гідри, які лежать в основі її рухової активності (Тизьо, 1998).

У першій серії досліджень ми вивчали вплив бікукуліну – блокатора ГАМКА-рецепторів на електричну активність клітин гідри. Як виявилось, вплив на клітини гідри зовнішнім розчином, в якому наявний бікукулін (5 мкмоль/л), приводив до значних змін спонтанної електричної активності. Протягом 10 хв від початку дії бікукуліну спостерігалась деполяризація мембрани від -39 ± 0,2 до -32 ± 0,4 мВ. Амплітуда ПД зростала від 18,8 ± 0,3 до 28 ± 0,2 мВ, а далі наступав розлад пачкової активності та відбувалась генерація, в основному, поодиноких ПД з частотою 7 на хв. Подібні зміни параметрів ПЕА, але більш виражені, спостерігались при дії даного блокатора в концентраціях 10 (рис. 9) та 15 мкмоль/л.

За наявності бікукуліну в середовищі у концентрації 15 мкмоль/л електрична активність генерувалась не у вигляді періодичних серій ПД (пачок), а безперервно, про це свідчила відсутність міжпачкового інтервалу. Це можна пояснити блокуванням гальмування, яке функціонує в природних умовах і опосередковане активацією ГАМК-рецепторів епітеліально-м'язових клітин.

Таким чином, нами отримано електрофізіологічні докази наявності ГАМК-рецепторів, очевидно, розміщених на постсинаптичній мембрані епітеліально-м'язових клітин гідри, що на підставі біохімічних досліджень було припущено Конкасом та співавторами (Concas et al., 1998). Отримані результати підтверджують також наші електронно-мікроскопічні дослідження. Зокрема, нам вдалось отримати зображення синаптичного контакту між нервовою та епітеліально-м'язовою клітинами гідри.

Під впливом конкурентного антагоніста NMDA-рецепторів D1-APV (5 та 10 мкмоль/л) виявлено часткове блокування генерації ПД та поодинокі ПД з амплітудою 16 ± 0,3 мВ, а в концентрації 15 мкмоль/л – припинення генерації ПД, яке тривало протягом усього часу аплікації антагоніста. Це вказує на участь NMDA-рецепторів у регуляції ПЕА клітин гідри. Більш виражений гальмівний ефект на ПЕА ми спостерігали під впливом конкурентного антагоніста АМРА-рецепторів CNQX. Збільшення концентрації до 15 мкмоль/л через 2 хв після введення розчину вело до миттєвого зникнення пачкової електричної активності.

Вплив D1-APV у концентрації 15 мкмоль/л, а також, поєднаний вплив з блокатором АМРА-рецепторів CNQX, вели до повного блокування генерації потенціалів дії з наступним відновленням після відмивання.

Отже, проведені нами дослідження дають можливість стверджувати про наявність глютаматних рецепторів на рухових нейронах клітин гідри Hydra oligactis Pallas, що беруть участь у процесах збудження.

Таким чином, нервова система гідри включає в себе збуджувальні та гальмівні синаптичні механізми регуляції електричної активності епітеліально-м'язових клітин, яка генерується пейсмекерними системами.

Наступна серія досліджень присвячена вивченню впливу катіонів Mg2+, Hg2+ та Pb2+ в різних концентраціях на електричну активність клітин прісноводної гідри.

Результати дії катіонів Mg2+, Hg2+ та Pb2+ у різних концентраціях на кількість потенціалів дії у пачці (N) клітин ектодерми гідри показано на рис. 10.

Виявлено, що при дії катіонів магнію у концентрації 1,6 мкмоль/л відбувалась незначна гіперполяризація мембрани (від -38,4 ± 2,0 до -42,1 ± 2,1 мВ) та збільшення амплітуди ПД на 50%. Після збільшення концентрації катіонів Mg2+ у середовищі до 2,5 мкмоль/л гіперполяризація зростала від -39,3 0,4 до -51,7 0,8 мВ. Амплітуда ПД збільшувалась на 100%, порівняно з контрольними параметрами.

Ми припускаємо, що такі ефекти пов'язані з відомою властивістю катіонів даних лужноземельних металів блокувати йонну провідність натрієвих та деяких типів кальцієвих каналів збудливих клітин, що узгоджується з даними літератури (Тизьо, Гойда, 1996). Ймовірно, що іони Ca2+, які є антагоністами катіонів магнію, беруть опосередковану участь в генерації ПЕА клітин ектодерми гідри.

У наступній серії експериментів нами встановлено, що катіони свинцю в концентрації 0,1 мкмоль/л викликають незначну деполяризацію мембрани (від -37,5 ± 0,4 до -35,3 ± 0,8 мВ). При цьому кількість ПД у пачках збільшувалась на 20%, тривалість міжпачкового інтервалу збільшувалась від 150 до 300 с. Однак найбільш вираженим був ефект дії свинцю на амплітуду ПД, яка зменшувалась від 19,4 ± 0,7 до 7,3 ± 1,4 мВ. Під впливом катіонів свинцю в концентрації 2,5 мкмоль/л відбувалася деполяризація мембрани від -38,3 ± 0,5 до -24,9 ± 0,8 мВ, а також, зменшувалась на 10,5% кількість ПД у пачках, збільшувалась на 257% тривалість міжпачкового інтервалу та зменшувалась від 19,6 до 6,4 мВ амплітуда ПД порівняно з контролем (рис. 11).

Аплікація катіонів ртуті в концентрації 0,001 мкмоль/л спричиняла тривалий (15-25 хв) депресивний ефект щодо генерації електричної активності (рис. 12). Даний ефект спостерігався при використанні концентрації 0,1 мкмоль/л, коли деполяризація мембрани становила від -38,1 ± 0,5 до -16,1 ± 1,2 мВ. Кількість ПД зменшувалась на 50%, а тривалість міжпачкового інтервалу - від 150 до 350 с порівняно з контролем (див. рис. 12).

Отже, результати наших досліджень свідчать про інгібувальний характер впливу катіонів свинцю та ртуті на перебіг спонтанної електричної активності клітин ектодерми гідри. Результати впливу катіонів магнію на електричну активність клітин ектодерми Hydra oligactis свідчать про блокування нервово-м'язової синаптичної передачі. Ефекти дії РЬ2+ та Hg2+ можна пояснити здатністю катіонів цих металів частково або повністю блокувати провідність кальцієвих і натрієвих іонних каналів плазматичної мембрани клітин ектодерми гідри, що беруть участь у генерації ПД. При цьому спостерігається чітка залежність ефекту від концентрацій катіонів у розчині.

Наші результати узгоджуються з даними літератури (Spenser, Schwab, 1980; Зигель, 1982; Филенко, 1988), згідно з якими катіони ртуті та свинцю спричинюють блокування спонтанної електричної активності епітеліально-м'язових клітин колоніального гідроїдного поліпа Coriophora та викликають токсичне ушкодження при використанні їх у високих концентраціях, а дія катіонів магнію викликає блокування синаптичної передачі у гідроїдів (Ball, Case, 1973; Spenser, 1975). У результаті наших досліджень встановлено концентрації даних катіонів у культуральному середовищі, що призводять до незворотніх змін, тобто викликають втрату рухової здатності та пошкодження клітин ектодерми. Крім цього показано, що вплив цих катіонів не є аналогічним до інгібіторів ГАМК- та глютаматних рецепторів.

На третьому етапі досліджували закономірності часової організації біоелектричних, енергозабезпечувальних і мембрано-транспортних процесів, що супроводжують клітинні цикли дроблення зародків в’юна та шпорцевої жаби. Для дослідження особливостей динаміки зазначених процесів та з’ясування часових залежностей між ними у ранньому ембріогенезі риб та амфібій нами проведено математичний аналіз аперіодичних та періодичних змін параметрів, що описують ці процеси.

Усі виявлені часові співвідношення характеризуються за довготривалими зсувами 30-60 хв (оскільки інтервал квантування становив 30 хв). Звідси зрозуміло, що зміни досліджуваних показників відображають події, які відбуваються на рівні макроорганізму, та часові взаємозв’язки між ними. Таке припущення узгоджується з результатами експериментальних досліджень.

Показано, що починаючи зі стадії 32-х бластомерів відбувається транспорт глікоген-фосфорилазного комплексу з жовтка у бластодерму (Мильман, Юровицкий, 1973; Юровицкий, 1999), що супроводжується збільшенням швидкості гліколізу. У цей же час у зародків в’юна між бластодиском та жовтком відбувається формування перибласту, за рахунок якого здійснюється активне засвоєння компонентів жовтка (Furshpan et al., 1968).

Крім того, зміни інтенсивності дихання у цей період можуть опосеред-ковуватись змінами в ультраструктурі популяції мітохондрій, оскільки показано, що починаючи зі стадії 16-ти бластомерів змінюється співвідношення між палич-коподібними та кулястими мітохондріями, зокрема збільшується кількість перших (Сухомлинова и соавт., 2000).

Отже, виявлені часові залежності між загальними змінами біоелектричних і метаболічних показників, ймовірно, зумовлені морфофізіологічними процесами пов’язаними з розвитком зародків в’юна.

Результати проведеного аналізу коливних складових досліджуваних показників виявили, що не усі вони мають тривалість періоду близьку до тривалості клітинних циклів під час дроблення зародків в’юна при 21 С, яка дорівнює 31.5 хв. Зокрема, знайдено, що періоди коливань ТМП, Ca2+, pHц та активність ізоцитратдегідрогенази (ізЦДГ) є близькими до тривалості поділів. Активність -кетоглутаратдегідрогенази (-КГДГ) має період приблизно у два рази більший від коливань названих показників. Для динаміки активності сукцинатдегідрогенази (СДГ), лактатдегідрогенази (ЛДГ) та швидкості поглинання кисню (ШПК) одержано дискретні спектри, у яких середня енергія розподілена між декількома коливними складовими з неспіврозмірними частотами. Аналіз динаміки активності СДГ, ЛДГ та ШПК свідчить про те, що на досліджуваному інтервалі часу змінам цих показників властивий квазіперіодичний характер. За результатами автокорелограм, періодограм ТМП, pHц та ізЦДГ виявлено нестабільність тривалості визначених періодів їх коливань. Одержані результати автокореляційного та спектрального аналізів цих показників узгоджуються з даними їх крос-кореляційного аналізу. Так, достовірна сильна кореляція, яка є майже стабільною за величиною, простежується між наступними часовими рядами: ТМП–pHц, ТМП–ізЦДГ, Ca2+–pHц, Ca2+–ізЦДГ, pHц–ізЦДГ. Ці дані свідчать про стійкий зв’язок між періодичними складовими названих показників з періодом приблизно 30-35 хв.

У двох серіях досліджень вивчена часова динаміка біоелектричних і метаболічних процесів у ранньому ембріогенезі зародків риб та амфібій.

У першій серії проведений аналіз часових співвідношень динаміки зазначених процесів у зародків шпорцевої жаби, а у другій – спектральний та крос-кореляційний аналіз (рис. 14 і 15) динаміки наступних показників в’юна та шпорцевої жаби: ТМП, вмісту катіонів K+ і Na+, співвідношення K+/Na+ у зародку, [Сa2+]в, pHц, ШПК і швидкості виділення вуглекислого газу (ШВВ). Виявлені достовірні крос-кореляції між змінами вмісту K+ і Na+, співвідношенням K+/Na+ у зародку та динамікою ТМП, ТМП і концентрацією цитозольного Ca2+, а також, встановлені кореляції між динамікою процесів, що зумовлюють зміни поляризації зародкових мембран (перерозподіл вмісту K+, Na+, співвідношення K+/Na+ у зародку) з одного боку, та зміни інтенсивності енергетичного метаболізму, з іншого, у зародків в’юна та в зародків шпорцевої жаби. За результатами спектрального аналізу виявлена близькість періодів коливань ТМП і концентрації цитозольного Ca2+ з тривалістю клітинних циклів у обох об’єктів.

Виявлено відмінності у часових співвідношеннях між змінами pHц та біоелектричних показників (рис. 15) цих об’єктів. Між цими показниками у шпорцевої жаби спостерігаються достовірні крос-кореляційні залежності із зсувом від 5-ти до 35-ти хв. На відміну від цього, у в’юна встановлено періодичність виникнення крос-кореляційних зв’язків із 30-хвилинним ритмом. Ці результати підтверджені спектральним аналізом динаміки pHц. На відміну від виявленої періодичності динаміки pHц у в’юна з періодом 31 хв (p0.05), у зародків шпорцевої жаби зміни цього показника на досліджуваному інтервалі часу можуть бути випадковими флуктуаціями.

Реалізація вказаних вище зв’язків, очевидно, також пов’язана із морфофізіологічними процесами, що супроводжують дроблення бластомерів тварин, оскільки більшість з них виявлено за довготривалими часовими зсувами в обох об’єктів. Цілісна картина одержаних результатів підтверджує універсальність часової організації динаміки метаболічних і біоелектричних процесів на ранніх стадіях ембріогенезу риб та амфібій. Крім того, це свідчить про те, що динаміка ТМП, перерозподілу вмісту K+, Na+, співвідношення K+/Na+ та інтенсивності енергетичного метаболізму, яка є властива зародкам, не залежить від типу дроблення та будови зародків цих тварин (Івашків, Гумецький, Санагурський, 2002).

У результаті наших досліджень з’ясовано, що в нормальних умовах розвитку зародків в’юна основною властивістю коливної динаміки метаболічних і біоелектричних характеристик є її значна нерегулярність, що проявляється у варіативності тривалості періодів їх коливань, не повному збігу їх величин між собою, причому для більшості метаболічних характеристик виявлено квазіперіодичний характер динаміки (Івашків, Гумецький, Санагурський, 2001, 2002).

Проведений математичний аналіз динаміки показав, що зміни функціонального стану зародків чітко відображаються у характеристиках коливань показників, які описують різні процеси, та у часових співвідношеннях між ними. Найбільш чутливими до змін функціонального стану слід вважати такі критерії, як час згасання осциляцій величини коефіцієнта кореляції на автокорелограмах, максимуми спектральної потужності коливань на періодограмах показників та форма крос-корелограм між коливними складовими різних показників.

На заключному етапі проводили математичне моделювання трансмембранного біоелектрогенезу на ранніх стадіях розвитку тварин з використанням різних підходів.

У результаті аналізу характеру коливних змін ТМП нами було запропоновано гіпотезу, що на ранніх стадіях ембріогенезу в'юна виникає автоколивний процес, який, в свою чергу, збуджуючи систему, веде до виникнення в ній власних згасаючих флуктуацій. Ця гіпотеза лягла в основу створеної нами моделі динаміки ТМП (Маслій, Санагурський, 2001, 2003).

У такому випадку сумарний трансмембранний потенціал, який ми одержуємо в результаті експериментальних вимірювань, повинен складатися із трьох складових:

Eа — автоколивна складова, Ес — потенціал спокою, Eз — складова згасаючих коливань, тобто

ЕТМП = Еа + Ез + Ес (1)

Запліднена яйцеклітина є високоупорядкованою біологічною системою із складними механізмами регуляції, розвитку та самоорганізації, в якій цілком природно можуть виникати автоколивні процеси. Для таких систем характерним є те, що коливання в них виникають не за рахунок зовнішніх впливів (початкового поштовху чи впливу періодичної дії), а в результаті внутрішньої здатності системи самостійно регулювати надходження енергії від постійного джерела. Усі автоколивні системи містять резонатор (осцилятор), джерело живлення та зворотний зв'язок між ними. Оскільки мова йде про біоелектричні процеси у клітині, то резонатор доцільно промоделювати з допомогою коливного контуру, який утворюється шляхом послідовного з'єднання ємності та індуктивності. Зворотний зв'язок – це відповідний біоелектричний механізм, з участю якого резонатор сам регулює надходження енергії від джерела.

Рівняння, яке описує вільні коливання осцилятора (Парселл, 1975), має вигляд:

q"(t) + щ02q(t) = 0 (2)

Розв'язком рівняння (2) є функція

q(t)= Q1cos(щ0t+в),

Q1 – амплітуда коливань,

q(t) – електричний заряд на мембрані клітини,

щ0 – циклічна частота власних коливань,

в – ?аза коливань.

У рівнянні (2) ?0=1/vLC,

де L – індуктивність,

C – електрична ємність.

Реальні коливні системи на початкових етапах перехідного процесу мають ще одну складову – власні згасаючі коливання коливної системи. Згасаючі власні коливання виникають практично у всіх реальних коливних системах, тому що процес відбувається у певному реальному середовищі, яке створює йому опір. Оскільки при створенні моделі біоелектричних процесів ми використовували методи електричних кіл, то можна записати диференційне рівняння, що описує згасаючі власні коливання (Парселл, 1975):

L1q" + Rq' + q/C1 = 0 (3),

де L1 – індуктивність,

R – опір,

C1 – ємність.

Записавши розв'язок рівняння (3) у вигляді q(t)=Q2е-гt+bсоs(?1t+б), ?и отримали формули для обчислення автоколивної складової ТМП Еа=a2cos(щ0t+в) ?a складової згасаючих коливань Eз=а1соs(?1t+б)?-гt+b. Підставляючи отримані значення складових ТМП у рівняння (1), ми одержали математичну модель, яка описує зміну ТМП на ранніх стадіях ембріогенезу:

Eтмп = а1соs(?1t+б)?-гt+b + a2cos(щ0t+в) + Еc (4),

де а1, a2 – амплітуди коливань,

щ1, щ0 – циклічні частоти коливань,

б, в – ?ази коливань,

г – ?екремент згасання коливань.

Модель (4) отримано в результаті розв'язку двох диференційних рівнянь другого порядку з постійними коефіцієнтами. Вона відображає значною мірою якісну картину процесу (рис. 16). Значення параметрів R та С, отримані в результаті математичного моделювання, співпадають з відомими із літературних джерел значеннями цих параметрів, отриманими експериментально.

У загальному випадку, параметри R, С, Q, L є функціями часу, температури та інших параметрів середовища. Математичну модель (4) також було апробовано на низці експериментальних даних змін ТМП за впливу катіонів деяких важких металів. У всіх випадках абсолютна похибка відтворення експериментальних даних за допомогою математичної моделі не перевищує 5%.

На рис. 16 показано експериментально отриманий ТМП