МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

Сокуренко Людмила Михайлівна

УДК 616.833-001.41-089.844-003.93

Регенерація периферійного нерва в умовах нейропластики, проведенoї в різні терміни після пошкодження, та стимуляції мієліногенезу

14.03.09 – гістологія, цитологія, ембріологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному медичному університеті ім. О.О. Бого-мольця МОЗ України.

Науковий керівник

доктор медичних наук, професор Чайковський Юрій Богданович, Національний медичний університет
ім. О.О. Богомольця МОЗ України, кафедра гістології, цитології та ембріології, завідувач.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, Квітницька-Рижова Тетяна Юріївна, інститут геронтології АМН України, лабораторія морфології і цитології, завідувач;

доктор медичних наук, професор Костинський Григорій Борисович, Медичний інститут Української асоціації народної медицини, кафедра гістології, цитології та ембріології, завідувач.

Провідна установа

Тернопільська державна медична академія ім. І.Я. Горбачевського, кафедра гістології, цитології та ембріології, МОЗ України, м. Тернопіль.

Захист відбудеться “__2___” жовтня 2003 р. о 1330 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.06 у Національному медичному університеті ім. О.О. Богомольця (03057, м. Київ, пр-т Перемоги, 34).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медич-ного університету ім. О.О.Богомольця МОЗ України (03057, м. Київ, вул. Зоологічна, 1).

Автореферат розісланий “ 30 ” серпня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.003.06 Грабовий О.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема хірургічного лікування та відновлення функцій пошкоджених периферійних нервів залишається актуальною та значимою, оскільки ураження периферійних нервів приводять до інвалідності, особливо в молодому працездатному віці. Водночас ця проблема є недостатньо вивченою, оскільки більше 60% потерпілих стають інвалідами II-III груп (Куропаткин А.І., 1990). Серед пацієнтів переважають хворі до 45 років (85,9%), а середній вік становить 31,2 року (Хонда О.М., 1998).

Як відомо, при тривалій відсутності зв’язків нервів з відповідними мотонейронами виникає атрофія м’язів з наступним їх заміщенням жировою тканиною. Це потребує відповідної корекції, тобто реіннервації м’язових волокон (Шрамко В.И., 1991; Пазиняк В., 2000; Stoll G., Muller H.W., 1999; Arun K., Gosain M.D., 2001; Evans G.R., 2001).

На результатах відновлення нервових стовбурів позначаються розміри дефектів периферійних нервів (Цимбалюк В.И. и др., 1992; Adarsh K. Gulati., 1996).

Актуальною проблемою сучасної медицини залишаються нейро-тканинні взаємовідношення, оскільки їх вивчення має як теоретичне значення, зумовлене участю нервової системи в підтримці морфофунк-ціональної організації тканин, так і клінічне, обумовлене тим, що резуль-тат відновлювальних операцій багато в чому залежить від характеру невротизації пошкоджених тканин (Костинський Г.Б., 1997; Фомін Т.М., 1999; Bain J.R., 1998; Dagum A.B., 1998; Akassoglou K. et al., 2003).

Тому, за умов пізнього звернення хворих за допомогою та наявності дефекту нерва, найперспективнішими методами виявляються такі реконструктивні мікрохірургічні втручання, як ауто- та ало-нейро-пластика кріоконсервованим трансплантатом (Чайковський Ю.Б., 1988; Оглезнев К.Я., Халиков В.А., 1990; Оттелин В.А., 1999; Lassner F., BecM., Berger A., 1995; Mackinnon S.E., 1996; Owen E.R., Dubernard J.M., Lanzetta M., Kapila H. et al., 2001; Mackinnon S.E., Doolabh V.B., 2001; Ackermann P.W. et al., 2003).

Для стимуляції регенераторних процесів у нерві за умов нейро-пластики використовуються фармакологічні засоби (вітаміни, гор-мони тощо), які мають переважно протизапальну дію (Челышев Ю.А., Хафизь-янова Р.Х. и др., 2000). І, практично, не застосовуються препарати, які б впливали на стан регенеруючих нервових волокон у периферій-ному відрізку нервового стовбура, зокрема специфічно на процес мієлі-нізації, який є важливою складовою відновлювального процесу, оскільки дов-жи-на периферійного відрізка нерідко сягає декількох десятків сантиметрів.

В умовах ауто- та алонейропластики були вивчені в експерименті морфологічні зміни нейронів спинномозкових вузлів (Жук О.Н., Калю-нов В.Н., 1996) і зміни в регенераційній невромі (Чайковський Ю.Б., 1999), стан центрального відрізка пошкодженого нерва, динаміка руйнування та відновлення нервових закінчень (Чайковський Ю.Б., Сокуренко Л.М., Яценко В.П., Моніна Н.Я., 2002).

Зміни ж периферійного відрізка нервового стовбура після нейропластики, особливо в умовах дії різноманітних фармакологічних засобів, вивчені недостатньо. Зовсім не вивчені ці процеси при відновленні неперервності нерва у віддалений строк після пошкодження.

Таким чином, є доцільним проведення досліджень по вивченню впливів, спрямованих на проростання регенеруючих аксонів у перифе-рійному відрізку пошкодженого нервового стовбура та їх мієлінізацію.

Якість результатів хірургічного лікування хворих з травматичними пошкодженнями нервів знижується мірою збільшення тривалості часу з моменту травми до дня проведення операції. Спроби впливати на відновлення пошкоджених нервів були спрямовані на нервові центри та ділянку пошкодження (Жук О.Н., Калюнов В.Н., 1996), на зміни в сполучній тканині (Чайковский Ю.Б., 1996), а вивчення дії лікарських препаратів на дистальні відділи пошкодженого нерва, зокрема на процес мієлінізації новоутворених нервових волокон, від чого залежить швидкість проведення імпульсів, практично не проводилось. У зв’язку з цим особливо важливим з практичної точки зору є проведення таких досліджень після нейропластики, виконаної у віддалені строки після пошкодження нерва.

Виходячи з вищесказаного можна стверджувати, що проблеми відновної хірургії травм периферійних нервів однозначно до цього часу не визначені, особливо у випадках ускладнених процесів. Оскільки ступінь відновлення структур та функцій нервів знаходиться у прямій залежності від повноти і часу їх реіннервації, вивчення способів алонейропластики, спрямованих на прискорення відновлення функцій органу і, відповідно, зменшення часу лікування хворих, а також вивчення впливу на мієлінізацію нервових волокон, є актуальною проблемою сучасної теоретичної і клінічної медицини.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у рамках планової комплексної науково-дослідної роботи кафедри гістології та ембріології НМУ: “Вивчити регенерати шкіри та реактивні зміни нервової системи за умов дії деяких фізіологічних та патологічних факторів”. Номер держреєстрації №0100U002640, 2000-2002 рр.

Мета та задачі дослідження. Мета роботи встановити особливості відновлення нервового стовбура в умовах заміщення його дефекту кріоконсервованим алотрансплантатом в різні терміни після пошкодження та під впливом ліпіну.

Досягнення цієї мети базувалось на вирішенні наступних задач:

1. Вивчити стан центрального відрізка, трансплантата та нейральних анастомозів сідничого нерва щурів в умовах алопластики, проведеної в різні терміни після пошкодження.

2. Вивчити невротизацію та мієлінізацію великогомілкового нерва щурів в умовах алопластики сідничого нерва, проведеної в різні терміни після пошкодження.

3. Вивчити стан проксимальної частини сідничого нерва, анастомозів, трансплантату та периферійного відділу сідничого нерва в умовах алопластики, проведеної в різні терміни після пошкодження сідничого нерва із застосуванням та без застосування ліпіну.

4. Вивчити невротизацію та мієлінізацію великогомілкового нерва щурів в умовах алопластики, проведеної в різні терміни після пошкод-ження сідничого нерва із застосуванням та без застосування ліпіну.

5. Вивчити залежність між змінами в трансплантаті та нейральних анастомозах і змінами в периферійному відрізку пошкодженого нерва.

Об’єкт дослідження: реактивні властивості нервових стовбурів.

Предмет дослідження: сідничий та великогомілковий нерви щурів в умовах алонейротрансплантації, проведеної відразу після пошкодження та через 2 тижні, на 1-й, 3-й, 6-й та 12-й тиждень післяопераційного періоду, з використанням та без використання ліпіну.

Методи дослідження: загальногістологічні, нейрогістологічні, електронномікроскопічні та морфометричні, які дозволили виявити реактивні властивості при регенерації сідничого нерва тканин.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше вивчено від-новлення нервового стовбура по всій його довжині в умовах мікрохі-рургічної алонейропластики залежно від часу після пошкодження. Вперше в умовах алонейропластики було вивчено стан нервових волокон, що проростають у периферійний відрізок нервового стовбура, та їх мієлінізацію під впливом ліпіну. Отримані дані дозволили з’ясувати закономірності процесів регенерації та мієлінізації нервових волокон залежно від терміну оперативного втручання та впливу препарату “ліпін”, кореляцію між змінами в трансплантаті та в нейральних анастомозах і змінами в периферійному відділі, пошкодженого нерва.

Ці результати дають змогу створити передумови удосконалення методики лікування травм нервових стовбурів у людини, а також надати теоретичне обґрунтування для розробки рекомендацій щодо вибору тактики операційних втручань і реабілітаційних засобів при тяжких формах пошкодження нерва.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані є передумовою для розробки в клінічній практиці способів покращення процесів відновлення периферійних нервів після їх пошкодження. Матеріали роботи, при впровадженні у навчальний процес, розширюватимуть уявлення студентів та слухачів про репаративні властивості нервових стовбурів та способів впливу на ці процеси.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проводились вивчення наукової літератури, виконання експериментів, мікро-морфологічні та морфометричні дослідження, аналіз та узагальнення отриманих результатів.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на: науковій конференції “Актуальні проблеми експери-ментальної медицини” (Київ, 1999); республіканській науковій конфе-ренції анатомів, гістологів, ембріологів і топографоанатомів (Івано-Франківськ, 2000); науковій конференції “Актуальні питання морфоге-незу” (Чернівці, 2001); VI науковій конференції студентів та молодих вчених (Тернопіль, 2002); науковій конференції “Актуальні проблеми експериментальної медицини” (Київ, 2002); IV міжнародній конференції по функціональній нейроморфології “Колосовские чтения–2002” (С.-Пе-тербург, 2002); міжнародній науковій конференції, присвя-ченій 100-річ-чю з дня народження видатного гістолога кримської ембрі-ологічної школи, доктора медичних наук, професора Б.П. Хватова (Сімферополь, 2002); III національному конгресі АГЕТА України (Київ, 2002).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 13 робіт з них 7 статей у наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК України; отримано Патент України та рішення про видачу Патенту України.

Обсяг та структура дисертації. Робота викладена на 175 сторінках машинописного тексту (обсяг тексту основної частини 135 c.) і складається з вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали та методи досліджень”, розділу власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків та списку використаних літературних джерел. Робота ілюстрована 19 мікрофотографіями, 38 електронограмами, 5 графіками і 2 таблицями. Список літератури містить 315 джерел (вітчизняних та іноземних).

_______________________________________________________________________

* Автор висловлює подяку за допомогу при виконанні експериментальної частини дисертації проф. Стеченко Л.О., доцентам кафедри гістології та ембріології Терещенко Т.Л. та Раскалєю В.Б., співробітникам НДЛЦ.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Експериментальні спостереження були проведені на 120 білих щурах вагою 150-200 г. Тварини цього виду найчастіше використовуються для вивчення регенерації периферійних нервів (Artur S.P. Varejгo, Marcel F. Meek, Antуnio J.A. et al., 2001). ?ідничі нерви людини і білого щура за принципом внутрішньої будови є ізоморфними формаціями периферійної нервової системи (Старченко І.І., 2000), а відмінності між ними полягають у кількісному складі нервових пучків. Експериментальні тварини були розподілені на 5 груп (табл. 1).

Перша група – інтактні тварини (10 щурів), показники будови яких були використані для оцінки відновлення ушкоджених нервів.

Друга група 30 щурів, яким введення фізіологічного розчину проводили при мікрохірургічній алонейропластиці сідничого нерва безпосередньо після ушкодження.

Третя група включала 25 щурів, яким введення ліпіну проводили при мікрохірургічній алонейропластиці сідничого нерва безпосередньо після ушкодження.

Четверта група 30 щурів, яким введення фізіологічного розчину проводили при мікрохірургічній алонейропластиці сідничого нерва через 2 тижні після травми.

П’ята група включала 25 щурів, яким введення ліпіну проводили при мікрохірургічній алонейропластиці сідничого нерва через 2 тижні після ушкодження.

Ще 25 тварин використані в якості донорів для отримання нейротрансплантатів.

Всі оперативні втручання проводили з дотриманням правил асептики та антисептики. Використовували гексеналовий наркоз з попередньою премедикацією дроперидолом і анальгіном.

Мікрохірургічну алонейропластику тваринам другої та третьої груп здійснювали в такий спосіб: виконували оперативний доступ до правого сідничого нерва, останній мобілізували і перетинали відповідно до рекомендацій Максименкова А.Н. (1953). Нерв перетинали на рівні його середньої третини і вилучали фрагмент довжиною 2 см. Здійснювали гемостаз. Алонейропластику виконували під оптичним збільшенням 10x. Застосовували мікрохірургічні інструменти: мікропінцети, мікроножиці, мікроголкотримач.

Кінці розмороженого трансплантата з довжиною, відповідною утвореному діастазу, з’єднували з відрізками нерва епіневральними швами. Нейрорафію проводили за допомогою ниток 10/0 на атравматичній голці.

Таблиця 1

Розподіл тварин за групами залежно від термінів дослідження

Експериментальні групи | Термін дослідження (тижні) | Всього

1 | 3 | 6 | 12

Інтактні тварини |

5 | 5

Мікрохірургічна алонейропластика сідничого нерва проведена безпосередньо після ушкодження | 5 | 5 | 5 | 10 | 25

Мікрохірургічна алонейропластика сідничого нерва проведена безпосередньо після ушкодження та введення ліпіну | 5 | 5 | 10 | 20

Мікрохірургічна алонейропластика сідничого нерва проведена через 2 тижні після травми | 5 | 5 | 5 | 10 | 25

Мікрохірургічна алонейропластика сідничого нерва проведена через 2 тижні після ушкодження та використання ліпіну | 5 | 5 | 10 | 20

Всього | 10 | 20 | 20 | 40 | 95

Використовували монофіламентні нитки (проленові або етилонові) фірми “Ethicon”. Здійснювали ретельний гемостаз, рану зрошували розчином антибіотиків і зашивали наглухо.

Кріоконсервація полягала в обробці нервових стовбурів спеціальним кріозахисним середовищем з наступним заморожуванням їх при температурі рідкого азоту (-196°С). При підготовці трансплантата донорам вводили летальну дозу гексеналу (200 мг/кг). Через 3-4 години після смерті сідничі нерви відсікали з дотриманням правил асептики й антисептики і занурювали на 1 годину в стерильну, охолоджену до +4°С рідину, що містила 15% гліцерину, 15% аутосироватки крові і 70% середовища 199. Далі трансплантати переносили в контейнер, заповнений кріозахисною рідиною вищезгаданого складу. Після герметизації контейнери занурювали в рідкий азот.

Через 3-4 тижні збереження в рідкому азоті зразки з нейротрансплантатами підігрівали на водяній лазні (+42°С). Ділянки сідничих нервів відмивали двічі в розчині Хенкса протягом 30 хв., після чого їх використовували для трансплантації.

Тваринам четвертої та п’ятої груп на першому етапі був зроблений дефект правого сідничого нерва довжиною 2 см таким же чином, як у другій та третій групах. Через 14 діб проводили другий етап операції. Здійснювали доступ до ушкодженого нерва. Нерв звільнювали від новоутвореної сполучної тканини та підшивали трансплантат так само, як у попередніх групах. Кріоконсервацію проводили тим же способом. Здійснювали ретельний гемостаз, рану зрошували розчином антибіотиків і зашивали пошарово наглухо.

Усі рани тварин після операції загоїлись первинним натягом. Тварини знаходились у віварії на звичайному раціоні, летальних випадків не спостерігалось.

Тваринам третьої та п’ятої груп через два тижні після оперативного втручання щодобово, протягом 10 діб, вводили підшкірно в ділянці нижньої третини стегна суспензію ліпіну у дозі 16-18 мг/кг.

Тваринам другої та третьої груп через два тижні після оперативного втручання щодобово, протягом 10 діб, вводили підшкірно в ділянці нижньої третини стегна фізіологічний розчин.

Матеріалом для дослідження були трансплантати з прилеглими відрізками (центральним, або проксимальним і периферійним, або дистальним) ушкодженого сідничого нерва та великогомілковий нерв через 7, 21, 42, 84 доби після трансплантації. Перед забором матеріалу тваринам вводили надлишкову дозу гексеналу (200 мг/кг), а для електронної мікроскопії летальну дозу ефіру.

Для світлооптичної мікроскопії матеріал фіксували у 10%-му розчині формаліну, промивали та отримували зрізи на заморожуючому мікротомі, які потім імпрегнували азотнокислим сріблом за Рассказовою. Для вивчення сполучної тканини препарати забарвлювали азур II-еозином.

Для стереологічного аналізу використовували напівтонкі поперечні зрізи нервів, виготовлені на ультратомі LКB і забарвлені толуїдиновим синім. Морфометричні дослідження, в основі яких лежать принципи стереометрії, (Лакин Г.Ф., 1973; Автандилов Г.Г. и др., 1981) проводили за допомогою напівавтоматичного пристрою для обробки графічних зображень.

У даному дослідженні визначали такі величини: об’єм волокон в об’ємі нерва (%), кількість нервових волокон в одиниці об’єму нерва (мкм3), площу поперечного зрізу нервового волокна (мкм2), площу поперечного зрізу осьового циліндру (мкм2), товщину мієлінової оболонки (мкм2).

При статистичному аналізі морфометричних даних обчислювали середні значення величин, середнє квадратичне відхилення, похибку середньої, коефіцієнт варіації і коефіцієнт точності визначення середньої у відповідності з рекомендаціями (Урбах В.Ю., 1964; Лакин Г.Ф, 1973). Порівняння отриманих результатів проводили за допомогою параметричного критерію Стьюдента. З метою оцінки співвідношення трьох типів мієлінових нервових волокон (за розміром) використовували непараметричний критерій КолмогороваСмірнова. Для виявлення зв’язків у змінах площ поперечних зрізів мієлінового нервового волокна, осьового циліндру та мієлінової оболонки використовували кореляційний аналіз. Препарати тонких і напівтонких зрізів фотографували за допомогою цифрової фотокамери та мікроскопу “Олімпус”.

Для електронно-мікроскопічного дослідження невеликі фрагменти дистальних відрізків великогомілкового нерва фіксували в 1%-му розчині чотирьохокису осмію за Колфільдом протягом 2 годин при температурі 4С. Об’єкти зневоднювали в етанолі зростаючої концентрації, в ацетоні і заливали в суміш епону з аралдитом за загальноприйнятою методикою (Бирюзова В.И. и др., 1963; Карупу В.Я., 1984). Ультратонкі зрізи одержували на ультратомі LKB-8800 (Швеція) в поздовжній та поперечній проекціях нерву, контрастували їх 2%-им розчином уранілацетату в 70-50%-му етанолі протягом 15 хвилин і азотнокислим свинцем стільки ж часу, а потім зрізи вивчали та фотографували в електронному мікроскопі ЭМВ 125К.

Результати дослідження та їх обговорення. Дані, отримані при імпрегнації регенеруючого нерва нітратом срібла, свідчать, що у тварин, яким проводили мікрохірургічну пластику нервового стовбура алотрансплантатом відразу ж після його перерізки, невротизація пересадженого фрагмента є досить рівномірною.

В ділянці проксимального відрізка нерва невротизація відбувається швидше й більш рівномірно, ніж у той же термін при алопластиці через 2 тижні після ушкодження.

У дистальний відрізок проникають тонкі новоутворені аксони у коротший термін, а сполучної тканини менше, порівняно з групами тварин з відстроченою алонейропластикою.

Проведений морфометричний аналіз свідчить, що в групах з пластикою безпосередньо після ушкодження кількість нервових волокон значно перевищує аналогічні показники при відстроченій алопластиці. Причому, через 6 тижнів після пластики, яка була проведена відразу після ушкодження, цей показник вдвічі більший, ніж при відстроченій алопластиці. Збільшення об’єму волокон відбувається, головним чином, за рахунок підвищення їх кількості, тоді як їх розміри не демонструють такої вираженої різниці і, на відміну від контрольного показника, статистично подібні в усіх групах порівняння (рис. 1).

Рис. 1. Графік змін стереологічних показників дистального відділу великогомілкового нерва. По осі абсцис – групи досліджень та терміни, по осі ординат – величини показників: (R) об’єм волокон та (Nj) кількість нервових волокон в одиниці об’єму нерва, площі поперечних зрізів нервового волокна (Sm), осьового циліндру (So), мієлінової оболонки (Sm).

Водночас аналіз розподілу типів волокон за площею свідчить про суттєву різницю в співвідношенні волокон за розмірами, а саме: в групі з відстроченою пластикою переважну більшість становлять дрібні, а в строк 6 тижнів спостерігали повну відсутність крупних волокон (рис. 2). При дослідженні відновлення нервово-м’язових взаємовідносин при оперативних втручаннях безпосередньо після ушкодження також спостерігали більш швидке утворення нервово-м’язових синапсів, ніж при відкладених втручаннях (Чайковський Ю.Б., Сокуренко Л.М., Яценко В.П., Моніна Н.Я., 2002).

Рис. 2. Розподіл мієлінових волокон залежно від значень площ їх поперечних зрізів. По осі абсцис – експериментальні групи та терміни, по осі ординат – кількість волокон відповідного діаметру, %.

Електронномікроскопічне дослідження демонструє, що при алопластиці безпосередньо після ушкодження спостерігали набагато більшу кількість мієлінових нервових волокон, дегенеративні зміни деяких волокон і розплавлення мієліну з утворенням ліпідного комплексу зустрічали рідше, порушення структурованості мієліну не було так поширене, як при відстроченій алонейропластиці. При останній спостерігали посилення реакцій сполучнотканинних елементів: збільшення кількості активних фібробластів і макрофагів, накопичення в ендоневрії колагенових та еластичних волокон. Мали місце явища склерозування, які виражені мінімально при алопластиці безпосередньо після ушкодження.

Невротизація периферійного відрізка великогомілкового нерва та мієлінізація новоутворених нервових волокон далеко не завжди відбуваються задовільно і не завжди ведуть до відновлення втрачених функцій, що залежить від багатьох причин. Найбільш поширеною з цих причин є триваліший час денервації, що призводить до дегенеративних змін і заміщення сполучною тканиною денервованих структур. Однак ці дані неоднозначно представлені в літературі. Деякі автори вважають, що регенерація ушкоджень периферійних нервів значно поліпшується при відкладеному шві (Бочкарьов Н.П., Стадніков В.В., 1984). На думку інших, при цьому важко очікувати добрі результати відновлення провідності нерву (Горбунова В.Г., 1972, 1975), оскільки феномен денервації призводить до різноманітних загальних та локальних порушень нервово-м’язового апарату (Нечипуренко Н.И., 1997). У зв’язку з цим у наших дослідженнях вибрані строки оперативного втручання безпосередньо та через 2 тижні після нейротомії, що моделює лікування ушкоджень нервів у людини через декілька місяців після травми, оскільки строки життя щурів набагато менші.

Отримані дані свідчать, що алопластика дефекту нервового стовбура відразу ж після ушкодження краще сприяє невротизації його периферійного відрізка, ніж відновлення безперервності нерва у віддалені строки.

Дані імпрегнації нітратом срібла свідчать, що в групах з використанням ліпіну відбувається більш рівномірна невротизація трансплантата порівняно з відстроченим оперативним втручанням. У ділянці проксимального відрізка нерва невротизація проходить швидше та більш рівномірно, ніж у той же термін при алопластиці через 2 тижні після ушкодження.

Новоутворені осьові циліндри в більшій кількості проникають в периферійний відрізок нервового стовбура, спостерігається більше зрілих нервових волокон, їх розміщення більш упорядковане, порівняно з групами без фармакологічного лікування. В групах з відстроченою алонейропластикою та використанням ліпіну сполучна тканина виражена менше, порівняно з групами без консервативного впливу.

При морфометричному аналізі відмічали більші об’єм і кількість мієлінових нервових волокон у групах з використанням препарату. Збільшення об’єму волокон в одиниці об’єму нерва відбувається, головним чином, за рахунок підвищення їх кількості, тоді як їх розміри не демонструють таких виражених відмінностей (рис. 1). Але кількість товстих мієлінових волокон і збільшення кількості середніх у групах з консервативною терапією свідчить про їх більш швидке відновлення, а саме: співвідношення дрібних, середніх та великих за розмірами волокон в групі з оперативним втручанням відразу після ушкодження та з використанням ліпіну практично співпадає з показниками контролю (рис. 2). В групі з відстроченою алопластикою, де не використовували ліпін, переважну більшість становлять дрібні волокна, а в ранній строк спостерігали повну відсутність великих волокон. При застосуванні консервативної терапії співвідношення волокон за розміром хоча і не повторює контрольні показники, але не так суттєво відрізняється від них, кількість великих волокон збільшується.

Електронномікроскопічне дослідження свідчить, що у тварин з алонейропластикою за умов консервативної терапії спостерігається більше мієлінових волокон, мієлінова оболонка яких товща, ніж у тварин з пластикою без ліпіну. Новоутворені мієлінові нервові волокна знаходяться в оточенні активних клітин Шванна. У групах з відстроченою алонейропластикою та фармакологічним впливом кількість сполучної тканини зменшується, порівняно з групами без використання ліпіну. Макрофаги у великогомілковому нерві експериментальних груп, які отримували ліпін, включають ліпідні гранули, локалізовані в цитоплазмі тіл клітин та їх відростках, які безпосередньо прилягають до клітин Шванна. Жирові краплі в деяких випадках оточують нейролемоцити з боку базальної мембрани, що можна трактувати, як використання препарату із депо з наступним утворення нашарувань мієліну.

Безпосередня пластика сприяє більш швидкому вростанню мієлінових нервових волокон, але ступінь їх дозрівання залишається приблизно однотипним. У зв’язку з цим є доцільним використання засобів, прискорюючих морфофункціональне дозрівання нервових волокон, що регенерують. Спроби поліпшити регенерацію нервів були спрямовані на нервові центри та ділянку ушкодження, на зміни в сполучній тканині (Жук О.Н., Калюнов В.Н., 1996.), в невромі (Чайковский Ю.Б., 1996). У той же час є дуже мало робіт, в яких би вивчався вплив лікарських препаратів на дистальні відділи ушкодженого нерва, зокрема на процес мієлінізації новоутворених нервових волокон, від чого залежить швидкість проведення по них імпульсів. Оскільки основним субстратом морфологічного та функціонального відновлення нервового стовбура є мієлінові нервові волокна, то з метою прискорення мієлінізації застосовували ліпін. Це – ліпосомальний препарат природного фосфатидилхоліну, який є однією з основних структур клітинної мембрани, концентричні нашарування якої утворюють мієлінову оболонку (Jean E. Vance, Robert B. Campenot, 2000). У попередніх дослідах (Чайковський Ю.Б., Літус В.І., Стефанов О.В., Галич С.П., 1998) було з’ясовано, що ліпін забезпечує зменшення проявів асептичного запалення та більш рівномірне дозрівання сполучної тканини в ділянках невральних анастомозів. Це, в свою чергу, полегшує проростання регенеруючих аксонів у периферійний відрізок ушкодженого нерва. Наші досліди довели, що ліпін направлено впливає на процес мієлінізації нервових волокон. При цьому препарат вводили щодобово протягом 10 діб підшкірно через два тижні після оперативного втручання, чим забезпечувалось утворення депо ліпіну до початку процесів мієлінізації в нервових волокнах (Нечипуренко Н.И., 1997).

Результати нашого дослідження вказують на те, що у тварин з алонейропластикою безпосередньо після травми та з введенням ліпіну процеси регенерації периферійного нерва відбуваються значно краще, ніж у тварин з пластикою безпосередньо після травми без фармакологічного лікування. У тварин з відстроченою нейропластикою також прискорюються процеси регенерації при використанні консервативної терапії, і хоча вони не такі інтенсивні, як у групах з нейропластикою відразу після травми із застосуванням ліпіну, але наближаються до регенераційної картини останньої моделі без постопераційних заходів.

При вивченні ушкодженого нерва по всій довжині спостерігали відповідність процесів, що відбувались у трансплантаті й анастомозах таким, що мали місце у периферійному відрізку нерва. У всіх серіях дослідів темпи дегенерації передіснуючих нервових волокон у дистальному відрізку перевищують ті, що відбуваються в трансплантаті.

Регенеруючі аксони спостерігали у всіх експериментальних групах в трансплантаті та анастомозах у більш ранні строки. В дистальних відрізках нерва невротизація відбувається в пізні терміни після проростання великої кількості нервових волокон вздовж трансплантата та анастомозів.

Візуально діаметр осьових циліндрів збільшується мірою зростання часу відновлення, але завжди більше в нейротрансплантаті та анастомозах, ніж у дистальному відділі великогомілкового нерва. Спостерігається відповідність між кількістю колатеральних гілочок, що направлені у бік регенераційної невроми, та їх упорядкування, порівняно з кількістю нервових волокон, які вросли з дистального кінця трансплантата в периферійний відрізок.

Кількість колб росту, мірою збільшення терміну дослідження, в анастомозах зменшується, водночас їх кількість у периферійному відрізку збільшується, що свідчить про потенції росту осьових циліндрів.

Нервові волокна отримують мієлінову оболонку спочатку в проксимальних відділах, а в більш пізні строки в дистальних. У той час, коли у проксимальному відділі з’являються волокна з мієліновими оболонками великої та середньої товщини, у дистальних відділах виявляли тільки новоутворені тонкі мієлінові волокна.

Таким чином, можна стверджувати, що існує кореляція між процесами, які відбуваються в трансплантаті та анастомозах і дистальному відрізку, що позначається на відновленні функцій всього нерва та нейро-м’язових взаємовідносинах. Ця залежність зберігається і при наявності факторів, що впливають на регенерацію нерва. Якщо алонейропластику проводили безпосередньо після травми та використовували ліпін, то регенерація відбувалась інтенсивніше по всій довжині нервового стовбура.

Висновки

1. В дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, яка полягає у з’ясуванні закономірностей невротизації та мієлінізації нервових волокон у периферійному нерві за умов мікрохірургічної алонейропластики, проведеної в різні терміни після ушкодження, і з використанням ліпіну.

2. У тварин з алонейропластикою, проведеною безпосередньо після травми сідничого нерва, спостерігається відновлення більшої частини нервових волокон дистального відрізка. У віддалений термін спостереження (3 місяці після оперативного втручання) у великогомілковому нерві об’єм мієлінових нервових волокон в одиниці об’єму нерва дорівнює 14,80,5% (порівняно з 39,03,5% у контрольній групі), а кількість мієлінових нервових волокон в одиниці об’єму нерва становить 2,80,04Ч10-4/мкм3 (у контрольній групі 3,40,08Ч10-4/мкм3).

3. У тварин, яким алонейропластика виконана безпосередньо після травми та вводився ліпін, спостерігаються кращі результати щодо регенерації периферійного нерва, ніж у тварин, яким ліпін не вводили. Це характеризується достовірно більшими об’ємом (28,10,2%) та кількістю (3,10,05Ч10-4/мкм3) мієлінових нервових волокон в одиниці об’єму нерва, достовірно більшою кількістю крупних за діаметром мієлінових нервових волокон, ніж у групі, де ліпін не використовувався.

4. У віддалені строки після проведення алонейропластики відновлення травмованого сідничого нерва відбувається повільніше, ніж після заміщення його дефекту відразу ж після ушкодження. Це характеризується достовірно меншим об’ємом (6,20,5%) та кількістю мієлінових нервових волокон (2,60,04Ч10-4/мкм3) в одиниці об’єму нерва. Крупні за діаметром мієлінові нервові волокна на 6-му тижні після операції не виявляються.

5. У моделі з відстроченою нейропластикою травмованого нерва використання ліпіну також поліпшує процеси регенерації. Кількісні показники відновлювального процесу наближуються до таких у тварин з алонейропластикою, проведеною безпосередньо після травми без фармакологічного впливу, але є менш вираженими, порівняно з такими при нейропластиці відразу після травми із застосуванням ліпіну. У віддалений строк спостереження у групі з відстроченою нейропластикою із застосуванням фармакологічного впливу у великогомілковому нерві об’єм нервових волокон в одиниці об’єму нерва дорівнює 14,40,7%, а кількість нервових волокон в одиниці об’єму нерва становить 2,90,08Ч10-4/мкм3.

6. Між відновлювальними процесами в трансплантаті та нейральних анастомозах і процесами проростання нервових волокон через дистальний відрізок та їх мієлінізацією існує залежність, яка позначається на відновленні всього нерва. Ця залежність зберігається і при наявності факторів, що впливають на регенерацію нерва. Якщо алонейропластика проводилась одразу після травми і використовувався ліпін, то регенерація відбувалась інтенсивніше по всій довжині нервового стовбура.

7. З’ясування реактивних властивостей регенеруючих тканин з урахуванням дегенераційно-денерваційних процесів, які переважають при ушкодженнях з великими дефектами нерва та при втраті часу після травми, дає змогу впливати на перебіг відновлювальних процесів для досягнення оптимального кінцевого результату.

8. Отримані результати демонструють, що застосування ліпіну після алонейропластики кріоконсервованим трансплантатом периферій-ного нерва покращує результати відновлення останнього і розширює уявлення про можливість фармакологічної стимуляції регенерації нервових стовбурів.

9. Покращення показників, які характеризують регенерацію периферійного нерва під впливом ліпіну, є передумовою розробки способів поліпшення відновлення нерва в клінічній практиці з метою прискорення мієлінізації ушкоджених нервів.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Чайковський Ю.Б., Мельник Н.О., Сокуренко Л.М., Моні-на Н.Я., Грабовий О.М. Вплив нейромедіаторів, ліпіну та лазеротерапії на регенераторні процеси в нервовій системі в умовах демієлінізації та травми // Український медичний альманах. - Івано-Франківськ, 2000. - Т. 3. - №3. - С. 175-177. (Автором самостійно проаналізована спеціальна література, проведені експеримент, гістологічна обробка матеріалу, аналіз отриманих даних і написання фрагменту роботи по вивченню впливу ліпіну на регенераторні процеси в периферійних нервах за умов їх травми).

2. Сокуренко Л.М., Раскалєй В.Б., Терещенко Т.Л. Особливості регенерації сідничого та великогомілкового нервів при алопластиці в різні терміни після пошкодження // Буковинський медичний вісник. - Чернівці, 2001. - №1-2. - С. 159-160. (Автором самостійно проаналізована спеціальна література, проведені експеримент, гістологічна обробка матеріалу, обробка та аналіз отриманих даних і написання роботи).

3. Сокуренко Л.М. Регенерація великогомілкового нерва при відстроченій алопластиці з використанням консервативної терапії // Галицький лікарський вісник. - Івано-Франківськ, 2002. - Т. 9. - №2. - С. 80-83.

4. Сокуренко Л.М. Ультраструктурні зміни в дистальному відділі великогомілкового нерва після трансплантації сідничого нерва // Український науково-медичний молодіжний журнал. - К., 2002. - №1-2. - С. 63-66.

5. Чайковский Ю.Б., Сокуренко Л.М., Стеченко Л.А. Ультраструктурная организация нейролеммоцитов после трансплантации периферического нерва // Таврический медико-биологический вестник. - Симферополь, 2002. - Т. 5. - №3. - С. 168-169. (Автором самостійно проаналізована спеціальна література, проведені експеримент, обробка матеріалу та отримання електронних мікрофотографій, аналіз даних і написання роботи).

6. Сокуренко Л.М., Куфтирєва Т.П., Раскалєй В.Б., Козак Г.І. Морфометричні аспекти сідничого нерва при алонейропластиці в різні терміни після пошкодження // Вісник морфології. - 2002. - Т. 8. - №1. - С. 17-19. (Автором самостійно проаналізована спеціальна література, проведені експеримент, гістологічна обробка матеріалу, статистична обробка та аналіз отриманих даних і написання роботи).

7. Чайковський Ю.Б., Сокуренко Л.М., Терещенко Т.Л, Скибін-ська Т.Р. Морфометричне дослідження регенерації великогомілкового нерва за умов алонейропластики та стимуляції мієліногенезу. // Медицина сьогодні і завтра. - Харків, 2002. - №2. - С. 15-18. (Автором самостійно проаналізована спеціальна література за темою дисертації, проведені експеримент, гістологічна обробка матеріалу, статистична обробка та аналіз отриманих даних і написання роботи).

8. Патент №47945 А, Україна, МПК А61К9/127 Спосіб лікування пошкоджень периферичних нервів / Сокуренко Л.М., Чайковський Ю.Б., Раскалєй В.Б., Терещенко Т.Л. Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця - №2001118009; Заявл. 23.11.2001. Опубл.: Промислова власність. Офіційний бюлетень. - 2002. - №7.- Кн. 1.- С.4.23. (Автором самостійно проаналізована спеціальна література, проведені експеримент, гістологічна обробка матеріалу, статистична обробка та аналіз отриманих даних і написання роботи).

9. Сокуренко Л.М., Раскалей В.Б., Терещенко Т.Л., Чайковский Ю.Б. Морфометрический анализ регенерации большеберцового нерва при пластике седалищного нерва в условиях стимуляции миелино-генеза. Колосовские чтения – 2002. - Санкт-Петербург, 2002. - С. 269.

10. Сокуренко Л.М., Чайковський Ю.Б., Раскалєй В.Б. Реіннервація м’язів нижньої кінцівки щурів із застосуванням алотрансплантатів. Актуальні проблеми експериментальної медицини.
- Київ, 1999. - С. 27-28.

11. Сокуренко Л.М., Раскалєй Д.В. Морфометричний аналіз регенерації великогомілкового нерва при алонейропластиці в різні терміни після пошкодження. VI наукова конференція студентів та молодих вчених. - Тернопіль, 2002. - С. 283-284.

12. Сокуренко Л.М., Раскалєй В.Б., Терещенко Т.Л. Актуальні питання морфології. Наукові праці III національного конгресу АГЕТА України. Київ 2002 р. - Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. - С. 337-338.

13. Чайковський Ю.Б., Сокуренко Л.М., Яценко В.П., Моніна Н.Я. Особливості мієлінізації та синаптогенезу при різних видах нейропластики (морфометричне дослідження) // Актуальні проблеми експериментальної медицини. - Київ, 2002. - С. 15-16.

АНОТАЦІЯ

Сокуренко Л.М. Регенерація периферійного нерва в умовах нейропластики, проведеної в різні терміни після пошкодження та стимуляції мієліногенезу. Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.09 – гістологія, цитологія та ембріологія. Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, Київ, 2003.

Дисертація присвячена вивченню регенерації та ремієлінізації периферійних нервів в залежності від термінів оперативних втручань. Завдяки застосуванню сучасних методів морфологічних, електронномікроскопічних та статистичних досліджень вивчено відновлення сідничого та великогомілкового нервів по всій їх довжині. Встановлена залежність між регенерацією в центральних та проксимальних відрізках нерва. Вивчено вплив ліпіну на регенерацію та ремієлінізацію нервових волокон.

Отримані дані виявились теоретичною основою для розробки відновлювальної терапії пошкоджених нервових стовбурів.

Ключові слова: регенерація нерва, великогомілковий нерв, сідничий нерв, денервація, алотрансплантація, мієлін, ліпін.

АННОТАЦИЯ

Сокуренко Л.М. Регенерация периферического нерва в условиях нейропластики, проведенной в разные сроки после повреждения и стимуляция миелиногенеза. Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.09 – гистология, цитология и эмбриология. Национальный медицинский университет им. А.А. Бого-мольца, Киев, 2003.

Исследование проводилось на 120 белых беспородных крысах. В соответствии с задачами исследования экспериментальным животным была проведена аллотрансплантация криоконсервированным транс-плантатом непосредственно и через 2 недели после травмы, и те же группы с использованием липина. Для сравнения использовали группу контроля. Материал забирался через 1, 3, 6 и 12 недель. Исследовались срезы седалищного и большеберцового нервов, импрегнированные нитратом серебра. Дистальные отрезки большеберцового нерва изучали с помощью стереологического анализа полутонких поперечных срезов нервов и метода электронной микроскопии.

Анализ литературы и проведенные исследования показали, что микрохирургическая аллонейропластика криоконсервованным транс-плантатом может быть использована как метод лечения травм периферических нервов с возникновением больших дефектов этих органов. Представленный способ моделирования травмы дает возможность экстраполировать результаты восстановления нервов к клиническим показателям. Полученные данные являются предпосылками для разработки способов улучшения восстановления периферических нервов после их повреждения.

Большое значение имеет и другой фактор, задерживающий регенерацию нерва: более длительное время денервации, которая приводит к дегенеративным изменениям и замещению соединительной тканью денервированных структур. Во всех сериях исследований темпы дегенерации предсуществующих волокон на ранних стадиях восстановления нерва практически одинаковы, однако в более поздних сроках в группах с аллонейропластикой, проведенной через 2 недели после повреждения, они задерживаются. Наблюдали также их ускорение в группах с использованием липина.

Эти результаты указывают на то, что у животных с аллонейропластикой непосредственно после травмы и с введением липина наблюдали лучшие результаты регенерации периферического нерва, чем у животных с пластикой непосредственно после травмы без фармакологического лечения. У животных с отсроченной нейропластикой также ускорялись процессы регенерации при использовании консервативной терапии. Хотя они не такие интенсивные, как в группах с нейропластикой сразу после травмы, но приближаются к регенерационной картине последней модели без послеоперационных мероприятий.

Полученные результаты демонстрируют, что использование липина после аллонейропластики криоконсервированным транс-плантатом периферического нерва улучшает результаты восстановления последнего и расширяет представления о возможностях фармакологической стимуляции регенерации нервных стволов.

Улучшение показателей, которые характеризуют регенерацию периферического нерва под влиянием липина, является предпосылкой разработки способов улучшения восстановления нерва в клинической практике с целью ускорения миелинизации поврежденных нервов.

Ключевые слова: регенерация нерва, большеберцовый нерв, седалищный нерв, денервация, аллотрансплантация, липин.

Summary

Sokurenko L.M. Regeneration of the peripheral nerve in condition of neuroplasty, carried out in different period after the injury and stimulated myelination. Manuscript.

The dissertation on competition of a scientific degree of the candidate of medical sciences on a speciality