ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМ. В.Н.КАРАЗІНА

Духопельников Євген Володимирович

УДК 577.32

МОЛЕКУЛЯРНІ МЕХАНІЗМИ ВЗАЄМОДІЇ НОВИХ АНТИБІОТИКІВ АКТИНОЦИНОВОГО РЯДУ З МАТРИЦЯМИ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ

03.00.02 – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Харків - 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті радіофізики та електроніки ім. О.Я.Усикова НАН України

Науковий керівник:

доктор фізико-математичних наук, професор

Семенов Михайло Олексійович, Інститут радіофізики та електроніки

ім. О.Я.Усикова НАН України, старший науковий співробітник (м.Харків).

Офіційні опоненти:

-Доктор фізико-математичних наук, професор Сорокін Віктор Олександрович, Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН України, провідний науковий співробітник, спеціальність 03.00.02 – біофізика;

-Кандидат фізико-математичних наук, доцент Пахомов Валерій Інокентійович, Севастопольський національний технічний університет МОН України, доцент, спеціальність 03.00.02 – біофізика;

Провідна установа:

Інститут теоретичної фізики ім. М.М. Боголюбова НАН України м. Київ.

Захист відбудеться 01.04.2005 року о 13-30 __ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному університеті ім. В.Н.Каразіна, 61077, м.Харків, пл.Свободи, 4, ауд.7-4.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна: 61077, м.Харків, пл.Свободи, 4.

Автореферат розісланий 27.02.2005 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Пошук нових біологічно активних речовин, що мають протипухлинну активність, є актуальною проблемою молекулярної біофізики та фармакології. До таких сполук належать похідні актиноцину. Молекулярна основа дії біологічно активних речовин цього ряду зумовлена їх взаємодією з ДНК. Сполуки актиноцинового ряду, що містять феноксазоновий хромофор та відрізняються лише кількістю метильних груп у бокових ланцюгах, нещодавно синтезовано у Санкт-Петербурзькому державному технічному університеті. Їх біологічну активність було показано у відділі гематології, онкології та пухлинної імунології університету Гумбольдта (Берлін). Однак природа різниці біологічної активності в ряді похідних актиноцину залишається нез’ясованою. Для вивчення зв'язку біологічної активності цих речовин з фізичними характеристиками (типи та енергії взаємодії) та особливостями структури комплексів, потрібні систематичні дослідження впливу довжини аміноалкільних ланцюжків у бокових радикалах похідних актиноцину на структуру та стабільність їх комплексів з різними структурами нуклеїнових кислот (НК).

У нинішній час добре відомо, що нативна структура нуклеїнових кислот (НК) формується та значною мірою стабілізується взаємодією з молекулами води. Тому при вивченні комплексів НК-похідні актиноцину потрібно враховувати не лише гідратацію вихідних компонентів, а і вплив води на стабільність комплексів.

З даних УФ та видимої спектроскопії відомо, що похідні актиноцину можуть утворювати декілька типів комплексів з НК: інтеркаляція, зв’язування у малому жолобку і зовнішнє зв’язування за рахунок електростатичної взаємодії з сахарофосфатним ланцюгом. Проте структурні та енергетичні характеристики таких комплексів вивчено недостатньо.

Щоб отримати такі дані, в роботі досліджувались одно- та двоспіральні структури poly(rC), з якими похідні актиноцину утворюють комплекси тільки за типом зовнішнього зв'язування, а також ДНК з тимуса теляти, з якою можливе утворення комплексів, специфічних до нуклеотидної послідовності.

Відомо, що при зв’язуванні з лігандами стабільність НК змінюється. Для розуміння природи впливу ліганда на стабільність нуклеїнових кислот потрібні дані про енергетичні параметри взаємодії у таких системах. Це дозволить встановити зв’язок між структурою комплексу, його стабільністю та біологічною активністю лікарського препарату.

Зв’язок дисертації з науковими програмами, планами, темами. Дисертацію було виконано в рамках держбюджетної наукової тематики відділу біофізики Інституту радіофізики і електроніки ім. О.Я. Усикова „Фізичні механизми взаємодії новосинтезованих біологічно активних речовин з гідратованою ДНК” (Шифр “Ліганд”, №0100U006336, постанова Бюро ОФА НАН України від 24.10.2000, протокол №9, 2001-2003 р.) і міжнародного гранту INTAS’97, грант 31753 “Design, synthesis and testing of novel biologically-active molecules as potential drugs with sequence-specific binding to nucleic acids”, 1999-2002.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було виявлення молекулярних механізмів взаємодії біологічно активних похідних актиноцину з полінуклеотидними матрицями, визначення стабільності цих комплексів і внеску енергій різних типів взаємодії, зокрема, взаємодії з гідратним оточенням, у загальну енергію стабілізації комплексу.

Для досягнення поставленої мети вирішувався наступний ряд задач:

· Експериментальне та теоретичне дослідження ІЧ спектрів лігандів (похідних актиноцину) та виконання віднесень основних смуг поглинання.

· ІЧ спектроскопічне визначення функціональних груп ДНК та лігандів, що беруть участь в утворенні комплексів за типом інтеркаляції та зовнішнього зв’язування, а також виявлення спектральних особливостей цих типів комплексів.

· Визначення центрів гідратації лігандів та їх комплексів з poly(rC) та ДНК, а також енергії взаємодії з молекулами води методами ІЧ спектроскопії та п’єзогравіметрії.

· Оцінка внеску енергії гідратації в загальну енергію стабілізації комплексів на підставі результатів, що отримано методами мікрокалориметрії та п’єзогравіметрії.

Об’єкт дослідження – ряд похідних актиноцину: актиноцил-біс-(3-диметиламіноетил) амін (Actактиноцил-біс-(3-диметиламінопропіл) амін (Actактиноцил-біс-(3-диметиламінобутил)амін (Actактиноцил-біс-(3-диметиламінопентил)амін (Actа також їх комплекси з одно- та двоспіральною структурами поліцитиділової кислоти (poly(rC)) та ДНК.

Предмет дослідження – структурні та енергетичні параметри комплексів похідних актиноцину з нуклеїновими кислотами, роль гідратації при комплексоутворенні.

Методи дослідження - квантово-хімічні розрахунки було використано для визначення частот нормальних коливань груп атомів феноксазонового хромофору. Метод ІЧ спектроскопії було використано для дослідження структури та визначення центрів гідратації комплексів НК – похідні актиноцину. Метод диференціальної скануючої мікрокалориметрії було використано для отримання термодинамічних параметрів теплової денатурації НК та їх комплексів з лігандами. Метод п’єзогравіметрії було використано для визначення кількості молекул води, що зв’язуються з комплексами, та для розрахунку енергії гідратації.

Наукова новизна отриманих результатів. У дисертаційній роботі вперше проведено теоретичні розрахунки частот нормальних коливань груп атомів похідних актиноцину - амінофеноксазону та діаміноактиноцину. На підставі характеристичності частот та теоретичних розрахунків виконано віднесення для смуг поглинання феноксазонового хромофору в експериментальних спектрах, які були отримані методом матричної ізоляції і в конденсованому стані.

Досліджено взаємодію похідного актиноцину Actз одно- та двоспіральними структурами poly(rC). Визначено центри зв’язування Actз poly(rC). Отримано енергетичні параметри комплексу, який формується за типом зовнішнього зв’язування. Показано, що ентальпія та ентропія плавлення комплексу менше, ніж відповідні параметри плавлення вільної двоспіральної poly(rC). Визначено енергію гідратації та її внесок у стабілізацію такого комплексу.

Отримано ІЧ спектри комплексів ДНК –V у недейтерованому та дейтерованому стані. Доведено, що взаємодія з лігандом призводить до зміни структури стопок азотистих основ. Виявлено центри гідратації ДНК та похідних актиноцину в комплексах.

Визначено енергію стабілізації комплексів ДНК –V. Встановлено внесок енергії взаємодії комплексів з гідратним оточенням у загальну енергію стабілізації комплексів. Виявлено, що комплекс ДНК –додатково стабілізується утворенням зв’язку між боковими ланцюгами похідного актиноцину та сахарофосфатним ланцюгом ДНК.

Аналіз калориметричних даних показав, що існує кореляція між термостабільністю комплексів ДНК –V та біологічною активністю лігандів.

Практичне значення отриманих результатів. Результати, що отримано, дозволяють встановити зв’язок між молекулярними параметрами біологічно активних речовин, енергетичними параметрами їх комплексів з ДНК, та біологічною активністю, що дозволить дати рекомендації для подальшого синтезу більш ефективних протипухлинних ліків.

Виконані віднесення смуг поглинання феноксазонового хромофору в ІЧ спектрах дозволяють більш точно інтерпретувати спектри комплексів актиноцину з нуклеїновими кислотами, а розраховані геометрія та заряди можуть бути використані для побудови моделей комплексів.

Особистий внесок здобувача. В опублікованих разом зі співавторами наукових працях особистий внесок здобувача полягає в наступному:

- в працях [1, , ] в отриманні ІЧ спектрів, обробці та інтерпретації отриманих результатів;

- в працях [4, ] в проведенні квантово-хімічних розрахунків та виконанні віднесень основних смуг поглинання в ІЧ-спектрах похідних актиноцину;

- в працях [3, , , ] в отриманні ізотерм гідратації та розрахунках енергії гідратації;

- в працях [7, ] в проведенні калориметричних вимірювань, розрахунку термодинамічних параметрів та аналізі отриманих даних.

Апробація роботи. Основні результати досліджень, що ввійшли у дисертацію, було представлено та обговорено на: I обласній конференції молодих науковців “Тобі, Харківщино, - пошук молодих”, Харків, 2002 р.; III з’їзді Українського біофізичного товариства, Львів, Україна, 2002 р.; II Харківській конференції молодих вчених “Радіофізика и НВЧ електроніка ”, Харків, 2002р.; XVI International School-Seminar "Spectroscopy of molecules and crystals", Sevastopol, Ukraine, 2003; III Харківській конференції молодих вчених “Мікрохвильова електроніка і радіолокація”, Харків, 2004 р.; конференції молодих вчених "Фізика Низьких Температур" (КМВ-ФНТ-2004), Харків, 2004 р.; І Українській науковій конференції "Прoблеми бiологiчної і медичної фізики" Xapків, 2004 р.; Семінарі Харківського відділення Українського біофізичного товариства, Харків, 2004.

Публікації. Результати дисертації опубліковано у 12 наукових працях, у тому числі в 4 статтях у наукових журналах, у 8 тезах доповідей на національних та міжнародних конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, 5 розділів та висновків. Повний об’єм дисертації складає 114 сторінок. Робота містить 34 малюнки та 15 таблиць. З них 4 малюнки та 3 таблиці на окремих сторінках. Список використаної літератури (148 найменувань) займає 14 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми дисертації, сформульовано мету та задачі дослідження, показано наукову новизну та практичне значення отриманих результатів.

У розділі 1 проведено аналіз літературних даних про структуру нуклеїнових кислот, різні типи взаємодії нуклеїнових кислот з біологічно активними речовинами та роль води у формуванні та стабілізації структури вільних нуклеїнових кислот та різних типів їх комплексів з біологічно активними речовинами. Особливу увагу приділено розгляду біологічної дії актиноміцину D та його аналогів - актиномінів та аналізу можливих типів їх комплексів з нуклеїновими кислотами. Показано, що структурні та енергетичні параметри комплексів похідних актиноцину Act –з ДНК вивчено недостатньо. На підставі аналізу літературних даних поставлено основні задачі дослідження.

У розділі 2 розглядаються експериментальні та розрахункові методики, а також приведені характеристики об’єктів, що досліджуються.

Для дослідження структури та гідратації комплексів НК _ –використано метод ІЧ спектроскопії завдяки його високій чутливості до міжмолекулярної взаємодії та конформаційного стану НК. У розділі коротко розглянуто фізичну основу методу, приведено віднесення для основних смуг поглинання. Описано методики виготовлення зразків плівок, отримання та обробки ІЧ спектрів. Помилка визначення оптичної щільності складала не більше за 2% , а частот - 1-2см-1.

Для визначення кількості молекул води (n), що зв’язані з НК та комплексами НК  –було використано метод п’єзогравіметрії. Помилка визначення n при повторних вимірюваннях складала у середньому 0,3 молекули води на нуклеотид. З апроксимації експериментальних ізотерм гідратації рівнянням адсорбції Д'Арсі і Ватта були отримані ентальпії гідратації вільних НК та комплексів.

Метод диференціальної скануючої калориметрії було використано для отримання термодинамічних параметрів теплової денатурації комплексів. Помилка при визначенні теплового ефекту при плавленні складала 1%.

Для проведення квантово-хімічних розрахунків оптимізованої геометрії та зарядів за методом Колмана, коливальних спектрів молекул та розподілу потенційної енергії коливань (PED) за природними координатами було використано програму GAMESS. Розрахунки молекул амінофеноксазону (AРh) та діаміноактиноцину (AАct) проводилися методами Хартрі-Фока HF(3-21G*), теорії кореляції електронів Mцller Plesset MP2(3-21G*) і теорії функціоналу щільності DFT/B3LYP(3-21G*).

У роботі досліджувалися одно- та двоспіральна poly(rС), ДНК з тимусу теляти та також похідні актиноцину, структурні формули яких наведено на рис.1.

Рис.1. Структурна формула похідних актиноцину.

Комплекси готувалися у водних розчинах з P/D (відношення кількості молей фосфату до кількості молей ліганду). Калориметричні дослідження проводилися у водних розчинах. Для досліджень методами ІЧ спектроскопії та п’єзогравіметрії готувалися плівки. Дослідження процесу гідратації проводилося за методиками, що були розроблені у відділі біофізики ІРЕ НАНУ.

Розділ 3 присвячено дослідженню структури та гідратації похідних актиноцину. Наведено результати квантово-хімічних розрахунків геометрії та коливальних спектрів похідних актиноцину APh і AAct. На підставі порівняння теоретичних частот з експериментальними ІЧ спектрами цих сполук, що отримані Івановим О.Ю. у низькотемпературних аргонових матрицях, були виконані віднесення основних смуг поглинання в ІЧ спектрі феноксазонового хромофору. Отримані результати наведено у таблиці 1.

В ІЧ спектрах похідних актиноцину в конденсованому стані сильна міжмолекулярна взаємодія призводить до зсуву частот смуг поглинання та їх значного розширення у порівнянні зі спектрами ізольованих молекул, що ускладнює інтерпретацію спектра.

Таблиця 1

Віднесення основних смуг поглинання в ІЧ спектрах APh та AАct, що ізольовані у аргонових матрицях, та дейтерованого Аctу конденсованому стані

(коливання: str–валентні, bend–деформаційні)

Частоти смуг поглинання, см-1 | Віднесення

APh | AAct | Actв D2O

1440-1580 | 1440-1580 | 1580,1612 | С и N атоми кільця (str, bend)

ССН (bend)_

1450-1490 | СН3 (bend)_

1550-1580 | СН3 (bend)

1586 | 1586 | 1420 | NH2 (ND2) (bend)

1637 | 1640 | 1612 | С3=О (str)

1658 | 1654 | 1445 | NH2 (ND2) (bend)_

1700 | 1642 | С=О в бокових ланцюгах (str)_

1706 | 1658 | С=О в бокових ланцюгах (str)

Оскільки у спектральну область 1550-1700 см-1 недейтерованих форм речовин основний внесок вносять коливання груп С=О та NH2, дейтерування зразку дозволяє розрізнити коливання ND2 і С=О груп. Віднесення смуг поглинання дейтерованого Actу плівці наведено у 3-му стовпці таблиці 1.

Для дослідження гідратації похідних актиноцину були отримані ІЧ спектри плівок Act _ при різних значеннях відносної вологості (ВВ) (рис.2). Низькочастотний зсув (Дн ?м-1) та зростання інтенсивності смуг поглинання С=О груп у бокових ланцюгах при збільшенні ВВ свідчить про гідратацію цих груп. Зростання інтенсивності смуги поглинання при 1612 см-1 (коливання атомів C=N та С3=О) з невеликим низькочастотним зсувом (?н  ?м-1) викликано зв’язуванням молекул води з атомом азоту N7 у кільці та групою С3=О. Збільшення інтенсивності смуг, що пов’язані з деформаційними коливаннями ND2 груп, та високочастотний зсув на н  ?м_ свідчать про гідратацію ND2 – груп.

У розділі 4 наведено результати ІЧ спектроскопічного дослідження гідратації та структури комплексів poly(rC) та ДНК з похідними актиноцину.

Зміни частот та інтенсивностей смуг поглинання сахарофосфатного ланцюга одно- та двоспіральної poly(rC) у комплексах при збільшенні ВВ (рис.3) викликані гідратацією фосфатних та рибозних груп. При цьому частотний зсув коливань фосфатних груп у комплексах значно менший, а зростання інтенсивності у 1,5-2 рази більше, ніж у відповідних вільних нуклеотидах (Семенов, 1993, 2000). Це свідчить про те, що комплекси сорбують більшу кількість молекул води у порівнянні з вільними poly(rC), але зв’язані вони з меншою енергією водневого зв’язку.

Для дослідження структури комплексів poly(rC) _проведено порівняння частот в області поглинання сахарофосфатного ланцюга у вільних полінуклеотидах та в комплексах при 0% ВВ. Менші частоти коливань фосфатних та рібозних груп у комплексах в порівнянні з вільними полінуклеотидами свідчать про зв’язування ліганду Actз сахарофосфатним ланцюгом poly(rC). При цьому більш ефективно відбувається взаємодія ліганду з двоспіральною poly(rC). Наприклад, для смуги антисиметричних коливань PO-груп (as1240 см-1) у разі двоспіральної poly(rC) частотний зсув =8 см-1, а для односпіральної poly(rC) =2 см-1.

Також було проведено порівняння ІЧ спектру дейтерованого комплексу двоспіральна poly(rC) в області поглинання 1350-1750 см-1 зі спектром, що був отриманий у вигляді суми спектрів вільних полінуклеотиду та ліганду з молярним внеском, що дорівнює відношенню компонентів у комплексі (рис.4). Частота смуги поглинання комплексу двоспіральна poly(rC) 1612 см-1 відрізняється від частоти смуги сумарного спектру лише на 3 (1) см-1, що свідчить про дуже слабку взаємодію ліганду з цитозином.

ІЧ спектроскопічне дослідження вологих плівок комплексів ДНК з похідними актиноцину в області поглинання 950_ см_ (рис. ) показало, що в усіх комплексах сахарофосфатний ланцюг гідратується менше, ніж у разі вільної ДНК. Тим не менш, на відміну від спектрів комплексів poly(rC), зв’язування меншої кількості молекул води з комплексами у порівнянні з вільною ДНК супроводжується такими самими частотними зсувами смуг поглинання фосфатних груп, тобто середня енергія взаємодії молекул води з комплексами має бути більшою, ніж з вільною ДНК.

Частоти смуг поглинання фосфатних груп ДНК у комплексі з лігандами Act при 0, 56 та 90% ВВ практично не відрізняються від частот, що характерні для вільної ДНК. Тому ми вважаємо, що похідні актиноцину Act _не взаємодіють з фосфатними групами ДНК при утворенні комплексів.

Спектральні особливості в області поглинання сахарофосфатного ланцюга виявлені для комплексу ДНК –(рис.5, б): при 0% ВВ пікова інтенсивність смуг поглинання на 30-50% вища, а інтегральна інтенсивність області поглинання 950-1300 см-1 збільшена на 70% у порівнянні з вільною ДНК та комплексами ДНК – ActI _. Також при 0% ВВ спостерігається чітко виражена інтенсивна смуга поглинання при   см _, що відповідає коливанням груп атомів С-О и Р-О. Частоти коливань фосфатних груп as=1238 см-1 і дезоксірібози  см_відрізняються від відповідних частот у спектрах вільної ДНК та комплексів ДНК з Act III _Виявлені особливості у спектрах комплексу ДНК свідчать про особливу взаємодію катіонних груп цього ліганду з сахарофосфатним ланцюгом ДНК.

У частотному інтервалі 1700-1720 см-1 знаходиться смуга, що чутлива до конформаційного стану ДНК (рис. ). У спектрах комплексів при 56% та 90% ВВ частота у максимумі поглинання відрізняється від відповідного значення для вільної ДНК. Це можна пояснити тим, що при взаємодії з похідними актиноцину змінюється структура стопок азотистих основ. Подібні зміни, як і в разі взаємодії з бромистим етидієм (Семенов, 1987) та дауноміцином (Chen, 1997), можуть бути пов’язані з інтеркаляцією феноксазонового хромофору, оскільки взаємодія з малим жолобком не змінює структуру ДНК.

Проведене, як і у випадку poly(rC), порівняння ІЧ спектра комплексу в області поглинання азотистих основ з сумарним спектром вільних ДНК та ліганду показало, що при 0% ВВ частота смуги поглинання у сумарних спектрах

(=1610 см-1) відрізняється від частоти смуги поглинання у комплексах (=1617 см_). Як приклад, на рис.6 наведено подібний аналіз для комплексу ДНК _Можливо, така різниця пов’язана зі змінами структури стопок азотистих основ при інтеркаляції.

Розділ 5 присвячено дослідженню впливу похідних актиноцину на термічну стабільність НК та визначенню внеску ентальпії гідратації у загальну енергію стабілізації комплексів. На рис. представлені результати мікрокалориметричної реєстрації процесу теплопоглинання розчинів вільної двоспіральної poly(rС) та її комплексу з Actпри P/D=23, а також вільної ДНК та її комплексів з Actі Actпри P/D5. За умови постійного тиску вимірювана величина q(T) має сенс надлишкової (стосовно розчинника) теплоємкості Cp. У табл. наведені термодинамічні параметри Hпл, Sпл і Gпл, розраховані з кривих теплопоглинання за рівняннями:

Hпл=CpdТ, Sпл=dТ, Gпл=Hпл-TSпл | (1)

де T1 і T2-температури початку й кінця переходу, відповідно.

Таблиця 2

Температура плавлення Tпл і термодинамічні величини H, S і G, отримані з даних ДСК для двоспіральної poly(rС) і poly(rС) _III, а також тимусної ДНК і її комплексів з Act –Зміни вільної енергії Гібса розраховували при 200С.

Зразок | Тпл,

0С | HДСК | SДСК | GДСК,20

ккал/моль пар основ | кал/мольград | ккал/моль пар основ

двоспіральна poly (rC) | 77 | 6,98 | 18,57 | 1.54

двоспіральна poly(rC)–Act | 70 | 4,85 | 9,48 | 2.77

ДНК | 83 | 7,50 | 20,8 | 1,40

ДНК – Act II | 96 | 12,3 | 32,9 | 2,66

ДНК – Act III | 98 | 10,4 | 27,7 | 2,28

ДНК – Act IV | 101 | 10,0 | 27,0 | 2,10

ДНК – Act V | 105 | 9,7 | 26,1 | 2,05

Взаємодія з Actпризводить до зменшення температури плавлення двоспіральної poly(rC), що можна пояснити в рамках “теорії скріпок” (М.Д. Франк-Каменецький, ) більшою константою взаємодії барвника з розплетеним полінуклеотидом, ніж із двоспіральним. Тому при розгляді процесів, що відбуваються в системі poly(rС) –у широкому інтервалі температур, до набору рівноваг (2,3), запропонованих L. (1983), необхідно додати рівняння (4), що описує взаємодію Actз розплетеним полінуклеотидом: |

poly2(rС) Act III > poly2(rС)+Act III | ?H1>0 | (2)

poly2(rС) > poly(rС) | ?H2>0 | (3)

poly(rС)+Act III > poly(rС) Act III | ?H3=0 | (4)

Зміну ентальпії сумарного процесу можна представити як: |

?HДСК= ?H1+?H2+H3, | (5)

а різницю в ентальпії плавлення вільної двоспіральної poly(rС) і комплексу poly(rС) –як: |

?HДСК-?H2=?H1+H3 | (6)

Ентальпія ?HДСК сумарного процесу, що відбувається при нагріванні системи poly(rС) –менше в порівнянні з ентальпією плавлення вільної poly(rС) (табл.2). Оскільки H3?0, це може бути викликано більшим значенням (за абсолютною величиною) ентальпії взаємодії Actз розплетеною poly(rС), ніж із двоспіральною.

Ентропія SДСК для комплексу двоспіральна poly(rС) – на 9 кал/моль·град, тобто практично в 2 рази менше, ніж ентропія плавлення вільної poly(rС). Таке розходження викликане, очевидно, не тільки взаємодією ліганд - розплетена poly(rС). Додатковими причинами можуть бути відмінності конформації двоспіральної poly(rС) у складі комплексу від конформації вільної poly(rС), а також менша впорядкованість гідратної оболонки комплексу в порівнянні з вільним полінуклеотидом.

На відміну від poly(rС) –, Tпл і ?HДСК для комплексів ДНК _  вище, ніж температури і ентальпії плавлення вільної ДНК (табл.2), тобто ентальпія взаємодії ліганда з розплетеною ДНК (H3, рівняння ) за абсолютним значенням менша, ніж ентальпія взаємодії ліганда з двоспіральною ДНК (-H1, рівняння ). Вважаючи, що H3 однакова для всіх лігандів, різницю у взаємодії Act із ДНК можна оцінити з даних табл. 2 як ?HДСК_?H2 (рівняння ). Для лігандів Act ентальпія взаємодії із ДНК відрізняється незначно. Можливо, це специфічний до нуклеотидного складу (інтеркаляція або зв'язування з жолобком) тип взаємодії, у який можуть вносити вклад молекули води й водневих зв'язків при прямому контакті груп хромофора і GC або AT – пар азотистих основ. Ентальпія взаємодії Actіз ДНК більше, ніж Act із ДНК, що викликано наявністю інших типів взаємодії, одним із яких можуть бути контакти між катіонними групами ліганда і сахарофосфатним ланцюгом ДНК, які були виявлені при ІЧ спектроскопічному вивченні цього комплекса.

Збільшення SДСК комплексів щодо ентропії плавлення вільної ДНК пов'язане з тим, що структура гідратного оточення комплексів більше впорядкована в порівнянні із ДНК.

Для дослідження енергетичних параметрів гідратації комплексів ДНК, одно- та двоспіральних poly(rC) з похідними актиноцину були отримані ізотерми гідратації (залежності кількості сорбованих молекул води від відносної вологості) Отримані ізотерми були апроксимовані рівнянням адсорбції Д’Арсі і Ватта (4), що враховує гетерогенність центрів гідратації.

, | (7)

де Vm – ємкість монослою;

x – відносна вологість;

ал, аг и b – активності води, що визначаються за формулою Кi/КL, де Кi-константа рівноваги реакції [пара + речовина > одиничний комплекс]; КL – константа конденсації води [насичена пара > рідина].

Використовуючи величини констант Кi адсорбційної рівноваги, можна знайти теплоту адсорбції Qi або ентальпію гідратації Нгидр=Qi:

Qi = RT lnKi/KL + TSi , | (8)

де Qi=Qi-QL – різниця між повною теплотою адсорбції вода – адсорбент Qi у відповідному адсорбційному шарі i і теплотою конденсації молекул води QL. Отримані дані наведені в таблиці 3.

Таблиця 3

Теплоти адсорбції води за законами Ленгмюра Qл і Генрі Qг і ентальпія гідратації для poly(rС), ДНК і їх комплексів з похідними актиноцину

Речовина | Qл

(ккал/моль пар основ) | Qг

(ккал/моль пар основ) | -Нгідр

(ккал/моль пар основ)

односпіральна poly(rС) | 4,64 | 0,88 | 5,42

односпіральна poly(rС) – | 4,54 | 1,32 | 5,86

двоспіральна poly(rС) | 4,36 | 1,22 | 5,58

двоспіральна poly(rС) – | 4,38 | 0,20 | 4,58

ДНК | 3,80 | 0,64 | 4,44

ДНК – | 4,32 | 2,48 | 6,80

ДНК – | 3,62 | 2,04 | 5,66

ДНК – | 3,72 | 1,92 | 5,64

ДНК – | 3,82 | 2,44 | 6,26

Можна бачити, що Нгідр односпіральної poly(rС) та її комплексу з Actпрактично не відрізняються. Для комплексу двоспіральна poly(rС) спостерігається помітне (~1 ккал /моль пар основ) зменшення за абсолютним значенням Нгідр, що може бути викликане тим, що Actвитісняє молекули води, які зв'язані з нуклеотидною матрицею, і структура гідратної оболонки комплексу менш упорядкована в порівнянні з вільною двоспіральною poly(rС).

Абсолютне значення енергії гідратації комплексів ДНК – помітно вище, ніж вільної ДНК, хоча з комплексом зв'язана менша кількість молекул води, чим з вільною ДНК. Це свідчить про те, що первинна гідратна оболонка комплексів ДНК із лігандами більше впорядкована, ніж гідратна оболонка вільної ДНК.

У загальну енергію стабілізації ДНК і комплексів роблять внесок енергії водневих зв'язків в уотсон-криковських парах, енергії взаємодії ДНК із молекулами води гідратної оболонки і взаємодії ДНК - ліганд. Якщо вважати, що при тепловій денатурації ДНК і її комплексів руйнуються ці типи взаємодій, було оцінено, що внесок води в загальну енергію стабілізації цих структур становить 60±5%. Для двоспіральної poly(rС) і комплексу poly(rС)  Actвнесок гідратації в загальну енергію стабілізації становить близько 80%, що може бути пов'язане як з більшою енергією гідратації цих структур, так і з меншим внеском інших типів взаємодії (водневих зв'язків у парі основ напівпротонованої poly(rС), стекінгу та ін.) Отриманий результат для комплексу poly(rС) _(94%) завищений, оскільки у значення -НДСК=4,85, що було використане при розрахунку, вносить значний вклад взаємодія ліганду з розплетеною poly(rС).

ВИСНОВКИ

1. Вперше проведено квантово-хімічні розрахунки геометрії та ІЧ-спектрів похідних актиноцину. На підставі характеристичності частот смуг поглинання та теоретичних розрахунків виконано віднесення для основних смуг поглинання феноксазонового хромофору в експериментальних спектрах. Досліджено похідні актиноцину в плівках при різних значеннях відносної вологості та визначено центри їх гідратації.

2. Досліджено взаємодію похідного актиноцину Actз односпіральною та двоспіральною структурами poly(rС). Зміни спектральних параметрів в області 950-1300 см-1 свідчать про зв'язування Actіз сахарофосфатним ланцюгом poly(rС). Взаємодії похідного актиноцину з азотистими основами не виявлено.

3. Вперше отримано ІЧ спектри плівкових зразків комплексів ДНК _–V у дейтерованому та недейтерованому станах. Спектральні зміни в області 1400-1800 см-1 свідчать про часткове порушення стопочної структури азотистих основ. Припущено, що ці зміни викликано інтеркаляцією феноксазонового хромофору між G-C парами ДНК.

4. Встановлено, що на відміну від інших похідних актиноцину, Actутворює додаткові зв'язки між своїми боковими ланцюгами й сахарофосфатним ланцюгом ДНК.

5. Методом калориметрії вперше визначено термодинамічні параметри теплової денатурації комплексів ДНК і двоспіральної poly(rС) з похідними актиноцину. Виявлено, що температура й ентальпія плавлення комплексу poly(rС)-Actменше, ніж вільної poly(rС). Стабільність та термостабільність комплексів ДНК з лігандами Actвище, ніж вільної ДНК. Найбільшу стабільність має комплекс ДНК з похідним актиноцину Actщо виявляє максимальну біологічну активність серед досліджених лігандів.

6. Методом ІЧ спектроскопії визначено центри гідратації похідних актиноцину та їх комплексів з полінуклеотидними матрицями. Показано, що взаємодія з похідними актиноцину по-різному впливає на гідратну оболонку ДНК і двоспіральної poly(rС). Апроксимація експериментальних ізотерм гідратації рівнянням Д'арси й Вата дозволила визначити енергії взаємодії молекул води з комплексами. Внесок гідратації в загальну енергію стабілізації комплексів становить 60-80

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Семёнов М.А., Круглова Е.Б., Духопельников Е.В., Больбух Т.В., Малеев В.Я. Физические механизмы взаимодействия производных актиноцина с ДНК 3. Спектроскопическое исследование влияния воды на взаимодействие актиноцил-бис-(3-диметиламинопропил) амина с одно- и двухспиральными структурами полицитидиловой кислоты. //Вісник Харківського Університету №560, Біофізичний Вісник. - 2001. -Вып.2 (9). -С. 33-39.

2. Березняк Е.Г, Семенов М.А., Больбух Т.В., Духопельников Е.В, Шестопалова А.В., Малеев В.Я. Исследование влияния воды на взаимодействие ДНК и производных актиноцина с различной длиной аминоалкильных цепочек методамиИК-спектроскопии и компьютерного моделирования. // Биофизика. -2002. -т.47, -№ , -с. 1019-1026.

3. Больбух Т.В., Духопельников Е.В., Семенов М.А., Березняк Е.Г., Малеев В.Я., Глибин Е.Н., Овчинников Д.В. Физические механизмы взаимодействия производных актиноцина с ДНК 7. Пьезогравиметрическое исследование комплексов ДНК с производными актиноцина // Вісник Харківського Університету №560, Біофізичний Вісник. -2002. -Вып.1 (10). -С. 30-35.

4. Духопельников Е.В., Березняк Е.Г., Иванов А.Ю., Судаков А.А., Семенов М.А., Малеев В.Я. Колебательные спектры производных феноксазина, изолированных в аргоновых матрицах. эксперимент и расчет // Вісник Харківського національного університету №606, Біофізичний вісник. -2003. -Вып.2 (13), -с. 5-11.

5. Больбух Т.В., Духопельников Є.В., Березняк К.Г., Семенов М.О, Малєєв В.Я. Ізотерми гідратації комплексів ДНК з похідними актиноцину // Тези Доповідей IІІ З’їзду Українсько-Го Біофізичного Товариства, Львів, -2002 -С.27.

6. Березняк К.Г., Больбух Т.В., Глібін Є.М., Духопельников Є.В., Овчинников Д.В., Семенов М.О. Взаємодія ДНК з похідними актиноцину за даними ІЧ-спектроскопії // Тези Доповідей IІІ З’їзду Українського Біофізичного Товариства, Львів. -2002 ., -С.28.

7. Больбух  Т.В., Березняк  Е.Г., Духопельников  Е.В., Зинченко  А.В., Семенов  М.А., Малеев  В.Я. Термодинамические параметры взаимодействия ДНК с производными актиноцина // Тези Доповідей IІІ З’їзду Українського Біофізичного Товариства, Львів, -2002. -Р., С.26.

8. Bereznyak Е.G., Dukhopelnykov Ye.V., Semenov М.А., Ivanov А.Yu, Glibin Е.N., Маlееv V.Ya Theoretical and experimental investigations of IR spectra of actinocin derivatives // Proceedings of the XVI Intern.School-Seminar "Spectroscopy of molecules and crystals", Sevastopol, Ukraine. -2003. -p.286.

9. Духопельников Е.В Исследование взаимодействия в системе ДНК-вода-производные актиноцина // Тез. докл. III Харьковская конф. мол. уч. “Микроволновая электроника и радиолокация”. Харьков, -2004, -с.25.

10. Духопельников Е.В Вклад гидратации в энергию стабилизации комплексов производных актиноцина с ДНК и poly2(rС). // Тези доповідей Конференція молодих вчених Фізика Низьких Температур (КМВ-ФНТ-2004), Харків -2004. -с.23.

11. Духопельников Е.В. , Круглова Е.Б., Березняк Е.Г., Семенов М.А., Зинченко А.В. Калориметрические и спектрофотометрические исследования стабильности двуспиральной poly(rС) в присутствии производного актиноцина. // Тези Доповідей І Української наукової конференції проблеми біологічної і медичної фізики ПБМФ-2004 Харків-2004 -с.51.

12. Е.В.Духопельников, Е.Г.Березняк, М.А.Семенов Молекулярные механизмы взаимодействия новых антибиотиков актиноцинового ряда с матрицами нуклеиновых кислот // Тези Доповідей І Української наукової конференції проблеми біологічної і медичної фізики ПБМФ-2004 Харків-2004 -с.49.

АНОТАЦІЯ

Духопельников Є.В. Молекулярні механізми взіємодії нових антибіотиків актиноцинового ряду з матрицями нуклеїнових кислот. – Рукопис

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. Харківський національний університет ім В.Н.Каразина, м. Харків 2005

Методами ІЧ спектроскопії, диференціальної скануючої калориметрії та п’єзогравіметрії проведено дослідження структури та стабільності комплексів похідних актиноцину (Act –) з poly(rC) та ДНК. Показано, що комплекс з poly(rC) утворюється за типом зовнішнього зв'язування з сахарофосфатним ланцюгом. Температура та ентальпія плавлення комплекса poly(rC)-ActIII менша ніж вільної poly(rC). Зміни в спектрах ДНК при утворенні комплексів свідчать про часткове порушення стопочної структури азотистих основ. Припущено, що ці зміни викликані інтеркаляцією феноксазонового хромофору в ДНК. Ліганд ActII додатково утворює зв'язки з сахарофосфатним ланцюгом. Стабілізація комплексів ДНК з похідними актиноцину визначається ентальпійним фактором. Максимальну стабільність має комплекс ДНК _ ActII.

Визначено центри гідратації похідних актиноцину та їх комплексів з полінуклеотидними матрицями. Показано, що взаємодія з похідними актиноцину по-різному впливає на гідратну оболонку ДНК та poly(rC). Внесок гідратації в загальну енергію стабілізації комплексів складає 60-80%

Ключові слова: нуклеїнові кислоти, похідні актиноцину, комплексоутворення, ІЧ спектроскопія, термодинамічні параметри, гідратація.

АННОТАЦИЯ

Духопельников Е.В. Молекулярные механизмы взаимодействия новых антибиотиков актиноцинового ряда с матрицами нуклеиновых кислот. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02  биофизика. Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, г. Харьков, 2005.

Методами ИК спектроскопии, дифференциальной сканирующей микрокалориметрии и пьезогравиметрии проведено исследование структуры и стабильности комплексов производных актиноцина (Act –) с poly(rC) и ДНК. Показано, что комплекс с poly(rC) образуется по типу внешнего связывания с сахарофосфатным остовом. Температура и энтальпия плавления комплекса poly(rC)-ActIII меньше, чем свободной poly(rC). Изменения в спектрах ДНК при образовании комплексов свидетельствуют о частичном нарушении стопочной структуры азотистых оснований. Предположено, что эти изменения вызваны интеркаляцией феноксазонового хромофора в ДНК. Лиганд Act II дополнительно образует связи с сахарофосфатным остовом ДНК. Стабилизация комплексов ДНК с производными актиноцина определяется энтальпийным фактором. Наибольшую стабильность имеет комплекс ДНК- ActII.

Определены центры гидратации производных актиноцина и их комплексов с полинуклеотидными матрицами. Показано, что взаимодействие с производными актиноцина по_разному влияет на гидратную оболочку ДНК и poly(rC). Вклад гидратации в общую энергию стабилизации комплексов составляет 60-80 %.

Ключевые слова: нуклеиновые кислоты, производные актиноцина, комплексообразование, ИК спектроскопия, термодинамические параметры, гидратация.

SUMMARY

Dukhopelnykov. E.V. Molecular mechanism of interaction of new actinocin antibiotics with nucleic acid matrices – Manuscript.

Thesis for a candidate’s degree by specialty 03.00.02 – biophysics. – V.N.Kharkiv National University, Kharkiv, 2005.

The physical properties of complexes of synthetic phenoxazone antibiotics, that are derivatives of actinocin (analogues of actinomycin D), with methylene chains of different length in the side groups of the chromophores ActII-ActV, with DNA and poly(rC) were studied by IR-spectroscopy, piezogravimetry and differential scanning calorimetry.

Quantum-chemical calculations were carried out to determine equilibrium geometry and IR spectra of actinocin derivatives aminophenoxazone and diaminoactinocin. Assignment of main adsorption band in IR spectra of this compound in argon matrices and condensed state was made. The hydration-active centers of actinocin derivatives were determined.

Main differences in IR spectra of complexes poly(rC)-ActIII from IR spectra of pure poly(rC) were observed in absorption region of sugar-phosphate backbone. This is an evidence of outside type of binding of Act III to ribose and phosphate groups of poly(rC). It is found that the melting temperature and enthalpy of poly(rC) in the presence of actinocin derivatives decreases. This fact is explained due to greater constant of interaction Act III with denaturated poly(rC) in comparison with double helical one. Melting entropy of complexes poly(rC)-ActIII is by 9 cal/mol higher than the melting entropy of pure poly(rC). We suppose that this is caused by conformation changes of polynucleotide and disordering of hydration shell.

The IR-spectra of free DNA and of complexes DNA - ActII-V in films were received. Samples were studied in non-deuterated and deuterated states at 0%, 56% and 90% RH. The analysis of spectra was carried out using reliably assigned DNA absorption bands sensitive to hydration and the conformation state of nucleic acid as well as using absorption bands of ligands. At 0% RH the superposition of absorption bands with the maximums at 1622 cm-1 for DNA and 1600 cm-1 for Act results in appearing of a wide absorption band with the maximum close to 1610 cm-1. This is by 7 cm-1 lower than that in the complex. This effect is connected with interaction of nitrogenous bases of DNA with phenoxazone rings of ligands.

The frequencies of the DNA absorption bands in the regions 900-1330 cm-1 for complexes DNA-ActIII-V at 0%, 56% and 90% RH practically did not differ from the frequencies specific for DNA. Therefore, we suppose that the interaction of ActIII-V with DNA does not affect the structural state of deoxyribose and phosphate groups of DNA. The spectrum of complexes DNA - ActII differs essentially from the spectra of free DNA and of complex DNA - ActIII-V. The features seen in the spectra of complex of DNA – ActII in the absorption region of sugar-phosphate backbone demonstrate interaction of cationic groups of this ligand with DNA.

It is found that the melting temperature and enthalpy of DNA in the presence of actinocin derivatives increases. Maximum value of the melting temperature and enthalpy was demonstrated by the complex DNA –Interaction of cationic groups of this ligand with DNA can be one of the causes of high stability of this complex in comparison with complexes of DNA - ActIII-V.

It is shown that the hydration shell of complexes poly(rC)-ActIII contains more water molecules than pure poly(rC). But the energy of water-complex interaction is lower than the energy of water-pure poly(rC) interaction. On the contrary, complexes DNA-Act II-V contain fewer number of water molecules than pure DNA. And the energy of water-complex interaction is greater than the energy of water-pure DNA interaction. In both case the interaction with hydrated environment sufficiently (up to 60-80%) stabilize the helical structure.

Key words: nucleic acid, actinocin derivatives, IRthermodynamics parameter, hydration.