АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ ЕНДОКРИННОЇ ПАТОЛОГІЇ

ім. В.Я. ДАНИЛЕВСЬКОГО

ГОРБЕНКО Наталія Іванівна

УДК 616.379-008.64:612-019:616-08;547.461.4

ПАТОГЕНЕТИЧНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ ПОХІДНОГО ЯНТАРНОЇ КИСЛОТИ – ФЕНСУКЦИНАЛУ В ТЕРАПІЇ ЦУКРОВОГО ДІАБЕТУ ТА ЙОГО СУДИННИХ УСКЛАДНЕНЬ

(експериментальне дослідження)

14.01.14 – ендокринологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора

біологічних наук

Харків – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського
АМН України

Науковий консультант:

доктор медичних наук, професор Полторак Вікторія Віталіївна,

Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського АМН України,

відділ експериментальної ендокринології, завідувач

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук Кучмеровська Тамара Муратівна,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

відділ коферментів, провідний науковий співробітник

доктор біологічних наук Бездробний Юрій Васильович,

Національна комісія з радіологічного захисту України

при Верховній Раді України, член комісії

доктор медичних наук, професор Паньків Володимир Іванович,

Буковинська державна медична академія МОЗ України,

кафедра клінічної імунології, алергології та ендокринології, професор кафедри

Провідна установа:

Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького МОЗ України, кафедра ендокринології, м. Львів

Захист відбудеться “ 16 ” грудня 2004 р. о 12.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.564.01 при Інституті проблем ендокринної патології
ім. В.Я. Данилевського АМН України за адресою: 61002, м. Харків, вул. Артема, 10.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського АМН України (61002, м. Харків, вул. Артема, 10).

Автореферат розісланий “ 11 ” листопада 2004 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат медичних наук Т.М. Тихонова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Цукровий діабет (ЦД) на сьогодні залишається єдиним неінфекційним захворюванням, поширеність якого, за даними Всесвітньої Організації Охорони Здоров'я, має характер епідемії. Так, якщо у 2000 році число хворих на ЦД у світі складало 151 млн, то у 2025 очікується збільшення цього показника до 300 млн (Zimmet P.Z. et al., 2001). За останні 10 років кількість хворих на ЦД в Україні зросла більш ніж у 1,5 раза і становить близько 1 млн осіб (Тронько М.Д. та
співавт., 1996; Паньків В.І., 2004).

На сьогодні головною причиною непрацездатності та смертності хворих залишаються діабетичні мікро- й макроангіопатії: нефропатія, ретинопатія, гангрена, інфаркт міокарда, інсульт (Сергієнко О.О., 1997; Тронько М.Д., 2000).

Результати багатоцентрових клінічних досліджень підтвердили припущення, що гіперглікемія є основним фактором, який індукує розвиток діабетичних мікроангіопатій, а інтенсивний глікемічний контроль дозволяє загальмувати їх клінічну маніфестацію у хворих на ЦД 1 та 2 типу (The Diabetes Control and Complications Trial Research Group, 1993; United Kingdom Prospective Diabetes Study, 1998). У той же час досягнення нормоглікемії на практиці виявляється досить складним завданням, пов’язаним із підвищеним ризиком гіпоглікемії, що свідчить про необхідність застосування альтернативної превентивної терапії. Її мета полягає в блокуванні основних патофізіологічних механізмів (активації поліолового шляху метаболізму глюкози і протеїнкінази С, зміни в редокс-стані піридинових нуклеотидів, підвищення синтезу діацилгліцеролу, утворення продуктів неферментативного глікозилювання, оксидативного стресу та гіпоксії), що призводять до розвитку діабетичних мікросудинних ускладнень (Feener E.P., King G.L., 1997; Singh R. et al., 2001).

В останні роки сформульовано гіпотезу, за якою оксидативний стрес являє собою універсальний механізм, причетний до основних біохімічних порушень, індукованих гіперглікемією. При цьому пусковим моментом є зростання продукції вільних радикалів на мітохондріальному рівні внаслідок посиленого внутрішньоклітинного метаболізму глюкози (Nishikawa T. et al., 2000).

Накопичено велику кількість даних, що вказують на існування зв’язку між підвищеним рівнем вільних радикалів та інсулінорезистентністю, яка є не тільки однією з ключових ланок патогенезу ЦД 2 типу, але й основною складовою метаболічного синдрому та провідним чинником ризику макросудинної патології (Plutzky J.
et al., 2002; Evans J.L. et al., 2003).

Вважається, що оксидативний стрес виступає патогенетичним механізмом, який поєднує інсулінорезистентність із дисфункцією панкреатичних бета-клітин та ендотелію, що створює передумови для застосування антиоксидантів з метою профілактики та лікування ЦД і його судинних ускладнень (Ceriello A., Motz E., 2004).

Результати ряду експериментальних та клінічних досліджень свідчать про
можливість гальмування розвитку діабетичних ангіопатій за допомогою природних (вітаміни А, С, Е, -ліпоєва кислота) та синтетичних (пробукол, нітекапон, ніканартин, раксофеласт, бутилпохідне гідроколтолуїну) антиоксидантів (Baynes J.W., Thorpe J.W., 1999; Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., 2000). Разом з тим, нещодавно завершені мультифакторіальні рандомізовані клінічні дослідження HPS (Heart Protection Study) не виявили зниження ризику серцево-судинних ускладнень за умов терапії антиоксидантними вітамінами (Heart Outcomes Prevention Evaluation Study Investigators, 2000; Yusuf S., 2002).

Суперечливий характер даних літератури щодо ефективності використання антиоксидантів для попередження або гальмування розвитку діабетичних ангіопатій зумовлює необхідність подальших експериментальних та клінічних досліджень у цьому напрямку. Водночас на особливу увагу заслуговують антидіабетичні препарати, яким притаманний антиоксидантний ефект, незалежний від гіпоглікемічної дії.

Нещодавно було показано, що прогресуюче погіршення глікемічного контролю у хворих на ЦД 2 типу пов’язане з поступовим зниженням функції панкреатичних бета-клітин (Turner R.C. et al., 1999).

На жаль, використання існуючих цукрознижуючих агентів (сульфаніламідів, бігуанідів, тіазолідиндіонів, глінідів та інгібіторів альфа-глюкозидази) не забезпечує довгострокової нормалізації глікемії та супроводжується розвитком побічних ефектів (Ефимов А.С., Скробонская Н.А., 1998; Полторак В.В., Горбенко Н.І., 1999), що обґрунтовує необхідність розширення спектру антидіабетичних засобів за рахунок сполук, які поєднують виразний гіпоглікемічний ефект із здатністю зберігати або поліпшувати секреторну функцію бета-клітин.

Зниження секреторної реакції бета-клітин у відповідь на підвищений рівень глюкози у хворих на ЦД 2 типу можуть спричиняти такі метаболічні дефекти, як порушення синтезу транспортера глюкози, мутація глюкокінази, підвищення активності глюкозо-6-фосфатази, зниження активності гліцерофосфатдегідрогенази та синтезу глікогену (Malaisse W.J., 1994). Останнім часом з'явилися повідомлення про можливість компенсації порушень в окисленні глюкози, які призводять до енерге-тичного виснаження бета-клітин, за допомогою ефірів янтарної кислоти
(Malaisse W.J., 2001; Горбенко Н.І., Полторак В.В., 2002). Серед них найбільш дослідженим представником є метиловий ефір янтарної кислоти. У той же час енте-
ральне використання цього ефіру супроводжується утворенням в організмі токсичної речовини – метанолу (Laghmich A. et al., 1998), що обмежує перспективність його клінічного застосування та свідчить про необхідність подальшого пошуку низько-токсичних сполук з антидіабетичними властивостями серед похідних янтарної кислоти.

Таким чином, незважаючи на досить великий арсенал пероральних анти-діабетичних препаратів, до складу якого входять представники різних класів хімічних сполук, головна мета фармакотерапії ЦД – зниження гіперглікемії та гальмування розвитку діабетичних мікро- й макросудинних ускладнень, ще залишається далекою від практичної реалізації.

У зв’язку із цим, розширення спектра антидіабетичних агентів за рахунок представників інших груп хімічних речовин, серед яких похідні янтарної кислоти мають багато патогенетично обґрунтованих переваг, може сприяти підвищенню ефективності лікування ЦД та його судинних ускладнень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в Інституті проблем ендокринної патології ім. В.Я.Данилевського АМН України відповідно до планів науково-дослідних робіт: „Розробка і впровадження нових антидіабетичних лікарських засобів – похідних янтарної кислоти”,
№ держреєстрації 0196U010248; „Пошук сполук з антидіабетичними властивостями серед арил- та гетарилпохідних янтарної кислоти та розробка на їх основі нових лікарських засобів”, № держреєстрації 0100U001600; „Фенсукцинал – перспективний засіб для попередження та гальмування клінічної маніфестації інсулін-залежного (тип 1) цукрового діабету”, № держреєстрації 0197U014644. Автор дисертаційної роботи був відповідальним виконавцем усіх вищезазначених НДР.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи – експериментально обґрунтувати наявність у низькотоксичного похідного янтарної кислоти – фенсукциналу комплексної антидіабетичної дії, спрямованої на головні патогенетичні ланки цукрового діабету та його судинних ускладнень.

Для досягнення зазначеної мети в роботі поставлено низку завдань:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

Об’єкт дослідження – пероральна фармакологічна корекція основних патогенетичних ланок ЦД та його судинних ускладнень.

Предмет дослідження – функціональна активність панкреатичних бета-клітин, інсулінорезистентність, діабетичні мікро- та макроангіопатії у тварин із інсуліновою недостатністю різного генезу на тлі застосування фенсукциналу та препаратів порівняння, антидіабетичні властивості похідних янтарної кислоти.

Методи дослідження – біохімічні, біофізичні, радіоімунологічні, імунофер-
ментні, гістологічні, фармакологічні, логіко-структурні та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. У дисертаційній роботі експериментально обґрунтовано концепцію перспективності мультифакторної антидіабетичної терапії, згідно з якою створена теоретична та методична основа для розробки нових антидіабетичних засобів, які не тільки впливають на головні патогенетичні ланки ЦД, але й істотно знижують основні чинники ризику серцево-судинної патології.

Уперше за допомогою комп’ютерної системи PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) було проведено логіко-структурну оцінку можливого спектра біологічної дії нових похідних янтарної кислоти, що спрямована на ключові патогенетичні ланки ЦД і його судинних ускладнень, та обґрунтована перспективність пошуку антидіабетичних сполук серед вищезазначеного хімічного ряду. За результатами первинного фармакологічного скринінгу виявлено нові сполуки з антигіперглікемічною та антиоксидантною дією, визначено закономірності зв’язку хімічної структури із біологічною активністю для амідів та імідів янтарної кислоти. Встановлено наявність виразної дозозалежної антиоксидантної та антигіперглікемічної активності для сполуки з ряду діамідів янтарної кислоти – фенсукциналу.

Уперше визначено стимулюючий вплив фенсукциналу на регенерацію панкреатичних бета-клітин та збереження їх функціональної активності після субтотальної деструкції стрептозотоцином у неонатальному віці.

Показано, що фенсукцинал проявляє антидіабетогенний ефект, захищаючи панкреатичні бета-клітини від аутоімунної деструкції, спричиненої введенням низьких доз стрептозотоцину, та від бета-цитотоксичної дії дитизону.

Встановлено превентивний ефект фенсукциналу щодо розвитку первинної інсулінорезистентності, індукованої дексаметазоном, та вторинної інсулінорезистентності, що виникає внаслідок тривалої гіперглікемії після ін’єкції стрептозотоцину.

Доведено гальмуючий вплив фенсукциналу на метаболічні прояви синдрому інсулінорезистентності, відтвореного за допомогою хронічного введення фруктози у щурів.

Визначено, що пероральне застосування фенсукциналу послаблює розвиток діабетичної нефропатії та ретинопатії за умов абсолютної та відносної інсулінової недостатності.

Показано, що фенсукцинал проявляє антиатерогенний ефект та гальмує прояви діабетичної кардіопатії у тварин із абсолютною інсуліновою недостатністю.

Уперше встановлено можливі молекулярні механізми реалізації комплексних антидіабетичних властивостей фенсукциналу, пов’язані з поліпшенням біоенерге-
тичних процесів і пригніченням оксидативного стресу в мітохондріях та зниженням неферментативного глікозилювання в діабетичних тварин.

Поглиблено концепцію щодо ролі оксидативного стресу в розвитку інсуліно-резистентності, ЦД та його судинних ускладнень.

Практичне значення одержаних результатів. Результати експериментального дослідження антидіабетичних властивостей фенсукциналу знайшли відображення в матеріалах доклінічного вивчення препарату, на основі яких було отримано дозвіл Фармакологічного комітету МОЗ України на проведення I фази клінічних випробувань (протокол № 9 від 28.11.96 ) та дозвіл Державного фармакологічного центру МОЗ України на проведення II фази клінічних випробувань (протокол № 9 від 26.10.00).

Встановлені закономірності зв’язку „фармакологічна дія – хімічна будова” серед похідних янтарної кислоти використовуються в навчальних програмах з медичної хімії на кафедрі органічної хімії Харківського національного університету
ім. В.Н. Каразіна, кафедрі фармакології Національного фармацевтичного університету та кафедрі фармакології і токсикології Харківської державної зооветеринарної академії.

Отримані дані щодо перспективності застосування природних та синтетичних антиоксидантів з метою профілактики та лікування ЦД застосовуються у відповідних лекційних курсах на кафедрі ендокринології та дитячої ендокринології Харківської медичної академії післядипломної освіти.

Розроблено нові методологічні підходи для визначення комплексних антидіабетичних властивостей оригінальних хімічних речовин, включені до монографії "Доклінічне дослідження лікарських засобів" (За редакцією О.В. Стефанова, Дер-жавний фармакологічний центр, Київ, 2001).

Результати досліджень, які знайшли відображення в патенті № 37895А, упроваджено на ВАТ "Фармацевтична фірма "Здоров'я", що організовує промислове виробництво фенсукциналу (акт від 04.11.2000).

Особистий внесок здобувача. Автором особисто на основі аналізу літератури було визначено напрямок, мету й завдання дослідження; самостійно розроблено методологію досліджень, виконано фармакологічні, біохімічні та біофізичні дослідження, проведено статистичну обробку отриманих даних та аналіз усього матеріалу, сформульовано основні положення та висновки. Автор безпосередньо брав участь у експериментальному моделюванні ЦД та інсулінорезистентності, у визначенні вмісту інсуліну в сироватці крові та мікроальбумінурії. Гістологічні та морфометричні дослідження підшлункової залози були проведені в лабораторії фармакології Інституту проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського АМН
України, електронно-мікроскопічні дослідження нирки – у лабораторії патоморфології Інституту медичної радіології ім. С.П. Григор’єва АМН України під керівництвом к.б.н. О.П. Лукашової, електронно-мікроскопічні дослідження ока – в Інституті очних хвороб та тканинної терапії ім. Філатова АМН України під керівництвом д.м.н., проф. Л.Т. Кашинцевої.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися та обговорювалися на сателітному симпозіумі 30 конгресу Європейської асоціації з вив-чення цукрового діабету „Diabetic microvascular complications. Recent concepts for pathogenesis and treatment” (Бохум, Німеччина, 1994), на І з’їзді Українського біофізичного товариства (Київ, 1994), на Третьому європейському конгресі з упровадження Сент-Вінсенської декларації (Афіни, Греція, 1995), на 5-му Діабетичному форумі з імунології (Орвієто, Рим, Італія, 1995), на 31 конгресі Європейської асоціації з вивчення цукрового діабету (Стокгольм, Швеція, 1995), на I Європейському конгресі з фармакології (Мілан, Італія, 1995), на І Національному з’їзді фармакологів України (Полтава, 1995), на 32 конгресі Європейської асоціації з вивчення цукрового діабету (Відень, Австрія,1996), на XVIII конгресі Європейської асоціації з парентерального та ентерального харчування (Женева, Швейцарія, 1996) на I Світовому конгресі з профілактики діабету та його ускладнень (Лінгбі, Данія, 1996), на VI конгресі Світової федерації українських лікарських товариств (Одеса, 1996), на науково-практичній конференції, присвяченій 75-річчю Української фармацевтичної академії (Харків, 1996), на 16 конгресі Міжнародної діабетичної асоціації (Гельсінкі, Фінляндія, 1997), на конгресі діабетологів із країн Чорного моря (Стамбул, Турція, 1997), на 13-му Міжнародному конгресі фармакологів (Мюнхен, Німеччина, 1998), на 34 конгресі Європейської асоціації з вивчення цукрового діабету (Барселона, Іспанія, 1998), на 35 конгресі Європейської асоціації з вивчення цукрового діабету (Брюссель, Бельгія, 1999), на Другому європейському конгресі з фармакології (Будапешт, Угор-щина, 1999), на V Національному з’їзді фармацевтів України (Харків,1999), на VII Світовій конференції з клінічної фармакології та терапії (Флоренція, Італія, 2000), на 5-му Європейському конгресі з ендокринології (Турін, Італія, 2001), на 5-му Європейському конгресі з клінічної фармакології та терапії (Оденс, Данія, 2001), на 37-му конгресі Європейської асоціації з вивчення цукрового діабету (Глазго, Великобританія, 2001), на VI з’їзді ендокринологів України (Київ, 2001), на ІІ Національному з’їзді фармакологів України (Дніпропетровськ, 2001), на науково-практичній конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження І.М. Буланкіна (Харків, 2001), на VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002), на міжнародній науково-практичній конференції „Новые технологии получения и применения биологически активных веществ” (Алушта, 2002), на 6-му Європейському конгресі з клінічної фармакології та терапії (Стамбул, Туреччина, 2003), на міжнародній конференції „Reactive Oxygen and Nitrogen Species, Antioxidant and Human Health” (Смоленськ, Росія, 2003), на Пленумі асоціації ендокринологів України, присвяченому 25-річчю кафедри ендокринології Львівського державного медичного університету ім. Данила Галицького (Львів, 2003), на 17 конгресі Міжнародної діабетичної асоціації (Париж, Франція, 2003), на науково-практичній конференції „Сучасні напрямки розвитку ендокринології” (Харків, 2004), на науково-практичній конференції, присвяченій 10-річчю відділу клінічної фармакології Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України (Київ, 2004), на 40-му конгресі Європейської асоціації з вивчення цукрового діабету (Мюнхен, Німеччина, 2004).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 77 наукових робіт, із яких 26 статей у фахових наукових виданнях (7 одноосібних та 19 у співавторстві), 3 патенти України, 1 методичні рекомендації та 47 тез у міжнародних журналах та збірниках матеріалів вітчизняних з’їздів і конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 331
сторінці машинописного тексту, складається зі вступу, огляду літератури, 8 розділів власних досліджень, заключення, висновків, списку використаних джерел. Матеріал дисертації ілюстровано 54 таблицями, 49 рисунками та мікрофотографіями. Список літератури (обсягом 45 сторінок) містить 457 джерел, у тому числі 389 іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. У роботі було використано 1022 статевозрілих самці щурів популяції Wistar, 84 кролі породи Shinshilla з розплідника Інституту проблем ендокринної патології АМН України та 46 самців мишей лінії СВА, які були доставлені з розплідника „Столбовая” (Московська обл., Росія).

Тварин утримували в стандартних умовах віварію при відповідному освітленні та годуванні ad libitum. Дослідження проводилися відповідно до національних "Загальних етичних принципів експериментів на тваринах" (Україна, 2001), що відповідають положенням „Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей” (Страсбург, 1985).

Прогноз біологічної активності амідів та імідів янтарної кислоти, синтезованих під керівництвом к.х.н. В.В. Ліпсон в лабораторії синтезу антидіабетичних сполук Інституту проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського АМН України, здійснювався за допомогою комп’ютерної системи PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) (Поройков В. В., 2001).

Фармакологічний скринінг уперше синтезованих сполук з метою дослідження гіпоглікемічної активності проводили на інтактних щурах відповідно до методичних рекомендацій (Полторак В.В., Горбенко Н.І., 2001). Антиоксидантну активність похідних янтарної кислоти визначали in vitro (на моделі окислення ліпопротеїнів яєчного жовтка) (Клебанов Г.И. и др., 1985) та in vivo (на моделі однодобового токсичного гепатиту) (Поздняков В.B, Иванов Н.И.,1979).

Дослідження антидіабетичних властивостей фенсукциналу проводили на
хімічно-індукованих моделях інсулінової недостатності та інсулінорезистентності різного генезу:

1) високодозовий стрептозотоциновий діабет (абсолютна інсулінова недостатність прямого бета-цитотоксичного генезу) (Rakieten N. et al., 1969);

2) низькодозовий стрептозотоциновий діабет (абсолютна інсулінова недостатність аутоімунного генезу) (Like A.A., Rossini A.A., 1976);

3) неонатально-індукований стрептозотоциновий діабет (еволюція інсулінової недостатності від абсолютної до відносної) (Portha B., 1985);

4) стрептозотоциновий діабет з одночасним уведенням нікотинаміду (відносна інсулінова недостатність та вторинна інсулінорезистентність) (Masiello P. et al., 1998);

5) дитизоновий діабет (абсолютна інсулінова недостатність прямого бета-цитотоксичного генезу) (Okamoto H., 1981);

6) дексаметазонова модель (первинна інсулінорезистентність без наявності ба-
зальної гіперглікемії) (Novelli M. et al., 1996);

7) фруктозна модель (метаболічні ознаки синдрому інсулінорезистентності)
(Levi B. et al.,1998).

Стан глюкозного гомеостазу визначали за показниками базальної глікемії, інсулінемії, під час тесту толерантності до глюкози та інсулінового тесту
(Akinmokun A. et al., 1992). Вміст глюкози в крові оцінювали за допомогою ферментативного аналізатора глюкози "Ексан-Г" (Литва), HbA1c – колориметричним методом (Parker K.M. et al., 1981). Концентрацію фруктозаміну в сироватці крові визначали за методом (Johnson R.N., 1982). Базальну інсулінемію визначали радіоімунологічним методом "подвійних антитіл" за допомогою наборів "рио-ИНС-ПГ-125I" (Республіка Білорусь). Площину під глікемічними (ППКг) та інсулінемічними (ППКі) кривими при проведенні навантажувальних тестів з глюкозою обчислювали за допомогою комп'ютерної програми "Mathlab". Коефіцієнти інсулінорезистентності та функції бета-клітин (ФБК) розраховували за допомогою алгоритму "HOMA" (Homeostatic Model Assessment) (Matthews D.R., 1985).

Мітохондрії виділяли з гомогенату печінки щурів методом диференціального центрифугування (Johnson D., Lardy H., 1987). Дихання реєстрували за допомогою полярографічного методу з використанням закритого електрода Кларка
(Франк Г.М., 1973). Панкреатичні острівці виділяли модифікованим методом (Lacy P., Kostianovsky M., 1967).

Оксидативний стрес характеризували за показниками малонового діальдегіду (МДА) (Стальная И.Д., Гаришвили Г.Т., 1977), дієнових (ДК), триєнових (ТК), тетраєнових (ТРК), оксидієнових (ОК) кон'югатів (Плацер З. и др., 1970) у гомогенатах печінки та сироватці крові експериментальних тварин. Вміст гідроперекисів ліпідів у мітохондріальній фракції визначали за методом (Лемешко В.В., Никитченко Ю.В., 1986). Антиоксидантний статус оцінювали за вмістом відновленого глутатіону (Beutler E. et al., 1963), активністю каталази (Королюк м.а. та ін., 1988), супероксиддисмутази (СОД) (Чевари С., 1991), глутатіонредуктази (Sieset al., 1978), глутатіопероксидази (Герасимов А.М. и др., 1976), параоксонази (Eckerson H.W. et al., 1983), церулоплазміну (Колб В.Г., Камышников В.С, 1982), показниками загальної антиоксидантної активності (Клебанов Г. И. и др., 1985). Вміст жиророзчинних вітамінів А (Паранич А.В. и др., 1992), Е та його метаболітів (димерів та токоферилхінону) (Yamanchi R. et al., 1989), а також бета-каротину (Паранич Л.И. и др., 1993) визначали спектрофотометрично в гомогенатах печінки експериментальних тварин.

Концентрацію загального холестерину, холестерину ліпопротеїнів високої густини (ЛПВГ-ХС), тригліцеридів визначали ферментативним методом за допомогою стандартних наборів фірми „Boeringer-Mannheim Gmb diagnostica” (Німеччина). Холестерин ліпопротеїнів низької густини (ЛПНГ-ХС) та атерогенний індекс розраховували за відповідними формулами (Friedewald W.T. et al., 1972; Герасимова Е.Н., 1980).

Активність аланінамінотрансферази (АлАТ) оцінювали в сироватці крові ди-гідрофенілгідразиновим методом (Reitmann S. et al., 1957), концентрацію неестери-фікованих жирних кислот (НЕЖК) – фотоколориметричним методом
(Duncomе W.C., 1963). Активність глюкозо-6-фосфатази визначали в гомогенатах печінки за методом (Swanson M., 1950).

Функціональний стан нирок оцінювали за вмістом креатиніну в сечі
(Кондрахин И.П. и др., 1985). Рівень мікроальбумінурії визначали імуноферментним методом (Пушкарев И.А., 1985) за допомогою тест-системи “Альбумін-ІФА”
(Україна). Функцiональний стан серцево-судинної системи досліджували методом електрокардiографiї (Дощицин В., 1982).

Статистичний аналіз отриманих результатів здійснено методами варіаційної статистики за допомогою стандартних пакетів програм Exel (версія 7), Biostat
(Гланц С., 1999) та Statistica (Stat. Soft. Inc., CША) (Реброва О.Ю., 2002) на персо-нальному комп’ютері Pentium III. Порівняння двох груп з нормальним розподілом здійснювали із застосуванням параметричного класичного t-критерію Ст’юдента для незалежних відбірок та модифікованого t-критерію Ст’юдента з роздільними оцінками дисперсій. При порівнянні двох груп з розподілом ознаки, відмінним від нормального, використовували непараметричний U-критерій Манна-Уітні. Розходження вважали статистично значущим при P<0,05.

Результати досліджень та їх обговорення. Скринінг амідів та імідів ян-тарної кислоти на предмет визначення у них антидіабетичних властивостей. Виходячи з мультифакторного генезу ЦД, перевага при виборі антидіабетичних засобів надається тим, що, за відсутності виразних побічних ефектів, одночасно впливають не тільки на ключові патогенетичні ланки захворювання, але й дозволяють знизити ризик діабетичних судинних ускладнень, які залишаються головною причиною інвалідизації та смертності хворих.

Виконана робота присвячена дослідженню комплексних антидіабетичних властивостей низькотоксичного похідного янтарної кислоти – фенсукциналу за умов експериментальної інсулінової недостатності, діабетичної судинної патології та інсулінорезистентності різного генезу.

Вибір фенсукциналу для розширеного доклінічного дослідження як потенційного антидіабетичного засобу був зумовлений результатами попереднього прогнозу біологічної активності за допомогою комп’ютерної системи PASS та фармакологічного скринінгу 55 оригінальних похідних янтарної кислоти.

У результаті комп'ютерного прогнозу біологічної активності амідів та імідів янтарної кислоти було виявлено широкий спектр фармакологічних властивостей (гіпоглікемічних, гіполіпідемічних, антиоксидантних, імуномодулюючих, антиатеро-склеротичних та ангіопротекторних), який із високим ступенем імовірності може бути притаманним вищезазначеним речовинам, що вказувало на доцільність проведення серед них первинного фармакологічного скринінгу з метою визначення перспективних речовин для розробки нових антидіабетичних сполук.

Скринінг похідних янтарної кислоти на предмет виявлення антигіперглікемічної дії проводили на щурах із порушеною толерантністю, яку відтворювали за допомогою дексаметазону. Встановлено, що бета-фенілетиламід 2-оксисукцинанілової кислоти (фенсукцинал) знижує рівень інтегральної глікемії під час тесту толерантності до глюкози більш ніж на 30 % порівняно з групою, що отримувала плацебо (Р<0,05). Слід відзначити, що за ступенем виразності антигіперглікемічної дії ця речовина не поступалася глібенкламіду.

Відповідно до гіпотези, яка розглядає оксидативний стрес як першопричину індукованих гіперглікемією біохімічних порушень (підвищеного утворення продуктів посиленого глікозилювання, збільшення метаболізму глюкози по гексозаміновому і поліоловому шляху, а також активації протеїнкінази С та транскрипційного
фактору Nf-kB), що призводять до розвитку діабетичних ангіопатій, використання антиоксидантних препаратів може бути одним із оптимальних напрямків фармакотерапії ЦД та його судинних ускладнень (Nishikawa T. et al., 2000).

У результаті фармакологічного скринінгу на моделях in vitro та in vivo було встановлено, що найбільш виразна антиоксидантна активність притаманна сполукам з ряду діамідів янтарної кислоти. Серед останніх максимальну антиоксидантну активність (72,171,13) %, яка перевершує дію вітаміну Е (51,913,79) %, (Р<0,05), спостерігали при введенні фенсукциналу як на моделі оксидативного стресу in vivo (хімічно-індукований токсичний гепатит), так і на моделі окислення ліпопротеїнів яєчного жовтка in vitro, де загальна антиоксидантна активність фенсукциналу в концентрації 100 мкМ була на рівні (93,071,03) %.

Дослідження антиоксидантних властивостей фенсукциналу також проводилися за умов ферментативного (індукованого НАДФН) та неферментативного (індукованого аскорбатом) ПОЛ, яке оцінювалося за накопиченням МДА в печінці конт-рольних мишей та тварин з низькодозовим стрептозотоциновим діабетом (модель абсолютної інсулінової недостатності). Встановлено, що використання фенсукциналу в дозі 25 мг/кг маси тіла протягом двох тижнів призводить до пригнічення як
ферментативного (5,460,54) проти (8,700,68) ммоль МДА/мг білка (Р<0,01), так і неферментативного ПОЛ (1,930,22) проти (7,790,70) ммоль МДА/мг білка (Р<0,001), підвищеного за умов діабету, що може бути результатом одночасного впливу сполуки як на стан мембран, так і на активність електрон-транспортних ланцюгів. У той же час, слід відзначити, що НАДФН-залежне ПОЛ пригнічувалося
меншою мірою, ніж аскорбат-індуковане, що свідчить про наявність у фенсукциналу більш виразних властивостей “пастки” вільних радикалів.

Максимальна антигіперглікемічна та антиоксидантна активність, яка була
визначена для похідного янтарної кислоти – фенсукциналу, стала підставою для його розширеного доклінічного вивчення як потенційного антидіабетичного засобу.

Вплив фенсукциналу на регенерацію та функціональну активність
панкреатичних бета-клітин у щурів із неонатально-індукованим стрептозотоциновим діабетом. Відомо, що на момент клінічної маніфестації ЦД 1 типу внаслідок аутоімунної деструкції зостається лише 10 % панкреатичних бета-клітин, а за умов ЦД 2 типу глюкотоксичність та ліпотоксичність також спричиняють поступове погіршення функції та загибель інсулінпродукуючих клітин, що неминуче призводить до посилення інсулінової залежності. В зв’язку з цим одним із напрямків запобігання та ослаблення інсулінової недостатності може бути стимулювання регенерації та гальмування деструкції панкреатичних бета-клітин.

Вивчення можливого впливу фенсукциналу на регенерацію панкреатичних
бета-клітин після їх субтотальної деструкції проводили на моделі неонатально-індукованого стрептозотоцинового діабету. Отримані дані дозволяють зробити
висновок про те, що використання фенсукциналу в дозі 5 мг/кг маси тіла проявляє помірний вплив на проліферацію панкреатичних бета-клітин, тоді як підвищення дози до 25 мг/кг дає змогу констатувати виразний стимулюючий ефект. Так, число та площина острівців Лангерганса при використанні фенсукциналу в дозі 25 мг/кг зростали більш, ніж у чотири рази порівняно з діабетичним контролем (P<0,05), що вдвічі перевищує фармакологічну дію препарату порівняння – нікотинаміду в аналогічній дозі (P<0,05).

Збільшення дози фенсукциналу до 50 мг/кг маси тіла не призвело до по-
дальшої інтенсифікації репаративних процесів та сприяло гіпертрофічному росту острівців. Таким чином, доза фенсукциналу 25 мг/кг може бути визначена як максимально ефективна, тобто мінімальна доза, яка дозволяє отримати максимальну терапевтичну дію.

Слід зазначити, що застосування фенсукциналу в усіх дозах, на відміну від нікотинаміду, супроводжувалося зниженням рівня МДА в гомогенатах печінки діабетичних щурів (P<0,05), а в дозах 25 та 50 мг/кг сприяло вірогідному підвищенню вмісту жиророзчинних вітамінів (А, Е та бета-каротину), тоді як при введенні нікотинаміду достовірно зростав тільки рівень вітаміну Е (P<0,01).

Виявлений стимулюючий вплив фенсукциналу на регенерацію панкреатичних бета-клітин у поєднанні з антиоксидантними властивостями зумовлює перспективність його використання для гальмування розвитку інсулінової недостатності.

Оскільки останнім часом з'явилися повідомлення про можливість компенсації за допомогою похідних янтарної кислоти порушень в окисленні глюкози, що призводять до енергетичного виснаження бета-клітин (Malaisse W.J., 2001), важливо було дослідити вплив фенсукциналу на функціональний стан панкреатичних бета-клітин після їх субтотальної деструкції стрептозотоцином.

При оцінці секреторної активності ізольованих панкреатичних острівців у щурів із неонатально-індукованим стрептозотоциновим діабетом було показано, що
застосування фенсукциналу запобігає розвитку функціональної неповноцінності бета-клітин на всіх етапах еволюції абсолютної інсулінової недостатності, про що свідчила адекватна секреторна реакція на підвищений рівень глюкози через 2, 5 і 14 діб після індукції діабету (рис. 1).

Встановлено, що введення фенсукциналу запобігає індукованому стрептозотоцином підвищенню МДА в печінці експериментальних тварин на етапі макси-мального підйому гіперглікемії (через 2 доби після індукції діабету), а також призводить до зниження цього показника на 5 добу експерименту порівняно з діабетичним контролем (P<0,05). Антиоксидантний ефект фенсукциналу в цьому випадку може бути зумовлений впливом останнього на вміст відновленого глутатіону, підвищення якого спостерігалося через 2 доби (210,0±3,1) проти (148,5±15,7) мг%, (Р<0,01) та 5 діб (222,0±10,3) проти (181,5±4,8) мг%, (Р<0,01) після введення стрептозотоцину порівняно з відповідними контрольними групами діабетичних тварин.

Таким чином, отримані результати свідчать про те, що застосування фенсукциналу запобігає розвитку функціональної неповноцінності панкреатичних бета-клітин у процесі еволюції абсолютної інсулінової недостатності в щурів із неона-
тально-індукованим стрептозотоциновим діабетом. Виявлений превентивний ефект препарату реалізується, можливо, за рахунок його стимулюючого впливу на регенеративні процеси в інсулінпродукуючому апараті підшлункової залози, а також підвищення активності антиоксидантної системи захисту в діабетичних тварин.

Антидіабетогенні властивості фенсукциналу за умов хімічно-індукованої абсолютної інсулінової недостатності. На сьогодні накопичено достатньо даних, які свідчать про наявність у панкреатичних острівців репаративних та захисних механізмів, що можуть забезпечити виживання бета-клітин після токсичних та ауто-імунних атак.

Рис. 1 Вплив фенсукциналу та нікотинаміду на секрецію інсуліну ізольовани-ми панкреатичними острівцями за умов інкубації з 5 мМ (а) та 15 мМ (б) глюкозою в різні строки після індукції неонатального стрептозотоцинового діабету:

* – вірогідність змін порівняно з групою "діабет+плацебо" (P<0,05);

** – вірогідність змін порівняно з групою "діабет+нікотинамід" (P<0,05).

Виходячи з цього, розробка пероральних препаратів, які сприятимуть підвищенню системи захисту бета-клітин та/або зниженню їх антигенності в “перед-діабетичний період” відкриє нові можливості для запобігання або затримки клінічної маніфестації ЦД 1 типу.

У результаті досліджень антидіабетогенного ефекту фенсукциналу на моделі низькодозового стрептозотоцинового діабету з аутоімунним генезом абсолютної інсулінової недостатності було показано, що профілактичне введення препарату
сприяє зниженню базальної гіперглікемії (рис. 2), гіпоінсулінемії (P<0,05) та підвищенню коефіцієнта функції панкреатичних бета-клітин у п’ять разів порівняно з діабетичним контролем (Р<0,001).

Рис. 2 Вплив фенсукциналу та нікотинаміду на динаміку глікемії у мишей СBA протягом 15 діб від початку індукції низькодозового стрептозо-тоци-нового діабету:

* – вірогідність змін порівняно з групою "інтактний контроль", (Р<0,05);
** – вірогідність змін порівняно з групою "плацебо+стрептозотоцин", (Р<0,05).

Позитивний вплив фенсукциналу на глюкозний гомеостаз за умов індукції діа-бету також супроводжувався виразним антиоксидантним ефектом. Так, при вико-ристанні фенсукциналу спостерігалося не тільки зниження концентрації МДА (Р<0,05), а і зростання вмісту відновленого глутатіону (Р<0,01) у печінці експери-ментальних тварин відносно діабетичного контролю. Привертає увагу той факт, що за здатністю гальмувати інтенсивність ПОЛ фенсукцинал перевершував препарат порівняння – нікотинамід (Р<0,05).

Гістологічний аналіз порушень морфоструктури ендокринної частини підшлункової залози експериментальних тварин, який проводився з використанням напівкількісного методу градації інсулітів, показав, що ступінь лімфоцитарної інфільтрації в острівцях мишей, яким вводили фенсукцинал, був значно нижчим порівняно з діабетичним контролем (Р<0,05). Так, більшість підшлункових залоз мишей, що отримували плацебо, мали наявний інсуліт, тоді як після обробки фенсукциналом спостерігався в основному периінсуліт.

Таким чином, профілактичне введення фенсукциналу гальмує розвиток метаболічних та морфологічних проявів абсолютної інсулінової недостатності аутоімунного генезу, що проявляється в поліпшенні глюкозного гомеостазу, оксидативного статусу та зниженні виразності лімфоцитарної інфільтрації в панкреатичних острівцях експериментальних тварин.

Антидіабетогенний ефект фенсукциналу вивчався також на моделі абсолютної інсулінової недостатності прямого бета-цитотоксичного генезу, яка індукувалася введенням дитизону. Встановлено, що застосування фенсукциналу протягом семи діб до та семи після введення діабетогенного чинника, на відміну від нікотинаміду, гальмує вдвічі ріст базальної гіперглікемії та підвищує коефіцієнт функції панкреатичних бета-клітин у шість разів порівняно з діабетичним контролем (табл. 1).

Таблиця 1

Вплив фенсукциналу та нікотинаміду на показники глюкозного гомеостазу в кролів через 7 діб після індукції дитизонового діабету, (XSх)

Група
тварин | Базальна глікемія, ммоль/л | Базальна інсулінемія, пмоль/л | Коефіцієнт
ФБК

Інтактний контроль

(n=5) | 4,730,21 | 239,2016,67 | 700,5140,2

Плацебо + дитизон

(n=5) | 24,022,95

Р1<0,001 | 52,207,25

Р1<0,001 | 9,12,2

Р1<0,001

Фенсукцинал +

дитизон

(n=5) | 13,841,72

Р1<0,001

Р2<0,02

Р3<0,05 | 165,0019,69

Р1<0,05

Р2<0,001

Р3<0,05 | 59,014,3

Р1<0,02

Р2<0,01

Р3<0,05

Нікотинамід +

дитизон

(n=5) | 19,421,20

Р1<0,001

Р2>0,05 | 98,2014,46

Р1<0,001

Р2>0,05 | 20,13,8

Р1<0,001

Р2<0,05

Примітки:

1. P1 – вірогідність змін порівняно з групою “інтактний контроль”;

2. P2 – вірогідність змін порівняно з групою “ плацебо + дитизон”;

3. P3– вірогідність змін порівняно з групою “нікотинамід + дитизон”.

Крім того, було показано, що профілактичне введення фенсукциналу запобігає розвитку оксидативного стресу під впливом дитизону. Так, концентрація дієнових кон’югатів та малонового діальдегіду в сироватці крові та вміст первинних продуктів ПОЛ у гомогенатах печінки кролів, що отримували препарат, вірогідно знижувалися відносно діабетичного контролю (Р<0,05) і практично не відрізнялися від показників, що спостерігалися в інтактних тварин. У той же час активність каталази істотно підвищувалася (0,9450,004) проти (0,8460,018) нмоль/г?хв (Р<0,001) після введення фенсукциналу, що свідчить про активацію антиоксидантної системи захисту.

Гістологічний аналіз морфоструктури підшлункової залози експериментальних тварин підтвердив, що у тварин, які отримували фенсукцинал до та після ін’єкції дитизону, морфоструктура екзо- та ендокринної частини підшлункової залози була змінена меншою мірою порівняно з діабетичним контролем, тоді як при введенні нікотинаміду не спостерігали позитивних змін гістоструктури залози на тлі індукції діабету.

Слід відзначити, що, виходячи з особливостей хімічної будови фенсукциналу, йому на противагу нікотинаміду, можуть бути притаманні хелатоутворюючі властивості. У зв’язку з цим превентивний ефект фенсукциналу, імовірно, пов’язаний із його здатністю зв’язувати острівцевий цинк у нетоксичні комплекси, що перешкоджає утворенню цитотоксичного хелату з дитизоном. У той же час, профілактичний ефект фенсукциналу, можливо, пояснюється утворенням таких комплексів з цинком, які не впливають на активність ферментів. Крім того, не виключено, що превентивна дія фенсукциналу реалізується також за рахунок інших механізмів (відновлення енергетичного балансу в бета-клітинах, стимулювання їх регенерації та посилення антиоксидантної системи захисту).

Отримані результати дають можливість констатувати наявність у фенсукциналу профілактичного ефекту щодо розвитку абсолютної інсулінової недостатності прямого бета-цитотоксичного генезу, що проявляється в поліпшенні глюкозного гомеостазу, нормалізації оксидативного статусу та гальмуванні порушень гістоструктури підшлункової залози експериментальних тварин.

Виявлені антидіабетогенні властивості фенсукциналу за умов абсолютної інсулінової недостатності різного генезу зумовлюють доцільність його клінічної апробації як препарату для попередження або гальмування клінічної маніфестації ЦД
1 типу.

Вплив профілактичного введення фенсукциналу на розвиток інсулінорезистентності різного генезу. Виходячи з патогенезу ЦД 2 типу, фармакотерапія з метою поліпшення глікемічного контролю повинна бути спрямована як на підвищення інсулінової секреції, так і на зниження інсулінової резистентності, яка є одним з головних чинників ризику макросудинної патології. У той же час, навіть серед відносно здорової популяції значний відсоток осіб (понад 20 %) має інсулінорезистентність та пов’язані з нею серцево-судинні чинники ризику, об’єднані назвою “метаболічний синдром” (Isomaa B. et al., 2001).

Відомо, що порушення глюкозного гомеостазу через зниження дії інсуліну можуть виникати у хворих без діабету внаслідок глюкокортикоїдної терапії.

Встановлено, що 10-добове пероральне застосування фенсукциналу гальмує розвиток інсулінорезистентності, індукованої дексаметазоном, про що свідчить зниження базальної гіперінсулінемії (P<0,05), майже дворазове підвищення коефіцієнта чутливості до інсуліну (P<0,02), поліпшення толерантності до вуглеводів (P<0,02) та нормалізація рівня НЕЖК у сироватці крові експериментальних тварин. Антиоксидантний ефект фенсукциналу в цьому випадку був підтверджений зменшенням вмісту первинних та вторинних продуктів ПОЛ (P<0,01) у гомогенатах печінки щурів.

Слід відзначити, що за ступенем виразності протекторної дії щодо розвитку інсулінорезистентності, індукованої дексаметазоном, фенсукцинал не поступався препарату порівняння – метформіну.

Таким чином, отримані результати дозволяють зробити висновок про те, що пероральне застосування фенсукциналу запобігає розвитку первинної інсуліно-резистентності (без наявності базальної гіперглікемії), індукованої дексаметазоном. Виявлений превентивний ефект фенсукциналу, імовірно, реалізується за рахунок поліпшення ліпідного обміну та оксидативного статусу експериментальних тварин.

Дослідження впливу фенсукциналу проводили також на моделі вторинної інсулінорезистентності, тобто такої, що виникає через деякий час після індукції гіперглікемії, у щурів з відносною інсуліновою недостатністю.

Встановлено, що застосування фенсукциналу протягом чотирьох тижнів, на відміну від вітаміну Е, запобігає розвитку інсулінорезистентності у діабетичних тварин, підтвердженням чого є суттєво підвищений коефіцієнт чутливості до інсуліну (табл. 2).

Крім того, препарат проявляв гальмуючий вплив на розвиток інтолерантності до глюкози, істотно знижуючи показники ППКг порівняно з групою діабетичних тварин. Про поліпшення глюкозного гомеостазу під впливом фенсукциналу також свідчить підвищення коефіцієнта функції панкреатичних бета-клітин на 120порівняно з діабетичним контролем (див. табл. 2).

Встановлено, що застосування фенсукциналу протягом чотирьох тижнів істотно зни-жує рівень як первинних (P<0,05), так і вторинних продуктів ПОЛ (P<0,01) в гомогенатах печінки щурів, порівняно з діабетичним контролем.

Крім того, як і в попередніх дослідженнях, фенсукцинал виявляв супресивний ефект відносно процесів ліпідної пероксидації, який поєднувався з гальмуючим впливом на зростання концентрації НЕЖК в сироватці крові щурів з відносною інсуліновою недостатністю (P<0,001).