БІЛОЦЕРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

КІБКАЛО ДМИТРО ВІКТОРОВИЧ

УДК 619:616.36 – 004:612.751.3

ІНФОРМАТИВНІСТЬ БІОХІМІЧНИХ ПОКАЗНИКІВ СПОЛУЧНОЇ ТКАНИНИ В ДИФЕРЕНЦІАЛЬНІЙ ДІАГНОСТИЦІ ГЕПАТОДИСТРОФІЇ І ЦИРОЗУ ПЕЧІНКИ У КОРІВ

16.00.01 – діагностика і терапія тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Біла Церква – 2004

Дисертацією е рукопис

Робота виконана в Харківській державній зооветеринарній академії

Міністерства аграрної політики України.

Науковий керівник – доктор біологічних наук Тимошенко Ольга Павлівна,

Харківська державна зооветеринарна академія,

професор кафедри діагностики і клінічної біохімії

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор

Кондрахін Іван Петрович,

Південний філіал “Кримський державний агротехнологічний університет” Національного аграрного університету, завідувач кафедри терапії та клінічної діагностики

кандидат ветеринарних наук, доцент

Локес Петро Іванович,

Полтавська державна аграрна академія, завідувач

кафедри терапії

Провідна установа – Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної

медицини УААН, відділ біотехнології та лабораторія

фармакології і токсикології, м. Харків

Захист дисертації відбудеться 27.01.2005 р. о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 27.821.02 в Білоцерківському державному аграрному університеті за адресою: 09111, м. Біла Церква, вул. Ставищанська, 126; навчальний корпус № 8, ауд. № 1.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Білоцерківського державного аграрного університету за адресою: 09110, м. Біла Церква, Соборна площа, 8/1.

Автореферат розісланий 21.12.2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради ________________________ Стадник П.О

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. В Україні намітилася тенденція до поліпшення генетичного потенціалу поголів’я великої рогатої худоби молочного напряму. У багатьох господарствах створені стада високопродуктивних корів, надої яких становлять 6–8 тис. кг молока за лактацію (Буркат В.П., 1998). Але молочному тваринництву значних економічних збитків завдають внутрішні неінфекційні хвороби. Досить поширеними серед них є захворювання печінки (Кондрахін І.П., 2000; Левченко В.І., 2001). Так, при молочній продуктивності 5–6 тис. кг хвороби печінки діагностують у 50–70 % корів, а у тварин з продуктивністю більше 6 тис. кг – у 75–90 % (Влізло В.В., 1998).

Незважаючи на те, що діагностика та профілактика захворювань печінки у великої рогатої худоби добре висвітлені в науково-методичній літературі (Левченко В.І., 1986; Влізло В.В., 2000; Сахнюк В.В., 2003), деякі питання залишаються недостатньо вивченими. При діагностуванні хвороб печінки не розроблені біохімічні критерії, за допомогою яких можна було б оцінити стан її сполучної тканини, що особливо актуально при цирозі. Існуючі діагностичні методи дозволяють диференціювати гепатодистрофію та цироз печінки на досить пізніх стадіях, коли вже розвиваються необоротні зміни. Можливості біохімічного дослідження показників стану сполучної тканини печінки (глікопротеїни, хондроїтинсульфати, фракції глікозаміногліканів) при діагностиці її патології у великої рогатої худоби не вивчені і тому не використовуються в науковій і практичній ветеринарній медицині. Дослідження їх може стати істотним внеском у диференціальну діагностику гепатодистрофії та цирозу печінки.

Зв’язок дисертаційної роботи з науковими програмами. Дисертаційна робота є фрагментом наукової теми кафедри діагностики та клінічної біохімії Харківської державної зооветеринарної академії “Розробка і впровадження нових та вдосконалення існуючих методів лабораторної діагностики для оцінки стану здоров’я тварин”, № державної реєстрації 0102U003546.

Мета дослідження. Експериментально і теоретично обґрунтувати використання інформативних біохімічних показників стану сполучної тканини для диференціальної діагностики гепатодистрофії і цирозу печінки у корів.

Для досягнення мети необхідно було вирішити наступні завдання:

- вивчити в експерименті на білих щурах біохімічні критерії стану сполучної тканини печінки і обґрунтувати можливості їх використання для диферен-

ціальної діагностики гепатиту і цирозу;

- вивчити функціональний стан печінки та біохімічні показники, що ха-рактеризують її стромальні елементи, при гепатодистрофії і цирозі у корів;

- обґрунтувати використання біохімічних показників стану сполучної тканини як інформативних тестів у диференціальній діагностиці гепатодистрофії та цирозу печінки у корів;

- вивчити динаміку біохімічних показників функціонального стану гепатоцитів та сполучної тканини печінки у корів при сумісній патології – гепатодистрофії і гострому ацидозі рубця;

- обґрунтувати інформативність і доцільність використання біохімічних показників сполучної тканини при оцінці функціонального стану печінки у високопродуктивних корів при згодовуванні несвіжої пивної дробини на фоні незбалансованого раціону по енергії, протеїну і цукру.

Об’єкт дослідження – патологія печінки у корів.

Предмет дослідження – експериментальне і теоретичне обґрунтування інформативності біохімічних показників стану сполучної тканини печінки у корів для диференціальної діагностики гепатодистрофії та цирозу.

Методи досліджень – клінічні; експериментальне моделювання (гострий токсичний гепатит і цироз печінки у щурів); біохімічні при дослідженні тканин печінки (оксипролін, тирозин, гексозаміни, гексуронові кислоти, фракції глікоз-аміногліканів) та сироватки крові (глікопротеїни, загальні хондроїтинсульфати, фракції глікозаміногліканів, загальний білок, білкові фракції, сечовина, креатинін, сечова кислота, тимолова проба, стрічка Вельтмана, холестерол, ?-ліпопротеїни, загальний та кон’югований білірубін, аланінамінотрансфераза, аспартатамінотрансфераза, лужна фосфатаза, загальний кальцій, неорганічний фосфор, каротин); гістологічні (виготовлення гістопрепаратів зразків печінки корів з наступним забарвленням парафінових зрізів гематоксиліном і еозином та за Маллорі); методи статистичного аналізу.

Наукова новизна роботи полягає в експериментальному і теоретичному обґрунтуванні інформативності біохімічних показників сполучної тканини печінки та сироватки крові корів для диференціальної діагностики гепатодистрофії і цирозу. Вивчено перерозподіл окремих фракцій глікозаміногліканів (ГАГ) при цирозі печінки у корів. Уперше в сироватці крові корів визначені ліміти показників, що характеризують стан сполучної тканини: глікопротеїнів, загальних хондроїтинсульфатів, фракцій ГАГ. Під час роботи на моделях гострого токсичного гепатиту та цирозу печінки було виявлено зміни фракційного складу глікозаміногліканів печінки щурів та зв’язок їх рівня з показниками метаболітів обміну глікопротеїнів і ГАГ у сироватці крові.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено, апробовано, експериментально і теоретично обґрунтовано інформативний діагностичний комплекс біохімічних показників сироватки крові великої рогатої худоби із включенням у нього тестів, що характеризують стан сполучної тканини (глікопротеїни, хондроїтинсульфати та фракції глікозаміногліканів), який можна використовувати для диференціальної діагностики гепатодистрофії і цирозу печінки. Визначені межі коливань цих показників для корів української червоно-рябої молочної породи. Одержані результати використовуються в науково-дослідній роботі та при викладанні предметів “Ветеринарна клінічна біохімія” і “Внутрішні хвороби тварин” у Білоцерківському державному аграрному університеті та Харківській державній зооветеринарній академії.

Особистий внесок здобувача. Здобувач самостійно виконав усі експерименти і досліди на тваринах, провів клінічні та біохімічні дослідження сироватки крові, статистичну обробку, аналіз та узагальнення одержаних результатів. Гістологічні дослідження тканин печінки виконувалися за консультативної допомоги доцентів кафедри анатомії і гістології тварин Харківської державної зооветеринарної академії В.С.Бирки та М.М.Куща, біохімічні дослідження тканин печінки – кандидата біологічних наук, наукового співробітника відділу проблем лабораторної діагностики та імунології Інституту патології хребта і суглобів ім. М.І. Ситенка Г.Ф. Клюєвої.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідалися на Міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій

150-річчю з дня заснування ХЗВІ (Харків, 20–22 вересня 2001р.), 4-й науково-практичній конференції “Проблеми неінфекційної патології тварин” (Біла Церква, 3–4 червня 2003р.), звітній науковій конференції викладачів, наукових працівників і аспірантів Харківської зооветеринарної академії за підсумками науково-дослідної роботи за 2001 і 2002 роки (Харків, 16–17 листопада 2002 р.).

Публікації за темою дисертації. Результати експериментальних досліджень опубліковані у 8 статтях у фахових виданнях: “Збірник наукових праць Харківського зооветеринарного інституту” (1), “Збірник наукових праць Харківської державної зооветеринарної академії” (2), “Вісник Білоцерківського державного аграрного університету” (2), “Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З.Гжицького” (1), “Наукові праці Полтавської державної аграрної академії” (1), “Вісник Полтавської державної аграрної академії” (1).

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, 6 розділів результатів власних досліджень, їх узагальнення та аналізу, висновків і пропозицій, списку використаної літератури, що містить 201 джерело, у тому числі 61 – із далекого зарубіжжя. Робота викладена на 148 сторінках комп’ютерного тексту, ілюстрована 28 таблицями та 11 рисунками. У додатку наведено 10 документів.

ВИБІР НАПРЯМІВ ДОСЛІДЖЕНЬ, МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ

ВИКОНАННЯ РОБОТИ

Незважаючи на велику кількість публікацій з патології печінки, біохімічні критерії, які характеризують стан її сполучної тканини, практично не вивчалися. Водночас відомо, що при хворобах печінки ця тканина бере активну участь у розвитку патологічних процесів. Так, при цирозі печінки відбуваються зміни її міжклітинного складу, тому дослідження біохімічних показників, які характеризують стан строми печінки, можуть мати істотне значення в диференціації гепатодистрофії та цирозу печінки. Проте подібні повідомлення в літературі відсутні або обмежені лише даними щодо людей та лабораторних тварин, що й визначило напрям наших досліджень.

Робота виконувалася протягом 2000–2004 рр. на кафедрах діагностики і клінічної біохімії, анатомії та гістології тварин Харківської державної зооветеринарної академії, у відділі проблем лабораторної діагностики та імунології

Інституту патології хребта та суглобів ім. М.І. Ситенка, на базі господарства АТОВ “Харківплемсервіс”, забійного пункту ПП “Лайн С” Харківського та СВК “Димитрово” Великобурлуцького районів Харківської області. Проведено клінічне дослідження та лабораторний аналіз крові 20 щурів та 32 корів.

На першому етапі інформативність біохімічних показників сполучної тканини для диференціації гострого гепатиту і цирозу печінки вивчали після експериментального відтворення патології на білих щурах лінії Wistar (по 5 тварин у кожній групі). Гострий токсичний гепатит моделювали шляхом внутрішньочеревинного введення карбону тетрахлориду (СCl4) в дозі 0,2 мл 50 %-ного олійного розчину; цироз печінки – введенням СCl4 підшкірно по 0,2–0,4 мл два – три рази на тиждень протягом трьох місяців. Десять інтактних щурів були контрольними до 1-ї (токсичний гепатит) та 2-ї (цироз) груп і становили 3-ю та 4-у групи відповідно. Після введення СCl4, згідно з методикою, щурів виводили з досліду методом декапітації під гексеналовим наркозом, відбирали проби крові і зразки печінки.

Вивчали функціональний стан гепатоцитів (активність АлАТ і АсАТ) та сполучної тканини печінки, визначаючи: а) в сироватці крові – вміст хондроїтинсульфатів та глікопротеїнів; б) у тканині органа – вміст оксипроліну, тирозину, гексозамінів, гексуронових кислот.

На другому етапі інформативність біохімічних показників сполучної тканини вивчали на коровах ПСП “Комуніст” (на забійному пункті ПП “Лайн С”) віком 5–10 років, 5 з яких були клінічно здорові, 5 – хворі на гепатодистрофію та 5 – хворі на цироз печінки. Після клінічного дослідження виконували біохімічний аналіз крові цих корів, після забою проводили патолого-морфологічну оцінку та відбирали зразки печінки для гістологічних досліджень і визначення біохімічних показників, що характеризують стан сполучної тканини. У тканині печінки визначали вміст оксипроліну, тирозину, гексуронових кислот, глікоз-аміногліканів та їх фракцій. Для оцінки стану сполучної тканини печінки в сироватці крові корів досліджували вміст хондроїтинсульфатів (ХСТ), глікопротеїнів (ГП), глікозаміногліканів та їх фракцій (хондроїтин-6-сульфату, хондроїтин-4-сульфату, гепарансульфату). Функціональний стан гепатоцитів оцінювали за результатами визначення їх білоксинтезувальної, пігментної і сечовино-утворювальної функцій та активності ферментів (АлАТ, АсАТ, ЛФ).

На третьому етапі вивчали клініко-біохімічну характеристику корів при сумісному перебізі патології: гепатодистрофія – гострий ацидоз рубця, в тому числі інформативність показників сполучної тканини – ГП та ХСТ – для діагностики стану печінки. Дослідження проводили у СВК “Димитрово” на коровах, симентальської породи віком 5–7 років, кількістю 10 голів, продуктивність 3–4 тисяч літрів молока за лактацію, у яких на фоні гепатодистрофії виник спалах гострого ацидозу рубця. Тварин досліджували клінічно та проводили біохімічний аналіз крові на 1-, 2-, 3-, 7-, 14-, 21-, 28- та 56-у добу після захворювання на гострий ацидоз рубця. Для оцінки стану сполучної тканини печінки в сироватці крові корів визначали вміст хондроїтинсульфатів та глікопротеїнів. Функціональний стан печінки оцінювали за результатами визначення білоксинтезувальної, пігментної та сечовиноутворювальної функцій, активності ферментів (АлАТ, АсАТ, ЛФ).

На четвертому етапі в АТОВ “Харківплемсервіс” також вивчали інформативність біохімічних показників сполучної тканини, що визначали в сироватці крові у корів української червоно-рябої молочної породи, які утримувалися на незбалансованому раціоні до складу якого входила несвіжа пивна дробина протягом тривалого часу в період лактації, три роки поспіль: у лютому 2001, 2002 та 2003 років. Для оцінки стану сполучної тканини та функціонального стану печінки визначали ті самі показники, що й на третьому етапі.

У сироватці крові визначали такі показники: загальний білок – рефрактометрично та біуретовим методом; білкові фракції – методом електрофорезу на папері в мединал-вероналовому буфері; сечовину – за кольоровою реакцією з діацетилмонооксимом; креатинін – за кольоровою реакцією Яффе (метод Поп-пера); холестерол – за методом Ілька; ?-ліпопротеїни – турбідиметричним методом за Бурштейном і Самаєм; загальний та кон’югований білірубін – модифікованим методом Ієндрашика; глікопротеїни (ГП) – за методом Штейнберга – Доценка; хондроїтинсульфати (ХСТ) – за методом Nеmeth – Csoka у модифікації Л.І. Слуцького; фракції глікозаміногліканів (хондроїтин-6- та хондроїтин-4-сульфат, гепарансульфат) – за М.Р.Штерном зі співавт.; загальний кальцій – комплексонометричним методом з індикатором мурексидом (за Луцьким Д.Я.); неорганічний фосфор – за реакцією з аскорбіновою кислотою (метод Фіске-Субароу); каротин – методом Карр-Прайса в модифікації Юдкіна; активність АлАТ та АсАТ визначали за допомогою уніфікованого динітрофенілгідразинового методу за Райтманом і Френкель; лужної фосфатази – за методом Боданські. Колоїдну стійкість білків встановлювали тимоловою пробою за Маклаганом та за допомогою стрічки Вельтмана.

У гідролізатах тканин печінки визначали вміст оксипроліну (Опро) за методом H. Stegemann, тирозину (Тир) – за методом Л.І. Слуцького, загальних гексозамінів (ГА) – за методом N.P. Boas. Рівень гексуронових кислот (ГУ) визначали за вмістом глюкуронової кислоти методом T. Bitter та H.M. Muir. Гістологічні зрізи тканин печінки робили за класичною схемою виготовлення гістопрепаратів з наступним фарбуванням парафінових зрізів гематоксиліном і еозином. Підрахунок відсотка строми в гістологічних зрізах печінки проводили за методом тестового точкового підрахунку (n=256) за Г.Г. Автанділовим. Сечу і молоко досліджували на вміст кетонових тіл реактивом Розера.

Математична обробка проводилася статистичними методами за допомогою непараметричного Х критерію Ван дер Вардена, Т критерію Фішера – Стьюдента та стандартного пакету “Статистика” в програмі ЕХЕL 2000.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Експериментальне відтворення гострого токсичного гепатиту та

цирозу печінки у білих щурів

Поглиблене вивчення можливості диференціальної діагностики гепато-дистрофії і цирозу печінки у корів з використанням біохімічних досліджень є актуальною, але досить складною проблемою. Тому дослідженням цих захворювань у корів передували експерименти на білих щурах, яким уводили у двох різних регламентах карбону тетрахлорид. Було встановлено, що біохімічним критерієм гострого токсичного гепатиту у тварин стало вірогідне зниження, порівняно з контрольною групою, вмісту загальних тканинних гексозамінів (р<0,001) та гексуронових кислот (p<0,05) у зв’язку з ушкодженням паренхіми печінки внаслідок запального процесу, що призвело до зменшення суми всіх компонентів, які досліджувалися (табл.1). Це супроводжувалося вірогідним (р<0,001 та р<0,01 відповідно) підвищенням рівня глікопротеїнів і хондроїтинсульфатів у сироватці крові, джерелом яких була ушкоджена печінка. Підвищення активності АлАТ у 2,1 рази, порівняно з контрольною групою, на фоні незначного збільшення активності АсАТ (в 1,19 рази) на моделі токсичного гепатиту свідчило про руйнування клітинних мембран гепатоцитів без істотного порушення мітохондрій.

При довготривалому експерименті, який тривав протягом трьох місяців і призводив до розвитку цирозу печінки у білих щурів, ушкодження її структури і функції характеризувалися іншими метаболічними критеріями, ніж при токсичному гепатиті. У зразках печінки при цирозі спостерігалося вірогідне (р<0,001) підвищення вмісту оксипроліну у порівнянні як з клінічно здоровими щурами, так і тваринами з ознаками токсичного гепатиту, що було безперечним свідченням її фіброзу.

Таблиця 1 – Біохімічні компоненти сполучної тканини в печінці і сироватці

крові білих щурів при експериментальному гострому

токсичному гепатиті і цирозі печінки

Група

Показник | Контроль | Токсичний

гепатит

(дослід I) | Цироз

(дослід II) | р<

між групами (дослід I і II) | Тканини, г/100г | Оксипролін | 0,15±0,003 | 0,153±0,003 | 0,496±0,002*** | 0,001 | Тирозин | 0,276±0,040 | 0,27±0,042 | 0,346±0,020 | 0,1 | Гексозаміни | 0,61±0,011 | 0,508±0,006*** | 0,772±0,007*** | 0,001 | Гексуронові

кислоти | 0,28±0,024 | 0,209±0,002* | 0,258±0,003 | 0,001 | Сума: Опро, Тир, ГА, ГУ | 1,316±0,045 | 1,14±0,037* | 1,872±0,015*** | 0,001 | Сироватка крові | Хондроїтин-сульфати, г/л | 0,358±0,017 | 0,432±0,013* | 0,528±0,007*** | 0,001 | Глікопротеїни, од. | 0,636±0,013 | 0,80±0,009*** | 0,77±0,008** | 0,5 | АлАТ,

ммоль/годл | 2,00±0,071 | 4,21±0,084*** | 3,50±0,061*** | 0,01 | АсАТ,

ммоль/годл | 3,11±0,097 | 3,69±0,051** | 5,80±0,036*** | 0,001 | Примітка. Вірогідна різниця з контролем*-р<0,05; **-р<0,01; ***-р<0,001

Іншим показником фіброзу печінки у щурів було підвищення вмісту гексозамінів (р<0,001), вміст гексуронових кислот, порівняно з контролем, не змінився, але при гепатиті він знижувався, тому різниця між дослідними групами була вірогідною (р<0,001). Сума вмісту оксипроліну, тирозину, глікоз-аміногліканів і гексуронових кислот, тобто показників, які характеризують стан сполучної тканини, при цирозі збільшилася на 43,5 % (р<0,001), а при гепатиті – зменшилася (р<0,05), тому різниця між дослідними групами була вірогідною (р<0,001) і становила 64,0 %. Цироз печінки супроводжувався вірогідним (р<0,001) збільшенням у сироватці крові концентрації хондроїтинсульфатів (на 23,2 %, порівняно з токсичним гепатитом; табл.1), що має діагностичне значення для диференціації цирозу печінки і гепатиту. Одночасне вірогідне (р<0,001) підвищення активності АлАТ і АсАТ було ознакою глибоких руйнівних змін гепатоцитів, тобто цитолітичного синдрому. Одержані в експерименті дані були використані для подальшого вивчення диференціальної діагностики цирозу печінки і гепатодистрофії у корів.

Інформативність показників сполучної тканини при диференціації

гепатодистрофії і цирозу печінки у корів

Було проведено комплексне обстеження корів з використанням клінічних, морфологічних і біохімічних методів вивчення структури і функціонального стану печінки. У корів, хворих на гепатодистрофію та цироз печінки, при клінічному обстеженні спостерігали подібні симптоми: загальний стан тварин був задовільним, температура тіла – в межах норми; спостерігалися зниження продуктивності та вгодованості, гіпотонія передшлунків, розлади серцево-судинної системи, гепатомегалія. Тому діагноз був уточнений морфологічними дослідженнями, проведеними після забою тварин. Було досліджено три серії зразків печінки, одержаних при розтині туш корів: а) зразки без істотних ушкоджень печінки; б) зразки печінки з ознаками гепатодистрофії; в) зразки печінки з ділянками цирозу.

Гістологічно тканина печінки корів, хворих на гепатодистрофію, на відміну від здорових (рис. 1), характеризувалася диcкомплексацією балок, розмитістю, їхніх контурів. Гепатоцити були збільшені, поліморфні, межі розмиті, цитоплазма дещо просвітлена, ядра збільшені, спостерігалася їх вакуолізація (жирова дистрофія; рис. 2). При морфометричному аналізі препаратів печінки загальна кількість стромальних елементів становила 8,1 – 10,0 %.

Тканина печінки корів, хворих на цироз, характеризувалася значним розростанням сполучної тканини уздовж жовчних ходів та кровоносних судин (рис. 3). Кількість стромальних елементів у препаратах становила 23,0–31,3 %.

Рис. 1. Норма. Зб.400 Рис 2. Жирова гепато- Рис. 3. Біліарний

дистрофія. Зб.400 цироз. Зб.200

Більша частина біохімічних показників, які характеризують функціональний стан паренхіми печінки корів при гепатодистрофії і цирозі (активність трансфераз, уміст сечовини, білірубіну, холестеролу), змінювалась односпрямовано і в однаковій мірі (табл. 2). Значно зниженим був при цирозі печінки вміст альбумінів, проте зміни тимолової проби і стрічки Вельтмана не завжди були показовими. Найбільш інформативною для диференціації цирозу є кількість -ліпопротеїнів: вона була у 2,9 рази більша, ніж у хворих на гепатодис-трофію, оскільки при цьому захворюванні вміст їх знижується. Проте необхідно зазначити, що вміст -ліпопротеїнів у сироватці крові корів, хворих на цироз, вірогідно не відрізнявся від показників у клінічно здорових, що знижує діагностичну цінність їх визначення.

Таблиця 2 – Показники функціонального стану печінки у корів при

гепатодистрофії та цирозі (M±m)

Показник | Група корів | Різниця між

хворими

коровами

р | клінічно

здорові

(n=5) | з ознаками

гепатодистрофії

(n=5)з ознаками

цирозу

(n=5)Білок, г/л | 81,9±1,39 | 77,2±1,48* | 72,2±1,83** | 0,1 | Альбуміни, г/л | 35,2±0,63 | 30,3±0,93** | 23,8±2,30*** | 0,05 | Глобуліни, г/л | 1-4,8±0,40 | 4,4±0,70 | 4,3±0,30 | 0,5 | 2-6,9±0,47 | 8,1±0,52 | 8,0±0,97 | 0,5 | - | 11,5±0,60 | 18,6±1,56** | 17,63±0,81** | 0,5 | - | 23,5±1,40 | 15,8±1,70 | 18,33±1,00 | 0,1 | Коефіцієнт А/Г | 0,75±0,01 | 0,65±0,04* | 0,50±0,05 | 0,01 | Тимолова проба, од. | 1,96±0,14 | 1,0±0,22** | 2,1±0,37 | 0,01 | Сечовина, ммоль/л | 4,0±0,10 | 3,5±0,42 | 3,1±0,12*** | 0,5 | Білірубін, мкмоль/л | 5,1±0,22 | 8,5±0,64*** | 8,9±1,2* | 0,5 | Холестерол, ммоль/л | 3,9±0,39 | 5,2±0,12* | 5,1±0,22* | 0,5 | -ліпопротеїни, од. | 5,1±0,42 | 2,34±0,77* | 6,7±0,72 | 0,01 | АсАТ, ммоль/годл | 1,6±0,07 | 1,88±0,04** | 1,8±0,13 | 0,5 | АлАТ, ммоль/годл | 0,97±0,05 | 1,49±0,14* | 1,2±0,15 | 0,5 | Примітка. * – р0,05; ** – р0,01; *** – р0,001, порівняно з контролем

На відміну від показників, що характеризують стан гепатоцитів, зміни біохімічних критеріїв сполучної тканини були більш вираженими. У тканинах печінки корів, хворих на гепатодистрофію, відбувалося підвищення вмісту оксипроліну (на 26,2 %; р0,01) і вуглеводовмісних білкових сполук – тирозину (р0,05), гексозамінів (34,9 %; р0,001), що є ознакою початкового розростання сполучної тканини (табл.3). Проте, частка оксипроліну в сумарній кількості компонентів сполучнотканинного матриксу не збільшувалася.

Зміни біохімічних показників сполучної тканини печінки у корів, хворих на цироз, на відміну від гепатодистрофії, характеризувалися значно більшим ступенем вірогідності (р0,001) підвищення вмісту оксипроліну (на 74,4 %), тирозину (56,3 %), гексозамінів (58,1 %), порівняно з клінічно здоровими коровами. Збільшення окремих компонентів матриксу печінки призвело до значного зростання (64,2 %) їх сумарної кількості (р0,001). У тканині печінки збільшується загальна кількість ГАГ (на 30,8 %; р0,001), які синтезуються юними фібробластами, що є, очевидно, захисною реакцією організму на початковому етапі фіброзу. Найбільш істотні зміни серед фракцій ГАГ виявлені щодо вмісту першої (р0,001), у складі якої переважає гіалуронова кислота, що необхідна для забезпечення механічних властивостей колагенових фібрил (Слуцкий Л.И., 1969). Кількість перерахованих компонентів сполучної тканини та хондроїтинсульфатів у корів, хворих на цироз печінки, була вірогідно більшою не лише в порівнянні з клінічно здоровими, а й з тваринами, хворими на гепатодистрофію (р0,05–0,001; табл. 3). Лише вміст специфічного компоненту базальних мембран у печінці третьої фракції ГАГ – гепарансульфатів і гепарину – в тканині печінки при цирозі була дещо меншою, ніж при гепатодистрофії. Відомо, що саме цей компонент тканинних ГАГ у нормі переважає у печінці і є маркером ураження її паренхіми.

Таблиця 3 – Біохімічні показники стану сполучної тканини при гепатодистрофії

та цирозі печінки у корів (M±m)

Біохімічний показник | Клінічно

здорові | Гепато-

дистрофія, n=5 (І група) | Цироз

печінки, n=5 (ІІ група) | Різниця між І і ІІ

групами | у процент. | p< | Тканина, г/100 г | Оксипролін | 0,82±0,02 | 1,04±0,02** | 1,43±0,010

*** | 37,5 | 0,001 | Тирозин | 0,16±0,0070,21±0,008* | 0,25±0,010

*** | 19,0 | 0,05 | Гексозаміни | 0,43±0,0140,58±0,013

*** | 0,68±0,012

*** | 17,2 | 0,001 | Гексуронові кислоти | 0,35±0,0330,46±0,067 | 0,53±0,067* | 15,2 | 0,1 | Сума (Опро, Тир, ГА, ГУ) | 1,76±0,042,29±0,06

*** | 2,89±0,085

*** | 26,2 | 0,001 | Фракції ГАГ, г/100 | І-гіалуронова

кислота | 0,14±0,0020,17±0,001

*** | 0,21±0,002

*** | 23,5 | 0,001 | ІІ-хондроїтин-сульфат | 0,057±0,0030,065±0,002 | 0,08±0,006* | 23,1 | 0,05 | ІІІ-гепаран-сульфат | 0,06±0,030,06±0,001 | 0,05±0,004

** | 16,7 | 0,5 | сума фракцій | 0,257±0,0040,295±0,003

*** | 0,34±0,006

*** | 15,3 | 0,001 | Сироватка | Хондроїтинсульфати, г/л | 0,05±0,0030,04±0,004 | 0,13±0,006

*** | 325,0 | 0,001 | Глікопротеїни, од | 0,41±0,0130,47±0,013* | 0,6±0,022** | 27,7 | 0,001 | Фракції ГАГ, од | І-хондроїтин-6-сульфат | 4,34±0,235,54±0,42* | 8,15±0,38

*** | 47,1 | 0,01 | ІІ-хондроїтин-4-сульфат | 2,52±0,152,38±0,07 | 3,66±0,08

*** | 53,8 | 0,01 | ІІІ-гепаран-сульфат | 1,12±0,091,56±0,06** | 2,26±0,08

*** | 44,9 | 0,001 | сума фракцій | 7,98±0,439,48±0,52 | 14,07±0,08

*** | 48,4 | 0,001 | Примітка. * – р0,05; ** – р0,01; *** – р0,001, порівняно з контролем.

У корів при цирозі печінки вірогідно (р0,001) підвищений уміст сироват-кових глікопротеїнів, і особливо загальних хондроїтинсульфатів (р<0,001), у порівнянні з тваринами контрольної групи і хворими на гепатодистрофію (табл. 3). При цирозі ХСТ було в 3,25 рази більше, ніж при гепатодистрофії, та у 2,6 рази – порівняно з нормою. Навіть мінімальна кількість ХСТ та ГП у сироватці крові при цирозі (0,11г/л і 0,55 од. відповідно) була більшою за максимальну (0,06 г/л і 0,51 од.) – при гепатодистофії. Уміст ХСТ підвищується також при остеодистрофії у корів, але, за нашими даними, концентрація їх при цьому значно вища (0,212 – 0,245 г/л), ніж при цирозі печінки (0,11 – 0,14 г/л).

Вміст ГАГ при цирозі печінки підвищувався за рахунок усіх фракцій, проте найбільше зростав рівень хондроїтин-6-сульфату (на 87,8 %; р0,001) і хондроїтин-4-сульфату (45,2 %; р0,001). Ці зміни дозволяють диференціювати цироз печінки від гепатодистрофії, оскільки ліміти цих фракцій при обох захворюваннях не перекриваються: вміст хондроїтин-6-сульфату при цирозі печінки становить 7,0–9,3, при гепатодистрофії – 4,1–6,5 од.; хондроїтин-4-сульфату, відповідно, 3,5–3,9 і 2,2–2,6 од. Проте, рівень саме цих двох фракцій глікозаміногліканів зростає і при остеодистрофії (Зухрабов А.В., 1986; Тимошенко О.П., Боровков С.Б., 2003). У таких випадках критерієм, який дозволяє диференціювати захворювання печінки та остеодистрофію, стає фракція гепарансульфату, який не міститься в кістковій тканині і вважається специфічним глікозаміногліканом печінки (Слуцкий Л.И., 1969; Уайт А., Хандлер Ф., 1980; Марри Р. и др., 1993), тому підвищення вмісту гепарансульфату в сироватці крові до 2,1–2,5 од. (р0,001) і концентрації ХСТ до 0,11 – 0,14 г/л (р0,001) є специфічними ознаками цирозу печінки.

При цирозі печінки вміст сироваткових гепарансульфатів зростає удвічі, що є наслідком руйнування і перебудови її тканини і підтверджувалося результатами гістологічних досліджень. У корів, хворих на гепатодистрофію, збільшення вмісту гепарансульфатів менш показове.

Таким чином, найбільш інформативними біохімічними тестами для диференціальної діагностики спонтанної гепатодистрофії і цирозу печінки у корів виявилися такі: вміст хондроїтинсульфатів, глікопротеїнів та фракцій ГАГ сироватки крові, які характеризують обмін сполучної тканини в печінці. Інші тести, за винятком вмісту альбумінів і -ліпопротеїнів, не були достатньо інформативними, щоб диференціювати цироз від гепатодистрофії.

Показники метаболічного профілю та стану сполучної тканини

печінки при поєднаному перебізі гепатодистрофії та гострого ацидозу рубця

Одержані результати були використані при дослідженні функцій печінки корів, хворих на поєднану патологію: гепатодистрофія – гострий ацидоз рубця. Дослідження проводили на початку спалаху гострого ацидозу рубця, у процесі лікування і протягом 56-ти діб з моменту виникнення захворювання. У корів, які мали клініко-біохімічні ознаки гепатодистрофії (гепатомегалія, низький рівень альбумінів – 37,2±2,78 %, підвищення активності амінотрансфераз майже у 2 рази, порівняно з контролем), були виявлені клінічні ознаки гострого аци-дозу рубця (пригнічення, гіпотонія рубця, діарея, кульгавість, зниження величини рН вмісту рубця до 4,0–5,0). Було проведено лікування тварин: змінено склад раціону, коровам вводили всередину 150 г натрію гідрокарбонату в 1 л води 5 разів протягом однієї доби та одноразово внутрішньовенно ін’єктували 800 мл 4%-ного розчину натрію гідрокарбонату. На четверту добу клінічні прояви гострого ацидозу рубця були відсутні, з чого було зроблено висновок, що тварини одужали. Паралельно проводилося біохімічне дослідження сироватки крові. На 1–2-у добу і через 3 доби з початку спалаху ацидозу відбувалося підвищення активності АлАТ і АсАТ, вмісту холестеролу, зниження вмісту загаль-ного білка, збільшення концентрації загального білірубіну. Це вказує на прогресуюче ушкодження гепатоцитів, порушення білоксинтезувальної функції печінки і наявність цитолітичного синдрому. Найбільші зміни виявилися на 14 добу з моменту спалаху гострого ацидозу рубця, коли 12 з 16 біохімічних тестів не відповідали показникам норми. У більшості тварин спостерігалися гіпо-альбумінемія (32,2±0,83%), підвищення рівня б1- і ?-глобулінів; зниження вмісту г-?лобулінів; ріст концентрації глікопротеїнів – до 0,55±0,02 од. (норма – 0,25–0,45 од.) і хондроїтинсульфатів – до 0,129±0,004 г/л (до спалаху ацидозу рубця – 0,09±0,005 г/л). Знижувався вміст сечовини (2,5±0,18 ммоль/л) і підвищувався вміст білірубіну (8,4±0,24 мкмоль/л); рівень ?-ліпопротеїнів трохи перевищував норму – 6,2±0,03 од. (норма – 3,0–6,0 од); залишалася підвищеною активність обох трансфераз (АлАТ – 1,8±0,07; норма до 1,0 ммоль/год·л та АсАТ – 3,0±0,09; норма до 1,5 ммоль/год·л).

Подальші спостереження (на 21-у, 28- та 56-у добу) підтвердили участь сполучної тканини в патологічному процесі: підвищувався вміст глікопротеїнів і хондроїтинсульфатів (рис. 4), що свідчить про розвиток фіброзу в печінці корів при поєднаній патології: гепатодистрофія – гострий ацидоз рубця.

Рис.4. Рівень ХСТ та ГП у сироватці крові корів при поєднаній патології:

гепатодистрофія – гострий ацидоз рубця

Дослідження стану печінки корів, яким згодовували пивну дробину на фоні незбалансованого раціону

Обстеження корів проводилося взимку, протягом трьох років поспіль (2001–2003). У 2002 р. до складу раціону корів замість буряків і частини силосу ввели неякісну пивну дробину, кількість концентратів зменшилася з 43,7 % у 2001 р. до 40 %. Раціон був дефіцитним за енергією (27,1 %), перетравним протеїном (21,2 %), цукром (43 %), макроелементами. Внаслідок цього у тварин виникла гепатодистрофія, про що свідчить вірогідне (р<0,05) зниження вмісту альбумінів, порівняно з 2001 р. (37,5±0,34 % та 40,5±1,12 % відповідно) та зростання – -глобулінів (31,5±1,20 %, порівняно з 27,2±1,42 % у 2001 році); зменшення А/Г коефіцієнта на 14,3 % (р<0,05), подовження стрічки Вельтмана до 8,4±0,30 пробірки (7,4±0,20 проб. у 2001р.; р<0,05) та підвищення активності АсАТ (на 13,2 %) і особливо АлАТ (1,3±0,08 ммоль/годл проти 0,77±0,13 – у 2001 р.; р<0,01). У 2003 р. коровам продовжували згодовувати неякісну пивну дробину, раціон залишався дефіцитним за енергією і цукром, цукро-протеїнове відношення було низьким. У зв’язку з цим зміни в печінці посилювалися:

збільшувалася кількість стромальних елементів, що підтверджувалося підвищенням вмісту сироваткових глікопротеїнів до 0,57±0,02 од. (р<0,001) і хондроїтин-

сульфатів у 2,3 рази – 0,18±0,009 г/л (0,08±0,004 г/л у 2001р.; р<0,001) на фоні менш виражених змін показників стану паренхіми печінки.

Таким чином, визначення біохімічних критеріїв стану сполучної тканини виявилося інформативним для диференціальної діагностики гепатодистрофії і цирозу печінки у корів. Вартість діагностичного комплексу (АсАТ, АлАТ, сечовина, креатинін, колоїдно-осадові проби, холестерол, ХСТ та ГП) для дослідження однієї проби сироватки крові корів, яка розрахована тільки з урахуванням ціни реагентів та енергоносіїв, становить, у середньому, 4,3 гривні. Одне визначення вмісту ХСТ коштує 15 коп., а ГП – 21 коп.

ВИСНОВКИ

1. На основі експериментального моделювання гострого токсичного гепатиту та цирозу печінки у білих щурів і вивчення патогенезу спонтанної гепатодистрофії та цирозу печінки у корів обґрунтована доцільність використання ін-

формативних біохімічних показників стану сполучної тканини (оксипроліну, тирозину, гексозамінів, гексуронових кислот та фракцій глікозаміногліканів у тканині печінки, глікопротеїнів, хондроїтинсульфатів і фракцій глікозаміногліканів у сироватці крові) для диференціальної діагностики гепатодистрофії і цирозу печінки у корів, що є новим розв’язанням одного з найважливіших завдань ветеринарної гепатології.

2. Одноразове введення білим щурам внутрішньочеревинно 50 %-ного олійного розчину карбону тетрахлориду в дозі 0,2 мл спричинює гострий токсичний гепатит, який, порівняно з клінічно здоровими тваринами, характеризується такими змінами: а) у тканині печінки – зниженням умісту гексозамінів на 17,8 % (р0,001), гексуронових кислот – на 25,1 (р0,05), сумарного вмісту оксипроліну, тирозину, гексозамінів та гексуронових кислот на 14,0 % (р0,05);

б) у сироватці крові – підвищенням концентрації хондроїтинсульфатів (0,432 0,013 г/л; р0,01), глікопротеїнів (0,800,009 од., р0,001), активності АлАТ у 2,1 рази (р0,001) і АсАТ – у 1,19 рази (р0,01).

3. Після введення білим щурам підшкірно карбону тетрахлориду в дозі 0,2 – 0,4 мл на 100 г маси тіла 2 – 3 рази на тиждень протягом трьох місяців розвивається цироз печінки, який проявляється такими ознаками : а) у тканині печінки – підвищенням вмісту гексозамінів – у 1,28 рази (р0,001), оксипроліну – 3,35 (р0,001), тирозину – у 1,25 рази (р0,01), вмісту сумарної кількості оксипроліну, тирозину, гексозамінів і гексуронових кислот – на 43,5% (р0,001);

б) у сироватці крові –лише значним підвищенням концентрації хондроїтин-

сульфатів (на 50,0 %; р0,001) та активності АсАТ (р0,001).

4. При клінічному дослідженні корів, хворих на спонтанну гепатодистрофію і цироз печінки, виявляються схожі клінічні симптоми: анорексія, гіпотонія передшлунків, інколи діарея, гепатомегалія (збільшення печінкового поля притуп-лення в 11- му міжреберному проміжку до 12–17 см).

5. Функціональний стан печінки у корів при цирозі, порівняно з гепатодистрофією, вирізняється більш низьким умістом альбумінів (на 21,5 %; р0,05) та підвищеною кількістю -ліпопротеїнів (р0,001). Зміни активності аміно-

трансфераз, вмісту сечовини, білірубіну та холестеролу при обох захворюваннях майже однакові (р0,5).

6. Спонтанна гепатодистрофія корів характеризується підвищенням умісту оксипроліну в тканині печінки на 26,8 % (р0,01), тирозину – 31,3 (р0,05), гексозамінів – 34,9 (р0,001), суми оксипроліну, тирозину, гексозамінів і гексуронових кислот – 30,1 (р0,001), а також суми всіх фракцій ГАГ на 14,8 % (р0,001), порівняно з клінічно здоровими коровами. Зміни біохімічних компонентів тканини печінки у корів при цирозі характеризуються більш високим ступенем вірогідності (р0,001) збільшення вмісту оксипроліну (на 74,4 %), тирозину (56,3), гексозамінів (58,1), гексуронових кислот (51,4) їх сумарної кількості (64,2), а також фракції тканинних ГАГ – гіалуронової кислоти (на 50 %)

порівняно з клінічно здоровими коровами. Вміст перерахованих показників сполучної тканини, а також хондроїтинсульфатів у корів, хворих на цироз печінки, був вірогідно більшим (р0,05–0,001), ніж при гепатодистрофії.

7. У сироватці крові корів при спонтанній гепатодистрофії виявлені зміни окремих показників, що характеризують стан сполучної тканини, а саме: підвищення концентрації глікопротеїнів – на 14,7 % (0,470,013 од, р0,05), хондроїтин-6-сульфату – 27,6 (5,540,42 од, р0,05) та гепарансульфату – на 39,3 % (1,560,06 од., р0,01). При цирозі печінки, на відміну від гепатодистрофії, підвищується рівень усіх показників сполучної тканини в сироватці крові, причому ці зміни характеризуються більш високим ступенем вірогідності (р0,01–0,001): концентрація хондроїтинсульфатів підвищується у 2,6 рази (0,130,006 г/л, р0,001; при гепатодистрофії вона зменшується); глікопротеїнів – на 46,3 % (0,600,022 од., р0,01), хондроїтин-6-сульфату – 87,8 (8,150,38 од., р0,001), хондроїтин-4-сульфату – на 45,2 % (3,660,08 од., р0,001), гепарансульфату – у 2 рази (2,260,08 од., р0,001).

8. Основними біохімічними показниками сироватки крові, за якими можна диференціювати цироз печінки від гепатодистрофії, є значно виражена гіпоальбумінемія (14,4–27,0 проти 27,2–32,7 г/л) та зміни тестів, що характеризують стан сполучної тканини: збільшення вмісту загальних хондроїтинсульфатів (0,11–0,14 проти 0,03–0,06 г/л), глікопротеїнів (0,55–0,68 проти 0,42–0,51 од.), хондроїтин-6-сульфату (7,0–9,3 проти 4,1–6,5 од.), хондроїтин-4-сульфату (3,5–3,9 проти 2,2–2,6 од.) та гепарансульфату (2,1–2,5 проти 1,4–1,7 од.)

9. Гепатодистрофія у корів, ускладнена розвитком гострого ацидозу рубця, на 1–7-у добу захворювання характеризується підвищенням у сироватці крові активності трансфераз (АсАТ; АлАТ) і вмісту білірубіну, на 14-у добу – зниженням умісту альбумінів і сечовини. Поступове підвищення вмісту глікопротеїнів (0,550,06 од.) і хондроїтинсульфатів (0,1290,004 г/л) з 14–28 доби свідчить про фібротизацію печінки.

10. Дослідженням функціонального стану печінки високопродуктивних корів у зимовий період упродовж трьох років встановлено, що згодовування тваринам несвіжої пивної дробини (10–12 % від поживності), на фоні незбалансованого раціону призводить до розвитку гепатодистрофії з поступовою фібротизацією печінки, на що вказує збільшення вмісту в сироватці крові корів глікопротеїнів на 26,7 % (0,570,02 од; р0,01) і хондроїтинсульфатів у 2,3 рази (0,180,009 г/л, р0,001); патологічні зміни паренхіми печінки підтверджуються підвищенням активності АсАТ і АлАТ та зниженням вмісту загального білка (р0,01).

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1. При диференціальній діагностиці гепатодистрофії і цирозу печінки у корів у схему лабораторного аналізу доцільно включати показники стану сполучної тканини. Підвищення вмісту глікопротеїнів до 0,42–0,51 од. (норма 0,25–0,45 од.) і стабільний рівень хондроїтинсульфатів – 0,03–0,06 г/л є характерними для гепатодистрофії; підвищення вмісту глікопротеїнів до 0,55–0,68 од., загальних хондроїтинсульфатів до 0,112–0,142 г/л – для цирозу печінки. У разі потреби для уточнення діагнозу на цироз печінки потрібно фракціонувати глікозаміноглікани сироватки крові. Збільшення вмісту ІІІ-ї фракції глікозаміногліканів (гепарансульфату) до значень 2,1–2,5 од. проти 1,4–1,7 од. при гепатодистрофії вказує на цироз печінки.

2. При лікуванні високопродуктивних корів, хворих на гепатодистрофію, що ускладнюється ацидозом рубця, доцільно проводити контроль стану печінки з використанням показників сполучної тканини; підвищений уміст глікопротеїнів і хондроїтинсульфатів свідчить про розвиток фібротизації печінки.

3. Результати досліджень щодо інформативності біохімічних показників сполучної тканини при хворобах печінки доцільно включати до курсу лекцій та лабораторно-практичних занять з клінічної біохімії тварин при вивченні тем “Біохімічна діагностика порушень стану сполучної тканини”