КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

СТЕПАНОВА ЛЮДМИЛА ІВАНІВНА

УДК 577.115.346: 616.341

ЛІПІДНИЙ СКЛАД АПІКАЛЬНОЇ МЕМБРАНИ ЕНТЕРОЦИТІВ

ТОНКОЇ КИШКИ ЩУРІВ ЗА ДІЇ ІОНІЗУЮЧОЇ РАДІАЦІЇ

03.00.01 – радіобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ-2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії фізико-хімічної біології

кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного

університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Хижняк Світлана Володимирівна,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка, провідний науковий співробітник

лабораторії фізико-хімічної біології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Серкіз Ярослав Іванович,

Інститут ядерних досліджень НАН України,

провідний науковий співробітник

сектору радіаційних технологій

доктор біологічних наук

Дружина Микола Олександрович,

Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології

ім. Р.Є. Кавецького НАН України,

завідувач відділу радіобіології

Провідна установа: Науковий центр радіаційної медицини АМН України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться “ 24 ” січня 2005 року о 1400 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного

університету імені Тараса Шевченка за адресою:

м. Київ, пр-т Глушкова 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 433.

Поштова адреса:

01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64, спецрада Д 26.001.24, біологічний факультет.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного

університету імені Тараса Шевченка за адресою: м.Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “23” грудня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Т.Р. Андрійчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Розвиток сучасних технологій супроводжується застосуванням іонізуючих випромінень в медицині, біології та промисловості, що обумовлює потребу розробки їх безпечного використання. Тому поглиблені різнобічні радіобіологічні дослідження, зокрема в галузі радіаційної мембранології, є актуальними.

Радіаційно-індуковані зміни в субмолекулярній організації та функціях клітинних мембран є початковим етапом розвитку біологічних ефектів [Somosy, 2000; Гродзинський, 2000]. Загальновизнано, що плазматична мембрана є чутливою мішенню щодо дії іонізуючої радіації – морфологічні та функціональні порушення клітинних мембран виникають практично відразу після опромінення у широкому діапазоні доз [Рыскулова, 1986; Горбенко, 1993; Дворецкий, 1998]. Сублетальні дози іонізуючої радіації призводять до перебудов плазматичних мембран, що може бути прямою чи опосередкованою причиною нестохастичних ефектів, які спостерігаються в клітинах та тканинах. З іншого боку, мембранні порушення можуть зумовлювати розвиток стохастичних ефектів [Somosy, 2000; Эйдус, 2001] тощо. Питання щодо радіочутливих компонентів мембран і механізми дії на них іонізуючих випромінень важливе для розуміння процесів радіаційного ураження клітин.

Беручи до уваги рідинно-мозаїчну структуру мембран, варіабельність їх функцій забезпечується, в основному, модифікацією поліненасичених жирних кислот мембранних ліпідів. Ліпіди – основні компоненти біомембран, які складають від 20 до 80% їх маси [Болдырев, 1997; Геннис, 1997; Lodish, 2000]. В зв’язку з цим, обговорюються численні аспекти змін мембранних ліпідів, що обумовлюють загибель клітин, в тому числі апоптоз та різноманітні інші форми незапрограмованої їх загибелі [Watters, 1999; Cristea, 2004]. З огляду на це, з’ясування механізмів дії іонізуючого випромінення на ліпідний склад мембран та вивчення метаболізму ліпідів мембран радіочутливих клітин становить безперечний інтерес [Klean, 1986; Stark, 1991; Потехина, 1995]. Відмічено, що радіочутливість клітин пов’язана з особливостями їх метаболізму та пропорційна швидкості метаболічних реакцій. Клітини з високим рівнем обмінних процесів і перетворення енергії чутливіші до опромінення, ніж клітини, які знаходяться в стані спокою – стаціонарній фазі. Тому існують відмінності клітинної та тканинної радіочутливості, що може визначатися особливостями біохімічного складу мембранних ліпідів, зокрема вмістом антиоксидантів тощо [Кузин, 1986; Кудряшов, 2001].

В радіобіологічних дослідженнях особлива увага зосереджена на структурах та процесах, які мають вирішальне значення в розвитку післярадіаційних ушкоджень. Одним з найрадіочутливіших органів є тонка кишка, порушення функції якої вважають найбільш глибокими і стійкими [Федоровский, 1984; Land Mia, 1991; Eastwood, 1997]. Тонка кишка відіграє роль селективного бар’єру між організмом і зовнішнім середовищем на шляху надходження поживних речовин у кров і лімфу. Основна її функція полягає в розщепленні та всмоктуванні екзогенних харчових продуктів, що забезпечується високоспеціалізованими епітеліальними клітинами – ентероцитами. Клітини слизової оболонки тонкої кишки утворюють структурно-функціональну систему, яка бере участь у секреторній, травній та транспортуючій функціях кишечника. Суттєву роль у цих процесах відіграє плазматична мембрана ентероцитів епітелію тонкої кишки [Уголев, 1986; Морозов, 1988; Choudhary, 1998].

Тому актуальним є вивчення реакції мембран та окремих її компонентів на дію іонізуючого випромінення у широкому діапазоні доз, оскільки, при цьому формуються детерміновані ефекти. Крім того, дослідження участі ліпідного обміну після опромінення визначає перспективність пошуку протипроменевих засобів серед регуляторів ліпідного обміну.

Зв’язок з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у рамках теми № 01БФ036-04 “Розробка наукових основ пошуку біологічно-активних сполук радіозахисної дії” (№ державної реєстрації 0101U002291) підрозділ “Дослідження структурно-функціонального стану клітин слизової оболонки тонкої кишки та печінки за умов впливу іонізуючої радіації” кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Мета та завдання дослідження. Мета роботи полягала в дослідженні ліпідного та жирнокислотного складу апікальної мембрани (АМ) ентероцитів (щіткова облямівка) слизової оболонки тонкої кишки щурів за дії іонізуючого випромінення в діапазоні доз від 0,1 до 6,0 Гр для оцінки радіаційно-індукованих змін структурного стану мембрани.

В зв’язку з цим були поставлені такі завдання:

1. Дослідити дію іонізуючої радіації в дозах 0,1; 0,4; 1,0; 2,0; 3,0 та 6,0 Гр (потужність дози 0,17 Гр/хв) на:

а) ультраструктуру епітеліальних клітин тонкої кишки;

б) якісний та кількісний вміст ліпідів та їх жирнокислотний склад в АМ ентероцитів слизової оболонки тонкої кишки;

в) біосинтез ліпідів, фосфоліпідів (ФЛ) та холестеролу (ХС) в АМ ентероцитів в динаміці (через 24, 48 та 72 год після опромінення);

г) динаміку процесів пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) та антиокиснювальну активність (АОА) АМ ентероцитів слизової оболонки тонкої кишки.

2. Вивчити структурний стан АМ ентероцитів слизової оболонки тонкої кишки за дії іонізуючої радіації:

а) визначити мікров’язкість АМ;

б) оцінити структурні перебудови білкової компоненти мембран;

в) визначити активність мембранозв’язаних ферментів АМ;

г) дослідити проникність АМ для К+, Na+ і Са2+ ;

3. Визначити методом головних компонент (факторний аналіз) дозозалежність протікання радіаційно-індукованих процесів в АМ ентероцитів за умов дослідження.

Об’єкт дослідження: дія іонізуючої радіації в дозах 0,1; 0,4; 1,0; 2,0; 3,0 та 6,0 Гр на АМ ентероцитів слизової оболонки тонкої кишки щурів.

Предмет дослідження: апікальна мембрана ентероцитів слизової оболонки тонкої кишки.

Методи дослідження: в роботі використовували радіометричні, електронно-мікроскопічний, біохімічні (визначення вмісту ліпідів та жирних кислот (ЖК), продуктів ПОЛ, активності ферментів), біофізичні (проникність К+, Nа+, Са2+), математичні (статистична обробка результатів, факторний аналіз) методи.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проведено комплексні морфологічні та біохімічні дослідження слизової оболонки тонкої кишки через 24 год після дії іонізуючої радіації в дозах 0,1; 0,4; 1,0; 2,0; 3,0 та 6,0 Гр. Виявлено, що з підвищенням дози іонізуючого випромінення поглиблюється пошкодження ультраструктури слизової оболонки тонкої кишки.

Встановлено зниження вмісту загальних ліпідів, ХС та ФЛ на фоні підвищення рівня лізоформ фосфоліпідів в АМ ентероцитів слизової оболонки тонкої кишки через 24 год після опромінення в дозах 1,0; 2,0; 3,0 і 6,0 Гр. В більш віддалені строки після опромінення (48 та 72 год) спостерігається певне відновлення вмісту ліпідів до контрольних значень, що свідчить про тимчасове радіаційно-індуковане порушення мембран. Встановлено порушення у функціонуванні окисно-антиокиснювальної системи тонкої кишки за дії випромінення.

Виявлено перерозподіл вмісту ЖК у різних фракціях ліпідів за дії іонізуючої радіації. У фракції ФЛ зростає частка ненасичених та зменшується частка насичених ЖК, для нейтральних ліпідів та вільних ЖК характерно зростання вмісту насичених та зменшення ненасичених ЖК. Виявлено активацію синтезу ЖК в ранні строки після опромінення (24 год) з наступним поверненням до контрольних значень в більш віддалені строки (48 та 72 год).

Встановлено, що зі збільшенням дози опромінення спостерігаються конформаційні зміни білкової компоненти АМ ентероцитів та зменшується мікров’язкость мембрани поряд зі зростанням її проникності для іонів Na, К та Са.

Використання методу факторного аналізу дозволило виявити дозозалежність протікаючих в слизовій оболонці тонкої кишки процесів за умов дії іонізуючої радіації в дозах 0,1 Гр – 6,0 Гр.

Встановлені структурно-функціональні порушення АМ ентероцитів розширюють існуючі уявлення про механізми дії іонізуючої радіації в діапазоні доз 0,1 – 6,0 Гр. Дане дослідження доповнює методичні підходи при оцінці радіобіологічних ефектів в динаміці дії протипроменевих засобів.

Практичне значення отриманих результатів. Результати, що отримані в роботі, можуть слугувати науковим обґрунтуванням розробки методів корекції та запобігання радіаційно-індукованих порушень структурно-функціональних властивостей як мембран ентероцитів тонкої кишки, так і інших біомембран. Одержані результати дії іонізуючої радіації на структуру ліпідної компоненти мембран ентероцитів можуть бути використані при розробці способів корекції порушень мембран. Показана доцільність використання методу факторного аналізу при оцінці дозозалежності протікання радіаційно-індукованих процесів.

Викладені в роботі положення можуть бути включені до навчальних програм вузів, де викладаються курси “Радіобіологія”, “Радіаційна медицина”, “Радіаційна біохімія” тощо.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто проаналізовано наукову літературу за темою роботи, самостійно виконано експериментальні дослідження, проведено підготовку матеріалів публікацій, статистичну обробку та аналіз результатів. За участю наукового керівника проведено планування експериментальних робіт, інтерпретацію результатів дослідження, а також сформульовані висновки роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи доповідались на: ІІ з’їзді радіобіологів України (з міжнародною участю) (Дніпропетровськ, 1995), ІІІ міжнародному з’їзді з радіаційних досліджень (Москва - Пущино, 1997), VІІ Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1997), VІІІ Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002), ІІІ з’їзді з радіаційних досліджень (радіобіологія і радіоекологія) (Київ, 2003), конференції “Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты” (Санкт-Петербург, 2004).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 статей у фахових журналах та 8 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду наукової літератури, опису матеріалів та методів дослідження, власних досліджень з обговоренням, заключення, висновків, списку використаної літератури, що включає 222 посилання.

Робота викладена на 149 сторінках машинопису, ілюстрована 15 рисунками та 30 таблицями.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження проведені на білих безпородних щурах-самцях, масою 180-200 г, яких утримували на стандартному раціоні віварію. Тварин разово тотально опромінювали на апараті РУМ-17 в дозах 0,1; 0,4; 1,0; 2,0; 3,0 та 6,0 Гр за умов: потужність поглинутої дози 0,17 Гр/хв, фільтри 0,5 мм Си і 1 мм Аl, сила струму 5 мА, напруга 200 кВ, шкірно-фокусна відстань – 50 см.

Виділення препаратів АМ ентероцитів слизової оболонки тонкої кишки з контрольних та опромінених тварин проводили згідно методики, описаної в роботах [Miller, 1981; Усатюк, 1988] із незначними модифікаціями. Чистоту препаратів оцінювали електронномікроскопічним методом [Lewis, 1977] та за активністю маркерних ферментів [Ghijsen et al, 1980; Lin tt al, 1984]. Вміст білка в досліджуваних мембранах визначали за методом Лоурі та співавт. [Lowry et al., 1977].

Екстракцію ліпідів проводили за методом Фолча [Folch, 1957]. Ліпіди розділяли методом одномірної (нейтральні ліпіди) та двомірної (ФЛ) тонкошарової хроматографії на пластинках Silufol розміром 15 х 15 см і визначали їх кількість [Brockhuyse, 1968]. Кількісне визначення ХС та вільних жирних кислот (ВЖК) проводили за методом [Прохорова, 1982], кількість триацилгліцеролів визначали згідно [Финдлей, Эванс, 1990]. Жирнокислотний склад ліпідів АМ ентероцитів тонкої кишки досліджували за методом газорідинної хроматографії [Синяк,1976] на хроматографі “GC-4 АРТЕ Shimadzu” (Японія) з полум’яним іонізаційним детектором.

Швидкість включення 2-14С-ацетату в ліпіди АМ ентероцитів тонкої кишки оцінювали за методом [Таранова, 1988]. Вимірювання радіоактивності проводили на рідинному сцинтиляційному лічильнику “Intertechnique-4000” (Франція).

Дієнові кон’югати та малоновий діальдегід визначали згідно [Орехович, 1977], вміст шиффових основ визначали відповідно до [Shenstone, 1971]. АОА оцінювали за методом [Семенов, 1985].

Дослідження мікров’язкості ліпідної компоненти АМ ентероцитів проводили з використанням флуоресцентного зонду пірену згідно з [Владимиров, 1980]. Проникність мембран для Са2+, К+ і Nа+ проводили з використанням синтетичного проникаючого аніону фенілдикарбаундекаборан (ФКБ-) [Скулачев, 1989], використовуючи насичені азолектином фільтри “Synpor” з діаметром пор 2,5 мкм.

Експериментальні дані оброблялись загальноприйнятими методами варіаційної статистики [Плохинский, 1981; Кучеренко та ін., 2001]. Для виявлення взаємозв’язку показників, які були досліджені за дії іонізуючої радіації в дозах 0,1; 0,4; 1,0; 2,0; 3,0 та 6,0 Гр, використаний метод головних компонент [Иберла, 1972; Граверман, 1983].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Виняткова чутливість клітинних мембран до змін довкілля пов’язана зі структурно-функціональними особливостями ліпідного бішару. Кожна жива клітина забезпечена тонко регульованою потужною ферментативною системою, яка й забезпечує, у гармонії з іншими гомеостатичними реакціями, відповідний ліпідний склад біологічних мембран [Рыскулова, 1986; Кудряшов, 2001]. Радіаційно-індуковані зміни субмолекулярної організації та функцій клітинних мембран мають принципове значення в розвитку біологічних ефектів дії іонізуючої радіації.

На першому етапі для визначення ступеня та міри ураження ультраструктури клітин проведено електронномікроскопічні дослідження епітелію тонкої кишки через 24 год після разової дії рентгенівського випромінення. Аналіз отриманих результатів свідчить, що за опромінення в дозах 0,1 та 0,4 Гр клітинний склад тонкошарового епітелію не змінюється у порівнянні з контролем. Незначним змінам піддаються лише різні за характером клітинні елементи. За дії іонізуючої радіації в дозах від 1,0 до 6,0 Гр спостерігаються більш значні порушення ультраструктури клітин слизової оболонки, в тому числі ентероцитів, які з підвищенням дози опромінення стають все більш вираженими і значущими у розвитку патологічних станів тонкої кишки. Аналіз отриманих результатів свідчить, що зі збільшенням дози іонізуючої радіації збільшується вакуолізація внутрішньоклітинних мембранних структур, спостерігається набряк і деструкція мітохондрій; зростає кількість лізосомоподібних утворень; порушується форма ядер і посилюється конденсація хроматину; на апікальній стороні ентероцитів з’являються ділянки, які позбавлені щіткової облямівки; в епітелії виникають зони некрозу, лізису окремих клітин та їх відторгнення.

Таким чином, розвиток ураження тонкої кишки за дії іонізуючої радіації від 0,1 до 6,0 Гр пов’язаний з виникненням порушень ультраструктури слизової оболонки, які посилюються зі збільшенням дози.

Важливою структурно-функціональною характеристикою мембран є якісний та кількісний склад її ліпідної компоненти [Потехина, 1992]. Результати порівняльних досліджень вмісту ліпідів в АМ ентероцитів слизової оболонки тонкої кишки, які були виділені з контрольних тварин та опромінених в дозах від 0,1 до 6,0 Гр наведені в таблицях (табл.1 та 2). Встановлено, що вміст загальної ліпідної фракції через 24 год після дії іонізуючої радіації в дозах 1,0; 2,0; 3,0 і 6,0 Гр зменшується в середньому на 17, 20, 21 та 29% відповідно. Зменшення вмісту ФЛ відбувається після дії іонізуючої радіації в дозах 2,0; 3,0 і 6,0 Гр в середньому на 20 – 21%. Через 48 год після опромінення вміст ФЛ залишається зниженим в середньому на 18% за дії доз 2,0; 3,0 та 6,0 Гр. Через 72 год після опромінення вміст ФЛ в мембранах ентероцитів наближається до контрольних значень.

Таблиця 1

Вміст ліпідів (мкг/мг білка) в апікальної мембрані ентероцитів слизової оболонки тонкої кишки за дії іонізуючої радіації, (M ±m, n=7)

Умови досліду | Загальні ліпіди | Фосфоліпіди

час після опромінення, год

24 | 24 | 48 | 72

контроль | 569,3 ± 43,8 | 367,2 ± 22,4 | 367,2 ± 22,4 | 367,2 ± 27,0

доза, Гр

0,1 |

509,7 ± 45,0 |

324,6 ± 30,4 |

335,5 ± 23,9 |

358,7 ± 28,6

0,4 | 485,6 ± 42,1 | 319,8 ± 25,1 | 320,7 ± 24,2 | 335,5 ± 23,4

1,0 | 470,4 ± 36,2* | 301,5 ± 28,5 | 322,1 ± 23,0 | 346,8 ± 27,6

2,0 | 453,5 ± 32,3* | 293,7 ± 26,4* | 307,4 ± 22,6* | 326,3 ± 22,8

3,0 | 448,9 ± 34,8* | 295,2 ± 26,8* | 308,2 ± 21,8* | 324,7 ± 24,5

6,0 | 406,7 ± 35,3 * | 290,8 ± 23,3* | 300,3 ± 23,4* | 330,6 ± 21,3

П р и м і т к а: тут і далі * Р 0,05 відносно контролю.

Вміст ХС зменшується в середньому на 22, 34, 53 та 62% через 24 год після дії опромінення в дозах 1,0; 2,0; 3,0 та 6,0 Гр відповідно (табл.2). Відновлення вмісту ХС відбувається швидше ніж ФЛ – і вже через 48 год після опромінення його вміст у мембранах ентероцитів вірогідно не відрізняється від контрольних значень у всьому інтервалі доз, що досліджувались.

Таблиця 2

Вміст холестеролу (мкг/мг білка) в апікальній мембрані ентероцитів слизової оболонки тонкої кишки за дії іонізуючої радіації, (M ±m, n=7)

Умови досліду | Час після опромінення, год

24 | 48 | 72

контроль | 118,7 ± 9,2 | 118,7 ± 9,2 | 118,7 ± 9,2

доза опромінення, Гр

0,1 |

104,8 ± 9,9 |

112,9 ± 9,8 |

113,8 ± 10,0

0,4 | 104,1 ± 10,2 | 110,2 ± 10,1 | 111,5 ± 9,8

1,0 | 92,3 ± 9,0* | 105,8 ± 9,5 | 108,2 ± 9,3

2,0 | 78,4 ± 7,1* | 105,4 ± 9,1 | 106,4 ± 9,5

3,0 | 56,3 ± 5,3* | 102,7 ± 9,6 | 105,1 ± 9,1

6,0 | 45,2 ± 4,4* | 98,3 ± 8,7 | 103,2 ± 9,4

Відомо, що ХС є попередником біосинтезу стероїдних гормонів, жовчних кислот, ефірів холестеролу тощо. Він входить до складу біологічних мембран, і зміна його кількості в мембрані впливає на фізико-хімічні властивості бішару – порушує кооперативні взаємодії жирних ацилів фосфоліпідів, змінює рухомість вуглеводневих ланок молекул ЖК фосфоліпідів, дестабілізує бішар мембрани, що призводить до порушення в’язкості мембран та їх проникності [Рыскулова, 1982; Элойя, 1989].

Суттєвим показником, який обумовлює властивості біомембран – є вміст індивідуальних ФЛ та співвідношення між ними (табл. 3). Виявлено, що зі збільшенням дози опромінення відбувається зменшення вмісту основних ФЛ на фоні підвищення рівня лізоформ (лізофосфатидилхоліну і лізофосфатидилетаноламіну). За дії іонізуючої радіації вміст фосфатидилетаноламіну знижується незначно. Вміст фосфатидилхоліну вірогідно зменшується за дії іонізуючої радіації в дозах 3,0 та 6,0 Гр в середньому на 21-29%. Вміст фосфатидилсерину за дії тих же доз зменшується в середньому на 39%, кількість фосфатидилінозитолу – в середньому від 24 до 29% при дії іонізуючої радіації в дозах 1,0; 2,0; 3,0 та 6,0 Гр. Найбільше змінюється вміст сфінгомієліну: за дії іонізуючої радіації в дозах 0,4; 1,0; 2,0; 3,0 і 6,0 Гр відносний вміст цього ліпіду зменшується в середньому на 20, 39, 46, 65 і 69% відповідно. Суттєве значення має підвищення рівня лізоформ фосфатидилхоліну і фосфатидилетаноламіну. Встановлено збільшення рівня лізофосфатидилхоліну в середньому на 23, 28 і 68% за дії доз 2,0; 3,0 і 6,0 Гр відповідно.

Таблиця 3

Вміст фосфоліпідів в апікальній мембрані ентероцитів слизової оболонки тонкої кишки через 24 год після дії іонізуючої радіації, (M±m, n=7)

Умови досліду | Фосфоліпіди, мкг/мг білка

ФХ | ЛФХ | СФМ | ФЕА | ЛФЕА | ФС | ФІ

контроль | 117,5±10,6 | 5,7 ± 0,4 | 22,9 ± 2,0 | 138,6 ± 11,2 | 0,3 ± 0,1 | 20,3 ± 1,8 | 61,9 ± 6,0

доза , Гр

0,1 |

102,8 ± 9,4 |

5,8 ± 0,5 |

21,7 ± 1,9 |

123,9 ± 10,1 |

0,4 ± 0,1 |

17,5 ± 1,5 |

52,5 ± 4,7

0,4 | 101,2 ± 9,6 | 6,1 ± 0,4 | 18,3 ± 1,4* | 123,3 ± 10,5 | 0,6 ± 0,1 | 18,2 ± 1,6 | 52,0 ± 5,0

1,0 | 97,8 ± 9,9 | 6,2 ± 0,4 | 14,0 ± 1,5* | 119,1 ± 11,6 | 0,9 ± 0,2* | 16,3 ± 1,5 | 47,2 ± 4,9*

2,0 | 103,7 ± 10,1 | 7,0 ± 0,5* | 12,3 ± 1,0* | 107,8 ± 9,9* | 1,0 ± 0,3* | 17,5 ± 1,4 | 44,4 ± 4,1*

3,0 | 93,0 ± 8,4* | 7,3 ± 0,6* | 8,0 ± 0,7* | 126,8 ± 12,0 | 1,4 ± 0,2* | 14,1 ± 1,1* | 44,2 ± 4,1*

6,0 | 83,3 ± 8,4* | 9,6 ± 0,8* | 7,1 ± 0,6* | 130,0 ± 12,4 | 4,7 ± 0,6* | 12,4 ± 1,1* | 43,7 ± 4,1*

П р и м і т к а: ФХ – фосфатидилхолін, ЛФХ – лізофосфатидилхолін,

СФМ – сфінгомієлін, ФЕА – фосфатидилетаноламін, ЛФЕА – лізофосфатидил-етаноламін, ФС – фосфатидилсерин, ФІ – фосфатидилінозитол.

За цих же умов опромінення спостерігається підвищення рівня лізофосфатидилетаноламіну від 3 до 16 разів. Слід зазначити, що збільшення вмісту лізоформ фосфоліпідів в мембранах сприяє формуванню гексагонального типу упаковки фосфоліпідних мембран. Це, насамперед, викликає підвищення проникності мембран, а також порушення міцності зв’язку білків із гідрофобною частиною ліпідного матриксу, що сприяє міграції частини молекул ліпідів в полярні поверхневі шари [Геннис, 1997].

Різноспрямованість радіаційно-індукованих змін вмісту ФЛ може вказувати на різну радіочутливість окремих процесів, які відповідають за синтез та розпад певних ФЛ.

Структури жирнокислотних ланцюгів ліпідів визначають спосіб пакування ліпідів в мембранах, білок-ліпідні та ліпід-ліпідні взаємодії, мікров’язкість мембран та ін. [Геннис, 1997; Lodish, 2000]. Зміни жирнокислотного складу ФЛ можуть надавати молекулам ФЛ інших властивостей. Ненасичені ВЖК здатні взаємодіяти з гідрофобними зонами молекул білка та при цьому витискувати зв’язані з ними жирнокислотні ланцюги ліпідів.

Встановлено, що за дії іонізуючої радіації, в умовах проведення досліджень, спостерігається незначне зменшення в загальній фракції ФЛ вмісту насичених ЖК (табл.4). Лише вміст пальмітинової (С16:0) кислоти вірогідно зменшується після опромінення в дозах 2,0; 3,0 та 6,0 Гр відповідно на 17, 20 та 27%. В той же час рівень ненасичених ЖК підвищується незначно. Лише за дії іонізуючої радіації в дозах 3,0 та 6,0 Гр вірогідно підвищується рівень лінолевої (С18:2) кислоти на 18 та 23% та докозопентаєнової (С22:5) кислоти – на 22 та 29% відповідно. Виявлені зміни вмісту ЖК у загальній фракції ФЛ призводять до

зниження коефіцієнту насиченості після опромінення в дозах 3,0 та 6,0 Гр відповідно на 17 та 22%. Подібні дослідження проведені також для фосфатидилхоліну та фосфатидилетаноламіну. Вірогідні зміни у складі ЖК фракції фосфатидилхоліну за дії іонізуючої радіації спостерігаються тільки для

стеаринової (С18:0) кислоти – підвищення рівня після опромінення в дозах 2,0; 3,0 та 6,0 Гр відповідно на 29, 39 та 58%, а також для докозопентаєнової (С22:5) – при опроміненні в дозах 3,0 та 6,0 Гр відповідно на 29 та 33%. Іонізуюча радіація призводить до зменшення у фракції фосфатидилетаноламіну вмісту пальмітинової (С16:0) кислоти – вірогідно за дії доз 3,0 та 6,0 Гр в середньому на 25% та 28%. За дії цих же доз відбувається вірогідне підвищення рівня ненасичених ЖК: ліноленової (С18:3) в середньому в 3,6 та 3,2 рази відповідно, ейкозапентаєнової (С20:5) – на 30 та 40%, докозапентаєнової (С22:5) – на 50 та 57%. Загальні порушення вмісту насичених і ненасичених ЖК у цих фракціях призводять до зменшення коефіцієнта насиченості в середньому на 10 - 14% для фосфатидилхоліна, та на 19 - 23% для фосфатидилетаноламіна за дії іонізуючої радіації в дозах 3,0 та 6,0 Гр відповідно. Іонізуюча радіація у всіх досліджуваних дозах не викликає суттєвий перерозподіл ЖК у фракції лізофосфатидилхоліна, відмічена лише тенденція до збільшення рівня ненасичених ЖК. У фракції нейтральних ліпідів вірогідно збільшується коефіцієнт насиченості за дії випромінення в дозах 2,0; 3,0 та 6,0 Гр на 23, 24 та 34% відповідно. Для вільних ЖК показано, що іонізуюча радіація викликає лише вірогідне зменшення вмісту арахідонової кислоти (С20:4) на 26%.

Аналіз отриманих результатів свідчить про різноспрямовані зміни ліпідного складу, та перерозподіл вмісту ЖК у різних фракціях ліпідів. Відомо, що ступінь насиченості ЖК слугує важливим фактором, який впливає на життєздатність клітин [Lee, 1982]. Крім того, збільшення кількості лізоформ фосфоліпідів та ВЖК, може бути пов’язане з підвищенням інтенсивності процесів окиснення та активації фосфоліпаз.

Активація процесів ПОЛ є універсальною реакцією на дію іонізуючої радіації. Порушення в системі регуляції процесів ПОЛ викликає зміни вільнорадикального окиснення ліпідів [Барабой, Сутковой, 1997]. Стан процесів ПОЛ після дії іонізуючої радіації оцінювали за вмістом дієнових кон’югатів, малонового діальдегіду, шиффових основ та визначали АОА. Встановлено, що відносний вміст дієнових кон’югатів суттєво не змінюється після дії іонізуючої радіації в досліджуваних дозах (табл.5). Відмічена лише тенденція до зменшення цього показника з підвищенням дози опромінення, що можливо зумовлено збільшенням загальної кількості подвійних зв’язків, як встановлено при визначенні насиченості ліпідів після опромінення. При оцінці вторинних продуктів ПОЛ встановлено, що загальний вміст малонового діальдегіду збільшується за доз 1,0; 2,0; 3,0 та 6,0 Гр на 31, 50, 56 та 69% відповідно. Встановлено, що Fе2+-аскорбат залежне окиснення підвищується за дії іонізуючої радіації в дозі 1,0 Гр в середньому на 22%, а після опромінення в дозі 2,0 Гр – на 32%, 3,0 Гр – на 41%, 6,0 Гр – на 64%. Відомо, що Fе2+-аскорбат індуковане підвищення накопичення малонового діальдегіду може свідчити про деструктивні зміни мембран ентероцитів за дії випромінення [Физер, 1984]. Кінцевим продуктом ПОЛ є утворення шиффових основ. Спостерігається збільшення вмісту шиффових основ, на 17% лише за дії іонізуючої радіації в дозі 6,0 Гр.

Таблиця 5

Вміст продуктів ПОЛ в апікальній мембрані ентероцитів слизової оболонки тонкої кишки через 24 год після дії іонізуючої радіації, (M ± m, n = 7)

Умови досліду | Дієнові кон’югати,

(А233/А218) | Малоновий діальдегід, нмоль/мг білка | Шиффові основи,

відн.од.

-Fе-аскорбат | +Fе-аскорбат

контроль | 0,92 ± 0,08 | 0,16 ± 0,01 | 2,23 ± 0,21 | 1,0

доза, Гр

0,1 |

0,90 ± 0,07 |

0,17 ± 0,02 |

2,31 ± 0,20 |

1,05 ± 0,04

0,4 | 0,88 ± 0,06 | 0,16 ± 0,03 | 2,52 ± 0,23 | 1,08 ± 0,04

1,0 | 0,85 ± 0,05 | 0,21 ± 0,02* | 2,74 ± 0,24* | 1,10 ± 0,03

2,0 | 0,82 ± 0,06 | 0,24 ± 0,03* | 2,90 ± 0,27* | 1,13 ± 0,04

3,0 | 0,80 ± 0,07 | 0,25 ± 0,02* | 3,12 ± 0,30* | 1,15 ± 0,04

6,0 | 0,76 ± 0,08 | 0,27 ± 0,03* | 3,65 ± 0,34* | 1,17 ± 0,05

Захист ліпідів мембран від надмірного накопичення продуктів ПОЛ в організмі виконує антиокиснювальна система. Інтегральною характеристикою функціонування цієї системи є її загальна АОА. Встановлено збільшення АОА при зростанні дози опромінення. Виявлена тенденція може у певній мірі пояснювати незначні зміни в кількості продуктів ПОЛ за дії досліджуваних доз іонізуючої радіації. Отримані результати свідчать про порушення у функціонуванні окисно-антиокиснювальної системи тонкої кишки після опромінення.

Порушення ліпідного складу мембран може призводити до змін процесів їх синтезу. Визначення включення в мембранні ліпіди ацетату, який є попередником всіх ліпідів при їх синтезі, вказує на інтенсивність протікання цього процесу. Дослідження біосинтезу ліпідів проводили in vivo за визначенням інтенсивності включення 2-14С-ацетату у різні ліпідні фракції АМ ентероцитів слизової оболонки тонкої кишки. Встановлено (рис.1), що через 24 год після опромінення щурів у дозах 0,1 та 0,4 Гр інтенсивність включення 2-14С-ацетату в загальні ліпіди досліджуваних мембран вірогідно не змінюється, а після опромінення в дозах 1,0; 2,0; 3,0 та 6,0 Гр відбувається активація включення 2-14С-ацетату в загальну фракцію ліпідів на 24, 42, 43 та 50% відповідно. Активація біосинтезу ФЛ зростає після опромінення в цих же дозах на 24, 39, 41 та 48% відповідно.

Інтенсивність біосинтезу ХС через 24 год також збільшується відносно контролю на 32, 41, 56 та 59% відповідно після дії іонізуючої радіації в дозах 1,0; 2,0; 3,0 та 6,0 Гр (рис.2). Встановлено вірогідне збільшення включення 2-14С-ацетату в загальну фракцію ліпідів через 48 год після опромінення: в дозі 2,0 Гр на 36%; в дозі 3,0 Гр – на 35%; а в дозі 6,0 Гр – на 42%. Біосинтез ФЛ активується радіацією у дозах 1,0; 2,0; 3,0 та 6,0 Гр на 21, 33, 33 та 41% відповідно. Ті ж дози викликають вірогідне збільшення включення 2-14С-ацетату в ХС на 26, 30, 35 та 50% відповідно. Через 72 год після опромінення в досліджуваних дозах спостерігається певне зменшення включення

2-14С-ацетату в усі фракції ліпідів. Так, при дії радіації в дозах 2,0; 3,0 та 6,0 Гр включення 2-14С-ацетату зростає для загальної фракції ліпідів від 32 до 40%; ФЛ – від 32 до 39%; ХС – від 22 до 42%.

Таким чином, активація синтезу ЖК в ранні строки після опромінення є харак-терною реакцією клітин слизової оболонки тонкої кишки на опромінення у широкому діапазоні доз. Враховуючи значення ліпідів у клітинній проліферації, а також основну роль клітин тонкої кишки в продукуванні ХС для організму, можна припустити, що за радіаційного впливу на організм активація біосинтезу (ФЛ та ХС в ранні строки після опромінення) пояснюється відновленням мембранних структур, як в самій тонкій кишці, так і в організмі в цілому [Коломийцева, 1989].

Виявлені зміни вмісту мембранних ліпідів та їх жирнокислотного складу, ступеню насиченості ЖК, молярного співвідношення ліпід/білок, а також протікання процесів ПОЛ можуть викликати структурні порушення АМ ентероцитів слизової оболонки тонкої кишки.

Загальною характеристикою структурного стану мембран слугує такий показник, як мікров’язкість, яку оцінювали при визначенні відносного ступеню ексимеризації флуоресцентного зонду пірену в досліджуваних мембранах. Встановлено, що вірогідне підвищення ступеню ексимеризації відбувається після опромінення в дозах 2,0 Гр на 22%, 3,0 Гр – на 28% та 6,0 Гр – на 34%, що вказує на зменшення мікров’язкості мембран ентероцитів за даних умов дослідження.

Наявність триптофанових залишків в мембранних білках зумовлює власну флуоресценцію мембран. Встановлено, що після дії іонізуючої радіації в дозах від 0,1 до 6,0 Гр спостерігається збільшення інтенсивності флуоресценції триптофанілів АМ ентероцитів, причому вірогідні зміни спостерігаються за дії випромінення в дозах 3,0 та 6,0 Гр на 22 та 36% відповідно відносно контролю. Причиною підвищення інтенсивності флуоресценції триптофанілів білків апікальної мембрани ентероцитів можуть бути радіаційно-індуковані структурні перебудови білкових молекул, які супроводжуються змінами в експонуванні на поверхні білків триптофанілів.

Порушення іонної проникності біомембран є одним із ранніх проявів дії іонізуючої радіації [Дворецкий, 1990]. При дослідженні проникної здатності апікальної мембрани ентероцитів для іонів К, Nа, Са встановлено, що за дії іонізуючої радіації в дозах від 0,4 до 6,0 Гр відбувається збільшення проникності мембран ентероцитів слизової оболонки тонкої кишки для досліджуваних іонів (табл.7).

Таблиця 7

Відносна проникна здатність апікальної мембрани ентероцитів тонкої кишки для К+ , Nа+ і Са2+ (M ± m, n = 7)

Іон | Проникність, %

контроль | доза опромінення, Гр

0,1 | 0,4 | 1,0 | 2,0 | 3,0 | 6,0

К+ | 100 | 122 ± 12 | 146 ± 15* | 264 ± 18* | 221 ± 20* | 312 ± 26* | 359 ± 25*

Na+ | 65 ± 4 | 78 ± 5 | 85 ± 6* | 110 ± 9* | 130 ± 12* | 143 ± 10* | 169 ± 14*

Ca2+ | 21 ± 2 | 23 ± 2 | 27 ± 3* | 39 ± 3* | 44 ± 4* | 46 ± 4* | 56 ± 5*

Виявлене дозозалежне зростання проникності плазматичної мембрани ентероцитів тонкої кишки для іонів натрію, калію та кальцію в результаті дії іонізуючої радіації в дозах 0,1 – 6,0 Гр може сприяти змінам концентрації іонів всередині клітини, що виступає як фактор порушення клітинного метаболізму.

Структурні зміни мембран ентероцитів можуть обумовлювати порушення функціонування мембранозв’язаних ферментів, які беруть участь у гідролізі, мембранному травленні та транспорті поживних речовин [Морозов, 1988]. Встановлено (табл.8), що іонізуюча радіація, в умовах проведення досліджень, викликає дозозалежне зниження активності лужної фосфатази в середньому на 15% за дози 6,0 Гр. Активність ?-глутамілтрансферази та аланінамінотрансферази після опромінення в дозах 1,0; 2,0; 3,0 та 6,0 Гр знижується в середньому на 10 - 30%. При цьому Са2+-АТФазна активність різко зменшується з підвищенням дози опромінення. Вірогідні зміни вже спостерігаються за дози 0,4 Гр – зменшення на 21%, за доз: 1,0 Гр – 59%, 2,0 Гр – 66%, 3,0 Гр – 69% та 6,0 Гр – 78%. Активність Мg2+-АТФази істотно не змінюється в умовах дослідження.

Можливо, причиною змін активностей досліджуваних ферментів є радіаційно-індуковані порушення ліпід-білкових взаємодій та конформаційні зміни білкових молекул, зменшення в’язкості мембран і, як наслідок, перехід білків в більш гідрофобні шари мембрани.

Таблиця 8

Активність ферментів апікальної мембрани ентероцитів слизової оболонки тонкої кишки через 24 год після дії іонізуючої радіації, (нмоль продукту/хв• мг білка), M ± m, n = 7

Умови досліду | Активність ферментів

Лужна фосфатаза | г-?лутаміл-трансфераза | Аланінаміно-

трансфераза | Са2+-АТФаза | Mg2+-АТФаза

контроль | 1190 ± 89 | 58,3 ± 4,2 | 210,0 ± 15,6 | 34,6 ± 2,8 | 316,2 ± 23,2

доза, Гр

0,1 |

1191 ± 85 |

60,0 ± 5,1 |

213,2 ± 14,9 |

32,6 ± 2,4 |

305,0 ± 22,4

0,4 | 1156 ± 80 | 63,3 ± 5,3 | 231,6 ± 16,4 | 27,5 ± 2,0* | 298,3 ± 21,7

1,0 | 1090 ± 78 | 53,4 ± 3,9 | 193,3 ± 13,8 | 14,3 ± 1,1* | 291,7 ± 21,6

2,0 | 1063 ± 77 | 48,3 ± 3,4 | 180,5 ± 12,7 | 11,6 ± 0,9* | 283,3 ± 20,8

3,0 | 1065 ± 80 | 45,1 ± 4,0* | 156,6 ± 11,0* | 10,7 ± 0,8* | 280,1 ± 19,9

6,0 | 1013 ± 71 | 40,2 ± 3,1* | 145,1 ± 10,5* | 7,7 ± 0,6* | 275,4 ± 19,3

Методом головних компонент проведений аналіз результатів дослідження (37 показників) за дії іонізуючої радіації в дозах від 0,1 до 6,0 Гр на ліпідний і жирнокислотний склад, структурний стан апікальної мембрани ентероцитів слизової оболонки тонкої кишки, який дозволив встановити дозозалежність дії іонізуючої радіації за відповідною зміною досліджених показників (рис.3).

Основний внесок у визначення дозової залежності вносять показники, що характеризують мікров’язкість мембран, їх проникність для К+, Nа+ та Са2+, активність Са2+-АТФази.

Базуючись на отриманих даних щодо вивчення ліпідного складу та фізичних властивостей плазматичної мембрани ентероцитів за дії іонізуючого випромінення в дозах 0,1 – 6,0 Гр встановлено, що структурні зміни АМ ентероцитів пов’язані зі зміною кількісного складу ліпідів, їх динамічних властивостей. Модифікація структурної організації білок-ліпідних комплексів, переміщення білків в ліпідний бішар, зменшення товщини ліпідного бішару та в’язкості ліпідної компоненти вказує на зміни взаємозв’язку між білковими та ліпідними молекулами. Таким чином, структурна дестабілізація АМ ентероцитів після опромінення обумовлює зміни активності ферментів та збільшення пасивної проникності мембран для іонів.

ВИСНОВКИ

1. Проведено дослідження структурно-функціонального стану мембран ентероцитів тонкої кишки після разової дії іонізуючого випромінення в широкому діапазоні доз (0,1; 0,4; 1,0; 2,0; 3,0 та 6,0 Гр), що дозволило встановити дозозалежні порушення ультраструктури слизової оболонки тонкої кишки, зміни ліпідного та їх жирнокислотного складу апікальної мембрани ентероцитів, в’язкості ліпідного бішару та збільшення його проникності для неорганічних іонів, зростання синтезу ліпідів та порушення окисно-антиокиснювального стану мембран.

2. Встановлено зменшення в досліджуваних мембранах кількості загальних ліпідів, фосфоліпідів та холестеролу через 24 год після опромінення в дозах 1,0 – 6,0 Гр та відновлення цих показників до контрольних значень через 72 год. Крім того, спостерігається зменшення вмісту основних фосфоліпідів та збільшення вмісту їх лізоформ, що може призводити до змін фізико-хімічних властивостей ліпідного бішару.

3. Виявлено, що зі зростанням дози опромінення відбувається перерозподіл вмісту жирних кислот у різних фракціях ліпідів. Характерним для фосфоліпідів є збільшення вмісту ненасичених жирних кислот, а для нейтральних – насичених і, як результат – різноспрямовані зміни коефіцієнту насиченості жирнокислотних залишків ліпідів, що свідчить про структурну модифікацію мембранних ліпідів.

4. Встановлено активацію синтезу фосфоліпідів та холестеролу у всі терміни досліджень. Підвищення синтезу ліпідів може зумовлювати зростання відновлювальної здатності мембран після опромінення.

5. Дія іонізуючого випромінення призводить до активації процесів ПОЛ: спостерігається підвищення вмісту малонового діальдегіду, збільшення його Fe2+-аскорбат залежного накопичення в мембранах та зростання антиокиснювальної активності. Виявлені зміни