НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИКИ

САВІНСЬКА Лілія Олексіївна

УДК 577.218

ОСОБЛИВОСТІ ЕКСПРЕСІЇ ? ТА ? ІЗОФОРМ ПРОТЕЇНКІНАЗИ РИБОСОМНОГО БІЛКА S6 ПРИ ЗЛОЯКІСНІЙ ТРАНСФОРМАЦІЇ В ТКАНИНАХ МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ ЛЮДИНИ

03.00.03 ? молекулярна біологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі структури та функцій нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Науковий керівник:

Офіційні опоненти:

Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології імені Р.Є. Кавецького, м. Київ.

Захист дисертації відбудеться 28 грудня 2004 року о 10 00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою:

03143, м. Київ, вул. Заболотного, 150.

Авторефереат розіслано_____листопада 2004 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук О.В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сигнальні системи або сигнальні шляхи клітини відіграють ключову роль у процесах регуляції клітинного росту, диференціації, проліферації та апоптозу. Їхня основна функція полягає в передачі позаклітинних стимулів, що індукуються гормонами, факторами росту, цитокінами та ін., від рецепторів клітинної мембрани до відповідних компартментів клітини (ядро, рибосоми, мітохондрії). Передача позаклітинного сигналу опосередковується складним каскадом послідовних фосфорилювань/дефосфорилювань компонентів сигнальних шляхів, а одними із основних складових сигнальних систем є білкові та ліпідні кінази і фосфатази. Ціла низка патологій, включаючи злоякісну трансформацію клітини, супроводжується порушеннями функціонування сигнальних систем, які пов’язані зі змінами експресії чи ензиматичної активності їхніх окремих компонентів. Саме тому в багатьох випадках компоненти сигнальних систем, що зазнають суттєвих змін у процесі онкогенезу, а саме рецептори клітинної мембрани та їхні ліганди, адапторні білки, білкові або ліпідні кінази та фосфатази, в багатьох випадках використовують в сучасній онкології як біомаркери злоякісної трансформації, а також як безпосередні мішені в специфічній хіміо- та імунотерапії онкологічних захворювань.

Представлена робота присвячена дослідженню особливостей експресії важливих компонентів сигнальних шляхів клітини, а саме та в ізоформам кінази рибосомного білка S6 (S6К та S6Кв).

Щонайменше два сигнальні шляхи, РІ-3К-залежний та сигнальний каскад за участю мTOR кінази, залучені до регуляції функціонування S6К та S6Кв. Білок S6 малої субчастинки рибосом є найбільш відомим і охарактеризованим субстратом для S6K. Встановлено кореляцію між фосфорилюванням S6 білка і підвищенням рівня трансляції родини мРНК, що містять у 5`-нетрансльованій ділянці специфічну олігопіримідинову послідовність, яка властива для мРНК усіх рибосомних білків та більшості факторів елонгації. Таким чином, S6 кінази є однією з кінцевих ланок у ланцюгу передачі мітогенних стимулів до апарату біосинтезу білка, що опосередковується фосфорилюванням білка S6 і є одними із ключових регуляторів ініціації білкового синтезу.

Обидві кінази виявляють високий ступінь як структурної, так і функціональної подібності: гомологія первинних структур на білковому рівні становить в середньому 85 %, за винятком N- та С-кінцевих ділянок відповідно з гомологією 28 % та 25 %. У структурі S6К? виявлено гомологічні сайти фосфорилювання, що може свідчити про спільні для обох форм S6К механізми регуляції активності. Кожна з кіназ представлена у клітині двома ізоформами - ядерною і цитоплазматичною, що кодуються одним геном і утворюються в результаті альтернативного сплайсингу мРНК. Для кожної з них білок S6 є специфічним субстратом.

Незважаючи на значну структурну та функціональну подібність між S6К та S6К?, існують і певні відмінності. С-кінцевий домен S6К?, на відміну від S6К?, містить багатий на пролін домен, який відповідає за білково-білкові взаємодії, а також додатковий сигнал ядерної локалізації (NLS), завдяки якому S6К? здатна до транслокації в ядро клітини. Білкова кіназа С здатна фосфорилювати S6К?, але не S6К, що не впливає на активність кінази, однак при цьому інактивується NLS. Є значні відмінності в кінетиці активації кіназ відомими мітогененами. Активність S6К? є чутливішою до мітогенних стимулів і менш чутливою до вмісту поживних речовин у мікрооточенні клітини. Все це свідчить про існування функціональних відмінностей між S6К та S6К?.

Як уже зазначалось, порушення механізмів передачі позаклітинних сигналів досить часто спостерігають при злоякісній трансформації клітини. Це значною мірою стосується і РІ-3 кіназного сигнального шляху, компоненти якого зазнають суттєвих функціональних змін - чи то за рахунок підвищеної/зниженої експресії, чи то конститутивно підвищеної/зниженої активності (PTEN, mTOR, PKB, TSC1/TSC2 (Holland, 2004)). На момент початку виконання дисертаційної роботи для S6K такі дані були відсутні взагалі. Беручи до уваги той факт, що у процесі злоякісної трансформації відбуваються суттєві зміни у рівні біосинтезу білка, і те, що саме S6K посідають одне із ключових місць у регуляції біосинтезу, актуальним було дослідження особливостей функціонування цих кіназ у злоякісних тканинах людини. На наше переконання, це дозволить розширити існуючі уявлення про молекулярні механізми онкогенезу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота відповідає основному плану фундаментальних досліджень, які проводяться у відділі структури та функцій нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (в. о. зав. відділу – к.б.н., с.н.с. В.В.Філоненко) за бюджетною темою №2.2.4.10 – “Дослідження сигнальних шляхів при злоякісній трансформації та пошук пухлиноспецифічних антигенів” (номер державної реєстрації - 0101U000360, 2001-2005 рр.).

Мета та завдання дослідження. Метою даної роботи було дослідити особливості експресії S6К та S6Кв в нормальних тканинах ссавців, у клітинних лініях раку молочної залози людини та в пухлинних тканинах молочної залози людини.

Відповідно до мети були поставлені такі завдання:

1. Клонувати та експресувати в клітинах бактерій С-кінцеві фрагменти S6Кб та S6Кв, що мають найменшу структурну гомологію.

2. Клонувати та експресувати в клітинах комах повнорозмірну форму S6Кв. Очистити з клітин бактерій та клітин комах рекомбінантні білки в препаративних кількостях.

3. Отримати високоспецифічні поліклональні та моноклональні антитіла проти S6Кб та S6Кв.

4. Методом Вестерн-блот аналізу дослідити рівень експресії S6К в різних тканинах ссавців та порівняти його з рівнем експресії відповідних мРНК.

5. Методом Вестерн-блот аналізу дослідити рівень експресії S6К в культивованих клітинах раку молочної залози, у тканинах первинних пухлин (доброякісних та злоякісних) молочної залози людини.

6. Імуногістохімічними методами дослідити особливості тканинної та субклітинної локалізації S6K у зразках пухлин (злоякісних і доброякісних) молочної залози людини.

7. Проаналізувати можливість використання S6 кіназ як біомаркерів злоякісних клітин молочної залози людини.

Об’єктом дослідження були ? та ? ізоформи протеїнкінази рибосомного білка S6, а предметом - особливості їхньої експресії в нормальних тканинах ссавців, у клітинних лініях раку молочної залози людини та в пухлинних тканинах молочної залози людини.

Методи дослідження: конструювання експресувальних векторів, експресія рекомбінантних білків у бактеріальних та бакуловірусних експресувальних системах, отримання моноклональних та поліклональних антитіл, імуноблотинг білків у тотальних лізатах культивованих клітин та тканин, імуногістохімічні дослідження парафінованих зрізів тканин.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше досліджено особливості експресії S6К та S6К? на рівні білка в різних тканинах ссавців. Виявлено найвищий вміст кіназ у тканинах мозку, гонад та тимусу. Проведено порівняльний аналіз експресії кіназ на рівні білка та на рівні мРНК і виявлено відсутність повної кореляції. Обговорюється можливість регуляції експресії кіназ як на рівні транскрипції генів S6К, так і трансляції відповідних мРНК.

Вперше досліджено експресію S6К та S6К? в доброякісних пухлинах (аденомах) молочної залози людини і виявлено підвищений вміст S6К, але не S6К? в більшості досліджуваних зразків. Вперше досліджено експресію та виявлено підвищений вміст S6К? в злоякісних пухлинах (аденокарциномах) молочної залози людини. Вперше отримано та охарактеризовано специфічні моноклональні антитіла проти S6К та S6К?. Проведено дослідження субклітинної локалізації S6К та S6К? в нормальних тканинах та пухлинах молочної залози. Вперше виявлено тенденцію до транслокації в ядро цитоплазматичної форми S6К? кінази у злоякісних клітинах пухлин молочної залози людини.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані полі- та моноклональні антитіла проти S6К та S6К? можуть бути використані для подальшого дослідження функціональних особливостей S6К в різних типах клітин і тканин імунохімічними та імуногістохімічними методами. Визначення рівня експресії та особливостей субклітинної локалізації S6К в злоякісних пухлинах у комбінації з використанням вже відомих маркерів злоякісних пухлин може застосовуватись для діагностики онкологічних патологій молочної залози людини. Отримані результати дають підстави розглядати S6К та S6К? як потенційні мішені для майбутньої імуно- та хіміотерапії онкологічних захворювань молочної залози людини.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу було виконано під керівництвом к. б. н., с. н. с., в. о. зав. відділу структури та функцій нуклеїнових кислот ІМБіГ НАН України В. В. Філоненка. Основний обсяг експериментальної роботи виконано за безпосередньої участі здобувача. Експресію рекомбінантних білків у бактеріальних експресувальних системах, їхнє очищення, отримання та тестування поліклональних антитіл, тестування моноклональних антитіл, імунохімічні дослідження експресії S6К та S6К? у тканинах щурів та тканинах молочної залози (нормальних та пухлинних) виконано безпосередньо пошукачем. Клонування рекомбінантних пептидів S6К та S6К? у відповідні вектори проведено спільно з к.б.н. Вудмаскою М. І. та к.б.н. Кухаренком О.П. Отримання моноклональних антитіл проводили у співробітництві з д. б. н., с. н. с. Погрібним П. В., к. б. н., с. н. с. Овчаренко Г. В. та аспірантом Горбенко О. В. Визначення експресії S6К та S6К? у клітинних лініях раку молочної залози проведено спільно з к. б. н., с. н. с. Гутом І. Т. (Людвіговський інститут раку, м. Лондон, Велика Британія) та к. б. н. Пальчевським С. С. Автор висловлює подяку к. б. н., с. н. с. Гуту І.Т. за допомогу в отриманні рекомбінантного білка повнорозмірної форми S6К?.

Автор висловлює подяку співробітнику кафедри онкології Національного медичного університету імені акад. Богомольця О. О. МОЗ України д. м. н., с. н. с. Чешуку В. Є. та клінічному ординатору Київської міської онкологічної лікарні Мальцю М. С. за допомогу у підборі клінічного матеріалу пухлинних тканин аденокарцином та фіброаденом молочної залози людини. Імуногістохімічні дослідження парафінованих зрізів тканин молочної залози виконано у співробітництві з лікарями Київської міської онкологічної лікарні та співробітниками морфологічної лабораторії БІОНТЕК м. Дніпропетровська к. б. н. Лизогубовим В. В. та к. м. н. Усенко В. С.

Автор також висловлює подяку співробітникам відділу структури та функцій нуклеїнових кислот, керівникові роботи к. б. н., с. н. с. Філоненку В. В. та всім колегам, які сприяли виконанню роботи, за допомогу, корисні поради та обговорення результатів. Отримані результати опубліковано у спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були апробовані на семінарах відділу структури та функцій нуклеїнових кислот ІМБіГ НАНУ і представлені на конгресі „Онкологія-2000”, на ІІІ Парнасівській конференції (м. Львів, 2000), на Конференціях для студентів, аспірантів та молодих спеціалістів (Київ, 2001, 2003), на Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004) та на спільному засіданні відділів структури та функцій нуклеїнових кислот, білкової інженерії, механізмів трансляції генетичної інформації, ензимології білкового синтезу ІМБіГ НАНУ.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті у провідних фахових виданнях та тези 4 доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів екпериментальних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел та додатків. Дисертацію викладено на 143 сторінках стандартного машинопису. Вона містить 35 рисунків, 1 таблицю. Список використаної літератури охоплює 251 найменування.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи досліджень. Для аналізу експресії S6K в нормальних тканинах ссавців брали молодих статевозрілих щурів віком від 2,5 до 4 місяців. Післяопераційні зразки тканин молочної залози були люб’язно надані співробітниками кафедри онкології Національного медичного університету імені акад. Богомольця О.О. МОЗ України та Київської міської онкологічної лікарні. Гомогенати тканин отримували механічним розтиранням в рідкому азоті або у гомогенізаторі Поттера при +4оС з додаванням лізуючого буфера. Концентрацію сумарного білка в отриманих супернатантах визначали за методом Бредфорда.

Для отримання рекомбінантних фрагментів S6К фрагмент кДНК, який кодує С-кінцеві амінокислотні послідовністі S6К? (453-525) та S6К (442-495) було ампліфіковано методом ПЛР за стандартним протоколом (рис.1). Ампліфіковані кДНК С-кінцевих фрагментів S6К? та було клоновано за NсоI/EcoRI сайтами в плазмідний експресувальний вектор рЕТ23d (“Novagene”, США), що містив ген резистентності до ампіциліну та безпосередньо за ініціюючим метіоніном послідовність, що кодує шість гістидинів. Як матрицю використовували повнорозмірну послідовність кДНК S6Кб ?ура та кДНК послідовність S6К людини. Експресію рекомбінантних білків проводили в бактеріальних клітинах ВL 21DЕЗ (Stratagene, США), трансформованих відповідними конструкціями. Очищення рекомбінантних пептидів із бактеріального лізату проводили з використанням афінного носія “Таlon” (Сlontech, США) згідно протоколу виробника.

Для експресії повнорозмірної форми S6К? використовували бакуловірусну експресувальну систему Вас-to-Вас (Invitrogene, США). Послідовність, яка кодує повнорозмірний білок S6К?, було клоновано з N-кінцевим His-tag у вектор pFastBacTMHT. Рекомбінантний бакуловірус, який містив вставку, що кодує повнорозмірну форму S6К?, отримували згідно протоколу фірми (Invitrogene, США). Експресію S6Кв проводили при інфікуванні клітин Sf9 рекомбінантним бакуловірусом. Білок виділяли з освітленого лізату на афінному носії Ni-NTA згідно протоколу фірми-виробника.

Для отримання поліклональних антитіл до С-кінцевих пептидів S6К? та S6К імунізацію кролів проводили за стандартними схемами. При досягненні титру антитіл у сироватці крові імунізованих тварин 1:104-1:105 (10-4-10-5) проводили забір препаративних об’ємів крові.

Для отримання моноклональних антитіл (МКАТ) до S6Кб ?а S6К використовували стандартні методи. Для імунізації тварин використовували рекомбінантний С-кінцевий фрагмент S6Кб та рекомбінантну повнорозмірну форму S6К. Відбір позитивних клонів клітин, що продукують специфічні антитіла, проводили методом твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) з використанням відповідних антигенів.

Оцінку вмісту S6Кб ?а S6К у лізатах клітин і тканин здійснювали імунохімічним методом (Вестерн-блот аналіз). Для візуалізації результатів імуноблотингу використовували набір реактивів ECL (Amersham Pharmacia Biotech, США) та рентгенівську плівку “Kodak” (США). Отримані зображення сканували та проводили відносну кількісну оцінку інтенсивності сигналів за допомогою програми Total Lab.

Для імуногістохімічних досліджень післяопераційні зразки тканин молочної залози фіксували розчином Буена, зневоднювали в спиртах зростаючих концентрацій та після трикратної обробки метилбензоатом (Aldrich, Німеччина) блоки тканин заливали у парафін. Зрізи завтовшки 5 мкм депарафінували трьома змінами по 5 хвилин чистого ксилолу (Реахім, Україна) та у спиртах, поступово знижуючи їхні концентрації. Детектування S6Кб ?а S6К проводили набором антитіл як і у Вестерн-блоті. Як субстрат для пероксидази використовували діамінобензидин (DAB).

Результати досліджень та їх обговорення. Виходячи із завдань роботи кДНК послідовності, що кодують С-кінцеві фрагменти S6Кб ?а S6К було клоновано у вектор для експресії білків у клітинах бактерій рЕТ23d в рамці з нуклеотидною послідовністю, що кодує шість гістидинів безпосередньо за стартовим метіоніном. Очистку рекомбінантних пептидів з лізатів клітин E.coli ВL 21DЕЗ, трансформованих відповідно рЕТ23d/His-S6Кб-? та рЕТ23d/His-S6К-С після індукції ізопропіл-?-D-тіогалактопіранозидом (ІПТГ) проводили методом афінної хроматографії на Ni-NTA сефарозі (рис.2А, Б). Для клонування повнорозмірної форми S6К, що містила додаткові шість гістидинів на N-кінці використовували бакуловірусну експресувальну систему Bac-to-Bac (Invitrogene, США), а рекомбінантна кіназа була експресована в клітинах комах, інфікованих бакуловірусом. Очистку S6К з лізатів клітин комах проводили також методом афінної хроматографії на Ni-NTA сефарозі (рис.2 В).

Для отримання поліклональних антитіл (ПКАТ) проти S6Кб ?а S6К як антиген для імунізації кролів використовували рекомбінантні С-кінцеві пептиди S6Кб та S6К?. Для отримання МКАТ проти S6Кб ?а S6К?, як антиген, використовували С-кінцевий пептид S6Кб ?а повнорозмірну форму S6Kв.

Антитіла отримували за стандартними схемами і після очищення перевіряли їх на специфічність та наявність перехресного розпізнавання ізоформ S6К? та S6К? методом імуноблотингу. Отримані поліклональні та моноклональні антитіла, які було використано в подальшій роботі, мали високий ступінь афінності та специфічності як до повнорозмірних рекомбінантних антигенів, експресованих у клітинах ссавців (доріжка 1 на рис.3А, 3Б, 3В та 3Г), так і до ендогенних форм S6К? та S6К? в клітинах лінії MCF7 (доріжка 2 на рис.3А, 3Б, 3В та 3Г).

Специфічність ПКАТ та МКАТ і відсутність імунологічного перехресту щодо S6К? та S6К? було підтверджено Вестерн-блотом, де як антигени було використано очищені препарати С-кінцевих пептидів обох кіназ та лізати клітин ліній НЕК 293, трансфікованих плазмідами для повнорозмірних форм кіназ (рис. 4).

Порівняльна характеристика рівнів експресії S6К? та S6К? в тканинах ссавців. Аналіз експресії S6К? та S6К? в нормальних тканинах щура на рівні білка проводили методом Вестерн-блот аналізу з використанням специфічних ПКАТ, порівнюючи отримані дані з попередніми результатами Нозерн-блот аналізу експресії відповідних мРНК (Gout et al. 1998).

Для р70 S6К? найвищий рівень експресії було виявлено в мозку та м`язах, дещо нижчий, однак високий в тимусі, сім`яниках, серці, яєчниках та легенях, незначний в передміхуровій залозі та нирках, і майже зовсім не виявлено експресії в щитовидній залозі, селезінці, печінці та кишечнику. Для S6К? спостерігали, в цілому, подібний розподіл рівня експресії, залежно від тканини, однак найвищий рівень експресії було виявлено в гонадах (сім’яниках та яєчниках), дещо нижчий в тимусі, мозку, легенях, серці та м`язах і майже не виявлено експресії S6К? в щитовидній залозі, селезінці та кишечнику.

Згідно аналізу експресії S6K та в тканинах людини на рівні мРНК методом Нозерн-блот аналізу (Gout, 1998) встановлено, що мРНК обох кіназ експресується в усіх органах з незначними відмінностями в рівнях їхньої експресії. Варто зазначити, що для S6K виявлено два специфічних транскрипти ( 3,4 та 7,4 тис. п. н.), у той час як для S6K - лише один розміром 2,2 тис. п. н., що може бути пов’язано з існуванням додаткових гомологічних форм S6K або сплайсових варіантів (табл. 1).

Таблиця1

Рівень експресії білка та мРНК S6 кінази в тканинах різних органів щура за результатами Вестерн- та Нозерн-блот аналізу

Назва органу | Білок | мРНК

S6Kб | S6Кв S6К бS6К ? | 7,4 тис.п.н. | 3,4 тис.п.н. | 2,2 тис.п.н. | 1. Тимус | + + + | + + | + + | + + | + + | 2. Сім`яники | + + + | + + + | + + | + + | + + | 3. Серце | + + + | + + | + + + | + + + | + + + | 4. Мозок | + + + + | + + | + + + | + | + 5. Яєчники | + + | + + + | + + + | + + | + + | 6. Легені | + + | + + | + | + | + 7. Передміхурова залоза | + | + | + + | + + | + + + | 8. Щитовидна залоза | + + 9. Підшлункова залоза | + | + | + + + | + + + | + + + | 10.Селезінка | + + + + + | + + + | + + + | 11.Нирки | + + | + | + | + | 12.Печінка | + + + | + | + | 13.Кишечник | + + | + + | + + + | 14.М`язи | + + + | + + | + + + + | + + + | + + + | Умовна оцінка рівня експресії: + + + + найвищий; + + + високий; + + помірний; + низький; + ? найнижчий; ? експресію не виявлено

Порівняння результатів Вестерн-блот аналізу з результатами Нозерн-блот аналізу дозволив зробити висновок про відсутність повної кореляції між експресією генів кіназ на рівні білка та на рівні мРНК (табл.1). У мозку поряд із низьким рівнем синтезу відповідних мРНК, спостерігається високий порівняно з іншими тканинами рівень S6Кб та S6Кв на рівні білка. І навпаки, результати Нозерн-блот аналізу свідчать про високий вміст мРНК S6К? та S6К? в підшлунковій залозі, селезінці та кишечнику, в той час, як високого рівня синтезу кіназ в цих органах нами не виявлено.

Відсутність прямої кореляції між експресією S6Кб та S6Кв на рівні мРНК та експресією відповідних білків можна пов’язати, в першу чергу, з різною ефективністю трансляції мРНК у клітинах відповідних тканин.

Експресія ? та ? ізоформ S6 кіназ у клітинних лініях різного походження. Згідно наших попередніх даних та літературних джерел надзвичайно високий вміст S6Kб спостерігали в клітинах ліній MCF7 та ВТ474 (Couch, 1999; Wu, 2000). Нами було перевірено рівень експресії обох ізоформ S6K в 34 клітинних лініях різного походження, а саме в 26 лініях епітеліальних клітин аденокарциноми молочної залози людини, зокрема 743-В, BT-20, BT-474, CAL-51, САMA-1, DU-4475, HMT-3552, MDA-MB-134, MDA-MB-157, MDA-MB-175, MDA-MB-231, MDA-MB-330, MDA-MB-453, MDA-MB-468, MDA-MB-469, PMC-42, SKBR-3, SKBR-5, SKBR-7, T47D, ZR75-1, ZR75-30, H4.1, С3.6, С5.2 та MCF7, лінії епітеліоподібних клітин молочної залози (HBL-100), виділеної з материнського молока, а також лінії нетрансформованих епітеліальних клітин протоку молочної залози, іморталізованих вірусом SV40 (HB4A). Окрім зазначених ліній, рівень експресії кіназ досліджували у клітинах іншої етіології: B16F1 – меланомні клітини миші, MDCK (NBL-2) – епітеліоподібні клітини нирки собаки, Jurkat – клітини лімфоцитарної Т-клітинної лейкемії людини, U937 –клітини дифузної гістіоцитарної лімфоми людини, COLO 320 – клітини аденокарциноми товстої кишки людини (рис.5).

Як свідчать результати імуноблотингу, високий рівень експресії S6К? спостерігали практично в усіх представлених клітинних лініях раку молочної залози порівняно з клітинними лініями іншого походження (B16F1; MDCK; Jurkat; U937; COLO 320). В лініях клітин, де спостерігали надекспресію цитоплазматичної форми S6К? (S6К?ІІ), а саме 743-В, BT-474, MCF7, MDA-MB-453, MDA-MB-468, ZR75-1, ZR75-30 – одночасно було детектовано підвищений вміст ядерної форми S6К? (S6К?І).

Рівень експресії S6К? у клітинних лініях раку молочної залози теж можна оцінити як підвищений, порівняно з клітинними лініями іншого походження, за винятком клітин лінії MDCK. Варто зазначити, що незважаючи на високу інтенсивність специфічних для S6К? люмінісцентних сигналів, у жодному із випадків ядерну форму S6К? не було детектовано. Оскільки за літературними даними співвідношення S6К?І/S6К?ІІ та S6К?І/S6К?ІІ в клітині є приблизно однаковим, можна зробити припущення, що в аналізованих клітинних лініях має місце надекспресія лише цитоплазматичної форми S6К? на відміну від S6К?, для якої виявлено збільшення вмісту і S6К?І.

Експресія ? та ? ізоформ S6К в пухлинах молочної залози людини. Представлені вище результати свідчать про підвищення експресії S6К ізоформ у клітинних лініях раку молочної залози. Наступним етапом було визначення експресії кіназ у доброякісних та злоякісних пухлинах молочної залози людини порівняно з нормальними тканинами методом Вестерн-блоту із використанням специфічних ПКАТ.

Враховуючи труднощі в отриманні тканин здорових донорів, за умовно нормальні вважали морфологічно не змінені тканини молочної залози, які оточували пухлину.

Результати Вестерн-блот аналізу гомогенатів умовно нормальних тканин та фіброаденом (доброякісних пухлин) молочної залози свідчать про підвищену експресію S6Кб в більшості досліджуваних зразків доброякісних пухлин порівняно з умовно нормальними тканинами (рис. 6А, 7А). Окрім того, вміст S6Кб в тканинах, які оточували злоякісні пухлини, був дещо вищим порівняно з тканинами, які оточували доброякісні пухлини. Ядерну форму S6Кб при цьому не виявлено в жодному із зразків. Аналіз експресії S6Kв в аналогічних зразках свідчить про дуже низький рівень експресії кінази, який майже не детектували.

Для полегшення візуальної оцінки рівня експресії S6Кб і S6Кв в пухлинних тканинах та порівняння його з базальним рівнем поряд зі стандартними позитивними контролями (клітини лінії MCF7, НЕК 293/pcDNA3.1–S6Кб, НЕК 293/pcDNA3.1–S6Кв)– як контроль використовували лізат нормальних тканин (рис.6 дор.9).

Результати Вестерн-блот аналізу гомогенатів злоякісних пухлин молочної залози (рис. 8А та 8Б) із використанням відповідних антитіл свідчать про підвищений вміст як S6Кб, так і S6Кв в більшості досліджуваних зразків порівняно з нормальними тканинами, а для S6Кв навіть порівняно з доброякісними пухлинами. У зразках із найвищим вмістом цитоплазматичної форми S6КбІІ (рис.8 А дор. 2,8,9) виявлено підвищений вміст і ядерної форми - S6КбІ. Ядерну форму S6Кв не було детектовано навіть у зразках із високим вмістом цитоплазматичної форми (рис.8 Б, дор. 2).

Аналізуючи отримані результати, можна зробити висновок, що в злоякісних новоутвореннях молочної залози в 75% обстежених випадків спостерігали підвищення рівня експресії S6Кб та приблизно у 80% випадків – підвищений рівень експресії S6Кв. Це свідчить про важливу роль обох ізоформ S6К у процесах злоякісної трансформації епітеліальних клітин залозистих протоків молочної залози. Аналіз доброякісних пухлин виявив підвищений вміст лише S6Кб, але не S6Кв.

Особливості експресії S6К в злоякісних пухлинах молочної залози. Порівняння результатів аналізу експресії кіназ у злоякісних пухлинах з детальним діагнозом пацієнтів–донорів пухлин виявило, що найвищий вміст S6Кв спостерігали в слабодиференційованих аденокарциномах (рис.8, дор.2, 10). Аналіз експресії кіназ в аденокарциномах низького та помірного ступеня диференціювання (рис.9, 10) дозволив встановити, що вміст як S6К?, так і S6Кв в слабодиференційованих пухлинах значно перевищував відповідний вміст в помірнодиференційованих. Таким чином, надекспресія S6К? та S6Кв супроводжується порушеннями механізмів диференціації клітини. Можна припустити, що саме надекспресія S6Кв вносить при цьому більший внесок, оскільки підвищення експресії кінази в доброякісних пухлинах, що за гістологічними ознаками є високодиференційованими, не спостерігається.

Приймаючи середнє значення флуоресценції специфічного для S6Кв сигналу в нормальних тканинах за 100%, таке значення для всіх 13 досліджених зразків низькодиференційованого раку становило 705% за підрахунком з використанням програми Total Lab. Відповідні значення для зразків пухлин помірнодиференційованих становили близько 300%.

Підрахунок інтенсивності специфічних для S6К? сигналів виявив підвищення інтенсивності сигналу в помірнодиференційованих пухлинах на 220% і слабодиференційованих на 530% порівняно з нормальними тканинами. Знову ж, на відміну від S6Кв, спостерігали підвищення рівня експресії ядерної форми S6К? в слабодиференційованих пухлинах порівняно з пухлинами помірнодиференційованими.

Таким чином, нами встановлено підвищений рівень експресії S6К? в аденомах та аденокарциномах молочної залози та підвищену експресію S6К? лише в аденокарциномах молочної залози. Наші результати значною мірою збігаються з літературними, однак є і відмінності. Нещодавно виявлено ампліфікацію гена S6К? в клітинах лінії MCF7, чим і пояснюється підвищений вміст S6К? в цих клітинах. Ампліфікацію гена S6К? також було виявлено в 9% випадків аденокарцином молочної залози, однак надекспресію кінази детектували лише в 15% випадків. Таким чином, ампліфікація гена є не єдиною причиною підвищеного вмісту кінази. Напевно, має місце і регуляція на рівні трансляції мРНК. Згідно наших даних, S6К? надекспресована як в аденокарциномах, так і фіброаденомах, однак підвищений вміст кінази ми спостерігали у понад 50% випадків, де, окрім того, детектували збільшення вмісту і ядерної форми S6К?І. Літературні дані інших груп стосовно особливостей експресії S6К? в ракових клітинах на сьогодні відсутні.

Оскільки для аналізу вмісту відповідних кіназ використовували екстракти пухлин, наступним завданням було виявити імуногістохімічними методами тип клітин, який відповідальний за підвищений вміст кіназ в пухлинах і, окрім того, дослідити особливості їхньої субклітинної локалізації.

Вивчення особливостей субклітинної локалізації S6К? та S6К? в нормальних і пухлинних тканинах молочної залози людини імуногістохімічним методом. Для аналізу використовували МКАТ, оскільки за попередніми даними вони були більш специфічними в роботі з парафіновими зрізами тканин. S6К? та S6К? мають чітку структурну локалізацію в умовно нормальних тканинах молочної залози, що оточують пухлину і не мають морфологічних ознак патології (рис.11). Обидві форми кінази детектували в цитоплазмі клітин залозистого епітелію з тенденцією до локалізації на внутрішній апікальній поверхні ацинусів. Деякі клітини строми та міоепітелію також мали слабке забарвлення цитоплазми. Ядерну локалізацію обох ізоформ не виявлено ні в залозистих, ні в стромальних клітинах.

У фіброаденомах молочної залози інтенсивність специфічного забарвлення та локалізація досліджуваних кіназ дещо відрізнялась від таких, виявлених в умовно здорових тканинах. Слід зазначити, що деякі ділянки фіброаденом мали більш інтенсивне забарвлення кінази S6Kб в цитоплазмі компонентів строми. Забарвлення S6Кв в цитоплазмі пухлинних клітин було дещо інтенсивнішим, ніж в прилеглих тканинах, та мало дифузний характер. В одиничних випадках спостерігалось позитивне забарвлення клітин строми.

Інтенсивність специфічного для S6Kб та S6Кв імуногістохімічного забарвлення була значно вищою в зразках аденокарцином. Окрім того, кінази були виявлені в ядрі злоякісних клітин (рис. 12Б). Цікаво, що в клітинах з інтенсивно забарвленим ядром майже не детектували кіназ у цитоплазмі на відміну від нормальних клітин (рис. 12А).

Статистичний аналіз 68 зразків аденокарцином молочної залози дозволив виявити головні закономірності в субклітинній локалізації кіназ. Встановлено, що в клітинах умовно нормальних тканин кінази локалізовані виключно в цитоплазмі. У злоякісних клітинах спостерігається транслокація кіназ із цитоплазми в ядро. Ядерну локалізацію S6Kб та S6К? виявлено в 25 % і в 78% випадків відповідно. Оскільки РКС залучена до регуляції ядерної локалізації S6К?, обговорюється можливість порушення РКС-залежних сигнальних шляхів у процесі злоякісної трансформації клітин.

Згідно літературних даних рівень експресії S6Kб на сьогодні вважається одним із найкращих прогностичних показників. Аналіз експресії та особливостей субклітинної локалізації S6К?, що зазнають суттєвих змін у злоякісних клітинах, є важливим як для розширення наших уявлень про механізми злоякісної трансформації, так і для використання з метою діагностики.

ВИСНОВКИ

В дисертаційній роботі вперше досліджено особливості експресії ? та ? ізоформ кінази рибосомного білка S6 в пухлинах молочної залози людини, що є важливим для з’ясування молекулярних механізмів онкогенезу, які супроводжуються порушеннями експресії компонентів сигнальних систем клітини.

1. Отримано специфічні поліклональні та моноклональні антитіла проти б та ? ізоформ S6К.

2. Проведено порівняльний аналіз експресії S6Кб та S6К? в різних тканинах ссавців на рівні мРНК та на рівні білка. Встановлено, що рівень вмісту кіназ та його кореляція з рівнем експресії відповідних мРНК залежить від типу тканини.

3. Виявлено підвищений рівень синтезу S6Kб в доброякісних пухлинах молочної залози людини порівняно з нормальними тканинами. Помітних змін синтезу S6Kв в доброякісних пухлинах не виявлено.

4. Встановлено підвищений рівень вмісту S6Кб і цитоплазматичної форми S6Кв у клітинних лініях та в злоякісних пухлинах раку молочної залози людини порівняно з нормальними тканинами. Встановлено кореляцію між збільшенням вмісту S6К в пухлинах та зниженням ступеня їх диференціювання.

5. Виявлено зміни субклітинної локалізації S6K в клітинах епітеліального походження пухлин молочної залози. Зафіксовано підвищений рівень вмісту S6Kб та S6КвІІ в ядрі злоякісних клітин (25% та 78% відповідно).

6. Запропоновано можливість використання виявлених особливостей експресії S6K для діагностики онкологічних патологій молочної залози людини.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Pogrebnoy P.V., Kukharenko A. P., Tykhonkova I. A., Pal’chevskiy S. S., Savinskaya L. A., Pogrebnaya A. P., Valevka T. I., Markeeva N. V., Soldatkina M. A., Matsuka G. Kh., Gout I. T., Filonenko V. V. Generation and characterization of monoclonal antibodies to p70S6kinase // Экспериментальная онкология. – 1999. – Т. 21, №4. – 232-238.

Особистий внесок дисертанта – отримання в бактеріальній експресувальній системі та очищення препаративних кількостей С-кінцевого фрагмента S6K; тестування специфічності зв’язування отриманих моноклональних антитіл до рекомбінантного антигена в реакціях ELISA та Вестерн-блотингу, а також до повнорозмірних форм білка S6K рекомбінантного та природного походження методом імуноблотингу та імунопреципітації. Аналіз, інтерпретацію отриманих результатів та підготовку статті до друку здійснено разом зі співавторами.

2. Савінська Л. О., Киямова Р. Г., Погрібний П. В., Овчаренко Г. В., Гут І. Т., Філоненко В. В. Порівняльна характеристика експресії та ізоформ S6 кінази в тканинах ссавців // Біополімери і клітина. – 2001. – Т.17, №5. – С.374-379.

Особистий внесок дисертанта – отримання в бактеріальній експресувальній системі та очищення препаративних кількостей С-кінцевих фрагментів S6K та S6К; очищення отриманих поліклональних антитіл проти S6K та S6К і тестування специфічності їхнього зв’язування з рекомбінантними антигенами в реакціях ELISA та Вестерн-блотингу, а також з повнорозмірними формами білків S6K і S6К (рекомбінантними та ендогенно експресованими) методом імуноблотингу та імунопреципітації; отримання та скринування методом імуноблотингу тканинних лізатів різних органів щурів для визначення відносного рівня синтезу в них кіназ S6K та S6Kв; ?ідготовка статті до друку.

3. Савінська Л. О., Усенко В. С., Лизогубов В. В., Погрібний П. В., Пальчевський С. С., Овчаренко Г. В., Чешук В. Є., Гут І. Т., Мацука Г. Х., Філоненко В. В. Експресія та - ізоформ р70S6К у клітинних лініях та пухлинах молочної залози людини // Біополімери і клітина. – 2003. – Т.19, №1. – С.64-70.

Особистий внесок дисертанта отримання та скринування методом імуноблотингу клітинних лізатів різних ліній аденокарциноми молочної залози та гомогенатів пухлинних тканин молочної залози людини рівня синтезу в них кіназ S6K та S6Kв, ?ідготовка статті до друку.

4. Savinska L. O., Lyzogubov V. V., Usenko V. S., Ovcharenko G. V., Gorbenko O. N., Rodnin V. M., Vudmaska M. I., Pogribniy P. V., Kyyamova R. G., Panasyuk G. G., Nemazanyy I. O., Malets M. S., Palchevskii S. S., Gout I. T., Filonenko V. V. Immunohistochemical analysis of S6K1 and S6K2 expression in human breast tumors // Experimental Oncology.–2004.–Vol.26, №1. – P.24-30.

Особистий внесок дисертанта – очищення препаративних кількостей рекомбінантного білка повнорозмірної форми S6К; тестування специфічності зв’язування отриманих моноклональних антитіл до рекомбінантного та природного білка S6К імунохімічними та імуногістохімічними методами; отримання та підготовка препаратів післяопераційного матеріалу пухлинних тканин молочної залози людини для імуногістохімічних досліджень. Аналіз, інтерпретацію отриманих результатів та підготовку статті до друку здійснено разом зі співавторами.

5. Pogrebnoy P.V., Markeeva N. V., Pogrebnaya A. P., Savinskaya L. A., Tykhonkova I. A., Gout I. T., Filonenko V. V., Matsuka G. Kh. Generation and characterization of monoclonal antibodies to p70S6kinase // The 2nd Congress of Oncologist from the CIS member States "Oncology-2000". – Kуiv (Ukraine).-2000. – №158.

Особистий внесок дисертанта – отримання в бактеріальній експресувальній системі та очищення препаративних кількостей препарату С-кінцевого фрагмента S6K; тестування специфічності зв’язування отриманих моноклональних антитіл до рекомбінантного та природного антигенів методом імуноблотингу та імунопреципітації.

6. Malanchuk O. M., Savinska L. O., Kiyamova R. G., Ovcharenko G. V., Filonenko V. V., Gout I. T. Comparative charakterization of S6 kinase and isoforms expression in mammalian tissues // Conference for studunts, PhD students and young scientists on molekular biology and genetics, –Kyiv (Ukraіne). – 2001. – P.136.

Особистий внесок дисертанта – отримання та скринування методом імуноблотингу тканинних лізатів різних органів щурів рівня синтезу в них кіназ S6K та S6Kв.

7. Palchevskyy S. S., Pogrebnoy P. V., Pogrebnaya A. P., Savinskaya L. A., Gout I. T., Filonenko V. V. Analysis of p70 S6 kinase (S6K1 and S6K2) expression in transformed cell lines and tumor tissues // Conference for students, PhD students and young scientists on molecular biology and genetics. – Kyiv (Ukraіne). – 2001. – P.157.

Особистий внесок дисертанта – отримання та скринування методом імуноблотингу клітинних лізатів різних ліній аденокарциноми молочної залози та гомогенатів пухлинних тканин молочної залози людини рівня синтезу в них кіназ S6K та S6Kв.

8. Filonenko V., Savinska L., Ovcharenko G., Vudmaska M., Panasyuk G., Nemazanyy I., Palchevskyy S., Gout I. Oncogenic potential of ribosomal protein S6 kinase // Тези Установчого з’їзду Українського товариства клітинної біології. – Львів (Україна), 2004. – C.114.

Особистий внесок дисертанта – скринування тканинних лізатів пухлин раку молочної залози різного ступеня диференціювання методом Вестерн-блот аналізу рівня синтезу в них кіназ S6K та S6Kв.

АНОТАЦІЯ

Савінська Л.О. Особливості експресії б та в ізоформ протеїнкінази рибосомного білка S6 при злоякісній трансформації в тканинах молочної залози людини. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 –