ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ім. В.Н.КАРАЗІНА

ДЯДЧЕНКО ВЛАДИСЛАВ ВАЛЕРІЙОВИЧ

УДК 543.061/.062 : 543.38 : 543.86] 001.8

ЕНЗИМНО-КІНЕТИЧНЕ ВИЗНАЧЕННЯ ФОСФОРОРГАНІЧНИХ ОТРУЙНИХ СПОЛУК З ВИКОРИСТАННЯМ ІНДИКАТОРНИХ
РЕАКЦІЙ ОКИСНЕННЯ 3,3?,5,5?-ТЕТРАМЕТИЛБЕНЗИДИНУ
ТА п-ФЕНЕТИДИНУ

02.00.02 – аналітична хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

Харків – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському гвардійському ордена Червоної Зірки інституті танкових військ імені Верховної Ради України Національного технічного університету “Харківський політехнічний інститут”,

Міністерство оборони України.

Науковий керівник: | кандидат хімічних наук, доцент

БЛАЖЕЄВСЬКИЙ Микола Євстахійович,

Національний фармацевтичний університет,

доцент кафедри фізичної та колоїдної хімії

Офіційні опоненти: | доктор хімічних наук, професор

БОЛОТОВ Валерій Васильович,

Національний фармацевтичний університет,

завідувач кафедри аналітичної хімії

кандидат хімічних наук

БЄЛІКОВА Лариса Іванівна,

Інститут сцинтиляційних матеріалів НАН України,

науковий співробітник відділу аналітичної хімії функціональних матеріалів та об’єктів навколишнього середовища

Провідна установа: | Український державний хіміко-технологічний університет, кафедра аналітичної хімії, Міністерство освіти і науки України,

м. Дніпропетровськ

Захист відбудеться 14.04.2005 року о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д .051.14 Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 7-80.

З дисертацією можна ознайомитися в Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4

Автореферат розісланий 12.03.2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради В.Г.Панченко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Фосфоровмісні органічні отрути (метафос, трихлорметафос, дихлорфос, хлорофос, фталофос, фозалон, карбофос, метилнітрофос тощо) належать до числа пестицидів, які підлягають першочерговому контролю у харчових продуктах та воді. За хімічною будовою вони є похідними фосфатної, тіо- та дитіофосфатної кислот – широко застосовуються у народному господарстві. Їх відносно високу токсичність пояснюють пригнічуючою дією на фермент холінестеразу, який відіграє важливу роль у регулюванні фізіологічних процесів. Цю здатність фосфорорганічних отруйних сполук (ФОС) знижувати активність холінестерази покладено в основу біохімічного методу їх визначення. Він ґрунтується на порівняльному вимірюванні каталітичної активності фермента холінестерази до і після контакту з інгібітором.

Більшість методів визначення активності холінестерази зводяться до визначення кількості утворених продуктів ферментної реакції – оцтової кислоти або холіну, є лабораторними і мають суттєві обмеження у несубстратній вибірковості до кислотних та основних домішок та точності. Робоча ділянка градуювального графіка має форму рівнобічної гіперболи, що є незручним під час виконання аналізу.

Відомий фотометричний метод визначення активності холінестерази за кількістю невитраченого у реакції субстрата ацетилхоліну (метод Хьостріна) не дозволяє використовувати кінетичний метод, бо вимагає зміни рН реакційного середовища в ході аналізу. Разом з тим, проведення аналізу в буферованому розчині дозволить виключити заважаючий вплив домішок кислотного та основного характеру, а виконання визначення інгібіторів холінестерази у кінетичному варіанті – дозволить покращити метрологічні характеристики біохімічного методу аналізу.

Актуальним убачається пошук нових індикаторних реакцій, а відтак – вивчення можливості їх застосування у біохімічному методі. Базисом такого пошуку можуть бути реакції гідроперекисного окиснення 3,3?,5,5?-тетраметилбензидину (ТМБ) та п-фенетидину (ПФ), які використовуються у теперішній час як індикаторні для визначення ФОС за їх власною каталітичною дією.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася згідно науково-дослідної тематики кафедри бойових токсичних хімічних речовин та засобів захисту факультету радіаційного, хімічного, біологічного захисту та екології Харківського гвардійського ордена Червоної Зірки інституту танкових військ імені Верховної Ради України Національного технічного університету “Харківський політехнічний інститут” і є складовою частиною науково-дослідної роботи “Розробка методики визначення питомої активності холінестераз для покращення якості проведення екологічного моніторингу хімічно небезпечних об’єктів”, замовником якої є Головнокомандувач Сухопутних Військ Збройних Сил України. Також дисертаційна робота виконувалася згідно науково-дослідної тематики кафедри фізичної, колоїдної та неорганічної хімії Національного фармацевтичного університету і є складовою держбюджетної теми “Хімічний синтез, виділення та аналіз нових фармакологічно-активних речовин, встановлення зв’язку “структура – дія”, створення нових лікарських препаратів”
(№ 198U007011).

Мета і задачі дослідження. Розширення можливостей біохімічного методу визначення ФОС на основі застосування реакцій окиснення ТМБ та ПФ гідроген пероксидом як індикаторних на непрореагований ацетилхолін. Для досягнення цієї мети необхідно:

– вивчити кінетику окиснення ТМБ та ПФ гідроген пероксидом у присутності субстрата біохімічної реакції ацетилхоліну;

– здійснити вибір оптимальних умов процесу окиснення ТМБ та ПФ, які можуть бути покладені в основу нових індикаторних реакцій під час визначення ацетилхоліну у біохімічній реакції;

– вивчити кінетику реакції ферментного гідролізу ацетилхоліну в присутності інгібіторів холінестерази із використанням індикаторних реакцій окиснення ТМБ та ПФ;

– розробити методики аналітичного визначення ФОС тощо біохімічним методом з використанням індикаторних реакцій окиснення ТМБ та ПФ;

– вивчити аналітичні характеристики та можливість практичного застосування розроблених методик в екологічному моніторингу та військовій індикації.

Об’єктом дослідження є нові індикаторні реакції окиснення ТМБ та ПФ гідроген пероксидом та їх застосування у біохімічному методі визначення ФОС тощо.

Предметом дослідження є реакції ферментного гідролізу ацетилхоліну в присутності холінестерази та ФОС; ензимно-кінетичне визначення ГД-7 (О-етиловий-S-в-?тилтіоетиловий етер метилфосфонової кислоти), метафосу, трихлорметафосу, хлорофосу, карбофосу, фталофосу та метилнітрофосу тощо із застосуванням індикаторних реакцій окиснення ТМБ та ПФ (метафос тощо).

Методи дослідження: кінетики, йодометрія, перманганатометрія, УФ/ВИД-спектрофотометрія, фотоелектроколориметрія.

Наукова новизна одержаних результатів. Показано, що замість канцерогенного бензидину як індикаторну речовину в реакції Шенеманна можна використовувати ТМБ. Вперше досліджено вплив ФОС у реакції гідролізу ацетилхоліну в присутності фермента холінестерази з використанням індикаторних реакцій окиснення ТМБ та ПФ. Показано, що реакції окиснення ТМБ та ПФ гідроген пероксидом можуть бути використані як індикаторні на непрореагований ацетилхолін під час ензимно-кінетичного визначення ФОС.

Практичне значення отриманих результатів. Дані, отримані в результаті проведених досліджень, розширюють функціональні можливості біохімічного методу аналізу з визначення ФОС тощо та його значення у хімічному аналізі органічних речовин. Отримані результати можуть бути основою для опрацювання нових методик кількісного визначення інгібіторів холінестерази біохімічним методом. Розробка методик у кінетичному варіанті з використанням індикаторних реакцій окиснення ТМБ та ПФ дозволяє істотно підвищити селективність визначення до кислотних та лужних домішок.

Результати дисертації були використані під час підготовки навчальних посібників “Технічні засоби хімічної розвідки та контролю”, “Військові технічні засоби хімічного аналізу. Книга ІІ” та “Бойові токсичні хімічні речовини” для курсантів факультету РХБ захисту та екології Харківського інституту танкових військ.

Особистий внесок здобувача. Аналіз літературних даних, експериментальні роботи, що стосуються індикаторних реакцій окиснення ТМБ та ПФ гідроген пероксидом в присутності непрореагованого ацетилхоліну та вивчення можливості їх застосування у біохімічному методі аналізу ФОС виконані самостійно згідно з вказівками наукового керівника. Особистий внесок здобувача в опублікованих працях наведено у їх списку.

Апробація результатів дисертації. Апробація результатів дисертації проводилася на 3-й Міжнародній міждисциплінарній науково-практичній конференції “Сучасні проблеми науки та освіти” 1-9 травня 2002 р. м. Ужгород, Україна та Міжнародній науково-практичній конференції “Інформаційні технології: наука, техніка, технологія, освіта та здоров’я” 15-16 травня 2003 р., Харків

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті в тому числі 3 у фахових виданнях та 4 тез доповідей.

Структура дисертації. Загальний обсяг дисертації становить 121 сторінку та складається з вступу, шести розділів, висновків, переліку використаної літератури, що нараховує 156 посилань та додатку А. Дисертація містить 13 таблиць та 40 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми дослідження, сформульовано мету та основні завдання дисертаційної роботи, показано її наукову новизну та практичну цінність.

У першому розділі “Ідентифікація та кількісне визначення фосфорорганічних отруйних сполук. Літературний огляд” наведено огляд літературних даних про методи та способи визначення ФОС. Особлива увага присвячена визначенню ФОС біохімічним методом. Відзначено, що незважаючи на велику кількість розроблених методик кількісного визначення ФОС біохімічним методом, практично усі вони зводяться до визначення активності фермента за швидкістю утворення продуктів ферментного гідролізу (кінетичний метод) чи визначення концентрацій продуктів гідролітичного розщеплення субстрату, а тому не є вибірковими до кислотних та основних домішок у аналізованій суміші. Обґрунтована перспективність розробки методик визначення активності фермента за зміною концентрації невитраченого у реакції субстрату у спектрофотометричному варіанті, що дозволить виключити заважаючий влив можливих супутніх речовин кислого та основного характеру і підвищити селективність та точність аналізу.

Методика виконання експериментальних досліджень та обробки одержуваних результатів, методи приготування стандартних розчинів описані у другому розділі “Реактиви, прилади та методи досліджень”. Використовували стандартні зразки розчинів пестицидів в ацетоні (метафосу, трихлорметафосу, фозалону, фталофосу, карбофосу) розфасовані у скляні ампули місткістю 3 мл виробництва Спеціального конструкторсько-технологічного бюро з дослідним виробництвом Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України та субстанції інгібіторів холінестерази: хлорофосу, четвертинних амонієвих солей та алкалоїдів відомого ступеню очищення (? %). Робочі розчини готували ваговим методом та розведенням стандартних зразків двічі дистильованою водою до потрібної концентрації. Для проведення біохімічної реакції використовувався препарат ферменту холінестерази VI класу із сироватки крові коня питомою активністю 23-27 АЕ/мг із комплекту реактивів військової автомобільної радіометричної та хімічної лабораторії АЛ-4М та ацетилхоліну хлорид, розфасований в ампули по 0,02 г із комплекту реактивів польової хімічної лабораторії ПХЛ-54. Решта реактивів була кваліфікації ч.д.а. У роботі використовували 3,3?,5,5?-тетраметилбензидин дигідрохлорид моногідрат, х.ч. 99% (“Aldrich”) та n-фенетидину гідрохлорид, х.ч., двічі перекристалізований з етанолу. Концентрацію гідроген пероксиду встановлювали перманганатометрично. За результатами дослідження оптимальних умов проведення реакції ферментного гідролізу ацетилхоліну в присутності холінестерази встановлено, що концентрації фермента (0,24 мг/мл), субстрату (3,310-4М), рН реакційного середовища (0,2 М фосфатний буфер з рН 8,3) та порядок її проведення добре погоджуються з літературними даними. Доведено, що лімітуючою стадією процесу окиснення індикаторної речовини (ТМБ чи ПФ) є реакція пергідролізу непрореагованої кількості ацетилхоліну, оскільки швидкість утворення забарвленого продукту індикаторної реакції визначається швидкістю утворення пероксіоцтової кислоти в реакції невитраченого субстрату з гідроген пероксидом. Це дозволило застосувати реакції окиснення ТМБ чи ПФ гідроген пероксидом як індикаторні на непрореагований субстрат.

У третьому розділі “Визначення фосфорорганічних пестицидів за реакцією Шенеманна з 3,3?,5,5?-тетраметилбензидином” показана можливість визначення фосфорорганічних пестицидів за реакцією Шенеманна з використанням як індикаторної речовини ТМБ:

3,3?,5,5?-тетраметилбензидин (ТМБ)

Оптимальним умовами проведення реакції Шенеманна з ТМБ в присутності хлорофосу, метафосу, трихлорметафосу та фозалону є: рН 11,0 (розчин NaOH), концентрація гідроген пероксиду 10-1 М, ТМБ 210-3М, для запобігання випадіння осаду основи ТМБ у реакційну суміш додавали етанол з розрахунку, щоб кінцева концентрація у розчині становила 40 %(об). Порядок змішування реагентів суттєво не впливає на швидкість індикаторної реакції. Результати вивчення залежності кінетики реакції окиснення ТМБ гідроген пероксидом у присутності та у відсутності хлорофосу показали, що утворення забарвленого продукту реакції досягає максимуму на 5 хв і у подальшому зменшується, ймовірно, пероксифосфатна кислота, утворена в реакції хлорофосу з гідроген пероксидом, піддається подальшій послідовній реакції пергідролізу з Н2О2, а відтак – призводить до руйнування продукту окиснення ТМБ. Це дало можливість використати метод фіксованого часу під час фотоелектроколориметричного контролю швидкості реакції (фотоелектроколориметр КФК-2УХЛ-010 світлофільтр №3 з ?еф=400 нм, l=2см). У випадку метафосу, трихлорметафосу та фозалону лінійний характер кінетичних кривих утворення забарвленого продукту на початкових стадіях реакцій дозволив здійснювати визначення їх методом тангенсів.

Метрологічні характеристики одержаних результатів кількісного визначення фосфорорганічних пестицидів каталітичним методом за реакцією Шенеманна з використанням ТМБ наведена у табл. 1.

Таблиця 1

Метрологічні характеристики одержаних результатів аналізу фосфорорганічних пестицидів за реакцією Шенеманна з використанням ТМБ (Р = 0,95, n = 5, tб (P,f) = 2,78)

№ з/п | Визначувана

Сполука | Уведено

мкг/мл | Знайдено

± х, мкг/мл | Sr, % | д, %

1. | Хлорофос | 1,5 | 1,3±0,2 | 11 | -10

2. | Метафос | 2,0 | 1,9±0,3 | 13 | -8,3

3. | Трихлорметафос | 2,0 | 2,1±0,3 | 12 | +8,1

4. | Фозалон | 15,0 | 16,0±1,7 | 13 | +9,3

У четвертому розділі “Визначення фосфорорганічних отруйних сполук ензимно-кінетичним методом з використанням індикаторної реакції окиснення 3,3?,5,5?-тетраметилбензидину” розроблені методики визначення фосфорорганічних отруйних сполук ензимно-кінетичним методом з використанням індикаторної реакції окиснення ТМБ.

Для кількісного визначення ФОС широко використовується біохімічний метод, в основу якого покладена здатність ФОС пригнічувати каталітичну активність ферменту холінестерази (ХE) в реакції гідролізу холінових естерів. Однак, незважаючи на високу специфічну чутливість біохімічного методу, методики визначення активності холінестерази за кількістю утвореної оцтової кислоти мають суттєві обмеження у неспецифічній селективності. Досліджена можливість кількісного визначення ФОС біохімічним методом у кінетичному варіанті із застосуванням індикаторної реакції окиснення ТМБ. Ферментна реакція гідролізу ацетилхоліну перебігає за наступною схемою:

Визначення ступеню інгібування фермента холінестерази у реакції гідролізу ацетилхоліну здійснювали за швидкістю реакції окиснення ТМБ пероксіоцтовою кислотою, яка утворюється у реакції непрореагованого ацетилхоліну з гідроген пероксидом:

Ймовірно, пероксіоцтова кислота окиснює ТМБ за наступною схемою:

Дві молекули 3,3?,5,5?-тетраметилдифенохінондиіміну, що утворилися, конденсуються з утворенням азометинового барвника – біс-(2,5,7,10-тетраметил-6-аміно)-азобіфенілу, забарвленого у жовтий колір (?max=422 нм):

Опрацьовано нову методику кількісного визначення інгібіторів холінестераз у водних розчинах за принципом: “Концентрація інгібітора – швидкість утворення забарвленого продукту”.

Вивчали оптимальні умови перебігу ферментної реакції: порядок змішування, концентрації, час витримування реагентів (?в), рН середовища, вплив природи буферного розчину. Найбільша швидкість реакції окиснення ТМБ досягалася при ?в ? 10 хв. Тому подальші досліди проводили при 10-хвилинній інкубації розчину непрореагованого ацетилхоліну з гідроген пероксидом. Для забезпечення умов перебігу реакції окиснення ТМБ за кінетичним рівнянням псевдопершого порядку використовували 50-100-кратний надлишок ТМБ, що відповідає кінцевій концентрації у реакційній суміші 610-4 М.

Методика визначення фосфорорганічних сполук антихолінестеразної дії. У пробірку вносили 2,0 мл 0,2 М фосфатного буферного розчину, аліквоту розчину інгібітора, додавали воду із розрахунку 16,6-х мл (де х – загальний об’єм реагентів), 0,5 мл 4 мг/мл розчину холінестерази, вмикали секундомір, перемішували перевертанням пробірку і термостатували при 370С 10 хв. Потім до одержаної суміші додавали 1,0 мл 5,4•10-3 М розчину ацетилхоліну і знову термостатували при 370С ще 10 хв. Після цього вносили 3,2 мл 10% гідроген пероксиду і термостатували при 370С. На 30-й хвилині до розчину додавали 3,0 мл етанолу і якнайшвидше приливали 0,5 мл 2•10-2 М розчину ТМБ. Суміш перемішували протягом 20 с і переносили у кювету спектрофотометра. Починаючи з першої хвилини, кожні наступні 2 хв впродовж 20 хв вимірювали значення світлопоглинання.

Визначення здійснювали за 5-6 концентраціями інгібітора із розрахунку, щоб мінімальна концентрація викликала 20%, а максимальна — 80% зниження активності холінестерази. Будували експериментальні кінетичні криві у координатах А–t, за прямолінійними ділянками розраховували тангенси кутів нахилу для побудови градуювального графіка.

Паралельно виконували так звану “фонову реакцію” – за відсутності інгібітора: у пробірку вносили 2,0 мл 0,2 М фосфатного буферного розчину, 0,5 мл 4 мг/мл розчину холінестерази, додавали води із розрахунку 16,6-х мл (де х – загальний об’єм реагентів) і 1,0 мл 5,4•10-3 М розчину ацетилхоліну, вмикали секундомір, розчин перемішували шляхом перевертання пробірки і термостатували при 37 0С протягом 10 хв. Після цього до розчину додавали 3,2 мл 10% гідроген пероксиду і знову термостатували. На 20-й хвилині до суміші приливали 3,0 мл етанолу і якнайшвидше 0,5 мл 2•10-2М розчину ТМБ. Одержану суміш перемішували протягом 20 с і переносили у кювету. Починаючи з 1 хв кожні наступні 2 хв впродовж 20 хв вимірювали значення світлопоглинання.

Ступінь інгібування (?U) обчислювали за формулою:

,

де: — швидкість реакції при Сі концентрації інгібітора, хв-1;

— швидкість реакції окиснення ТМБ пероксіоцтовою кислотою, яка утворюється в реакції ацетилхоліну з гідроген пероксидом за відсутності інгібітора та холінестерази, хв-1;

— швидкість реакції за відсутності інгібітора, хв-1.

Значення визначали наступним чином: у пробірку вносили
2,0 мл 0,2 М фосфатного буферного розчину, 1,0 мл 5,4·10-3М водного розчину ацетилхоліну, додавали води із розрахунку 16,6-х мл (де х – загальний об’єм реагентів), 3,2 мл 10% гідроген пероксиду, вмикали секундомір, перемішували пробірку шляхом перевертання і термостатували при 370С 10 хв. Після цього додавали 3,0 мл етанолу і якнайшвидше 0,5 мл
2•10-2 М розчину ТМБ. Суміш перемішували протягом 20 с і переносили у кювету. Починаючи з 1 хв кожні наступні 2 хв впродовж 20 хв вимірювали значення світлопоглинання.

Як приклад, на рис. наведені кінетичні криві утворення продукту реакції окиснення ТМБ у присутності різних концентрацій ГД-7.

Рис. 1. Кінетичні криві індикаторної реакції окиснення ТМБ пер-оксіоцтовою кислотою, утвореної в попередній реакції пергідролізу непрореагованого АХ в присутності ГД-7, мкг/мл: 1 – 0,03; 2 – 0,15; 3 – 0,6; 4 – 0,75; 5 – 1

Лінійний характер кінетичних кривих утворення забарвлених продуктів на початковій стадії дозволяє скористатися методом тангенсів під час обробки результатів експерименту.

Характеристики методик кількісного визначення фосфорорганічних сполук ензимно-кінетичним методом з використанням індикаторної реакції окиснення ТМБ такі (ФОС, інтервал визначуваних концентрацій (мкг/мл), рівняння градуювального графіка): ГД-7, 0,03-1, у=0,0022х+0,0066; метафос, 0,9-10, у=0,0011х+0,0034; трихлорметафос, 0,1-1, у=0,0034х; хлорофос, 0,085-0,83, у=0,0031х+0,0025; карбофос, 0,73-5, у=0,0029х+0,0020; фталофос, 0,06-0,6, у=0,0034х+0,0008; метилнітрофос, 0,03-0,12, у=0,0030х+0,0033.

Правильність результатів аналізу перевірена методом “уведено –знайдено” під час аналізу штучно виготовлених модельних сумішей. Метрологічні характеристики одержаних результатів експерименту наведені у табл. 2. Як видно з таблиці, наявність у розчині домішок кислотного (HCl) та основного (NH3, NaHCO3) характеру не впливає на правильність результатів.

Таблиця 2

Метрологічні характеристики одержаних результатів аналізу ФОС ензимно-кінетичним методом з використанням індикаторної реакції окиснення ТМБ (Р = 0,95, n = 5, tб (P,f) = 2,78) | № з/п | Визначувана сполука | Уведено,

мкг/мл | Знайдено

± х, мкг/мл | Sr, % | д, % | 1. | ГД-7* | 0,60 | 0,59 | ±0,06 | 7,6 | -2,5

2. | Метафос* | 5,0 | 4,9 | ±0,6 | 9,6 | -2,0

3. | Трихлорметафос* | 0,20 | 0,19 | ±0,02 | 10,3 | -2,5

4. | Хлорофос | 0,17 | 0,16 | ±0,02 | 10,7 | -1,7

5. | Карбофос** | 2,2 | 2,0 | ±0,3 | 13,2 | -8,1

6. | Фталофос** | 0,24 | 0,20 | ±0,03 | 8,1 | -4,2

7. | Метилнітрофос | 0,06 | 0,06 | ±0,01 | 6,9 | +6,7 | * В присутності 1•10-3–5·10-3М хлористоводневої кислоти.

**В присутності 1•10-35·10-3М аміаку, 1•10-3–10-1М натрію гідрокарбонату.

Під час визначення 0,06 – 0,6 мкг/мл різних за будовою ФОС Sr ? 13 %. Відносне відхилення середнього значення результатів аналізу від уведеної кількості становить від – 8,1% до +6,7%.

У п’ятому розділі “Визначення інгібіторів холінестераз ензимно-кінетичним методом з використанням індикаторної реакції окиснення п-фенетидину” розроблені методики визначення метафосу, деяких четвертинних амонієвих солей та алкалоїдів ензимно-кінетичним методом з використанням індикаторної реакції окиснення ПФ.

Досліджена можливість здійснення кількісного визначення речовин антихолінестеразної дії біохімічним методом із застосуванням реакції окиснення n-фенетидину (ПФ) як індикаторної.

Реакція гідролізу АХ перебігає за наступною схемою:

Визначення ступеню інгібування фермента ХE у реакції гідролізу АХ виконували за швидкістю індикаторної реакції окиснення ПФ пероксіоцтовою кислотою, яка утворюється у реакції непрореагованої кількості ацетилхоліну з гідроген пероксидом у попередній стадії аналізу:

Схема окиснення ПФ пероксіоцтовою кислотою до забарвленого азоксифенетолу
(?max= 358 нм) має вигляд:

Результати експериментів дозволили опрацювати нову методику кількісного визначення інгібіторів ХE у водних розчинах за принципом: “Концентрація інгібітора – швидкість утворення забарвленого продукту”.

Вивчали оптимальні умови перебігу ферментної реакції: порядок змішування, концентрації, час витримування реагентів, вплив рН середовища та природи буферного розчину. Світлопоглинання вимірювали на СФ-26 (?max=358 нм, l=1 см). Швидкість реакцій характеризували тангенсом кута нахилу лінійної ділянки кінетичної залежності А—t. Вимірювання здійснювали при 37 0С, температуру реакційної суміші забезпечували водяним термостатуванням, рН розчинів контролювали за допомогою скляного електроду ЭСЛ-43-07 на лабораторному іонометрі “И-130”. Хімічний посуд використовували із комплекту військової радіометричної та хімічної лабораторії АЛ-4М.

За результатами порівняльного вивчення оптимальних умов проведення біохімічної реакції з ТМБ та ПФ не виявлено суттєвих відмінностей в умовах проведення реакцій стосовно природи буферу, рН реакційного середовища, концентрацій ХЕ та АХ, а також часу їх витримки. Під час здійснення визначення з використанням як індикаторної реакції окиснення ПФ не вимагається введення у реакційну суміш етанолу, як в реакції з ТМБ, що деякою мірою спрощує аналіз.

Методика визначення. У пробірку вносили 10,0 мл 0,2 М буферного розчину, аліквоту розчину інгібітора (у випадку аналізу тіонію до вихідного розчину інгібітора додавали 3-кратний молярний надлишок гідроген пероксиду і витримували на киплячому водяному огрівнику 20 хв), додавали води із розрахунку 16,6-х мл (де х – загальний об’єм реагентів),
0,5 мл 4 мг/мл розчину холінестерази, вмикали секундомір, перемішували перевертанням пробірку і термостатували при 370С 10 хв. Потім до одержаної суміші додавали 1,0 мл 5,4•10-3М розчину ацетилхоліну і знову термостатували при 37 0С ще 10 хв. Після цього вносили 1,6 мл 10% гідроген пероксиду і термостатували при 370С. На 30-й хвилині до розчину додавали 1,0 мл 0,5% розчину ПФ. Суміш перемішували і переносили у кювету спектрофотометра. Через кожні 2 хв впродовж 20 хв вимірювали світло-поглинання А.

Визначення здійснювали методом градуювального графіка за 5-6 концентраціями інгібітора із розрахунку, щоб мінімальна концентрація викликала 20%, а максимальна – 80% зниження активності холінестерази. Будували експериментальні кінетичні криві у координатах А–t, за прямолінійними ділянками розраховували тангенси кутів нахилу для побудови градуювального графіка.

Паралельно виконували реакцію за відсутності інгібітора: у пробірку вносили 10,0 мл 0,2 М буферного розчину, 0,5 мл 4 мг/мл розчину холінестерази, додавали води із розрахунку 16,6-х мл (де х – загальний об’єм реагентів) і 1,0 мл 5,4·10-3 М розчину ацетилхоліну, вмикали секундомір, розчин перемішували шляхом перевертання пробірки і термостатували при 370С протягом 10 хв. Після цього до розчину додавали 1,6 мл 10% гідроген пероксиду і знову термостатували. На 20-й хвилині до суміші додавали 1,0 мл 0,5% розчину ПФ. Одержану суміш перемішували і переносили у кювету. Через кожні 2 хв протягом 20 хв вимірювали значення світлопоглинання.

Ступінь інгібування (?U) обчислювали за формулою:

,

де: — швидкість реакції при Сі концентрації інгібітора, хв-1;

— швидкість реакції окиснення ПФ пероксіоцтовою кислотою, яка утворюється у реакції невитраченого ацетилхоліну з гідроген пероксидом за відсутності інгібітора та холінестерази, хв-1;

— швидкість реакції за відсутності інгібітора, хв-1.

Порядок визначення наступний: у пробірку вносили 10,0 мл 0,2 М буферного розчину, 1,0 мл 5,4•10-3 М водного розчину ацетилхоліну, додавали води із розрахунку 16,6-х мл (де х – загальний об’єм реагентів), 1,6 мл 10% гідроген пероксиду, вмикали секундомір, перемішували шляхом перевертання пробірку і термостатували при 370С 10 хв. Після цього додавали 1,0 мл 0,5% розчину ПФ. Одержану суміш перемішували і переносили у кювету. Через кожні 2 хв протягом 20 хв вимірювали світлопоглинанння.

Характеристики методик кількісного визначення речовин антихолінестеразної дії ензимно-кінетичним методом з використанням індикаторної реакції окиснення ПФ такі (назва визначуваної речовини, інтервал визначуваних концентрацій (моль/л): метафос, 1•10-62,5·10-5; тіоній, 6?10-101,2?10-8; декаметоксин, 1,4?10-9-8,4?10-9; дезоксипеганін, 4,3•10-7-4,3·10-6; атропіну сульфат, 1,5?10-6-6?10-5.

Правильність результатів аналізу перевірена методом “уведено –знайдено” під час аналізу штучно виготовлених модельних сумішей точно відомого складу.

Метрологічні характеристики одержаних результатів аналізу інгібіторів холінестераз ензимно-кінетичним методом з використанням індикаторної реакції окиснення ПФ наведені у табл. 3.

Таблиця 3

Метрологічні характеристики одержаних результатів аналізу інгібіторів холінестераз ензимно-кінетичним методом з використанням індикаторної реакції окиснення ПФ (Р = 0,95, n = 5, tб (P,f) = 2,78)

№ з/п | Визначувана сполука | Уведено,

моль/л | Знайдено

± х, моль/л | Sr, % | д, %

1. | Метафос | 1,0·10-5 | (1,1±0,1)·10-5 | 10,0 | +9,0

2. | Тіоній | 3,0·10-9 | (2,8±0,2)·10-9 | 5,4 | -5,6

3. | Декаметоксин | 2,8·10-9 | (3,0±0,2)·10-9 | 4,6 | +6,4

4. | Дезоксипеганін | 8,4·10-7 | (8,8±0,4)·10-7 | 3,2 | +5,4 | 5. | Атропіну сульфат | 6,0·10-6 | (6,3±0,3)·10-6 | 4,3 | +4,1

Опрацьовані високочутливі та селективні методики кількісного визначення сполук антихолінестеразної дії біохімічним з використанням реакції окиснення ПФ як індикаторної на непрореагований субстрат. Під час визначення 6•10-106·10-5 М сполук антихолінестеразної дії
Sr ? 10 %. Відносне відхилення середнього значення результатів аналізу від уведеної кількості становить від – 5,6% до +9 %.

У шостому розділі “Визначення метафосу в об’єктах довкілля ензимно-кінетичним методом з використанням індикаторної реакції окиснення п-фенетидину” показана можливість визначення метафосу в об’єктах довкілля ензимно-кінетичним методом з використанням індикаторної реакції окиснення ПФ.

Методики ґрунтуються на поглинанні метафосу із повітря сорбентами та видобування речовини із сорбенту розчинником або екстрагуванні метафосу із ґрунту або води органічними розчинниками та подальшому аналізі екстрагенту за посередництвом біохімічної реакції з використанням індикаторної реакції окиснення ПФ. Швидкість утворення забарвленого продукту індикаторної реакції реєструють фотоколориметричним методом на КФК-2УХЛ-010 (світлофільтр № 2, ?еф = 364 нм).

Визначення метафосу у сконцентрованій ацетоновій витяжці проводять за стандартною методикою, описаною у п’ятому розділі (див. стор.10).

Під час перевірки даної методики методом “уведено – знайдено” після концентрування ацетонового екстракту у пробірку уводили 1,0 мл стандартного розчину метафосу в ацетоні, який містив 0,2–5,0 мкг метафосу та 100-кратний молярний надлишок речовин кислого (HCl) та основного характеру (NH3, NaHCO3) і потім здійснювали визначення згідно методики.

Метрологічні характеристики опрацьованої методики визначення метафосу у повітрі, ґрунті та річній воді (проби взяти у Харківському регіоні) наведені у табл. 4.

Таблиця 4 | Метрологічні характеристики визначення метафосу ензимно-кінетичним методом з використанням індикаторної реакції окиснення ПФ (градуювальний графік y = a + bx, де х – концентрація метафосу, мкг/мл) | ФОС | Об’єкт

дослідження | а | b | r | Cн | Інтервал визначуваних концентрацій | метафос | повітря | 0,0015 | 0,0045 | 0,991 | 0,04 мг/м3 | 0,04 – 0,4 мг/м3 | вода | 0,0013 | 0,0041 | 0,988 | 0,08 мг/л | 0,08 – 1 мг/л | ґрунт | 0,0017 | 0,0038 | 0,991 | 0,2 мг/кг | 0,2 – 2 мг/кг

За результатами досліджень проб повітря, води та ґрунту присутність метафосу в них не виявлена.

У табл. 5 наведені результати визначення метафосу у повітрі, ґрунті та річковій воді. Вони свідчать про принципову можливість здійснення аналізу опрацьованим методом. Одержані результати характеризуються задовільною відтворюваністю та правдивістю. Нижня межа визначуваних концентрацій метафосу у повітрі складає 0,04 мг/м3, ґрунті 0,2 мг/кг, у воді 0,08 мг/л.

Таблиця 5

Перевірка правильності методики визначення метафосу в концентрованій ацетоновій витяжці повітря, ґрунту та річкової води методом

“уведено – знайдено”, мкг/мл (n = 3, Р = 0,95) | Уведено | Знайдено | Sr, % | Уведено | Знайдено | Sr, % | Повітря | 2,0 | 2,1 ± 0,2 | 12 | 1,0 | 0,9 ± 0,2 | 22 | 5,0 | 5,2 ± 0,5 | 10 | 3,0 | 3,2 ± 0,6 | 20 | Вода | 5,0 | 5,4 ± 1,1 | 21 | 0,20 | 0,21 ± 0,03 | 14 | Ґрунт | 0,5 | 0,6 ± 0,1 | 13 | 0,5 | 0,4 ± 0,1 | 17 | 1,0 | 1,1 ± 0,1 | 10 | 0,75 | 0,8 ± 0,1 | 14 | 1,5 | 1,6 ± 0,2 | 11 | 1,0 | 1,1 ± 0,1 | 16 | 2,0 | 1,9 ± 0,2 | 10 | Одержані результати підтверджують перспективність визначення фосфорорганічних сполук запропонованим способом у поєднанні з екстракцією. Це дозволяє об’єднати чутливість, простоту і експресність (опрацьована методика вимагає не більше години для одиничного визначення, включаючи стадію виділення пестициду з основи, концентрування та власне визначення). Для здійснення визначення можливе використання стандартного типового обладнання (фотоелектроколориметр КФК-2УХЛ-010). Під час визначення метафосу у пробах: повітря, ґрунту та води Sr ? ± 22 %, ± 17 % та ± 14 % відповідно.

ВИСНОВКИ

В результаті проведених кінетичних досліджень нових реакцій окиснення 3,3?,5,5?-тетраметилбензидину та п-фенетидину гідроген пероксидом в присутності субстрату фермента холінестерази – ацетилхоліну показано можливість застосування їх як індикаторних під час визначення фосфорорганічних отруйних сполук антихолінестеразної дії біохімічним методом.

Основні наукові та практичні результати роботи можна сформулювати у вигляді таких узагальнюючих висновків:

1. Обґрунтовано вибір умов та показані переваги застосування ТМБ як індикаторної речовини в гідропероксидній реакції Шенеманна. Опрацьовані методики кінетичного визначення фосфорорганічних пестицидів метафосу, хлорофосу, фозалону та трихлорметафосу у водних та водно-ацетонових розчинах. Під час визначення 0,2-30 мкг/мл фосфорорганічних сполук
Sr = 13%.

2. Вивчена кінетика реакції ферментного гідролізу ацетилхоліну в присутності інгібіторів холінестерази із використанням індикаторних реакцій окиснення ТМБ та ПФ.

3. Опрацьовані селективні методики та показана можливість ензимно-кінетичного визначення ГД-7 (О-етиловий-S-в-?тилтіоетиловий етер метилфосфонової кислоти), метафосу, трихлорметафосу, хлорофосу, карбофосу, фталофосу, метилнітрофосу, а також алкалоїдів дезоксіпенаніну, атропіну сульфату та четвертинних амонієвих сполук тіонію та етонію з використанням індикаторної реакції окиснення ТМБ на невитрачений субстрат. Домішки кислотного та основного характеру не заважають визначенню. Під час визначення 0,06 – 0,6 мкг/мл ФОС Sr ? 13 %. Відносне відхилення результатів аналізу від уведеної кількості (правильність) складає від – 8,1% до +6,7%.

4. Розроблено методики та показана можливість ензимно-кінетичного визначення метафосу, а також четвертинних амонієвих сполук тіонію, декаметоксину та алкалоїдів дазоксипеганіну й атропіну сульфату з використанням індикаторної реакції окиснення ПФ. Під час визначення 6•10-106·10-5 М сполук антихолінестеразної дії Sr = 10 %.

5. Розроблені методики та показана можливість ензимно-кінетичного визначення метафосу у пробах повітря, ґрунту та води в присутності 100-кратного молярного надлишку домішок кислого та основного характеру. Нижня межа визначуваних концентрацій під час визначення метафосу у повітрі складає 0,04 мг/м3, у воді – 0,9 мг/л та у ґрунті – 0,02 мг/кг. Під час визначення метафосу у пробах: повітря, ґрунту та води Sr ? ± 22 %, ± 17 % та ± 14 % відповідно.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Блажеєвський М.Є., Дядченко В.В. / Застосування реакції Шенеманна як індикаторної для визначення фосфорорганічних сполук ферментним методом // Вісник ХНУ. 2003, № 596. Хімія. Вип. 10 (33), – С.114-120.

Особистий внесок здобувача: приготування реактивів, вивчення оптимальних умов проведення біохімічної реакції, спектрофотометричне дослідження індикаторної реакції окиснення ТМБ, М.Є.Блажеєвський запропонував виконувати визначення інгібіторів холінестераз у кінетичному варіанті методом тангенсів з використанням реакції Шенеманна (окиснення ТМБ) як індикаторної на непрореагований ацетилхолін у біохімічній реакції; обговорення одержаних результатів з науковим керівником М.Є.Блажеєвським, написання та оформлення статті.

2. Блажеєвський М.Є., Дядченко В.В. / Кінетичне визначення інгібіторів холінестераз біохімічним методом із застосуванням реакції окиснення п-фенетидину як індикаторної // Фармацевтичний журнал. 2004, № 2, –С. 52-58.

Особистий внесок здобувача: приготування реактивів, вивчення оптимальних умов проведення біохімічної реакції, спектрофотометричне дослідження індикаторної реакції окиснення ПФ, М.Є.Блажеєвський запропонував виконувати визначення інгібіторів холінестераз кінетичним методом тангенсів з використанням реакції Шенеманна (окиснення ПФ) як індикаторної на непрореагований ацетилхолін у біохімічній реакції; обговорення одержаних результатів з науковим керівником М.Є.Блажеєвським, написання та оформлення статті.

3. Дядченко В.В., Ляхова Т.В. / Визначення мікрограмових кількостей фосфорорганічних пестицидів хлорофосу та дихлофосу у бінарній суміші каталітичним методом // Збірник наукових праць. Вип. 3 (41). Х.: ХВУ, 2002. – С. 144-146.

Особистий внесок здобувача: розробка методики визначення ФОП за реакцією Шенеманна з ТМБ, встановлення її спектрофотометричних характеристик, придбання реактивів, написання та оформлення статті. Ляхова Т.В. надала технічну допомогу у приготуванні реактивів та проведення спектрофотометричних вимірювань.

4. Блажеєвський М.Є., Дядченко В.В. / Ензимно-кінетичне визначення метафосу у пробах повітря, ґрунту та води // Фармацевтичний журнал. 2004, № 4, – С. 60-64.

Особистий внесок здобувача: приготування реактивів, розробка методик вилучення метафосу з об’єктів довкілля під керівництвом наукового керівника, апробація методики; обговорення одержаних результатів з науковим керівником М.Є.Блажеєвським, написання та оформлення статті.

5. Дядченко В.В., Малёваный С.В., Третьяк О.В. / Перспективы и пути развития ферментативных методов экологического контроля // Анотації доповідей 3-ї Міжнародної міждисциплінарної науково-практичної конференції “Сучасні проблеми науки та освіти” (1-9 травня 2002 р. м. Ужгород, Україна), – С. 106.

6. Блажеєвський М.Є., Дядченко В.В. / Визначення фосфорорганічних сполук антихолінестеразної дії біохімічним методом за реакцією Sснonemann як індикаторної // Інформаційні технології: наука, техніка, технологія, освіта та здоров’я: Анотації доповідей міжнародної науково-практичної конференції 15-16 травня 2003 р., Харків. – С. 341.

7. Дядченко В.В. / Визначення хлорофосу та дихлофосу каталітичним методом // Інформаційні технології: наука, техніка, технологія, освіта та здоров’я: Анотації доповідей міжнародної науково-практичної конференції 15-16 травня 2003 р., Харків. – С. 350.

8. Блажеєвський М.Є., Дядченко В.В. / Визначення сполук антихолінестеразної дії біохімічним методом на основі реакції окиснення п-фенетидину як індикаторної // Інформаційні технології: наука, техніка, технологія, освіта та здоров’я: Анотації доповідей міжнародної науково-практичної конференції 15-16 травня 2003 р., Харків. – С. 351.

АНОТАЦІЯ

Дядченко В.В. Ензимно-кінетичне визначення фосфорорганічних отруйних сполук з використанням індикаторних реакцій окиснення 3,3?,5,5?-тетраметилбензидину та п-фенетидину. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.02 – аналітична хімія. – Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, Харків, 2004.

Дисертаційна робота присвячена розробці методик визначення фосфорорганічних отруйних сполук ензимно-кінетичним методом з використанням індикаторних реакцій гідроперекисного окиснення 3,3?,5,5?-тетраметилбензидину та п-фенетидину. Вивчена кінетика реакції ферментного гідролізу ацетилхоліну в присутності інгібіторів холінестерази із використанням індикаторних реакцій окиснення 3,3?,5,5?-тетраметилбензидину та п-фенетидину, з’ясовані оптимальні умови проведення реакцій. Розроблені методики ензимно-кінетичного визначення фосфорорганічних отруйних сполук у штучно виготовлених модельних сумішах та метафосу в об’єктах довкілля. На прикладі хлорофосу показана можливість застосування неканцерогенного 3,3?,5,5?-тетраметилбензидину під час визначення ФОС за їх власною каталітичною дією у реакції Шенеманна.

Ключові слова: спектрофотометрія, фотоколориметрія, холінестераза, ацетилхолін, фосфорорганічні сполуки, 3,3?,5,5?-тетраметилбензидин, п-фенетидин.

АННОТАЦИЯ

Дядченко В.В. Энзимно-кинетическое определение фосфорорганических отравляющих соединений с использованием индикаторных реакций окисления 3,3?,5,5?-тетраметилбензидина и
п-фенетидина. – Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата химических наук по специальности 02.00.02 – аналитическая химия. – Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, Харьков, 2004.

Диссертационная работа посвящена разработке методик определения фосфорорганических отравляющих веществ энзимно-кинетическим методом с использованием индикаторных реакций гидроперекисного окисления 3,3?,5,5?-тетраметилбензидина (ТМБ) и п-фенетидина (ПФ).

Для определения фосфорорганических пестицидов по реакции Шенеманна предложено использование неканцерогенного ТМБ. Определены оптимальные условия проведения реакции: рН ,0 (раствор NaOH), концентрация перекиси водорода 10-1 М; ТМБ 210-3М. Во избежание выпадения осадка основания ТМБ добавляли этанол до концентрации 40% (об.). Порядок смешивания реактивов существенно не влияет на скорость индикаторной реакции. Использовали такой порядок смешивания реактивов: в пробирку вносили 4,0 мл 0,1М NaOH, 2,0 мл водного или водно-ацетонового раствора пробы с ФОС, 1,0 мл 1М перекиси водорода, 1,0 мл 40% водно-спиртового 210-2М раствора ТМБ, доводили спиртом до объёма 10,0 мл, пробирку перемешивали, переносили в кювету спектрофотометра и измеряли значение поглощения через каждые 2 мин в течении 15 мин.

Изучена кинетика реакции ферментативного гидролиза ацетилхолина в присутствии ингибиторов холинэстеразы с использованием индикаторных реакций окисления ТМБ и ПФ, выяснены оптимальные условия проведения реакций. Разработаны методики энзимно-кинетического определения фосфорорганических отравляющих соединений в искусственно приготовленных модельных смесях и в объектах окружающей среды (метафос). Определение производят при 37 0С в 0,2 М фосфатном буфере. В пробирку вносят 2,0 (10,0) мл фосфатного буфера (в скобках приведены значения для индикаторной реакции окисления ПФ), аликвоту раствора ингибитора, добавляют воду из расчёта 16,6-х (где х – суммарный объём реагентов), 0,5 мл 4 мг/мл раствора холинэстеразы сыворотки лошади VI класса удельной активностью 28 АЕ/мг, включают секундомер, перемешивают содержание пробирки переворачиванием, на 10-й мин прибавляют 1,0 мл 5,410-3М раствора ацетилхолина и выдерживают ещё 10 мин. Далее вносят 3,2 (1,6) мл 10 % раствора перекиси водорода и на 30-й мин вносят 3,0 мл этанола и 0,5 мл 210-2М раствора ТМБ (1,0 мл 0,5% ПФ, этанол не добавляют). Смесь перемешивают 20 с, переносят в кювету спектрофотометра и, начиная с 1 мин, каждые 2 мин в течении 20 мин измеряют значение оптической плотности (?max=422 нм, l=1 см для ТМБ и ?max=358 нм, l=1 см для ПФ). Определение осуществляют методом градуировочного графика по 5-6 концентрациям ингибитора из расчёта, чтобы минимальная концентрация ингибитора вызывала 20%, а максимальная – 80% снижения активности холинэстеразы. Строят экспериментальные кинетические кривые в координатах A –, по прямолинейным участкам рассчитывают тангенсы углов