НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ІМЕНІ О.В. ПАЛЛАДІНА

ЛІНЕЦЬКА Марія Василівна

УДК 577.352.4

МЕХАНІЗМИ РЕАЛІЗАЦІЇ ДІЇ АЛЬФА-ЛАТРОТОКСИНУ

ЯК СТИМУЛЯТОРА НЕЙРОСЕКРЕЦІЇ

03.00.004 - Біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ-2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі нейрохімії

Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НAH України.

Науковий керівник - кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник

ГІММЕЛЬРЕЙХ Ніна Германівна,

завідувач відділу нейрохімії

Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НAHУ.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

МАТИШЕВСЬКА Ольга Павлівна,

професор кафедри біохімії

Київського національного університету

імені Тараса Шевченка;

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник

БАБІЧ Лідія Григорівна,

старший науковий співробітник

відділу біохімії м'язів

Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ

Провідна установа - Інститут фізіології імені О.О. Богомольця НАН України,

відділ нейрохімії

Захист відбудеться 7 червня 2005 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ (01601 Київ, вул. Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розіслано 6 травня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук О.В. Кірсенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. З'ясування механізму здійснення синаптичної передачі посідає провідне місце серед найважливіших проб-лем нейробіології та є предметом особливої уваги в багатьох лабораторіях світу. Ключовим етапом передачі нервового імпульсу є вивільнення нейромедіатора в синаптичну щілину, тобто процес ней-росекреції. Останнім часом було доведено, що вивільнення із нервових терміналей таких нейромедіаторів, як g-аміномасляна кислота (ГАМК), глутамат, ацетилхолін, відбувається за участю двох механізмів: Са2+-активованого процесу екзоцитозу – злиття синаптичних везикул із пресинаптичною мембраною, та Ca2+-незалежного Na+-залежного процесу вивільнення ме-діаторів із цитозольного пулу за участю специфічних транспортерів медіаторів, локалізованих у пла-зматичній мембрані.

Унікальним інструментом вивчення процесу нейросекреції є ?-латротоксин (a-LTX), основний токсичний компонент отрути павука каракурта (Latrodectus mactans tredecimguttatus). Внаслідок спе-цифічного зв’язування з Ca2+-залежним (нейрексин Іб) або з Ca2+-незалежним (латрофілін/CIRL) ре-цепторами, локалізованими на пресинаптичній мембрані, токсин стимулює потужне вивільнення ней-ромедіаторів із нервових терміналей як за наявності, так і за відсутності позаклітинного Са2+ в експе-риментах in vitro. Але, незважаючи на досить високий інтерес науковців до дослідження a-LTX, ме-ханізм його секретогенної дії ще не до кінця з'ясований. Тому нові дані, одержані в результаті даного дослідження, матимуть важливе значення для розвитку уявлень про механізм нейротоксичної дії a-LTX зокрема і механізму нейросекреторного процесу взагалі.

Результати багатьох попередніх досліджень свідчать, що стимуляція ней-росекреції внаслідок зв'язування ?-LTX з двома різними рецепторними білками на пресинаптичній мембрані відбувається із залученням тих самих механізмів екзоцитозу, які задіяні й у потенціалзале-жному вивільненні медіаторів. Але у низці лабораторій було показано, що цей токсин здатен викли-кати вивільнення нейромедіаторів за умов, коли екзоцитоз не може бути стимульований ані потенціа-лом дії, ані кальцієвими іонофорами, ані гіпертонічним розчином сахарози. Очевидно, ефект ?-LTX передбачає обхід деяких етапів, наявних у звичайному механізмі нейросекреції, викликаному потен-ціалом дії.

Досі нез’ясованим залишається питання, чи приєднання токсину до різних рецепторів залежно від присутності чи відсутності Ca2+ в середовищі стимулює реалізацію одного чи різних механізмів дії. Особливий інтерес дослідників викликає секретогенна дія ?-LTX в безкальцієвому середовищі. Гостро дискусійним є питання щодо джерела нейротрансміттерів, вивільнення яких стимулює токсин: чи викликає він тільки екзоцитоз синаптичних везикул, чи здатен також стимулювати вихід нейроме-діатора з цитозольного (невезикульованого) пулу? Якщо токсин вивільняє нейромедіатор із цитозолю, то яким є механізм цього вивільнення – через пори, які формує a-LTX у мембрані, чи через специфі-чний транспортер нейромедіатора на плазматичній мембрані?

Наші експерименти мали на меті з'ясувати чи може стимулювати ?-LTX процес екзоцитозу, тобто вивільнення нейромедіатора з везикульованого пулу, в безкальцієвому середовищі; чи є мі-шенню дії токсину цитозольний пул нейромедіатора, і якщо так, то яким є механізм вивільнення ме-діатора з нього під дією токсину.

Мета дослідження полягала у з'ясуванні механізму секретогенної дії ?-латротоксину, зокрема встановленні залежності ефекту токсину від наявності або відсутності позаклітинного Са2+ (а отже, від типу рецептору, з яким зв'язується токсин), а також участі двох пулів нейромедіатора – везикульованого та цитозольного – в реалізації секретогенної дії ?-LTX. Відповідно до цього були поставлені такі задачі дослідження:

1.

2.

3.

4.

5.

Наукова новизна одержаних результатів. Застосовуючи різні підходи, які полягали у викори-станні агентів, які впливають на цитозольний або везикульований пули ГАМК, було показано, що:

1)

2)

3)

4)

5)

Практичне значення отриманих результатів. Отримані дані щодо механізму реалізації дії ?-LTX як стимулятора нейросекреції мають передусім фундаментальне значення, оскільки дозволяють доповнити сучасні уявлення про механізми функціонування нервової клітини. Результати цієї роботи можуть бути використані для створення фармакологічних препаратів, які специфічно впливають на процес передачі нервового імпульсу, тобто становлять і прикладний інтерес.

Особистий внесок здобувача. Автор виконувала експериментальну частину роботи, здійсню-вала підбір та обробку літературних даних. Аналіз, обробка та обговорення результатів були прове-дені спільно з науковим керівником. Друковані праці підготовані за безпосередньої участі автора.

Структура дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 151 сторінках друкованого тексту. Робота складається з вступу, огляду літератури, результатів досліджень, обговорення результатів, ви-сновків, списку літератури з 302 джерел, 39 рисунків, 1 таблиці.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідалися на:

Поглибленій школі для молодих фізіологів з проблем клітинних мембран та сигнальних систем, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця, Київ, 2000;

Літній школі "Фармакологія синаптичної передачі в нервовій системі", Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця, Київ, 2002;

Школі з нейронаук товариства IBRO, Вроцлав, Польща, 2002;

4-ій Парнасівській конференції ''Молекулярні механізми активації клітини: біологічні сигнали та їхні ферменти-мішені", Вроцлав, Польща, 2002;

4-ій Конференції із сигнальних систем клітини, Дубровнік, Хорватія, 2004;

Поглибленій школі з нейронаук товариства IBRO, Ялта, Крим, 2004;

конференціях-конкурсах молодих учених у 2001-2002 рр. та на семінарах в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ.

Публікації. Результати досліджень опубліковані в 5 статтях у наукових фахових виданнях та 6 тезах доповідей у збірках наукових конференцій.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження виконані на щурах (самці вагою 100-120 г). У декапітованих тварин швидко вилучалися великі півкулі головного мозку. Синаптосоми виділяли з гомогенату великих півкуль шляхом диференційного центрифугування та центрифугування в градієнті фіколла за методом Котмана (Cotman, 1974). Фракцію синаптосом суспендували в стандартному сольовому розчині, що містив (мM): NaCl – 126, KCl – 5, MgCl2 – 1.4, NaH2PO4 – 1.0, HEPES – 20 (pH 7.4), d-глюкозу – 10, амінооксиоцтову кислоту (інгібітор ГАМК-трансамінази) – 0.1. Сольовий розчин насичували O2 перед використанням. Усі операції проводили при 0-40С. Концентрацію білка визначали за методом Лоурі (Lowry et al., 1951) у модифікації Ларсона (Larson et al., 1986).

Синаптосоми (2 мг білка/мл) навантажували [3H]ГАМК у стандартному сольовому розчині, що містив 1 мМ кальцію. Синаптосоми, відмиті шляхом центрифугування від [3H]ГАМК, яка не захопи-лася, та від Са2+, суспендували в номінально безкальцієвому стандартному сольовому розчині. Препарат (1мг білка/мл) використовувався для досліджень одразу і не довше 4 год після виділення.

Кількість вивільненої [3H]ГАМК визначали в супернатантах і в SDS-розчинених осадах шляхом вимірювання радіоактивності у сцинтиляційній рідині AСS на лічильнику Delta 300 (“Tracor Analytic”, США). Вміст [3H]ГАМК у супернатантах вира-жався у відсотках від загальної кількості мітки у синаптосомах. Вивільнення [3H]ГАМК із синаптосом, преінкубованих без стимулювальних агентів в Ca2+-вмісному або без-кальцієвому середовищі, приймалося за базальне вивільнення. Стимульоване вивіль-нення [3H]ГАМК обчислювали як різницю між кількістю [3H]ГАМК, що вивільняється під впливом стимулювальних агентів, і базальним вивільненням.

Для перемеалізації брали навантажені [3H]ГАМК синаптосоми протягом 2 год після навантаження. Синаптосоми, суспендовані у номінально безкальцієвому стан-дартному сольовому розчині з 2 мM АТФ, обробляли 20 мкг/мл дигітоніном протягом 5хв при 250С. Потім на препараті дослі-джували стимульоване вивільнення [3H]ГАМК.

Зміни трансмембранного потенціалу синаптосом реєстрували, вимірюючи флуоресценцію катіонного потенціалчутливого зонду родаміну 6G на спектрофлуориметрі Hitachi MPF-4 (Японія) у термостатованій кюветі при постійному перемішуванні. Довжини хвиль збудження і флуоресценції були 528 нм і 551 нм, відповідно.

Статистична обробка даних проводилась за загальновизнаними методами варіаційної статистики за допомогою ПК. Всі чисельні значення результатів досліджень наводились у вигляді ± середньоквадратичне відхилення (SEM). Після кожного результату наводиться значення кількості експериментів (n). Достовірність статистичних відмінностей для груп даних досліджень визначалася за допомогою Стьюдент тесту (t-тесту). Критерієм достовірності відмінностей було значення р 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Для дослідження особливостей механізмів стимуляції ?-латротоксином нейросекреції було об-рано декілька експериментальних стратегій: в синаптосомах змінювали кількість нейромедіатора у везикульованому пулі або в цитозолі, або пригнічували екзоцитоз різними агентами, також комбіну-вали ці підходи, і потім досліджували особливості дії ?-LTХ за цих умов.

1.

В рамках першої серії дослідів нашим завданням було з'ясувати, чи визначає кількість ГАМК у цитозолі відповідь синаптосом на дію ?-LTХ. Загальний підхід полягав у тому, щоб виснажити цито-зольний пул [3H]ГАМК шляхом пермеалізації синаптосом або використовуючи конкурентні інгібі-тори ГАМК-транспортера (НК і 2,4-ДАМК), і після цього виміряти Ca2+-залежне і Ca2+-незалежне LTХ-стимульоване вивільнення [3H]ГАМК. Якщо джерелом медіатору є цитозоль, то логічно припус-тити, що виснаження цього пулу має спричинити відповідне послаблення виходу нейромедіатора.

В результаті проведених дослідів ми встановили, що для пермеалізованих дигітоніном синапто-сом необхідна наявність екзогенного АТФ для підтримання протонного градієнту синаптичних вези-кул і здатності їх до екзоцитозу у відповідь на зростання [Са2+]i. Додавання б-LT? до синаптосом, пермеалізованих у базкальцієвому буфері, спричиняє швидке вивільнення [3H]ГАМК, що є більшим за присутності АТФ, аніж за його відсутності. Вивільнення відбувається і у середовищі з ЕГТА, отже ефект токсину може розвиватися і за дуже низьких концентрацій Са2+.

Для того, щоб з'ясувати, чи за цих умов зв'язується ?-LTХ специфічно з Са2+-незалежним рецеп-тором, були проведені експерименти з конканаваліном А. Цей лектин практично не змінює здатність токсину приєднуватися до рецепторів, але пригнічує нейросекрецію, стимульовану ?-LTХ. Преінку-бація з ConА майже повністю інгібує здатність токсину вбудовуватися до плазматичної мембрани. Крім того, після зв'язування із мембранним рецептором ?-LTХ піддається конформаційним змінам, яким і перешкоджає ConА (Khvotchev &Sudhof, 2000). В наших дослідах, коли синаптосоми перед пермеалізацією обробляли 5мкМ ConА, 1 нМ токсин за таких умов не викликав вивільнення [3H]ГАМК. Отже, можна зробити припущення, що нейросекреція, стимульована ?-LTХ з пермеалізо-ваних синаптосом у середовищі, вільному від Са2+, є результатом специфічного впливу токсину на процес екзоцитозу. Це узгоджується і з даними інших дослідників (Bittner&Holz, 2000).

Наступними були проведені досліди з конкурентними інгібіторами зворотного захоплення ГАМК. Отримані результати свідчать, що НК і 2,4-ДАМК ефективно виснажують цитозольний пул [3H]ГАМК. Після додавання до навантажених синаптосом цих агентів відбувається гетерообмін ней-ромедіатора з ними, внаслідок чого спостерігається значне зростання кількості позасинаптосомальної мітки.

Водночас, виснаження цитозольного пулу [3H]ГАМК має різні наслідки для дії a- LTХ. За та-ких умов у механізмі дії субнаномолярної та наномолярної концентрацій токсину спостерігаються іс-тотні відмінності. Після зменшення цитозольного пулу [3H]ГАМК секретогенний ефект 3нМ a-LTХ (концентрація, що перевищує Кд токсин-рецепторного комплексу) був у 2 -3 рази слабшим за конт-роль. Причому результати таких дослідів були подібними, незалежно від наявності в середовищі Ca2+, а отже і від типу залученого рецептора токсину.

В той же час, із синаптосом з виснаженим цитозольним пулом [3H]ГАМК вивільнення, викли-кане 0.5 нМ токсином, було навіть трохи вищим за контроль. Це можна пояснити конкурентним бло-куванням НК зворотного входу [3H]ГАМК. Результати цих експериментів були подібними, незалежно від наявності в середовищі Ca2+. Логічно було припустити, що у субнаномолярній концентрації (ниж-чій за Кд комплексу токсин-рецептор) a-LTХ не викликає помітного виходу цитозольної ГАМК.

Таким чином, механізм вивільнення ГАМК, скоріш за все, не визначається наявністю чи відсут-ністю Са2+ в середовищі (а отже, і типом рецептора, до якого приєднується токсин). Експерименти вказували на можливість того, що під дією токсину ГАМК виходить із цитозолю. Варто було продов-жити дослідження із застосуванням підходу, який би міг підтвердити та поглибити зроблені ви-сновки.

2. Вплив a-латротоксину на синаптосоми за умов модулювання процесу екзоцитозу синап-тичних везикул інгібіторами протеїнфосфатаз

Відомо, що багато білків, які беруть участь у здійсненні процесу екзоцитозу, регулюються шля-хом фосфорилювання-дефосфорилювання. Ми обробляли синаптосоми інгібіторами основних сери-нових/треонінових протеїнфосфатаз (ПФ) – 1, 2А і 2В, щоб порівняти, чи однаково потребують акти-вності певних ПФ для своєї секретогенної дії 4-амінопіридин (стимулятор Са2+-залежного екзоцитозу) та a-LTХ.

В наших експериментах 1мкM окадаєва кислота (інгібує ПФ 1 та 2А) помітно пригнічувала сек-ретогенний ефект 2мM 4-амінопіридина. 1мкM циклоспорин А (інгібітор ПФ 2B), навпаки, посилю-вав екзоцитоз, стимульований 4-амінопіридином. Отже, ПФ 1, 2А та 2В є важливими для цього про-цесу. Це узгоджується і з висновками інших дослідників (Baldwin et al., 2003). Як 1мкM ОК, так і 10мкM CsА посилювали стимулювальну дію a-LTХ. Це свідчить про те, що механізми нейросекреції, викликаної токсином і 4-амінопіридином, мають певні відмінності.

Окремо варто зазначити, що по-перше, ефекти обох агентів на дію токсину були однаковими се-редовищах з Са2+ та без Ca2+. По-друге, чим нижчою була використана концентрація a-LTХ, тим по-мітнішою була активація CsА нейросекреції, стимульованої a-LTХ. Можливо, що у випадку високих концентрацій токсину зростав внесок процесу витікання ГАМК із цитозолю (нечутливе до дії інгібі-тора ПФ).

3. Дія a-LTX за умов інгібування процесу екзоцитозу інгібітором ФІ 4-кінази феніларсен оксидом

Наступна серія експериментів була проведена на синаптосомах, в яких було пригнічено синтез фосфатидилінозитол-4,5-дифосфату, який є однією з молекул, важливих для здійснення екзоцитозу. Для цього був використаний інгібітор ФІ4-кінази (а зрештою, і процесу екзоцитозу) феніларсен оксид (ФАО). Завданням був детальний аналіз дії ФАО на вивільнення [3H]ГАМК, стимульоване деполяри-зацією 4-АП або різними концентраціями a-LTХ.

ФАО майже повністю пригнічував нейросекрецію, стимульовану як деполяризацією 4-АП (тобто екзоцитоз), так і субнаномолярною концентрацією токсину. Це можна було розглядати, як ще одне підтвердження того, що основна дія низьких концентрацій токсину – стимуляція екзоцитозу. Чу-тливість до ФАО a-LTХ-стимульованого екзоцитозу не залежала від наявності Са2+ в позаклітинному середовищі.

Цікаво, що чим вищою була концентрація токсину, тим меншою ставала чутливість його впливу до ФАО (так само, як і до циклоспорину А в попередніх експериментах). Отже, із зростанням концентрації токсину в реалізації його дії зростає внесок фактора, нечутливого до ФАО. Цим факто-ром може бути пасивний вихід нейромедіатора через пори, сформовані токсином у плазматичній ме-мбрані, або вихід внаслідок оберненої роботи ГАМК-транспортера плазматичної мембрани.

Припущення про цитозольне джерело вивільнюваної a-латротоксином ГАМК підтвердили ре-зультати подальших експериментів, в яких вплив ФАО вивчався на синаптосомах з попередньо ви-снаженим цитозольним пулом медіатора. В препараті, обробленому ніпекотиновою кислотою, [3H]ГАМК представлена в основному везикульованим пулом, на який і діє інгібітор. За цих умов чут-ливість до ФАО нейросекреції, стимульованої і високою, і низькою концентраціями a-LTХ, було по-дібною. Це свідчить про те, що чутливість до ФАО виявляє лише процес екзоцитозу. І "внесок" екзо-цитозу до дії токсину в даному разі, швидше за все, є практично однаковим, незалежно від концент-рації a-LTХ.

Важливо зазначити, що в усіх проведених експериментах інгібітор діяв на вихід [3H]ГАМК, викликаний токсином, незалежно від присутності позаклітинного Са2+. Отже, фактор наявності Са2+ в середовищі не визначає здатності токсину вивільнювати нейромедіатор із цитозолю. Найбільш імові-рно, що інтенсивність витікання медіатору залежить лише від кількості утворених у мемб-рані латротоксинових каналів, що в свою чергу залежить від використаної концентрації токсину.

Ці результати суперечать висновкам Ashton et al. (2001), які припустили, що в лише безкальці-євому середовищі відбувається вихід нейромедіаторів із цитозольного пулу через латротоксинові пори. Але узгоджуються з даними Hlubek et al. (2000), Volynski et al. (2000), які показали, що прони-кні властивості згаданих пор визначає сама молекула токсину, а не тип рецептора (до Са2+-залежного нейрексину 1a чи до Са2+-незалежного латрофіліну), до якого вона приєдналась.

4. Відповідь на a-LTX синаптосом з виснаженим везикульованим пулом ГАМК

Наступний етап досліджень передбачав проведення експериментів на синаптосомах зі зміненим везикульованим пулом ГАМК. Ми використали агенти, які, викликаючи активний вихід нейромедіа-тора з синаптичних везикул, спричиняють його перерозподіл між везикульованим та цитозольним пу-лами, збільшуючи вміст останнього. Це були протонофор FCCP та інгібітор Н+-АТФази синаптичних везикул бафіломіцин А1. Якщо дія a-LTХ спрямована на різні пули, то можна припустити, що такий перерозподіл [3H]ГАМК змінюватиме співвідношення між внесками кожного з механізмів дії ток-сину.

У всіх попередніх дослідженнях ми вимірювали вивільнення [3H]ГАМК, стимульоване 0.5 нМ a-LTХ за час, що не перевищував 5 хв. В експериментах із FCCP продовження інкубації з a-LTХ до 10 хв дозволило виявити певні особливості механізму дії токсину, пов'язані з виходом [3H]ГАМК з невезикульованого пулу. Виснаження везикул і, відповідно, збагачення цитозольного пулу нейроме-діатора спричиняло зникнення (або значне зниження) вивільнення [3H]ГАМК, що спостерігається протягом перших 2 хв дії a-LTХ, але вже на 5-тій та особливо на 10-тій хв кількість вивільненої мітки різко зростала.

Кінетика процесу в експериментах з FCCP відрізнялася залежно від використаної концентрації токсину. Максимум активності токсину, пов'язаної зі стимулюванням екзоцитозу, спостерігався про-тягом перших 2 хв для всіх концентрацій a-LTХ, але момент початку другої стадії вивільнення ней-ромедіатора залежав від використаної концентрації токсину. Для наномолярного a-LTХ він майже збігався з моментом закінчення першої стадії, а для субнаномолярного – наставав лише на 5-ту хв.

Досліди з макролідним антибіотиком бафіломіцином А1 підтвердили, що на різних етапах дії a-LTХ реалізуються різні механізми вивільнення [3H]ГАМК. Нейросекреція, що відбувається протягом перших 2 хв дії токсину була дуже чутливою до бафіломіцина А1, що свідчило про те, що на цьому етапі вихід [3H]ГАМК відбувається шляхом екзоцитозу. Другий етап (через 5 хв дії a-LTХ) характе-ризувався практичною нечутливістю до дії використаного інгібітора, вказуючи на інше джерело виві-льнюваної [3H]ГАМК – цитозоль. Важливо зазначити, що були отримані практично ідентичні резуль-тати в середовищі з Са2+ та без Са2+. Це підтверджує наші попередні висновки про те, що a-LTХ не потребує наявності позаклітинного Са2+ для стимуляції вивільнення нейромедіатора.

Якщо a-LTХ вивільняє ГАМК із цитозолю, то постає логічне питання: яким є механізм такого виходу. Одним з можливих шляхів є витікання ГАМК через пори, які формує токсин у плазмалемі. Іншим імовірним механізмом є обернена робота ГАМК-транспортера плазматичної мембрани. Участь цього транспортера у відповіді синаптосом на a-LTХ на сьогодні є зовсім недослідженою.

Щоб з’ясувати це питання ми використали NO-711, несубстратний блокатор ГАМК-перенос-ника плазматичної мембрани, який пригнічує як вхід, так і вивільнення нейромедіатора, зупиняючи транспорт ГАМК на проміжному етапі.

Проведені експерименти з інгібітором NO-711 підтвердили, що ГАМК-транспортери залучені a-LTХ-стимульованого вивільнення [3H]ГАМК, а точніше до другого етапу цього процесу (після 2 хв дії токсину). NO-711 пригнічував вивільнення [3H]ГАМК, стимульоване як низькими, так і високими концентраціями a-LTХ. Хоча кінетика цього процесу відрізнялася для різних концентрацій токсину.

Для того, щоб секретогенна дія a-LTХ ставала чутливою до блокатора ГАМК-транспортера, у всіх експериментах необхідний був деякий час, який залежав від концентрації токсину. Протягом цього лаг-періоду, ймовірніше за все, відбувається формування токсинових пор у клітинній мембрані, а тривалість цього процесу залежить від концентрації a-LTХ (Гиммельрейх и др., 1990). З одного боку, вхід через ці пори дивалентних катіонів викликає швидку деполяризацію пресинаптичної мемб-рани, що може бути достатнім для помітного виходу ГАМК завдяки оберненій роботі ГАМК-перено-сників. З іншого – через дані пори, які проникні також і для невеликих молекул, може частково виті-кати і вільна цитозольна ГАМК. Цим можна пояснити неповне пригнічення NO-711 виходу [3H]ГАМК, стимульованого 0.5нМ LTХ. Таким чином, токсинові пори можуть відігравати подвійну роль в цьому процесі – пряму і непряму. Хоча не можна відкидати і можливість безпосередньої взає-модії молекули a-LTХ та мембранного переносника нейромедіатора.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

Лінецька М.В. "Механізми реалізації дії альфа-латротоксину як стимулятора нейросекреції". - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2005.

Дисертацію присвячено з'ясуванню механізму вивільнення нейромедіатора з нервових закінчень головного мозку щурів, індукованого ?-латротоксином (?-LTX) - основним компонентом отрути павука каракурта. Досліджено механізм дії токсину за наявності або відсутності позаклітинного Са2+. Показано участь двох пулів ГАМК – везикульованого та цитозольного – в реалізації секретогенної дії ?-LTX. З'ясовано, що механізм дії ?-LTX певною мірою залежить від концентрації токсину: у високій концентрації він значно ефективніше стимулює вихід нейромедіатора із невезикульованого пулу. Вперше одержані дані щодо участі ГАМК-переносника плазматичної мембрани у вивільненні ГАМК під дією a-LTX.

Ключові слова: a-латротоксин, синаптосоми, екзоцитоз, ГАМК, цитозольний пул, ГАМК-переносник.

Линецкая М.В. "Механизмы реализации действия альфа-латротоксина как стимулятора нейросекреции". - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Институт биохимии им. О.В. Палладина НАН Украины, Киев, 2005.

Диссертация посвящена выяснению механизма освобождения нейромедиатора из нервных окончаний головного мозга крыс, индуцированного ?-латротоксином (?-LTX) - основным компонентом яда паука каракурта. Изучен механизм действия токсина в присутствии или отсутствии внеклеточного Са2+. Показано вовлечение двух пулов ГАМК – везикулированного и цитозольного – в реализацию секретогенного действия ?-LTX. Доказано, что механизм действия ?-LTX определённым образом зависит от концентрации токсина: в высокой концентрації он значительно эфективнее стимулирует выход нейромедиатора из невезикулированного пула. Впервые получены данные об участии ГАМК-переносчика плазматической мембраны в высвобождении ГАМК под действием a-LTX.

Ключевые слова: a-латротоксин, синаптосомы, экзоцитоз, ГАМК, цитозольный пул, ГАМК-переносчик.

Linetska M.V. "a-Latrotoxin as stimulator of neurosecretion: mechanisms of action". - Manuscript.

Thesis for a candidate degree in biological sciences, 03.00.04 - Biochemistry. - Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2005.

The study was concentrated on mechanism of neurotransmitter release from nerve terminals induced by a-latrotoxin (б-LTX) - the major component of black widow spider venom. Rat brain synaptosomes were employed to investigate the mechanism of б-LTX action in the presence and absence of extracellular Ca2+. Different experimental approaches were used to examine the participation of the two pools of [3H]GABA (vesicular and cytosolic) in the realisation of secretogenic action of a-LTX.

The effect of LTX was studied under conditions when cytosolic [3H]GABA pool was depleted either by applying competitive inhibitors of the GABA transporter, nipecotic acid (NA) and 2,4-diaminobutyric acid (2,4-DABA), or by permeation with digitonin. It was shown that LTX is able to stimulate Ca2+-independent exocytosis from digitonin-permeated synaptosomes. Experiments with NA and 2,4-DABA revealed that depletion of cytosolic GABA impairs LTX-stimulated [3H]GABA release. So LTX can induce not only exocytotic release of [3H]GABA, but also outflow of the neurotransmitter from the cytosolic pool.

The other strategy was to test LTX action under conditions when exocytosis was modulated by inhibitors of enzymes, important for this process. Ocadaic acide (inhibits of protein phosphatases 1, 2A), cyclosporine A (inhibits protein phosphatase 2B) and phenylarsine oxide (inhibitor of phosphatidylinositol 4-kinase) were exploited. It was shown that [3H]GABA release evoked by the nanomolar toxin concentrations was less sensitive to this modulators, in comparison with release, evoked by subnanomolar LTX. Thus, the effect of the high LTX concentrations is likely to be due not only to stimulation of exocytosis, but also to additional factor, insensitive to modulators of exocytosis. It is reasonably to suggest that the leakage from cytosolic [3H]GABA pool could be this factor.

At the next step of research the LTX effect was studied when synaptic vesicle [3H]GABA was depleted and non-vesicular pool was enlarged. To create this conditions protonophore FCCP and bafilomycin A1 (inhibitor of vesicle H+-ATPase) were used. GABA redistribution between two synaptosomal pools caused abolishment of early response to LTX (during first 2 min) and increase of tardy step (5-10 min). It could be concluded that first rapid step of toxin action reflects stimulation of vesicle exocytosis and the second tardy step is due to release of cytosolic GABA.

To determine the participation of GABA carrier in the toxin-stimulated GABA release, non-substrate high-affinity GABA transport blocker NO-711 was used. Preliminary incubation of synaptosomes with NO-711 caused no effect on the first step (2 min) of LTX action but significantly decreased second step. This means that during the tardy step of LTX action [3H]GABA releases from cytosole via GABA-transporter (at least in part). The involvement of plasma membrane GABA transporter in a-LTX-stimulated GABA release was demonstrated for the first time.

Key words: a-latrotoxin, synaptosomes, exocytosis, GABA, cytosolic pool, GABA-transporter.