КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

НУРИЩЕНКО Наталія Євгенівна

УДК 577.353

МОЛЕКУЛЯРНІ ТА БІОФІЗИЧНІ МЕХАНІЗМИ ДІЇ УЛЬТРАЗВУКУ НА ТКАНИНИ ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМУ ЗАПАЛЕННІ І ХРОНІЧНОМУ ТОНЗИЛІТІ

03.00.02 – біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

КИЇВ - 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біофізики біологічного факультету Київського національному університеті імені Тараса Шевченка

Науковий консультант | доктор біологічних наук, професор

Мірошниченко Микола Степанович

завідувач кафедри біофізики

Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Офіційні опоненти: |

доктор біологічних наук, професор Матишевська Ольга Павлівна, професор кафедри біохімії Київського національного університету імені Тараса Шевченка

доктор біологічних наук, професор Якименко Ігор Леонідович, завідувач кафедри фізики і вищої математики Білоцерківського державного аграрного університету

доктор біологічних наук Скрипнюк Зеновій Дмитрович, завідувач відділу теоретичної та експериментальної інформотерапії ТОВ „Науково-дослідний інститут інтегративної та негентропійної медицини”

Провідна установа |

Інститут фізіології імені О.О. Богомольця НАН України, м. Київ

Захист відбудеться 16.03.2005 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка ( м. Київ, просп. Акад. Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд._____)

Поштова адреса: 01033, м. Київ-33, вул. Володимирська, 64

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка ( 01033, м. Київ-33, вул. Володимирська, 58)

Автореферат розісланий 12.02.2005 року

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Цимбалюк О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ультразвук (УЗ) є тим фізичним чинником, що обумовлює появу чисельних ефектів фізичної, хімічної та біологічної природи, а також різнобічно впливає на органи та системи живого організму.

В медицині ультразвук використовується вже кілька десятиліть. Цей фізичний фактор забезпечив собі положення ключової діагностичної методики як на сьогодні, так і в майбутньому. Не менш важливим є його застосування з лікувальними цілями.

Відомо, що дія УЗ на біологічні об’єкти визначається як станом самого об’єкту, так і параметрами ультразвукового сигналу. Тому підбір оптимальних параметрів ультразвукової дії є надзвичайно важливим з точки зору отримання бажаного лікувального ефекту, а вдосконалення ультразвукової терапії являється актуальним завданням медичної акустики. Так, традиційні терапевтичні ультразвукові прилади працюють на одній із стандартних, дозволених для застосування, частот в діапазоні від 0,88 МГц до 5,28 МГц. Такий тип сигналу носить назву моночастотного ультразвуку (МУЗ). Неодноразово робилися спроби підвищити його біологічну і терапевтичну ефективність. Це стає можливим за рахунок застосування стохастичного ультразвуку (СТУЗ) - акустичного сигналу, параметри якого змінюються приладом випадково в часі.

Загальноприйнято, що механізм дії УЗ високих інтенсивностей пов’язаний з кавітацією [Miller et al.,1996; Mitome, 1993, Brujan, 2004] та утворенням вільних радикалів [Suhr, Brummer, 1991; Riesz, Kondo, 1992; Misik, Riesz, 2000; Miyoshi et al., 2003]. Значну роль відіграють і теплові ефекти [Riesz, Kondo, 1982; Nyborg, 2001].

В той же час, механізм дії малих (дотеплових) інтенсивностей УЗ, які застосовуються з терапевтичними цілями, і, особливо, в умовах розвитку патологічних станів, до кінця ще не встановлений, незважаючи на велику кількість проведених досліджень [Dyson, 1987; Сарвазян, Пашовкин, 1988; Сологуб та ін., 1991; Johns, 2002; Johns et al., 2003; Riesz, Kondo, 2003; Schortinghuis et al., 2004]. Звісно, відсутність вичерпних знань стримує застосування такого важливого для фізіотерапії лікувального засобу. Тому розкриття механізмів впливу як традиційного моночастотного, так і стохастичного ультразвуку на клітини і тканини в нормі і при патології є, безумовно, актуальною проблемою сучасної біології і медицини.

Зв’язок з науковою тематикою організацій. Робота виконана у рамках тем „Розробити і впровадити в клінічну практику Київського науково-дослідного інституту отоларингології нові ультразвукові методи та апаратуру для лікування хронічних запальних захворювань ЛОР-органів” ( № державної реєстрації 01890005787, 1989 – 1991 рр., науковий керівник д.б.н., проф. Д.І. Заболотний), „Розробити нові методики лікування запалення верхніх дихальних шляхів з застосуванням терапії крайнє високими частотами та стохастичним ультразвуком” (№ державної реєстрації 0195v02985, 1995 – 1997 рр., наукові керівники д.б.н., проф. Д.І. Заболотний, к.б.н., ст. наук. співробітник А.Ф. Карась), „Розробити методи лікування хворих на поліпозний риносинусит з використанням нових препаратів / нейропептиди, цитокіни / та деяких фізичних факторів (№ державної реєстрації 0198u004514, 1998 – 2000 рр., наукові керівники д.б.н., проф. Д.І. Заболотний, к.б.н., ст. наук. співробітник А.Ф. Карась) Київського науково-дослідного інституту отоларингології ім. проф. О.С. Коломийченка АМН України. В цих темах дисертант приймав участь як відповідальний виконавець.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала у встановленні механізмів дії терапевтичних інтенсивностей (0,1 Вт/см2 – 1,0 Вт/см2) традиційного моночастотного, а також принципово нового стохастичного УЗ в нормі та при експериментальному запаленні і хронічному тонзиліті.

В зв’язку з цим були поставлені такі завдання:

1. Вивчити вплив моночастотного і стохастичного ультразвуку на розвиток каррагінанового набряку кінцівки щурів, що є класичною моделлю експериментального запалення. Для визначення механізмів ультразвукового впливу дослідити перекисне окиснення ліпідів, антиоксидантний захист, нейтрофільну інфільтрацію.

2. Дослідити дію моночастотного і стохастичного ультразвуку на процеси вільнорадикального окиснення та антиоксидантний захист, показники біоенергетики на моделі експериментального запалення верхніх дихальних шляхів. Крім того, розробити інформативні критерії об’єктивної оцінки ефективності ультразвукового лікування хворих.

3. Визначити параметри ультразвуку, які стимулюють метаболічні реакції за умови мінімальної деструктивної дії на організм на основі вивчення впливу МУЗ і СТУЗ на показники проникності мембран еритроцитів, активність АТФ-аз мембран еритроцитів, синтетичну активність лімфоцитів крові, стан перекисного окиснення ліпідів та активність ендогенних антиоксидантів, перерозподіл відновлених і окиснених форм нікотинамідаденін динуклеотидних і нікотинамід аденін динуклеотидфосфатних коферментів.

4. Встановити механізм протизапального впливу ультразвуку при хронічному тонзиліті, для чого дослідити:

а) процеси вільнорадикального окиснення та ендогенної інтоксикації в плазмі крові хворих на хронічний тонзиліт до та в динаміці ультразвукового лікування;

б) вивчити ферментативну активность Mg-залежних АТФ-аз еритроцитів крові хворих на хронічний тонзиліт до та в динаміці ультразвукового лікування;

в) визначити активність сукцинатдегідрогенази, лактатдегідрогенази, АТФ-ази, кислої фосфотази в лімфоцитах та нейтрофілах периферичної крові хворих на хронічний тонзиліт при консервативному лікуванні моночастотним та стохастичним УЗ.

г) визначити вміст ДНК в епітеліальних клітинах мигдаликів хворих на хронічний тонзиліт до та в динаміці ультразвукового лікування.

Об’єкт дослідження: експериментальне запалення, кров хворих на хронічний тонзиліт.

Предмет дослідження: механізми протизапальної дії ультразвуку терапевтичних інтенсивностей в діапазоні 0,1 – 1,0 Вт/см2.

Для досягнення поставленої мети використовували біофізичні, біохімічні методи досліджень: хемілюмінесцентний та спектрофотометричні методи визначення перекисного окиснення ліпідів та активності антиоксидантних систем; цитофотометричні методи визначення активності ферментів в клітинах крові, а також вмісту ДНК в епітеліальних клітинах піднебінних мигдаликів; спектрофотометричні методи визначення активності мембранних АТФ-аз; люмінесцентний метод визначення синтетичної активності лімфоцитів крові. Були також застосовані фізіологічні методи моделювання запалення.

Наукова новизна: Вперше проведено комплексне дослідження механізмів протизапальної дії традиційного моночастотного та стохастичного ультразвуку на моделях запальних патологій та при хронічному тонзиліті.

На моделях експериментального запалення показано, що ультразвук в області терапевтичних інтенсивностей здатний спричиняти як протизапальну, так і прозапальну дію в залежності від інтенсивності. Так, і МУЗ, і СТУЗ пригнічують розвиток запалення при інтенсивностях 0,1 Вт/см2; 0,2 Вт/см2, а при інтенсивностях більших, ніж 0,5 Вт/см2 - підсилюють його.

Показано, що протизапальна дія МУЗ і СТУЗ пов’язана з їх здатністю впливати одночасно на декілька механізмів експериментального запалення. Це проявляється у властивості УЗ з інтенсивностями 0,1 – 0,3 Вт/см2, по-перше, зменшувати прояви окисного стресу та, по-друге, знижувати енергетичну забезпеченість запальних реакцій.

Встановлено, що МУЗ і СТУЗ з інтенсивностями 0,1-0,3 Вт/см2 проявляють біологічну ефективність при відсутності супутніх пошкоджень на клітини.

Розроблено інтегральний показник лабораторного визначення стадії запального процесу у хворих на хронічний тонзиліт, що складається з двох компонентів, де перший з них характеризує стан антиоксидантних систем крові хворих, а другий - вказує на зміни в концентрації токсичних речовин білкової природи, які відіграють роль специфічних маркерів ендогенної інтоксикації організму. Також показано існування залежності активності іонних АТФ-аз мембран еритроцитів від гостроти запального процесу в піднебінних мигдаликах.

Застосування ультразвуку як моночастотного, так і стохастичного режимів сприяє нормалізації активності іон-транспортних АТФ-аз мембран еритроцитів хворих та покращує стан метаболізму.

Проведення терапії як моночастотним, так і стохастичним ультразвуком призводить також до зниження рівня ендогенної інтоксикації та нормалізації процесів вільнорадикального окиснення, що порушуються при хронічному тонзиліті. Однак, СТУЗ-терапія викликає триваліший і більш виражений позитивний вплив на досліджувані показники. Це обумовлено здатністю СТУЗ ефективно впливати на вільнорадикальне окиснення в плазмі крові хворих та прискорювати видалення епітеліальних клітин піднебінних мигдаликів з порушеним в результаті розвитку патології геномом.

Отримані дані розширюють існуючі уявлення про механізми розвитку запалення, хронічного тонзиліту, зокрема.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено оптимальні режими терапевтичного моночастотного і стохастичного ультразвуку і доведено, що при запропонованих величинах частоти та інтенсивності ультразвукового сигналу спостерігається стимуляція метаболічних процесів при відсутності деструктивного впливу на клітини та тканини організму. Отримані експериментальні дані стали основою для проведення обмежених клінічних досліджень щодо апробації стохастичної ультразвукової терапії.

Дані про ефективність біологічної дії СТУЗ послужили обґрунтуванням для удосконалення нового ультразвукового приладу „Тератон-У”, котрий здатний генерувати ультразвукові сигнали обох режимів.

Особистий внесок здобувача. При виконанні роботи здобувачем самостійно було проведено теоретичні пошуки та започатковано нові напрямки досліджень механізмів впливу ультразвуку терапевтичного діапазону на розвиток запальних процесів. Підбір та обробка літератури, постановка дослідів, а також статистична обробка результатів виконувались безпосередньо автором. Робота по дослідженню впливу МУЗ і СТУЗ на інтерфероногенез виконувались спільно з к.б.н. Кривохатською Л.Д. (Київський інститут отоларингології ім. проф. О.С. Коломийченка АМН України). Цитофотометричні дослідження активності ферментів у хворих на хронічний тонзиліт під дією МУЗ і СТУЗ-терапії проведені спільно з к.б.н. Карасем А.Ф. (Київський інститут отоларингології ім. проф. О.С. Коломийченка АМН України). Клінічні дослідження проводив науковий співробітник Інституту отоларингології ім. проф. О.С. Коломийченка АМН України лікар Стрежак В.В. З цими науковими співробітниками автор має спільні публікації. Усі результати отримані дисертантом особисто чи при його безпосередній участі у виконанні експерименту.

Апробація результатів роботи. Основні результати дисертації висвітлені на науково-практичній конференції по емоціанально-стресорній психотерапії, фізичному вихованню, реабілітації і діагностиці ( Одеса, 1990), науковій конференції „Україна: людина, суспільство, природа” (Київ, 1995), на 8-ому з’їзді отоларингологів України (Київ, 1995), на 2-му з’їзді радіобіологів України (Київ, 1995), ювілейній науково-практичній конференції, присвяченій 100-річчю професора О.С.Коломийченка (Київ, 1998), 2-му світовому конгресі отоларингологічної алергології, ендоскопії та лазерної хірургії, об’єднаній нараді американської академії з отоларингології, хірургії голови та шиї разом з всегрецьким товариством отоларингологів, хірургів голови та шиї; 11-ому всегрецькому конгресі з отоларингології, хірургії голови та шиї (Афіни, 2001), Ш міжнародному симпозіумі „Механізм дії надмалих доз” (Москва, 2002), Ш міжнародному симпозіумі „Актуальні проблеми біофізичної медицини” (Київ, 2002), XVII світовому конгресі міжнародної оториноларингологічної федерації (IFOS) (Каїр, 2002), Ш-ому з’їзді з радіаційних досліджень (Київ, 2003), міжнародній конференції „Сучасні технології діагностики та лікування верхніх дихальних шляхів та вуха” ( Київ, 2004).

Публікація матеріалів. Головні положення дисертаційної роботи відображені в 33 публікаціях, серед яких 21 стаття у фахових наукових виданнях, що визнаються положеннями ВАК України, та 10 тез доповідей на вітчизняних та міжнародних наукових конференціях і симпозіумах.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, 6-ти розділів (огляд літератури, матеріали та методи досліджень, 4-х глав з описом власних досліджень з обговоренням), заключення, висновків, списку використаних джерел (446 посиланнь). Робота викладена на 316 сторінках машинопису, ілюстрована 75 рисунками та 32 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У „Вступі” обґрунтовано актуальність теми дослідження, визначено зв’язок напрямку досліджень із науковою темою, сформульовано мету та завдання дослідження, розкрито наукову новизну і практичне значення роботи, зазначено особистий внесок здобувача, наведено інформацію про апробацію результатів дослідження.

У першому розділі, який складається з двох підрозділів „Механізми дії терапевтичного ультразвуку” і „Роль реакційних кисневих форм та антиоксидантного захисту в механізмах розвитку запалення” проведено теоретичний аналіз досліджуваної проблеми, проаналізовано і узагальнено наукові дані про механізми дії ультразвуку високих, середніх і малих інтенсивностей в умовах норми та при патологічних станах, а також розглянуто роль вільних радикалів і оксидантів в розвитку запалення.

Матеріали та методи досліджень

Методика вибору режимів моночастотного та стохастичного ультразвуку для терапевтичних цілей. Дослідження реакцій клітин і тканин на дію моночастотного і стохастичного ультразвуку різних інтенсивностей були проведені на 200 білих безпородних статевозрілих щурах вагою 180-200 г.

Тварин дослідних груп (n=6-10) озвучували в області піднебінних дужок. Перед процедурою волосяний покрив на місці дотику аплікатора видаляли безпечною бритвою. Як контактне середовище використовували дезодоровану вазелінову олію. Джерелом ультразвуку як моночастотного, так і стохастичного режимів був апарат “Тератон-V”. Крім того, застосовували розроблений I. Островським та O. Марченком [Ostrovskiy, Marchenko, 1992] експериментальний терапевтичний апарат для генерації стохастичного ультразвукового сигналу. Як джерело моночастотного ультразвуку використовували також прилад УЗТ-3.04ІЗ. Частота моночастотного ультразвуку становила 0,88 МГц, а стохастичного змінювалась в діапазоні 0,88-2,64 МГц.

При вивченні впливу моночастотного та стохастичного ультразвуку на перекисне окиснення ліпідів, активність ендогенних антиоксидантів, на вміст і перерозподіл відновлених і окиснених форм нікотинамідаденін динуклеотидних та нікотинамідаденін динуклеотидфосфатних коферментів тварин піддавали 10-хвилинному озвученню. Інтенсивність УЗ моночастотного і стохастичного режимів становила 0,2 Вт/см2 , 0,3 Вт/см2, 0,5 Вт/см2 та 1,0 Вт/см2. Дослідження проводили через 3 год, 24 год та 48 год після дії ультразвуку.

Окрім одноразової дії моночастотного та стохастичного ультразвуку, досліджували також його курсовий вплив. Для цього проводили п’ятиразове озвучення (по 10 хвилин через добу протягом десяти діб).

При дослідженні впливу моночастотного та стохастичного ультразвуку на проникність мембран еритроцитів, активність АТФ-аз та функціональну активність лімфоцитів крові застосовували СТУЗ з інтенсивностями 0,12 Вт/см2, 0,25 Вт/см2, і 0,5 Вт/см2, а МУЗ - з інтенсивностями 0,1 Вт/см2, 0,3 Вт/см2, 0,5 Вт/см2. Проводили курсове озвучення. Тварин декапітували під легким ефірним наркозом через 3 години після останнього сеансу.

В усіх серіях дослідів в якості контрольної використовували групу тварин, яким проводили так зване „вдаване озвучення”, що являло собою імітацію процедури озвучення, але при відключеному генераторі ультразвукового сигналу.

Проникність мембран еритроцитів крові визначали за осмотичною резистентністю еритроцитів до розчинів сечовини різної концентрації [Казеннов та ін., 1984]. Вимірювання проводили на спектрофотометрі СФ-46 (ЛОМО, Росія).

Параметри функціональної активності лімфоцитів крові аналізували за співвідношенням РНК/ДНК, яке отримували на підставі вимірювання флуоресценції клітин після фарбування акридиновим оранжевим за методом [Карнаухов, 1978]. Інтенсивність флуоресценції клітин в областях 640 нм (для РНК) і 530 нм (для ДНК) реєстрували на люмінесцентному мікроскопі ЛЮМАМ И-3. Ініціацію флуоресценції здійснювали довжиною хвилі 436 нм, котру виділяли світлофільтром із спектру ртутної дугової лампи ДРШ - 250. На кожному препараті аналізували по 25 лімфоцитів.

Визначення активності Na+,K+-АТФ-ази мембран еритроцитів крові проводили за методом [Прохорова, 1982].

Перекисне окиснення ліпідів (ПОЛ) оцінювали за вмістом малонового діальдегіду (МДА) в плазмі крові за методом [ Porter, 1976]. Активність супероксиддисмутази (СОД) визначали за методом [Дубинина, 1983], а каталази – за методом [Королюк, 1988]. Білок визначали за [Lowry, 1951].

Визначення вмісту нікотинамідаденін динуклеотидних коферментів проводили за методом [Bernovsky,Svan, 1990], а нікотинамідаденін динуклеотид фосфатних коферментів – за методом [Jorgensen, Rasmussen, 1973].

Методика дослідження механізмів протизапальної дії моночастотного і стохастичного ультразвуку. Дослідження механізмів протизапальної дії ультразвуку, як моночастотного, так і стохастичного режимів, проведені на моделях запалення - каррагінановому набряку кінцівки щурів і запаленні верхніх дихальних шляхів. Каррагінановий набряк відтворювали відповідно до методу [Winter et al., 1962]. 0,1 мол 1%-ного розчину каррагінану вводили в праву задню лапу щурів. Товщину лапи вимірювали через 1 год, 2 год, 3 год, 4 год, 12 год, 24 год після ін'єкції флогогену. Про розвиток набряку судили по його відсотку, що розраховували відповідно до формули: I (% набряку) = (І1-І0)/І0 100, де I1 - товщина лапи після введення каррагінану; I0 - товщина лапи до введення каррагінану.

Модель каррагінанового запалення верхніх дихальних шляхів відтворювали за [Тимченко та ін., 2001]. Для моделювання запалення 0,1 мл 2 %-ного розчину каррагінану вводили в піднебінну дужку щурів. Для оцінки розвитку запалення верхніх дихальних шляхів визначали кількість лейкоцитів та лімфоцитів, процентний вміст гранулоцитів та моноцитів в крові щурів. В крові, що брали меланжерним методом, за допомогою камери Горяєва визначали загальний вміст лейкоцитів. В мазках крові, що фарбували за методом Паппенгейма, підраховували кількість окремих клітинних форм лейкоцитів. Дослідження картини крові проводили через 1 год, 3 год, 6 год і 24 год після індукції запалення.

Дослідження впливу моночастотного і стохастичного ультразвуку на каррагінановий набряк кінцівки щурів виконані на 110 білих безпородних щурах масою 180 -200 г ( n=6-10). При дослідженні однократної дії моночастотного і стохастичного ультразвуку тварин озвучували з інтенсивностями 0,1 Вт/см2, 0,2 Вт/см2, 0,5 Вт/см2, 1,0 Вт/см2 за 1 год до введення каррагінану в область кінцівки. При вивченні курсової дії ультразвуку моночастотного і стохастичного режимів тварин піддавали 5-разовому озвученню тими ж інтенсивностями з інтервалом у добу. Через 1 год після останнього озвучення відтворювали каррагінановий набряк.

При досліджені впливу моночастотного і стохастичного ультразвуку на експериментальне запалення верхніх дихальних шляхів тварин озвучували в області проекції піднебінних дужок курсом з п’яти процедур через добу. Інтенсивність ультразвукового сигналу обох режимів складала 0,2 Вт/см2 і 0,3 Вт/см2. Експерименти виконані на 130 білих безпородних щурах масою 175 -200 г (n=8-10).

При дослідженнях дії ультразвуку на моделях експериментального запалення контрольну групу складали тварини, яким замість каррагінану вводили фізіологічний розчин.

З метою визначення механізмів протизапальної дії моночастотного і стохастичного ультразвука при каррагінановому запаленні кінцівки щурів проводили вимірювання рівня малонового діальдегіду, відновленого глутатіону та активності мієлопероксидази в тканинах, що були взяті з місця відтворення запалення. Експерименти виконані на 350 білих безпородних щурах-самцях масою 180 -200 г ( n=6-10). Показники досліджували на піку розвитку набряку - через 3 год після введення каррагінану. Тварин вбивали під ефірним наркозом.

Активність мієлопероксидази визначали відповідно до методу [Mullane et al., 1985], вміст малонового діальдегіду - згідно [Okhawa et al., 1979], а вміст відновленого глутатіону - згідно [Griffith, 1999].

При експериментальному запаленні верхніх дихальних шляхів дослідження біофізичних і біохімічних показників проводили через 3 год після його відтворення, на піку розвитку.

Вивчення вільнорадикальних процесів в плазмі крові щурів проводили хемілюмінесцентним методом [Журавлев, Шерстнев, 1985]. Вимірювання здійснювали на хемiлюмiнометрi ПХЛ-01 з наступним аналізом хемiлюмiнограм за допомогою спеціально розробленої комп’ютерної програми.

Окисний стрес при експериментальному запаленні верхніх дихальних шляхів вивчали за маркерними показниками. В якості останніх розглядали вміст малонового діальдегіду, активність cупероксиддисмутази та каталази, вміст відновленого та окисненого глутатіону, їх співвідношення, а також співвідношення відновленої до окисненої форми нікотинамідаденін динуклеотидфосфату (НАДФН/НАДФ+).

Визначення вмісту відновленого та окисненого глутатіону в плазмі та еритроцитах крові щурів, а також їх співвідношення проводили за методом [Sies, 1999].

Співвідношення НАДФ+/НАДФН розраховували відповідно до методу [Bernofsky, 1973].

Методика вивчення механізмів дії моночастотного і стохастичного ультразвуку при хронічному тонзиліті. Дослідження проводили на крові людей трьох груп. Першу з них складали хворі на хронічний тонзиліт, яким лікарі проводили лікування з використанням моночастотного ультразвуку (15 осіб). Другій групі хворих на дану патологію проводили стохастичну ультразвукову терапію (20 осіб). В кожній з груп виділяли хворих на компенсовану і декомпенсовану форми хронічного тонзиліту. Контрольну групу складали умовно здорові пацієнти, що проходили планове обстеження ЛОР-органів (20 осіб). Хворі отримували по 10 сеансів УЗ-терапії. Інтенсивність УЗ складала 0,2 Вт/см2. У пацієнтів в динаміці лікування, а також після 10-ти сеансів, а також через 1 місяць, 6 місяців, 1 рік та 3-4 роки після УЗ-терапії брали венозну кров у пробірки з гепарином (50 од/мл) і використовували її для подальших досліджень.

Дослідження дії ультразвуку при хронічному тонзиліті, в патогенезі якого важлива роль належить запаленню, проводили, зважаючи на основні механізми розвитку цієї патології.

Вільнорадикальне окиснення в плазмі крові хворих оцінювали за допомогою хемілюмінесцентного методу [Журавлев, Шерстнев, 1985].

Показником ендогенної інтоксикації вважали рівень середньомолекулярних пептидів (СМП) в крові хворих. Кількісні розрахунки концентрації СМП проводили у відповідності з протоколом, запропонованим у роботі [Габриэлян та ін., 1980]. Вимірювання здійснювали на спектрофотометрі СФ-46 (Росія) на довжині хвилі 254 нм.

Визначення активності іон-транспортних АТФ-аз еритроцитів крові хворих проводили за методом [Прохорова, 1982].

Кількісне визначення ДНК проводили в мазках епітеліальних клітин, які отримували шляхом переносу зіскобів з поверхні мигдаликів на предметні скельця [Фьольген, 1960]. Фотометрію препаратів здійснювали за допомогою скануючого мікроскопа-фотометра МФТХ-2М (Росія) на довжині хвилі 546 нм. Спеціально розроблена програма дозволяла вимірювати виключно загальну абсорбцію ядерної ДНК в клітинах. Як контроль використовували лімфоцити крові, що мають плоїдність 2n та чоловічі сперматозоїди добровольців - донорів з плоїдністю 1n. Використання контролю надало змогу встановити коефіцієнт кореляції між плоїдністю клітин та абсорбцією в них ядерної ДНК. Спостереження проводились після кожного з 10 сеансів УЗ-терапії, а також через тиждень, три тижні і 1,5 року після лікування.

Експериментальні дані обробляли загальноприйнятими методами варіаційної статистики [Брандт, 1975] з використанням tкритерію Стюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Стимулюючі та деструктивні ефекти різних інтенсивностей моночастотного і стохастичного ультразвуку терапевтичного діапазону. Перший етап роботи був пов’язаний з вивченням біологічної дії стохастичного та моночастотного ультразвуку в порівняльному аспекті, з’ясуванні механізмів їх дії, а також з визначенням оптимальних параметрів цього фізичного фактора щодо його біологічної ефективності і відсутності пошкоджуючої дії.

При вивченні впливу ультразвуку терапевтичних інтенсивностей на вміст малонового діальдегіду, як кінцевого продукту перекисного окиснення ліпідів, а також активність основних антиоксидантних ферментів – супероксиддисмутази та каталази встановлено, що застосування МУЗ та СТУЗ з інтенсивністю 0,2 Вт/см2 та СТУЗ з інтенсивністю 0,3 Вт/см2 призводило до зниження вмісту МДА в крові дослідних тварин через 3 год після озвучення. При дії МУЗ з інтенсивністю 0,2 Вт/см2 спостерігалось зниження рівня МДА на 32,1 % (р<0,05), а СТУЗ – на 37,7% (р<0,05). Стохастичний ультразвук з інтенсивністю 0,3 Вт/см2 зменшував рівень МДА на 33,3 % (р<0,05). Виявлені зміни досліджених показників можна пояснити активацією ферментативних процесів утилізації кисню таких, як тканинне дихання, окиснювальне фосфорилювання. На користь цього також свідчить той факт, що УЗ вищезгаданих інтенсивностей не впливав на активність ферментів антиоксидантного захисту. Під впливом МУЗ з інтенсивністю 0,3 Вт/см2 та 0,5 Вт/см2 і СТУЗ з інтенсивністю 0,5 Вт/см2 не спостерігалось достовірних змін досліджених показників.

При застосуванні УЗ обох режимів з інтенсивністю 1,0 Вт/см2 відмічалось підвищення вмісту малонового діальдегіду та зміна активності супероксиддисмутази і каталази. В разі використання СТУЗ встановлено більш значне посилення перекисного окиснення ліпідів. Так, через 3 год після озвучення при застосуванні МУЗ рівень малонового діальдегіду збільшився на 34,9 % (р<0,05) порівняно з контролем, а у випадку застосування СТУЗ - на 55,4 % (р<0,05). Але вже через 24 год після впливу МУЗ рівень МДА знижувався і не відрізнявся від контролю. При озвученні СТУЗ рівень МДА зменшувався з часом, але і через 48 год перевищував контрольні величини на 34,6 % (р<0,05). Більш виражений вплив стохастичного ультразвуку, порівняно з моночастотним, на оксидантно-антиоксидантний баланс в організмі підтверджується також і динамікою зміни активності ферментів антиокиснювального захисту. При дії МУЗ з інтенсивністю 1,0 Вт/см2 через 3 год спостерігалось підвищення активності супероксиддисмутази на 72,5 % (р<0,05) порівняно з контролем, тоді як активність каталази не змінювалась. Через 24 год рівень супероксиддисмутази нормалізувався, а активність каталази навпаки підвищувалась на 30,6 % (р<0,05). Проте, через 48 год показники активності цих ферментів не відрізнялись від контролю. Під впливом такої ж інтенсивності СТУЗ спостерігались більш глибокі зміни в системі антиокиснювального захисту. Через 3 год після озвучення активність як супероксиддисмутази, так і каталази перевищувала контрольні значення на 93,9 % (р<0,05) і 25,5 % (р<0,05), відповідно. Через 24 год активність СОД залишалась підвищеною на 66,4 % (р<0,05), а каталази – на 46,2 % (р<0,05). Однак, через 48 год активність СОД знижувалась на 41,4 % (р<0,05), а каталази - залишалася підвищеною на 37,5 % (р<0,05) порівняно з контролем. Встановлене співвідношення активності антиоксидантних ферментів представляється цілком закономірним, оскільки відомо, що при збільшенні концентрації специфічного субстрату активність ферменту спочатку підвищується, а потім, коли запаси субстрату виснажуються, знижується. Враховуючи те, що супероксиддисмутаза є першим ферментом в системі антиокиснювального захисту, зміни її активності відбуваються раніше і більш виражені.

Таким чином, вплив як МУЗ, так і СТУЗ на баланс в системі прооксиданти-антиоксиданти залежить від інтенсивності ультразвукового сигналу. Так, при інтенсивностях до 0,3 Вт/см2 відбувались зміни, що були спрямовані на зниження перекисного окиснення ліпідів. Ультразвук обох режимів з інтенсивностями 0,3 Вт/см2 і 0,5 Вт/см2 не впливав на ПОЛ. При дії МУЗ з інтенсивністю 1,0 Вт/см2 відбувалась активація ПОЛ, але системи антиоксидантного захисту компенсували підвищений рівень вільнорадикального окиснення. При дії СТУЗ з інтенсивністю 1,0 Вт/см2 зміни в системі антиоксидантного захисту були не здатні нейтралізувати дію вільних радикалів і нормалізувати перекисне окиснення ліпідів.

НАДН та НАДФН є носіями “відновлюючої здатності”, а НАДФН також забезпечує відновлення ферментів антиоксидантного захисту [Lee et al., 2002].

При визначенні дії різних інтенсивностей ультразвуку моночастотного та стохастичного режимів на загальний вміст нікотинамідаденін динуклеотидних - НАД(Н) - та нікотинамідаденін динуклеотидфосфатних - НАДФ(Н) - коферментів, їх окиснених - НАД+, НАДФ+ - і відновлених - НАДН, НАДФН - форм, а також співвідношення НАД+/НАДН і НАДФ+/НАДФН виявлено наступне. Застосування МУЗ і СТУЗ вело до зміни рівня і перерозподілу окиснених та відновлених форм нікотинаденін динуклеотидних та нікотинаденін динуклеотидфосфатних коферментів. Під впливом одноразового озвучення з різними інтенсивностями спостерігалась стійка тенденція до підвищення рівня НАД+, НАДН, НАД(Н) з переважанням відновленої форми, що призводило до зниження співвідношення НАД+/НАДН (рис.1А) на 6,8 % і 6,6 % – при інтенсивності 0,2 Вт/см2; 7,2 % і 6,8 % - при інтенсивності 0,3 Вт/см2; 4,3 % і 3,6 % – при інтенсивності 0,5 Вт/см2 для МУЗ і СТУЗ, відповідно.

Рис. 1. Відносна зміна співвідношення НАД+/НАДН (А) та НАДФ+/НАДФН (Б) при дії моночастотного і стохастичного ультразвуку різних інтенсивностей (n=8-10): * - достовірна різниця відносно контролю при р>0,95

Застосування УЗ з інтенсивністю 1,0 Вт/см2 призводило до переважного підвищення рівня НАД+ і зростання співвідношення НАД+/НАДН на 13,9 % (р<0,05) для МУЗ і на 16,9 % (р<0,05)– для СТУЗ.

Більш виражені зміни спостерігались з боку НАДФ+, НАДФН та НАДФ(Н) (рис. 1Б). При застосуванні УЗ усіх режимів відбувалось зниження як НАДФ+, НАДФН, так і НАДФ(Н), яке ставало достовірним при інтенсивності 0,5 Вт/см2 і далі посилювалось при інтенсивності 1,0 Вт/см2. При інтенсивностях 0,2 Вт/см2 і 0,3 Вт/см2 переважали відновлені форми. Співвідношення НАДФ+/НАДФН знижувалось на 12,8 % для МУЗ і на 6 % – для СТУЗ при інтенсивності 0,2 Вт/см2; на 5,4 % для МУЗ і на 10 % – для СТУЗ при інтенсивності 0,3 Вт/см2. При застосуванні УЗ з інтенсивністю 1,0 Вт/см2 окислені форми НАДФ+ ставали домінуючими і співвідношення НАДФ+/НАДФН збільшувалось на 28,2 % (р<0,05) для МУЗ і на 24,8 % (р<0,05)– для СТУЗ.

Через 24 год після впливу ультразвуку зберігалась тенденція до зниження рівня нікотинамідаденін динуклеотидфосфатних коферментів, але співвідношення окиснених та відновлених форм знаходилось в межах контрольних значень. При курсовому застосуванні як МУЗ, так і СТУЗ ця тенденція утримувалась з незначним переважанням НАДФН при інтенсивностях 0,2-0,5 Вт/см2 і НАДФ+ – при інтенсивності 1,0 Вт/см2.

Отримані результати свідчать про те, що УЗ обох режимів з інтенсивностями 0,2 Вт/см2 і 0,3 Вт/см2 викликає зміни нікотинамідаденін динуклеотидних та нікотинамідаденін динуклеотидфосфатних коферментів, що є сприятливими для клітини з позиції біоенергетики, оскільки в цьому випадку посилюється аеробний гліколіз та зростає відновлюючий потенціал. В той же час, УЗ з інтенсивністю 1,0 Вт/см2, підвищуючи співвідношення НАД+/НАДН та НАДФ+/НАДФН, негативно впливає на перебіг біосинтетичних реакцій. Слід зазначити, що саме за межею в 1,0 Вт/см2 починається діапазон пошкоджуючих інтенсивностей УЗ.

З метою визначення мембранних механізмів дії ультразвуку було проведено дослідження впливу різних інтенсивностей ультразвуку обох режимів на проникність еритроцитарних мембран та активність внутрішньо мембранного ферменту - Na+,K+-АТФ-ази, а також функціональну активність лімфоцитів крові.

Було показано, що дія СТУЗ з інтенсивностями 0,12 Вт/см2 і 0,25 Вт/см2 та МУЗ з інтенсивностями 0,1 Вт/см2 і 0,3 Вт/см2 не призводила до значних змін проникності мембран еритроцитів, про що свідчить відсутність помітного зростання виходу гемоглобіну в умовах озвучення. При застосуванні ультразвука з інтенсивністю 0,5 Вт/см2 процент гемолізу еритроцитів підвищувався в 2,5 рази (р<0,05) і 2,2 рази (р<0,05), відповідно для СТУЗ і МУЗ.

Ультразвук моночастотного (0,1 Вт/см2 і 0,3 Вт/см2) та стохастичного (0,12 Вт/см2 і 0,25 Вт/см2) режимів сприяв незначному збільшенню функціональної активності лімфоцитів. При застосуванні УЗ з інтенсивністю 0,5 Вт/см2 ці зміни набували статистичної достовірності – показник підвищувався на 35,0 % (р<0,05) у випадку застосування МУЗ і на 31,7 % (р<0,05) - для СТУЗ.

Вивчення активності Na+,K+-АТФ-ази мембран еритроцитів показало

(рис. 2), що під впливом СТУЗ з інтенсивністю 0,12 Вт/ см2 та 0,25 Вт/см2 відбувалось збільшення активності ферменту в 1,4 (р<0,05) і 1,6 рази (р<0,05), відповідно. При застосуванні МУЗ з інтенсивностями 0,1 Вт/см2 і 0,3 Вт/см2 спостерігалось підвищення активності Na+,K+-АТФ-ази в 1,5 рази (р<0,05) і в 1,6 рази (р<0,05), відповідно.

Під впливом СТУЗ з інтенсивністю 0,5 Вт/см2 спостерігалось зниження активності ферменту відносно контролю в 1,5 рази (р<0,05). Під впливом МУЗ такої ж інтенсивності активність Na+,K+-АТФ-ази зменшувалась в 1,8 рази (р<0,05).

Проведені дослідження показали, що стохастичний ультразвук з інтенсивностями 0,12 Вт/см2 і 0,25 Вт/см2, а також моночастотний ультразвук з інтенсивностями 0,1 Вт/см2 і 0,3 Вт/см2 не впливають значним чином на проникність еритроцитарних мембран. Підвищення активності Na+,K+-АТФ-ази, що спостерігалось при використанні зазначених інтенсивностей ультразвуку, очевидно, здатне компенсувати перерозподіл іонів, що виникає під впливом ультразвуку. Завдяки цьому порушення мембран не розвиваються і не спричиняють значних змін внутриклітинного метаболізму.

Рис. 2. Активність Na+,K+-АТФ-ази мембран еритроцитів щурів під впливом моночастотного і стохастичного ультразвуку різних інтенсивностей (M±m; n=9-10): 1 – контроль; 2 – СТУЗ 0,12 Вт/см2; 3 – МУЗ 0,1 Вт/см2; 4 – СТУЗ 0,25 Вт/см2; 5 – МУЗ 0,3 Вт/см2; 6 – СТУЗ 0,5 Вт/см2; 7 – МУЗ 0,5 Вт/см2

* - достовірна різниця відносно контролю при р>0,95

Ультразвук з інтенсивністю 0,5 Вт/см2 підвищує проникність мембран еритроцитів і, як наслідок, зростання виходу гемоглобіну. При дії ультразвуку з інтенсивністю 0,5 Вт/см2 відбувалось, на наш погляд, порушення стеричної взаємодії Na+,K+-АТФ-ази з мембранними фосфоліпідами, що супроводжувалось зниженням ферментативної активності. В результаті гальмування роботи Na+,K+- насосу значно уповільнюється гідроліз АТФ, що дає змогу клітині спрямувати свій заощаджений енергетичний потенціал на здійснення синтетичних процесів, наприклад, синтез РНК. Підвищення функціональної активності лімфоцитів свідчить на користь такого припущення.

Узагальнюючи отримані результати можна констатувати, що як МУЗ, так і СТУЗ в області інтенсивностей 0,1-0,3 Вт/см2 проявляють таку біологічну дію, яка зумовлює стимуляцію нормальних фізіологічних реакцій.

Ультразвук обох режимів з інтенсивністю 0,5 Вт/см2 спричиняє зміни, що ведуть до підвищення мембранної проникності, зниження ферментативної активності Na+,K+-АТФ-ази [Нурищенко, 2003]. Підвищення інтенсивності УЗ до 1,0 Вт/см2 призводить до активації перекисного окиснення ліпідів за рахунок неспроможності системи антиоксидантів нейтралізувати дію вільних радикалів. УЗ цієї інтенсивності викликає також перерозподіл окиснених і відновлених форм нікотинамідаденін динуклеотидних та нікотинамідаденін динуклеотидфосфатних коферментів з переважанням окиснених форм [Нурищенко, Островський та ін., 2003], що негативно позначається на перебігу біосинтетичних реакцій.

Результати дослідження свідчать про більш виражену біологічну дію СТУЗ порівняно з традиційним МУЗ як в області стимулюючих (до 0,5 Вт/см2), так і пошкоджуючих (> 1 Вт/см2) інтенсивностей. Якщо врахувати те, що метою застосування низьких інтенсивностей УЗ є стимуляція нормальних фізіологічних реакцій при пошкодженнях та патологічних станах, а високих – контрольоване селективне та сфокусоване знешкодження тканин, то більш виражений ефект СТУЗ можна застосовувати як з nnoпершою ( в діапазоні до 0,5 Вт/см2 ), так і з другою (>1 Вт/см2) ціллю.

Механізми впливу ультразвуку терапевтичних інтенсивностей на розвиток експериментального каррагінанового запалення. Другий етап досліджень був пов’язаний з визначенням механізмів протизапальної дії ультразвуку. Дослідження проводили на класичній моделі експериментального запалення - каррагінан-індукованому набряку кінцівки щурів. Застосування цієї моделі дозволяє оцінити протизапальну дію як фармакологічних препаратів, так і фізичних факторів. Важливими ланцюгами в механізмі розвитку каррагінанового запалення є збільшення продукції вільних радикалів, а також пригнічення антиоксидантного захисту. Це дозволило нам, використовуючи зазначену модель, вивчати як протизапальні властивості ультразвуку, так і механізми дії цього фізичного фактора при запаленні.

Протизапальну дію МУЗ і СТУЗ оцінювали за його здатністю впливати на величину експериментального набряку. Введення каррагінану в лапу щурів викликало розвиток набряку з максимальною величиною через 3 год після ін'єкції флогогену. Одноразове озвучення тварин УЗ обох видів з інтенсивностями 0,1 Вт/см2, 0,2 Вт/см2, 0,5 Вт/см2 не викликало істотних змін каррагінанового набряку кінцівки щурів. Одноразове озвучення з інтенсивністю 1,0 Вт/см2 сприяла збільшенню набряку на 13,3 % і на 18,9 % - через 1 год, на 11,2 % і на 14,6 % - через 2 год, на 5,1 % і на 9,2 % - через 3 год, на 5,2 % і на 8,5 %– через 4 год, на 8,0 % і на 10,3 % - через 12 год, на 10,1 % і на 13,5 % - через 24 год після індукції запалення, відповідно для МУЗ та СТУЗ.

При курсовій дії ультразвук обох режимів також впливав на каррагінан-індукований набряк лапи щурів в залежності від інтенсивності.

МУЗ з інтенсивністю 0,1 Вт/см2 при курсовому застосуванні зменшував розвиток каррагінанового набряку як на ранніх, так і більш пізніх його етапах (рис. 3 ). МУЗ з інтенсивністю 0,2 Вт/см2 також сприяв зменшенню набряку через 2 год, 3 год, 4 год, 12 год. УЗ моночастотного режиму з інтенсивністю 0,5 Вт/см2 через 1 год, 2 год, 3 год, 4 год збільшував величину набряку. Однак через 12 год і 24 год спостерігалось його зменшення. Курсова дія МУЗ з інтенсивністю 1,0 Вт/см2 потенціювала запалення і зсувала пік його розвитку з третьої години на другу. СТУЗ виявився більш діючим для зниження набряку при інтенсивностях 0,1 Вт/см2 і 0,2 Вт/см2. СТУЗ з інтенсивністю 0,5 Вт/см2 викликав збільшення каррагінанового набряку через 2 год і 3 год та трохи знижував його через 12 год і 24 год. СТУЗ з інтенсивністю 1,0 Вт/см2 потенціював розвиток каррагінанового набряку і зсував пік його розвитку з третьої години на другу. Однак через 12 годин величина набряку достовірно не відрізнялась від такої при запаленні.

Рис 3. Вплив моночастотного (А) і стохастичного (Б) ультразвуку різних інтенсивностей на розвиток каррагінанового запалення кінцівки щурів: * - достовірна різниця відносно контролю при р>0,95

З метою визначення механізмів, за якими моночастотний і стохастичний ультразвук модифікують експериментальне запалення, досліджували їх вплив на активність мієлопероксидази (МПО) як маркерного ферменту активності нейтрофілів, вміст малонового діальдегіду, а також вміст одного з основних компонентів антиоксидантного захисту - відновленого глутатіону (ГSH).

Дослідження тканини, взятої з місця набряку на піку його розвитку, показало, що введення флогогену призводило до підвищення рівня малонового діальдегіду в 16,8 разів (p<0,05) порівняно з контролем. Рівень відновленого глутатіону зменшувався в 2,4 рази (p<0,05), а активність мієлопероксидази збільшувалась в 6,2 рази (p<0,05) по відношенню до контрольних значень ( рис. 4-6).

Одноразове озвучення тварин ультразвуком обох режимів з інтенсивностями 0,1 Вт/см2; 0,2 Вт/см2 і 0,5 Вт/см2 істотним чином не впливало на досліджені показники. Під впливом УЗ з інтенсивністю 1,0 Вт/см2 спостерігалось підвищення рівня малонового діальдегіду порівняно