ІНСТИТУТ ОЧНИХ ХВОРОБ І ТКАНИННОЇ ТЕРАПІЇ ІМ. В.П. ФІЛАТОВА АМН УКРАЇНИ

ПАВЛІВ ОЛЕКСАНДРА БОРИСІВНА

УДК 617.711:617.713)-002-06:617.741-004.1616.899]-091-07-08

СИНДРОМ ШЕГРЕНА: ОФТАЛЬМОЛОГІЧНІ, ІМУНОГІСТОХІМІЧНІ ТА ПАТОМОРФОЛОГІЧНІ КРИТЕРІЇ ДІАГНОСТИКИ

14.01.18 - офтальмологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Одеса - 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному медичному університеті

ім. Данила Галицького МОЗ України.

Науковий керівник: кандидат медичних наук, доцент

КОРДОНЕЦЬ Ірина Гаврилівна,

Львівський національний медичний

університет ім. Данила Галицького

МОЗ України, доцент кафедри офтальмології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Бездітко Павло Андрійович,

Харківський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри офтальмології

доктор медичних наук, професор Петруня Андрій Михайлович,

Луганський державний медичний університет МОЗ України, професор кафедри очних хвороб

Провідна установа:

Харківська державна медична академія післядипломної

освіти МОЗ України, кафедра офтальмології, м. Харків

Захист відбудеться “ ___15__” ____квітня___ 2005р. о ___10__ годині на

засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.556.01 в Інституті очних хвороб і тканинної терапії ім. В.П. Філатова АМН України за адресою: 65061, м. Одеса, Французький бульвар, 49/51.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту очних хвороб і тканинної терапії ім. В.П. Філатова АМН України за адресою: 65061, м. Одеса, Французький бульвар, 49/51.

Автореферат розісланий “__15___” ___березня_____________2005р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради, доктор медичних

наук, професор В.С.Пономарчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення патогенезу як первинного, так і вторинного синдрому Шегрена (СШ), визначення основних клінічних та патоморфологічних критеріїв діагностики, опрацювання нових терапевтичних концепцій є однією з актуальних проблем офтальмології (Стерлінг Дж. Вест, 1999; Саrsons S., Harris, 1998; Haga H.-J., 1999; Manthorpe R., Manthorpe T., Theander E., 1999). Це зумовлено тим, що одним з основних проявів СШ є ураження ока – сухий кератокон’юнктивіт (СКК), який може викликати значні пошкодження зорових функцій (Бржеский В.В., Сомов Е.Е., 2002; Marguardt R., Michael A. Lemp, 1991; Messmer E., 2001). Але дуже часто СКК діагностується помилково або на пізніх стадіях, результатом є неправильно підібране лікування, яке малоефективне у цій ситуації або обтяжує клінічну картину. Це пов’язано зі значним поліморфізмом клінічної картини, недостатньою інформованістю практичних офтальмологів щодо спеціальних методів визначення сльозоутворення, неоднозначною інтерпретацією результатів обстеження. Навіть при коректному діагнозі, ефективність лікування СКК при СШ не завжди є достатньою (Kanski J. Jack, 1999; Messmer E., 2001). Проблема є дуже актуальною, оскільки СШ – важке автоімунне захворювання, яке викликає не тільки погіршення якості життя пацієнтів, а може спричинити до інвалідності у найбільш працездатному віці (Коваленко В.Н., Шуба Н.М., 2002; Стерлінг Дж. Вест, 1999).

Відповідно до сучасних поглядів на патогенез СШ, розвиток цієї патології є результатом генетично зумовленої схильності організму до автоімунних порушень у поєднанні з гормональними змінами та чинниками зовнішнього середовища (екологічні порушення, стрес, інфікування вірусами) (Стерлінг Дж. Вест, 1999; Саrsons S., Harris E.K., 1998).

Відомо, що однією з основних ланок розвитку СШ є порушення експресії муцинів у всіх слизових оболонках, зокрема в оці та ротовій порожнині. Тому ряд авторів пропонують проводити поглиблене вивчення експресії муцинів у слизових оболонках різних органів, їх взаємозв’язок та вплив на функціонування муцинового шару, що дає можливість більш цілеспрямовано впливати на патогенетичні процеси виникнення цього захворювання (Hedqvist B., 1999; Hibino S.H. et all., 2000; Jumblatt M.M. et all., 2000; Гут І.Й., 2000).

На даний час відкрито і описано тринадцять типів муцинів (MUC1-MUC12) та очікується відкриття нових (Jumblatt M.M. et all., 2000; Watanabe H, 2000). В оці людини ідентифіковано наступні епітеліальні муцини: MUC1, MUC2, MUC4, MUC5AC, MUC5В та MUC7 (Гут І.Й., 2000; Vujkovic V. et all., 2002). Грунтуючись на структурних особливостях, а також на клітинній локалізації, дані муцини поділяють на дві групи: трансмембранні (MUC1 та MUC4) і секреторні (MUC2, MUC5AC, MUC5В та MUC7) (G. Langer, 2000; Gipson I.K., 2000). MUC1, MUC2, MUC4 експресуються епітеліоцитами кон’юнктиви та рогівки; MUC5AC – келихоподібними клітинами; MUC7 – слізною залозою (Jumblatt M.M. et all., 2000; Watanabe H, 2000).

У ротовій порожнині у нормі виявлено експресію як трансмембранних (MUC1, MUC4), так і секреторних муцинів (MUC5B, MUC7) (Гут І.Й., 2000; Хэм А., Кормак Д., 1982; Bolstad A.I., Nakken B., 1999; Gendler S.J., Spicer A.P., 1995). Встановлено, що при їх недостатності та порушенні співвідношення виникає ксеростомія, характерна ознака СШ (Саrsons S., Harris E.K., 1998; Daniels T.E. et all., Hedqvist B., 1999).

На нинішній день експресія муцинових генів при СШ інтенсивно вивчається на генному, молекулярному, клітинному, патоморфологічному, біологічному рівнях, в експерименті на тваринах (Gipson I.K., 2000; Hibino S.H. et all., 2000; Gamache D.A. et all., 2000).

Аналізуючи дані літератури, ми прийшли до висновку, що вивчення порушення муцинового шару, одного з основних чинників розвитку СШ, має велике теоретичне та практичне значення. Найбільш поширеними проявами СШ є ксероофтальмія та ксеростомія. Тому встановлення закономірностей та взаємодії експресії різних типів муцинів (трансмембранних та секреторних) у кон’юнктиві ока та слизівці порожнини рота залежно від стадії захворювання, ступеня патоморфологічних пошкоджень відкриває одну з важливих сторін патогенезу. На сьогоднішній день не існує єдиних методів діагностики та класифікації, які би чітко уточняли ступінь важкості СКК при СШ. Це свідчить про необхідність розробки нових методологічних підходів до діагностики та уточнення класифікації для визначення стадійності патологічного процесу. Недостатньо патогенетично обгрунтоване лікування СКК при СШ, вимагає розробки нових терапевтичних концепцій. Тому наші дослідження були спрямовані у цих напрямках.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом комплексної теми кафедри офтальмології ФПДО з курсом очних хвороб Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького “Розробка терапевтичних методів лікування запальних захворювань переднього відтинку ока (клініко-експериментальне дослідження)” (№ державної реєстрації 0199 003672). Автор у даній роботі була співвиконавцем.

Мета дослідження: підвищення ефективності діагностики СКК при СШ щляхом визначення імуногістохімічних критеріїв – інтенсивність експресії муцинів різних типів (секреторних і трансмембранних); патоморфологічних (гістологічних та імпресійно-цитологічних) – ступінь дегенеративних змін кон’юнктиви; офтальмологічних – порушення функції сльозоутворення та доповнення класифікації СКК.

Задачі дослідження:

1. Визначити методом імуногістохімії інтенсивність експресії муцинів різного типу (трансмембранних та секреторних) залежно від ступеня дистрофічних змін кон’юнктиви у хворих на синдром Шегрена (від стадії СКК при СШ).

2. Встановити інтенсивність експресії муцинів різного типу (трансмембранних та секреторних) у слизівці порожнини рота залежно від ступеня дистрофічних змін у хворих на синдром Шегрена.

3. На основі отриманих результатів провести порівняльний аналіз експресії муцинів різного типу (трансмембранних та секреторних) у кон’юнктиві ока та слизівці порожнини рота у хворих на синдром Шегрена.

4. Розробити новий ефективний метод діагностики різних стадій сухого кератокон’юнктивіту на основі диференційованого підходу до визначення функції сльозоутворення з використанням методу імпресійної цитології.

5. Доповнити класифікацію сухого кератокон’юнктивіту з використанням об’єктивізації визначення сльозопродукції та патоморфологічних змін методом імпресійної цитології.

6. Запропонувати схему лікування сухого кератокон’юнктивіту залежно від доповненої нами стадійності захворювання.

Об’єкт дослідження: сухий кератокон’юнктивіт при синдромі Шегрена.

Предмет дослідження: експресія муцинів різного типу (трансмембранних та секреторних) у кон’юнктиві та слизівці порожнини рота; гістологічні та гістохімічні обстеження біоптатів кон’юнктиви та слизівки порожнини рота; імпресійно-цитологічні відбитки епітелію кон’юнктиви; дослідження функції сльозоутворення; стадійність сухого кератокон’юнктивіту при синдромі Шегрена.

Методи дослідження: стандартні діагностичні тести для визначення сльозоутворення (модифікований тест Шірмера, проба Норна, ліпідінтерференція за методикою Мак-Дональда, тест з бенгальським рожевим за бальною системою ван Бийстервельда, тест з флюоресцеїном за бальною системою Норна); рутинні гістологічні методики фарбування гематоксилином та еозином; гістохімічні методики фарбування алціаново-блакитним та ШИК-реакція; імуногістохімічні методики з використанням моноклональних антитіл до муцинів різного типу (трансмембранних та секреторних).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше методом імуногістохімії виявлена закономірність експресії різних типів муцинів (трансмембранних та секреторних) у кон’юнктиві ока хворих на синдром Шегрена, яка полягає у значному їх зменшенні або повній відсутності, що викликає порушення утворення муцинового шару.

Доповнені знання про стадійність дистрофічних змін кон’юнктиви при синдромі Шегрена на основі гістологічних та імпресійно-цитологічних методів, які полягають у зміні структури епітеліоцитів (пікнотизація ядра, гідропічна дистрофія цитоплазми, порушення латерального з’єднання між клітинами до повної деструкції), значному зменшенні або повній відсутності келихоподібних клітин, наявності інтенсивного, дифузного інфільтрату субепітеліально.

Вперше виявлено, що у слизівці порожнини рота при синдромі Шегрена відбуваються аналогічні дистрофічні зміни епітеліальних клітин та слинних залоз, а також субепітеліально, що викликає зниження або повну відсутність експресії як секреторних, так і трансмембранних муцинів.

Практичне значення одержаних результатів. Запропоновано комплекс стандартних діагностичних тестів у визначеній послідовності для діагностики сухого кератокон’юнктивіту (ефективність 85%), який полягає у визначенні ліпідінтерференції за методикою Мак-Дональда, складок кон’юнктиви у нижньо-темпоральному квадранті, слізного меніска, проби Норна, проведенні тестів з бенгальським рожевим за бальною системою ван Бийстервельда та з флюоресцеїном за бальною системою Норна, модифікованої проби Шірмера, імпресійної цитології (свідоцтво про реєстрацію авторського права на твір №7121 від 12.02.2003).

Інформативно-діагностичним тестом важкості клінічного перебігу сухого кератокон’юнктивіту, а також прогнозу його розвитку є порушення утворення муцинового шару за рахунок зменшення або повної відсутності експресії як секреторних, так і трансмембранних муцинів, що виявлено у 85% обстежених хворих на синдром Шегрена за допомогою проби Норна та тесту з бенгальським рожевим за бальною системою ван Бийстервельда.

Запропоновано застосовувати імпресійну цитологію, як об’єктивний метод виявлення морфологічних змін епітелію кон’юнктиви, який відображає ступінь дистрофічних порушень у 76,7% хворих на синдром Шегрена, а також для контролю ефективності проведеної терапії.

Пропонується проводити дослідження біоптатів слизівки порожнини рота як доступний інформативно-діагностичний тест у 80% хворих на синдром Шегрена, який є менш травматичний порівняно з біопсією кон’юнктиви.

Доповнено класифікацію сухого кератокон’юнктивіту (Brewitt та ін.,2002) індексом ”сухого ока”, що дало можливість об’єктивізувати визначення сльозопродукції та патоморфологічних змін методом імпресійної цитології у 90% обстежених хворих.

Запропонована схема лікування сухого кератокон’юнктивіту при синдромі Шегрена залежно від уточненої нами стадійності захворювання, яка полягає у застосуванні при І стадії – монотерапії низьковіскозних замінників сльози не більше 4 разів у день, а при ІІ та ІІІ стадіях у комбінації низьковіскозної та високовіскозної штучних сліз на фоні регенеруючої та магнітотерапії, причому при ІІа стадії – інстиляції до 6 разів за день, при ІІб – до 8 разів за день та при потребі, при ІІІ – до 10 разів за день та при потребі (коливання ефективності терапії 60-85%).

Впроваджений метод імуногістохімічного визначення експресії муцинів у кон’юнктиві ока та слизівці порожнини рота при синдромі Шегрена використовується у Львівському обласному патологоанатомічному бюро, а метод імпресійно-цитологічного дослідження відбитків кон’юнктиви – в очному відділенні та у центральній клініко-діагностичній лабораторії Львівської обласної клінічної лікарні. Запропонований комплекс стандартних діагностичних тестів у визначеній послідовності для діагностики сухого кератокон’юнктивіту застосовується в очному відділенні Львівської обласної клінічної лікарні.

Основні наукові та практичні положення роботи включені в програму лекцій та практичних занять лікарів-інтернів та курсантів кафедри офтальмології факультету післядипломної освіти Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно вибрано тему, обсяг та мету дослідження, сформульовано завдання та обгрунтовано методи дослідження. Методологічну побудову дисертації визначив науковий керівник роботи, к.мед.н., доц. Кордонець І.Г. Клініко-діагностичні обстеження та лікування 60 хворих на синдром Шегрена дисертантка провела самостійно на базі очного та ревматологічного відділень Львівської обласної клінічної лікарні. Всі хворі за скеруванням дисертантки проконсультовані стоматологом у Львівській обласній стоматологічній поліклініці. Імуногістохімічне визначення експресії муцинів у кон’юнктиві ока та слизівці порожнини рота (50 досліджень) проведено на базі лабораторії імуногістохімії та аналізу зображень НПЦ “Медичні технології” (м.Дніпрoпетровськ) при консультаціях завідуючого лабораторією, к.б.н. Лизогубова В.В. та лікаря Брістольського Універститету (Велика Британія), к.б.н., Гут І.Й., патоморфологічні (гістологічні та гістохімічні) обстеження 50 біоптатів – на кафедрі патологічної анатомії Львівського національного медичного універститету ім. Данила Галицького при консультаціях з асистентом кафедри, к.мед.н. Серветник М.І, імпресійно-цитологічні (120 відбитків кон’юнктиви) – у центральній клініко-діагностичній лабораторії Львівської обласної клінічної лікарні при консультаціях з проф. А. Ведріхом та доктором Й.Непп (університетська клініка очних хвороб та оптометрії, м. Відень, Австрія). Самостійно здобувач провела аналіз одержаних результатів, написала всі розділи дисертації та сформулювала висновки.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації викладені та обговорені на засіданні Львівського (1998, 1999, 2002, 2004) та Донецького (2002) обласних офтальмологічних товариств, на ІІ та ІV Українсько-Польських конференціях з офтальмології (Трускавець, 1999; Київ, 2003), VІІІ конгресі Світової федерації українських лікарських товариств (СФУЛТ) (Львів, 2000), міжобласних науково-практичних конференціях “Актуальні проблеми офтальмології” (Дніпропетровськ, 2002; Ужгород, 2004), науковому семінарі “Синдром сухого глаза – актуальные вопросы диагностики и лечения” (Київ, 2003; Харків, 2003, 2004; Дніпропетровськ 2004), на засіданні австрійського офтальмологічного товариства (Альпбах, Тіроль, 2004).

Публікації. Основні результати дисертаційної роботи опубліковані у 12 наукових роботах, які повною мірою відображають зміст роботи і отримані автором результати. З них 5 статей у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 7 робіт – у матеріалах конференцій та з’їздів.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена українською мовою на 161 сторінці комп’ютерного тексту. Складається із вступу, 3 розділів, аналізу і узагальнення результатів дослідження, висновків і списку використаних джерел. Проілюстрована 26 таблицями і 41 малюнком, що розміщені в тексті роботи. Список використаних джерел містить 176 найменувань на 30 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У роботі наведено результати клінічних, клініко-лабораторних, патоморфологічних та імуногістохімічних досліджень 60 хворих з СШ: 27 (45%) – з первинним, 33 (55%) – з вторинним СШ, із них 25 (42%) пацієнтів – з ревматоїдним артритом, 5 (8%) – з системною склеродермією, 3 (5%) – з системним червоним вовчаком. Діагноз первинного або вторинного СШ був встановлений ревматологом за клінічною картиною, результатами імунологічних обстежень, а також на основі встановлення офтальмологом діагнозу сухого кератокон’юнктивіту та стоматологом ксеростомії.

Серед обстежених було 58 жінок (96,7%) та 2 мужчини (3,3%) віком від 40 до 70 років. Тривалість захворювання СШ становила від 1 до 20 років, в основному до 5 років (56%). Із 120 очей початкова (І) стадія СКК була встановлена у 20 (16,7%), виражена (ІІ ст.) – у 80 (66,7%), причому легка форма (ІІа ст.) – у 38 (31,7%) та важка (ІІб ст.) – у 42 (35%), а пізня (ІІІ ст.) – у 20 (16,7%) очах.

Для встановлення діагнозу та стадії СКК проведені спеціальні офтальмологічні обстеження для оцінки сльозопродукції, які характеризують кожний з трьох шарів слізної плівки (СП):

І. Муциновий шар: час розірвання слізної плівки (ЧРСП) – проба Норна; тест з бенгальським рожевим (БР) за бальною системою ван Бийстервельда.

ІІ. Ліпідний шар: ліпідінтерференція (ЛІФ) за методикою Мак-Дональда.

ІІІ. Водний шар: модифікований тест Шірмера І (ТШ І); біомікроскопічна оцінка слізного меніску (СМ).

IV. Загальні ознаки: скарги пацієнта; тест з флюоресцеїном (ФЛ) за бальною системою Норна; біомікроскопічне визначення складок кон’юнктиви у нижньо-темпоральному квадранті.

Для підтвердження діагнозу та встановлення стадійності патологічного процесу було проведено імуногістохімічне, гістохімічне та гістологічне дослідження 20 біоптатів кон’юнктиви, а також слизівки порожнини рота (20 біоптатів) при СШ. Імпресійна цитологія кон’юнктиви (ІЦ) проводилась за методикою Kruse F.E. (1985) у 30 пацієнтів (60 очей). Імуногістохімічне дослідження проводилось згідно стандартного протоколу, для визначення експресії муцинів було використано антитіла до трансмембранного муцину 1 та секреторного муцину 5АС. Кількість муцинів оцінювали за напівкількісною методикою: 0 балів – відсутність забарвлення, 1 – слабке та вогнищеве, 2 – слабке або вогнищеве, 3 – інтенсивне та дифузне. З метою стандартного гістологічного дослідження отримані тканинні зрізи фарбували гематоксилін-еозином, алціаново-голубим та ШИК-реакція.

На основі отриманих результатів було створено комп’ютерні бази даних за допомогою електронних таблиць Excel 97, які було опрацьовано за допомогою пакету статистичних програм STATISTICA for Windows 5.0 з визначенням критерію Манн-Вітні та Тьюкі.

При визначенні стану сльозопродукції хворих на СШ, дослідженні імуногістохімічних та патоморфологічних біоптатів кон’юнктиви та слизівки порожнина рота встановлено наступне.

Оцінка скарг пацієнтів у балах сухості дала можливість виявити закономірність: при І стадії – відсутні у 4 (6,7%) та незначні у 6 (10%) пацієнтів (0 або 1 бал сухості); при ІІа – в основному помірні (2 бали) у 12 (20%) та сильні у 6 (10%); при ІІб – сильні (3 бали) у 18 (30%) та у 3 (5%) дуже виражені (4 бали), при ІІІ – сильні у 4 (6,7%) та дуже виражені у 6 (10%). Найчастіше спостерігалось відчуття сухості та стороннього тіла, печія, почервоніння, білі або прозорі виділення (від 80% до 90%), рідше – свербіж, “плач без сліз”, важкість повік, погана переносимість диму, вітру та ін. екзогенних факторів (від 25% до 35%).

Для визначення водного шару СП використовували модифікований тест Шірмера (1903) – тест Шірмера І (ТШ І) без анестезії із закритими очима (основна і рефлекторна сльозопродукція) (1950). За норму вважали ТШ І ? 10 мм/5хв. У хворих з СШ функціональна активність всіх слізних залоз значно понижена: І стадія СКК – 6±0,1 (мм/5хв); ІІа – 3,0±0,5 (мм/5хв); ІІб – 1,1±0,4 (мм/5хв); ІІІ – 0,1± 0,1 (мм/5хв) (різниця достовірна при порівнянні ІІІ стадії з І та ІІа стадіями, критерій Тьюкі р<0.05).

Про водний шар свідчить також біомікроскопічне визначення слізного меніску (СМ). У 84 очах (70%) спостерігалось витончення, нерегулярність СМ або його відсутність, найчастіше у темпоральній частині, тільки у 36 очах (30%) – у межах норми.

Діагностичним критерієм порушення стабільності СП використовувався показник ЧРСП – проба Норна (1969), норма 10 с і більше. У всіх хворих з СШ цей показник був значно понижений залежно від стадії СКК: І стадія - 6±0,3 с; ІІа – 4,9±0,6 с ; ІІб – 2,8±0,5 с; ІІІ – 1,6±0,4 с (різниця достовірна при порівнянні І та ІІа стадій з ІІб та ІІІ, критерій Тьюкі р<0.05).

Для визначення стану муцинового шару СП або зовнішньої епітеліальної мембрани застосовували тест з БР за бальною системою ван Бийстервельда, де максимальне число фарбування становить 9 балів (1969). Результати обстеження хворих на СШ підтвердили правило S.C.G.Tseng (1994): найчастіше фарбувалась кон’юнктива та рогівка у межах відкритої очної щілини у так званій експонованій зоні поверхні очного яблука (100 очей – 83,3%). Так, при І ст. цей показник становив 2,0±0,1 балів; при ІІа ст. – 3,9±0,4 бали; при ІІб ст. – 4,5±0,2 бали; при ІІ ст. – 6,8±0,5 бали (різниця достовірна при порівнянні ІІІ стадіїї з І та ІІ, критерій Тьюкі р<0.05).

Про ступінь епітеліопатії, яка виникає у результаті порушення всіх шарів СП, свідчить тест з ФЛ за бальною системою Норна (1969), де максимальна кількість балів – 15. Так, при І стадії – 0,9±0,1 балів, при ІІа стадії – 2,2±0,6 балів, при ІІб – 6,1±0,6 та ІІІ – від 8,7±1,4 балів (різниця достовірна при порівнянні ІІІ стадії з І та ІІ, критерій Тьюкі р0.05).

Дистрофічні зміни епітеліальних клітин кон’юнктиви у хворих на СШ підтверджені біомікроскопічним визначенням складок кон’юнктиви у нижньо-темпоральному квадранті та їх бальною оцінкою, запропонованою Hoh H. та ін. (1995): тільки у 20 очах (16,7%) не виявлено складок кон’юнктиви (0 балів); при І стадії виявлені складки тільки в 1 бал – 10 очей (8,3 %); при ІІа стадії 1 бал – 14 очей (11,7 %), 2 бали – 20 (16,7 %), 3 бали – 4 (3,3 %); при ІІб стадії 1 бал – 6 очей (5 %), 2 бали – 14 (11,7 %), 3 бали – 22 (18,3 %); при ІІІ стадії 1 бал – 2 ока (1,7 %), 2 бали – 4 (3,3 %), 3 бали – 12 (10 %) (різниця достовірна при порівнянні ІІІ та ІІб стадій з І та ІІа стадіями, критерій Тьюкі р0.05).

При СШ значно порушується ліпідний шар, про що свідчать результати визначення ліпідінтерференції (ЛІФ) за методикою Мак-Дональда (1969). З 120 хворих з СШ у 84 (70%) цей показник був патологічним – 1 бал сухості, у 36 (30%) – у межах норми, тобто 0 балів сухості. Максимально (на 7/8) очну щілину необхідно було звужувати при ІІб та ІІІ стадії СКК.

На основі проведених досліджень розроблена система оцінки клінічних та морфологічних ознак СКК, що знайшло відображення в уніфікованій карті первинного огляду таких хворих (свідоцтво про реєстрацію авторського права на твір №7121 від 12.02.2003). У 51 пацієнта (102 ока) (85%) встановлено ефективність запропонованого комплексу стандартних діагностичних тестів у визначеній послідовності: ліпідінтерференція за методикою Мак-Дональда, біомікроскопічне визначення складок кон’юнктиви у нижньо-темпоральному квадранті та слізного меніска, проба Норна, тест з БР за бальною системою ван Бийстервельда, тест з ФЛ за бальною системою Норна, модифікована проба Шірмера, імпресійна цитологія. При цьому проба Норна та тест з БР у 85% обстежених (102 ока) є важливим інформативно-діагностичним тестом визначення порушення утворення муцинового шару.

Результати проведених обстежень вираховували у балах сухості: скарги від 0 до 4 балів, ТШ І 0–3 бали, ЧРСП – 0–2 , ЛІФ – 0 або 1 бал, фарбування ФЛ 0–3, БР 0–2 та ІЦ 0–2 бали, на основі чого визначили індекс „сухого ока” від 0 до +1 (Й. Непп та ін., 2000), де 0 балів – відсутні клінічні прояви СКК; +1 – максимально виражені. Класифікацію клінічної картини СКК за Brewitt та ін. (1997) доповнили значенням індексу “сухого ока”, який запропонували поділити відповідно до стадій: до 0,3 – І стадія (початкова); 0,3-0,5 – ІІа стадія (виражена – легка форма); 0,5-0,8 – ІІб стадія (виражена – важка форма); 0,8-1,0 – ІІІ стадія (пізня). За допомогою доповнення цієї класифікації клінічні прояви важкості СКК були оцінені найбільш повно у 90% (108 очей). Із 60 хворих на СШ початкова (І) стадія СКК була встановлена у 10 (16,7%), виражена (ІІ ст.) – у 40 (66,7%), причому легка форма (ІІа ст.) – у 19 (31,7%) та важка (ІІб ст.) – у 21 (35%), а пізня (ІІІ ст.) – у 10 (16,7%) пацієнтів.

Клінічні дані підтверджені імуногістохімічними, гістологічними та імпресійно-цитологічними дослідженнями.

При імуногістохімічному дослідженні 5 біоптатів нормальної, неураженої кон’юнктиви спостерігалась експресія антигенних детермінант трансмембранного муцину 1 у всіх клітинах епітеліального пласту у вигляді надзвичайно дрібних, внутрішньоцитоплазматичних включень коричневого забарвлення (позитивний результат імуногістохімічного дослідження – 2-3 бали), розташованих переважно по периферійній частині цитоплазми, ближче до плазматичної мембрани. Більшої інтенсивності та однорідності експресія епітопів трансмембранного муцину 1 набуває в епітеліоцитах середньої та верхньої третини пласту (3 бали) порівняно з клітинами базальної зони (2 бали), що зумовлює фіксацію мукози до апікальної поверхні епітеліальних клітин, рівномірне поширення мукозного гелю на поверхні кон’юнктивального епітелію та стабілізацію слизового шару.

У слизопродукуючих келихоподібних клітинах, які розташовані поміж епітеліоцитами, ми не спостерігали реакції взаємодії з антигенними детермінантами муцину 1 (0 балів), оскільки ці клітини не синтезують трансмембранних муцинів. Зате у келихоподібних клітинах виявлено виражену реакцію взаємодії з антигенними детермінантами муцину 5АС (3 бали), так як секреторний муцин синтезується цими клітинами, нагромаджується у їх цитоплазмі, а згодом виділяється на поверхню епітеліального пласту, зволожує поверхню очного яблука та сприяє взаємозв’язку між епітеліоцитами і СП. У межах самого епітеліального пласту кон’юнктиви реакція з моноклональними тілами до епітопів муцину 5АС відсутня (0 балів).

Нами вперше проведено імуногістохічне визначення експресії муцинів у 20 хворих (20 очей) з різними стадіями СКК при СШ (досліджували по 5 біоптатів з кожної стадії), яке показало при початковій стадії незначне зменшення трансмембранного (2 бали) та відсутність (0 балів) або незначну кількість (1 бал) секреторного муцину. Очевидно достатня кількість трансмембранного муцину при початковій стадії частково компенсує значне зменшення секреторного, тому муциновий шар порушується незначно, про що свідчать результати функціональних проб та легкий ступінь важкості протікання патологічного процесу.

При кожній наступній стадії порівнянно з початковою виявлено прогресивне зменшення трансмембранного муцину: при ІІа – 1 бал; ІІб – 1 або 0 балів; ІІІ – 0 балів та відсутність секреторного – 0 балів (табл. 1, 2).

Таблиця 1

Експресія трансмембранного муцину 1 в нормі та залежно від стадії СКК

Кількість обстежень (n=21) | 0 балів | 1 бал | 2 бали | 3 бали | Контроль (n=9) | 0 | 0 | 0 | 5 | СКК (n=12) | 8 (ІІб, ІІІ стадії) | 8 (І, ІІа, ІІб стадії) | 4 (І стадія) | 0 | p<0.05, критерій Манн-Вітні

Таблиця 2

Експресія секреторного муцину 5АС в нормі та залежно від стадії СКК

Кількість обстежень (n=21) | 0 балів | 1 балів | 2 бали | 3 бали | Контроль (n=9) | 0 | 0 | 0 | 5 | СКК (n=12) | 18 (ІІ та ІІІ стадії) | 2 (І стадія) | 0 | 0 | p<0.05, критерій Манн-Вітні

Таким чином, спостерігається достовірна відмінність за кількістю як муцину 1 та муцину 5АС між хворими з СКК та контрольною групою (p<0.05, критерій Манн-Вітні). Така закономірність експресії як трансмембранних, так і секреторних муцинів викликає значне порушення або повну відсутність муцинового шару, що підтверджують результати визначення сльозоутворення.

Зменшення або відсутність продукції муцинів при СКК зумовлюється глибокими альтеративними змі-нами багатошарового плоского епітелію, які прогресивно збільшуються при кожній наступній стадії захворювання, що підтверджено нами гістологічно та методом ІЦ. Так, при дослідженні 20 біоптатів хворих з СШ виявлено, що епітеліоцити у всіх відділах пласту стають практично мономорфними, спостерігається гідропічна дистрофія цитоплазми та пікнотизація ядра, зміню-ється ядерно-цитоплазматичне співвідношення від 1:2 до 1:6 та більше. Ядра в таких видозмінених епітеліоцитах в зв’язку з пікнозом можуть набувати патологічної, змієподібної форми, так звані, “snakes”. Кількість келихоподібних клітин або різко зменшується, або вони не виявляються зовсім.

У сполучній тканині, розташованій субепітеліально, виявляється інтенсивний, дифузний інфільтрат, який складається з переважаючої кількості лімфоцитів, варіабельного числа плазматичних клітин та гістіоцитів. Інфільтрат проявляє значний епітеліотропізм – має властивість розповсюджуватися не тільки в межах сполучної тканини, але й поширюватись майже до поверхневих відділів багатошарового плоского епітелію, пошкоджуючи при цьому епітеліоцити та викликаючи альтеративні зміни в келихоподібних клітинах.

При імпресійно-цитологічному дослідженні у контрольній групі (20 очей) виявлено монопласт круглих або полігональних епітеліальних клітин, латерально з’єднаних між собою. Ядра цих клітин зафарбовані гомогенно, базофільно, темніше порівняно з блідою прозорою цитоплазмою та мають овальну форму. Співвідношення ядра до цитоплазми становить приблизно 1:1 до 1:2. Між поверхневими епітеліальними клітинами групами розташовані слизопродукуючі клітини, зафарбовані періодною кислотою та реагентом Шиффа в червоно-фіолетовий колір (ШИК-позитивні) – келихоподібні, які значно більші від епітеліальних та мають келихоподібну форму.

При імпресійно-цитологічному обстеженні 120 відбитків кон’юнктиви (60 очей по 2 відбитки на кожному оці у верхньому та назальному квадрантах) виявлені аналогічні альтеративні зміни, як при гістологічному дослідженні. На підставі одержаних даних проведений аналіз дистрофічних змін епітеліальних клітин згідно запропонованої нами бальної градації, де максимальний ступінь дистрофії становить 11: 0 балів – норма, від 1 до 4 балів – слабовиражений (стадія 1 – 0 балів сухості), від 5 до 7 балів – середньовиражений (стадія 2 – 1 бал сухості), від 8 до 11 – важкий ступінь дистрофії кон’юнктиви (стадія 3 – 2 бали сухості). За даними ІЦ показник дистрофії в обстежених хворих становив при І ст. 2,0±0,3 бали; ІІа ст. – 5,2±0,5 бали; ІІб ст. – 6,5±0,6 бали; ІІІ ст. – 10,3±0,4 бали (різниця достовірна при порівнянні ІІІ стадії з ІІ та І, критерій Тьюкі p<0.05). У 6 (20%) обстежених хворих встановлено легку, у 14 (46,6%) – середньовиражену, у 10 (33,4%) – важку форму дистрофії. За допомогою імпресійної цитології виявлені дистрофічні порушення у 76,7% (46 очей).

Встановлення морфологічних змін кон’юнктиви при СШ має велике діагностичне значення, так як вони можуть бути виявлені задовго до зниження кількості виділеної сльози. Для того, щоб запальний клітинний інфільтрат, розташований субепітеліально, зруйнував епітеліальні та келихоподібні клітини настільки, щоб зменшилося вироблення сльози, потрібен час, а за допомогою біопсії можна вже на ранніх стадіях захворювання виявити їх лімфоцитарну інфільтрацію та дистрофічні зміни.

При СШ спостерігається порушення муцинового шару у слизових оболонках різних органів, зокрема у ротовій порожнині, сухість якої є одним з основних проявів даного захворювання. При обстеженні стоматологом ксеростомія виявлена у 35 пацієнтів: 1 стадія – 12 (20%), 2 стадія – 21 (35%), 3 стадія – 9 (15%); у 18 хворих (30%) ознак сухості не було.

Нами проведено імуногістохімічне та гістологічне дослідження 25 біоптатів слизової порожнини рота (5 – норма, 20 – хворі на СШ).

При обстеженні 5 біоптатів незміненої ротової порожнини методом імуногістохімії виявлено експресію трансмембранного муцину 1 в усіх епітеліальних клітинах вздовж внутрішньої поверхні плазматичної мембрани у вигляді суцільної темно-коричневої облямівки (3 бали), подібно до продукції в епітеліоцитах кон’юнктиви. Експресія MUC 5АС не спостерігається (0 балів), що зумовлено відсутністю келихоподібних клітин серед епітеліоцитів нормального багатошарового епітеліального пласту слизівки рота. При гістохімічному дослідженні у цитоплазмі ацинарних епітеліоцитів малих слинних залоз виявлено депозити муцинів, що містили як нейтральні, так і кислі мукополісахариди – секреторний муцин 5АВ (3 бали), аналогічно до процесів у келихоподібних клітинах кон’юнктиви.

Морфологічні зміни у ротовій порожнині при СШ були однотипними та корелювали із стадіями перебігу захворювання: наростання дистрофічних змін епітеліальних клітин при кожній наступній стадії, при вираженій ксеростомії – їх атрофія та некроз, поява фокального папільозу, поодиноких інтраепітеліальних судин дрібного калібру та лімфоцитів, у малих слинних залозах спостерігались подібні зміни, але більш яскраво виражені, у підлеглих субепітеліальних зонах виявлено лімфоцитарну інфільтрацію та інтерстиційний набряк. Секреторна активність збережених залозистих клітин на початкових стадіях захворювання залишалась помірною, а при виражених стадіях – відсутня. Особливої інтенсивності вищезазначені морфологічні зміни набували при ІІІ стадії захворювання. Методом імуногістохімії виявлено, що дистрофічні зміни у порожнині рота викликають порушення утворення муцинового шару за рахунок зменшення експресії або повної відсутності як секреторних (1 або 0 балів), так і трансмембранних муцинів (від 0 до 2 балів) залежно від стадії захворювання, у результаті чого виникає ксеростомія.

Показано, що дослідження біоптатів слизівки порожнини рота при СШ є доступним інформативно-діагностичним тестом, менш травматичним методом порівняно з біопсією кон’юнктиви у 28 хворих з ксеростомією (80%) при синдромі Шегрена. Тому доцільно його застосовувати для діагностики СШ у повсякденній практиці.

Оскільки СШ є автоімунним захворюванням, необхідно проводити комплексне патогенетично обгрунтоване лікування. На основі аналізу проведених досліджень запропонована схема лікування сухого кератокон’юнктивіту при синдромі Шегрена залежно від уточненої нами стадійності захворювання (з коливанням ефективності від 60 до 85%), яка полягає у застосуванні при І стадії – монотерапії низьковіскозних замінників сльози не більше 4 разів у день, а при ІІ та ІІІ стадіях у комбінації низьковіскозної та високовіскозної штучних сліз на фоні регенеруючої та магнітотерапії, причому при ІІа стадії – інстиляції штучних сліз до 6 разів за день, при ІІб – до 8 разів за день та при потребі, при ІІІ – до 10 разів за день та при потребі.

ВИСНОВКИ

1. Сухий кератокон’юнктивіт є розповсюдженим захворюванням переднього відтинку ока, до 12% хворих офтальмологічного профілю віком до 40 років та понад 67% після 50 років мають ознаки цього захворювання, яке у важких випадках, в першу чергу при cиндромі Шегрена, можуть привести до значних пошкоджень зорових функцій. Так як порушення муцинового шару відіграє важливу роль у патогенезі синдрому Шегрена, подальше вивчення його ролі та критеріїв діагностики має актуальне значення для клінічної офтальмології.

2. Вперше методом імуногістохімії у кон’юнктиві ока хворих на синдром Шегрена виявлено порушення муцинового шару за рахунок зменшення або повної відсутності експресії муцинів різних типів (трансмембранних та секреторних), яка за 3-бальною шкалою становить: а) трансмембранний при І стадії – 2 бали, ІІа – 1 бал, ІІб – 1 або 0 балів, ІІІ – 0 балів; б) секреторний – при І стадії – 1 або 0 балів, при наступних стадіях – 0 балів.

3. Доповнені знання про стадійність дистрофічних змін кон’юнктиви при синдромі Шегрена на основі гістологічних та імпресійно-цитологічних методів, які полягають у зміні структури епіталіоцитів (пікнотизації ядра, гідропічній дистрофії цитоплазми, порушенні латерального з’єднання між клітинами до повної їх деструкції), у значному зменшенні або повній відсутності келихоподібних клітин, наявності інтенсивного, дифузного інфільтрату субепітеліально та викликають порушення утворення муцинового шару.

4. Вперше виявлено, що у слизівці порожнини рота при синдромі Шегрена відбуваються аналогічні дистрофічні зміни епітеліальних клітин та слинних залоз, що зумовлює зниження або повну відсутність експресії як секреторних, так і трансмембранних муцинів.

5. Запропоновано комплекс стандартних діагностичних тестів у визначеній послідовності для діагностики сухого кератокон’юнктивіту (ефективність 85%), який полягає у визначенні ліпідінтерференції за методикою Мак-Дональда, складок кон’юнктиви у нижньо-темпоральному квадранті, слізного меніска, проби Норна, тесту з бенгальським рожевим за бальною системою ван Бийстервельда, тесту з флюоресцеїном за бальною системою Норна, модифікованій пробі Шірмера та проведенні імпресійної цитології (свідоцтво про реєстрацію авторського права на твір №7121 від 12.02.2003).

6. Пропонується об’єктивний метод виявлення морфологічних змін епітелію кон’юнктиви – імпресійну цитологію, за допомогою якої виявлені дистрофічні порушення у 76,7% хворих на синдром Шегрена по запропонованій 11-бальній градації: 0 балів – норма, до 4 балів – слабо виражений, 5-7 балів – середньо виражений, 8-11 балів – важкий ступінь дистрофії.

7. Рекомендовано проводити дослідження біоптатів слизівки порожнини рота як доступний інформативно-діагностичний тест (80%) при синдромі Шегрена, який є менш травматичний порівняно з біопсією кон’юнктиви.

8. Найбільш повно клінічні прояви важкості сухого кератокон’юнктивіту (90%) характеризуються шляхом використання індексу ”сухого ока”: до 0,3 – І стадія (початкова); 0,3-0,5 – ІІа стадія (виражена – легка форма); 0,5-0,8 – ІІб стадія (виражена – важка форма); 0,8-1,0 – ІІІ стадія (пізня).

9. Запропонована схема лікування сухого кератокон’юнктивіту при синдромі Шегрена залежно від уточненої нами стадійності захворювання (з коливанням ефективності від 60 до 85%), яка полягає у застосуванні при І стадії – монотерапії низьковіскозних замінників сльози не більше 4 разів у день, а при ІІ та ІІІ стадіях у поєднанні низьковіскозної та високовіскозної штучних сліз на фоні регенеруючої та магнітотерапії, причому при ІІа стадії – до 6 разів за день, при ІІб – до 8 разів за день та при потребі, при ІІІ – до 10 разів за день та при потребі.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гут І.Й., Еллінгем Р., Істі Д., Павлів О.Б., Кордонець І.Г.,Семенова Г.С. Дослідження експресії трансмембранного муцину (MUC1) в кон’юнктиві ока людини методом гібридизації in situ // Офтальмол. журн. – 2001. – №2. – С.71-75.

2. Павлів О.Б. Імпресійна цитологія в діагностиці сухого кератокон’юн-

ктивіту при синдромі Сьєгрена // Офтальмол. журн. – №5. – 2002. – С. 16-21.

3. Павлів О.Б. Алгоритми діагностики сухого кератокон’юнктивіту // Львівський медичний часопис. – 2003. – №3. – Т. ІХ. – С.10-13.

4. Павлів О. Б. Закономірності експресії секреторного муцину 5АС в кон’юнктиві ока у хворих на сухий кератокон’юнктивіт при синдромі Шегрена // Практична медицина. – 2003. – №5. – Т. ІХ. – С. 37-41.

5. Павлів О. Б. Закономірності експресії трансмембранного муцину 1 в кон’юнктиві ока у хворих на сухий кератокон’юнктивіт при синдромі Шегрена // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. – 2004. – №1 (25). – С. 13-19.

6. Гут І.Й., Еллінгем