АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ

БЕРЕЖНА Лідія Григорівна

УДК 615.9: 615.281

РОЛЬ ІНДУКЦІЇ ЦИТОХРОМУ Р-450 2Е1 В ПАТОГЕНЕЗІ ГЕПАТОТОКСИЧНОСТІ ІЗОНІАЗИДУ

14.03.06 – токсикологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в |

Інституті фармакології та токсикології АМН України

Науковий керівник | - доктор біологічних наук, професор КОВАЛЕНКО Валентина Миколаївна, Інститут фармакології та токсикології АМН України, завідувач відділом загальної токсикології

Офіційні опоненти | - доктор медичних наук ЛІТВІНОВА Надія Володимирівна, Інституті фармакології та токсикології АМН України, головний науковий співробітник відділу біохімічної фармакології

- доктор біологічних наук ЛЕОНЕНКО Ольга Броніславівна, Інститут медицини праці АМН України, провідний науковий співробітник лабораторії медико-біологічних критеріїв виробничих впливів

Провідна установа | Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя МОЗ України

Захист дисертації відбудеться 11.10.2006 р. о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14).

Автореферат розісланий 09.09.2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

Д 26.550.01

кандидат біологічних наук І.В. Данова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження останніх десятиріч показали, що система цитохромів Р-450 печінки відіграє провідну роль у біотрансформації великої кількості хімічних речовин як ендогенного, так і екзогенного походження. В результаті реакцій за участі монооксигеназної системи досить часто утворюються високореактивні токсичні інтермедіати, які не знешкоджуються в реакціях кон’югації у другій фазі метаболізму. Це є причиною пошкодження печінки за дії значної кількості ксенобіотиків, що піддаються біотрансформації із залученням цитохрому Р-450 [D.P. Josephy, P.F. Guengerich, J.O. Miners, 2005].

З огляду на високу індуцибельність, важлива роль в механізмах токсичної дії речовин на печінку належить етаноліндукованій ізоформі цитохромів – цитохрому Р-450 2Е1 (CYP 2E1) [G. Ekstrom, M. Ingelman-Sundberg, 1999]. За його участі відбувається біотрансформація ряду низькомолекулярних речовин, що належать до класів спиртів, альдегідів, кетонів, багатьох ароматичних сполук, включаючи фармакологічні засоби - парацетамол, хлорзоксазон, теофілін та ін. При цьому утворюються, здебільшого, реакційноздатні метаболіти, які взаємодіють з макромолекулами гепатоцитів, викликаючи різноманітні порушення їх структури та функціонування [S. Zhou et al., 2005]. Крім того відомо, що активація CYP 2E1 супроводжується утворенням активних форм кисню, здатних призводити до модифікації структури макромолекул та стимулювати перекисне окиснення ліпідів [S. Tafazoli, D.D. Spehar, P.J. O'Brien, 2005].

Існує припущення, що до індукторів CYP 2E1 належить ізоніазид - гідразид ізонікотинової кислоти – фармакологічний засіб, який широко застосовується для профілактики та лікування туберкульозу [T.V. Brody, J. Larner, K.P. Minnevan, 1998]. Встановлено, що у 10-20 % пацієнтів, які приймають ізоніазид протягом тривалого часу, мають місце ушкодження печінки, а у 20 із 1000 осіб формується блискавичний гепатит, який може призводити до фатальних наслідків [M.F. Stewart, A.J. Freemont, T. Richardson, 1995]. Вважають, що молекулярною основою ушкодження клітин печінки може служити утворення реактивних інтермедіатів одного з метаболітів ізоніазиду, ацетилгідразину, в результаті його активації за участю системи CYP 2E1 [J.A. Timbrel, 1991]. Однак, є дані протилежного характеру, за якими ізоніазид виступає інгібітором ряду ізоформ цитохрому Р-450, включаючи CYP 2E1 [Y. Nishimura et al., 2001].

Враховуючи суперечливість даних літератури, а також відсутність досліджень, що доводять наявність залежності між активацією CYP 2E1 та механізмами токсичного впливу ізоніазиду на печінку, цілком доцільним є проведення цілеспрямованих досліджень для встановлення можливого зв’язку між гепатотоксичністю ізоніазиду та його метаболізмом за участю CYP 2E1. Це може послужити підґрунтям для розробки засобів профілактики та терапії гепатотоксичної дії ізоніазиду та інших речовин, включаючи лікарські засоби, біотрансформація яких здійснюється із залученням CYP 2E1.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано у відповідності з планом науково-дослідних робіт Інституту фармакології та токсикології АМН України в межах теми "Вивчення механізмів біотрансформації фармакологічних речовин з ряду ароматичних сполук, які метаболізують за допомогою цитохрому Р-450 2E1 та обґрунтування напрямків зниження їх токсичності шляхом корекції обміну в печінці” (№ державної реєстрації 0100U000297).

Мета роботи. На основі експериментальних досліджень встановити участь CYP 2E1 в патогенезі гепатотоксичної дії ізоніазиду та обґрунтувати шляхи її корекції.

Завдання дослідження:

1. Дослідити стан монооксигеназної системи печінки щурів за умов уведення ізоніазиду окремо та сумісно з індукторами CYP 2E1 (рифампіцин та етиловий спирт).

2. Встановити вплив специфічного інгібітора CYP 2E1, дисульфіраму, на монооксигеназну систему, процеси перекисного окиснення в печінці щурів, біохімічні та морфологічні показники гепатотоксичності за дії ізоніазиду.

3. Дослідити наявність кореляційної залежності між індукцією CYP 2E1 та критеріальними показниками ушкодження печінки.

4. Вивчити стан монооксигеназної, антиоксидантної систем печінки та гепатопротекторні властивості експериментальної полівітамінної композиції “МВ” за умов застосування у щурів ізоніазиду окремо, сумісно з рифампіцином або на тлі індукції CYP 2E1 етиловим спиртом.

Об’єкт дослідження. Лікарські засоби, що проявляють гепатотоксичну дію.

Предмет дослідження. Індукція CYP 2E1 ізоніазидом та її місце в патогенезі його гепатотоксичної дії.

Методи дослідження. В роботі використано токсикологічні, біохімічні, фармакологічні, морфологічні та статистичні методи.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше експериментально встановлено наявність прямої кореляційної залежності між збільшенням активності фермента-маркера CYP 2E1 - n-нітрофенолгідроксилази та критеріальними показниками гепатотоксичності за дії ізоніазиду. На прикладі дисульфіраму показано здатність інгібіторів CYP 2E1 попереджати розвиток ушкоджень печінки щурів. Встановлено властивість полівітамінної композиції метаболічної дії “МВ” знижувати ступінь індукції CYP 2E1, проявляючи при цьому гепатопротекторні властивості за умов ушкодження печінки ізоніазидом в експерименті.

Практичне значення роботи. Експериментально обґрунтовано доцільність використання інгібіторів CYP 2E1 для зменшення гепатотоксичних властивостей ізоніазиду.

Результати дисертаційної роботи впроваджено у навчальний процес на кафедрах фармакології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця, Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова, Луганського державного медичного університету, Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського, на кафедрі військової токсикології, радіології та медичного захисту військово-медичного інституту Української військово-медичної академії.

Особистий внесок здобувача. Робота з першоджерелами, планування етапів експерименту, проведення експериментальних досліджень, статистична обробка та аналіз отриманих даних виконані здобувачем самостійно. Морфологічні дослідження виконані за консультативної допомоги кандидата медичних наук О.В. Сергієнко та кандидата медичних наук А.В. Матвієнко (Інститут фармакології та токсикології АМН України).

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались на міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених “Вчені майбутнього” (Одеса, 2005р.); II науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів “Актуальні проблеми фармакології та токсикології” (Київ, 2005р.); міжнародній конференції “16th European Students Conference” (Берлін, 2005р.); міжнародній конференції “42nd Congress of the European Societies of Toxicology Eurotox” (Краків, 2005р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 наукових праць, з них 5 статей у фахових журналах та 4 тези доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів та методів досліджень, 4 розділи власних досліджень, аналіз отриманих даних, висновки, список використаних джерел. Дисертаційна робота викладена на 130 сторінках машинопису. Роботу ілюстровано 19 рисунками та 17 таблицями. Бібліографія включає 197 джерел, з них 153 іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Експерименти проведено на 214 статевозрілих білих щурах-самцях лінії Вістар з масою тіла 160-200 г, вирощених у віварії Інституту фармакології та токсикології АМН України. Тварини утримувались на стандартному раціоні віварію з вільним доступом до їжі та води.

В роботі використано: субстанцію ізоніазиду виробництва ЗАТ Фармацевтична фірма “Дарниця” (Україна), рифампіцин виробництва фармацевтичного заводу “POLFA”А.О. (Польща), дисульфірам фірми Sigma (Німеччина), піридоксину гідрохлорид, метіонін та композицію “МВ” надано АТ “Київський вітамінний завод”.

Експериментальні моделі ураження печінки, використані в дослідженні, представлено в табл. 1. Для моделювання експериментального медикаментозного гепатиту щурам внутрішньоочеревинно вводили ізоніазид у дозі 100 мг/кг маси тіла [С.М. Дроговоз, Ю.І. Губський, 2001] або ізоніазид у дозі 50 мг/кг та рифампіцин у дозі 86 мг/кг маси тіла щурам - внутрішньошлунково, виходячи з дозових рівнів при їх застосуванні в клініці [В.М. Петренко, 2002]. Дисульфірам, інгібітор CYP 2E1, вводили у дозі 30 мг/кг, виходячи з дози його застосування в клініці при алкоголізмі [C. Dollery, 1999]. Композицію “МВ” вводили щурам внутрішньошлунково у дозі 50 мг/кг маси тіла. У якості препаратів порівняння використовували антидот ізоніазиду піридоксин [M. Sievers, L. Chin, 1992] та метіонін, що є одним з основних складників композиції “МВ”. Піридоксину гідрохлорид і метіонін щурам вводили внутрішньошлунково у дозах 5 мг/кг та 60 мг/кг маси тіла, відповідно. Дози препаратів порівняння та компонентів експериментальної композиції “МВ” (метіонін, б-токоферол, піридоксин, нікотинамід, фолієва кислота, тіамін, цианкобаламін, цинку сульфат) розраховували, виходячи з добових доз, що застосовуються в медичній практиці [Ф.П. Тринус, 1994]. Всі вищезазначені дози досліджуваних засобів було обчислено з урахуванням коефіцієнту видової чутливості [Ю.Р. Рыболовлев, Р.С. Рыболовлев, 1979]. Експериментальний алкоголізм моделювали згідно Ю.В. Бурова та Н.Н. Вередникова [1985]. Щурам контрольної групи вводили 0,9 % розчин NaCl, шлях введення – відповідно до експериментальної моделі.

Через 24 год. після останнього введення досліджуваних засобів у тварин під легким наркозом діетиловим ефіром відбирали кров зі стегнової вени та піддавали евтаназії шляхом цервікальної дислокації. Печінку відмивали через воротну вену 0,15 М розчином КСl, виділяли мікросомну фракцію печінки за методом S.A. Kamath та F.A. Kummerow [1971]. Постмітохондріальну фракцію печінки щурів отримували за методом І.І. Карузіної та А.І. Арчакова [1977]. Усі процедури виконували з дотриманням холодового режиму ( +4 0С).

Стан монооксигеназної системи печінки оцінювали за вмістом цитохромів Р-450 та b5 [T. Omura, R. Sato, 1964], n-нітрофенолгідроксилазною [D.R. Koop, 1990] та анілін-N-гідроксилазною [И.И. Карузина, А.И. Арчаков, 1977] активністю в мікросомній або постмітохондріальній фракціях печінки.

В мікросомній або постмітохондріальній фракціях печінки досліджували швидкість НАДФН- та аскорбат-залежного утворення продуктів реакції з тіобарбітуровою кислотою (ТБК) [И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили, 1977]. В гомогенаті печінки визначали вміст білкових та небілкових (глутатіон) SH-груп [J. Sedlak, R. Lindsay, 1968].

У гомогенаті, постмітохондріальній фракції та фракції мікросом печінки визначали вміст білку [O.H. Lowry, N.J. Rosebrough et al., 1951].

Активність аланін- (АлАТ), аспартатамінотрансферази (АсАТ), лужної фосфатази (ЛФ), вміст загального білірубіну в сироватці крові визначали за допомогою біотестів виробництва НПП “Филисит-Диагностика” (Україна) та фірми PLIVA – Lachema a.s. (Чехія).

Обчислювали відносну масу печінки. Для гістологічного вивчення зрізи печінки забарвлювали гематоксиліном і еозином за методикою М.Г. Шубича [1965]. Аналіз препаратів здійснювали за допомогою мікроскопа Leica, (Німеччина).

Таблиця 1

Експериментальні моделі індукції та інгібування цитохрому Р-450 2Е1 у щурів

Експериментальні моделі |

Досліджуваний засіб |

Референтні засоби

Дисульфірам, 30 мг/кг, внутрішньошлунково + ізоніазид, 100 мг/кг, внутрішньоочеревинно, через 3 години після

введення дисульфіраму, 14 днів. |

- |

-

Ізоніазид, 50 мг/кг, внутрішньочеревинно, раз на добу, 28 днів. |

композиція “МВ”

50 мг/кг, 28 днів |

піридоксину гідрохлорид

5 мг/кг, 28 днів

Ізоніазид, 50 мг/кг, внутрішньошлунково + рифампіцин, 86 мг/кг, внутрішньошлунково, 28 днів. |

композиція “МВ”

50 мг/кг, 28 днів |

піридоксину гідрохлорид,

5 мг/кг, 28 днів

метіонін, 60 мг/кг,

28 днів

Водний 15%-вий розчин етанолу без обмежень, 4 місяці + ізоніазид, 50 мг/кг, внутрішньошлунково, раз на добу, останні 28 днів. |

композиція “МВ”

50 мг/кг, 28 днів |

піридоксину гідрохлорид,

5 мг/кг, 28 днів

метіонін, 60 мг/кг, 28 днів

Розраховували коефіцієнт кореляції (r). Результати піддавали статистичній обробці та представляли у вигляді середнього арифметичного (М) і стандартної похибки середнього арифметичного (m) для певної вибірки (n). Вірогідність різниці середніх значень досліджуваних показників оцінювали за t- критерієм Ст’юдента. Зміни вважали статистично вірогідними при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

В результаті проведених досліджень показано, що внаслідок внутрішньоочеревинного введення щурам ізоніазиду у дозі 50 мг/кг протягом 28 днів активність маркерного ферменту ізоформи CYP 2E1, п-нітрофенолгідроксилази, у постмітохондріальній фракції печінки зростала відносно контролю у три рази (рис. 1).

Рис. 1 Вплив ізоніазиду, введеного щурам внутрішньоочеревинно у дозі 50 мг/кг протягом 28 днів на активність n-нітрофенолгідроксилази та швидкість аскорбат-індукованого утворення ТБК-реактантів в постмітохондріальній фракції печінки щурів

*- р<0,05 порівняно з контролем.

Це супроводжувалось збільшенням майже у 1,5 рази швидкості аскорбат-індукованого утворення ТБК-реактантів (рис. 1) та зменшенням вмісту SH-груп білків у гомогенаті печінки на 13,7 % у порівнянні з контрольною групою, що, на нашу думку, може вказувати на їх окисну модифікацію та/або взаємодію з токсичними інтермедіатами ізоніазиду.

Отримані нами дані цілком узгоджуються з літературними, де показано, що збільшення активності ізоформи CYP 2E1 є одним із потужних промоторів розвитку оксидативного стресу, здатного спричиняти загибель клітин печінки [B.E. Jones, H. Liu et al., 2002].

Значне збільшення рівня індукції CYP 2E1 та посилення прооксидантних процесів в печінці спостерігалось також за умов внутрішньошлункового уведення щурам ізоніазиду у дозі 50 мг/кг протягом 28 днів на тлі індукторів цитохрому Р-450 2Е1 - рифампіцину або етанолу. Так, активність маркера CYP 2E1, n-нітрофенолгідроксилази, та швидкість НАДФН-індукованого утворення ТБК-реактантів в мікросомах печінки зростали, відповідно, в середньому у 2,6 і 1,6 рази в залежності від експериментальної моделі (табл. 1).

Таблиця 1

n-Нітрофенолгідроксилазна активність та швидкість НАДФН-індукованого утворення ТБК-реактантів фракції мікросом печінки щурів за умов внутрішньошлункового введення ізоніазиду у дозі 50 мг/кг сумісно з рифампіцином у дозі 86 мг/кг протягом 28 днів або на тлі етанолу (4 місяці), нмоль/хв мг білка (M + m; n 6)

Досліджувані показники |

Контроль | Ізоніазид

+ рифампіцин |

Контроль | Ізоніазид

+ етанол

n-Нітрофенолгідроксилазна активність |

1,22 + 0,12 |

2,86 + 0,34* |

1,74 + 0,16 |

5,07 + 0,22*

Швидкість

НАДФН-індукованого утворення ТБК-реактантів |

1,03 + 0,14 |

1,71 + 0,16* |

1,77 + 0,17 |

2,56 + 0,11*

* - р<0,05 порівняно з контролем.

Досліджуючи загальний вміст цитохрому Р-450 в мікросомах печінки щурів, яким вводили ізоніазид у дозі 50 мг/кг протягом 28 днів окремо або на тлі етанолу, ми показали, що рівень вищезазначеного показника зменшувався, відповідно, на 34 % та 20 % відносно контролю (рис. 2).

Рис. 2 Вміст цитохрому Р-450 в мікросомах печінки щурів, яким протягом 28 днів вводили ізоніазид у дозі 50 мг/кг окремо та на тлі экспериментального алкоголізму

* - р<0,05 порівняно з контролем.

Причиною цього можуть бути деструктивні зміни в мембранах ендоплазматичного ретикулуму, які виникають внаслідок посилення процесів ПОЛ та ковалентна взаємодія активних метаболітів ізоніазиду та етанолу з молекулами цитохрому з наступною їх деградацією [F.P. Guengerich, 2001].

Внутрішньоочеревинне введення щурам ізоніазиду у дозі 50 мг/кг протягом 28 днів призводило до збільшення активності АлАТ сироватки крові майже у 2 рази та відносної маси печінки на 50 % порівняно з контрольними тваринами. Це свідчить про різке зростання некрозодистрофічних порушень в клітинах печінки внаслідок токсичної дії реактивних інтермедіатів ізоніазиду. Під впливом ізоніазиду, внутрішньоочеревинно уведеного щурам у дозі 100 мг/кг маси тіла, також спостерігалось збільшення у 1,5 рази рівня загального білірубіну сироватки крові відносно контролю. Морфологічні дослідження печінки щурів за аналогічних умов експерименту виявили ознаки гіаліновокраплинної та гідропічної дистрофії, а також осередки некрозу печінки.

Внутрішньошлункове введення щурам інгібітора CYP 2E1, дисульфіраму у дозі 30 мг/кг маси тіла протягом 14 днів на тлі ізоніазиду, уведеного внутрішньоочеревинно у дозі 100 мг/кг маси тіла, призводило до зменшення на 50 % п-нітрофенолгідроксилазної активності та швидкості НАДФН-залежного утворення ТБК-активних продуктів мікросом печінки до рівня контрольних тварин (табл. 2).

Таблиця 2

n-Нітрофенолгідроксилазна активність та швидкість НАДФН-індукованого утворення ТБК-реактантів фракції мікросом печінки щурів за умов внутрішньоочеревинного введення ізоніазиду у дозі 100 мг/кг на тлі внутрішньошлункового введення дисульфіраму у дозі 30 мг/кг протягом 14 днів, нмоль/хв · мг білка (M + m; n 6)

Досліджувані показники |

Контроль |

Ізоніазид |

Ізоніазид

+ дисульфірам

n-Нітрофенол-гідроксилазна активність |

1,58 + 0,13 |

4,66 + 0,78* |

2,19 + 0,33х

Швидкість

НАДФН-індукованого утворення ТБК-реактантів |

1,36 + 0,10 |

2,30 + 0,38* |

1,14 + 0,26х

Примітки:

1. * - р<0,05 порівняно з контролем;

2. х - р<0,05 порівняно з групою щурів, яким вводили ізоніазид у дозі 100 мг/кг маси тіла.

Крім цього, дисульфірам сприяв збереженню рівня загального білірубіну сироватки крові, відносної маси печінки щурів на рівні контрольних тварин і морфологічних показників. Це свідчить про здатність інгібітора CYP 2E1 попереджати розвиток структурно-функціональних порушень печінки.

Доказом прямого зв’язку між індукцією етанолзалежної ізоформи цитохрому Р-450 ізоніазидом та його токсичною дією на печінку є наявність позитивної кореляційної залежності між зростанням активності маркерного ферменту CYP 2E1, n-нітрофенолгідроксилази, та збільшенням рівня показників гепатотоксичності ізоніазиду – швидкість НАДФН-залежного утворення ТБК-реактантів фракції мікросом печінки, рівень загального білірубіну сироватки крові та відносна маса печінки (табл. 3).

Таблиця 3

Кореляційна залежність між n-нітрофенолгідроксилазною активністю фракції мікросом печінки, швидкістю НАДФН-залежного утворення ТБК-реактантів, рівнем білірубіну сироватки крові та відносною масою печінки за умов введення щурам ізоніазиду у дозі 100 мг/кг, 14 днів, (n 6)

Досліджувані показники | Коефіцієнт кореляції, r

n-Нітрофенол-гідроксилазна

активність,

нмоль/хв · мг білка | Швидкість НАДФН-залежного утворення ТБК-реактантів, нмоль/хв · мг білка |

1,00

Рівень загального білірубіну сироватки крові, мкмоль/л |

0,82

Відносна маса печінки, г/кг маси тіла |

0,91

Отримані нами експериментальні дані показали, що за умов введення щурам ізоніазиду окремо, сумісно з рифампіцином або етанолом, ушкодження печінки відбувається за рахунок посилення індукції CYP 2E1, що призводить до активації процесів ПОЛ та утворення токсичних інтермедіатів досліджуваних ксенобіотиків, здатних виступати промоторами ушкодження макромолекул, дестабілізації біомембран клітин печінки тощо. Це визначає необхідність пошуку засобів, здатних попереджати порушення, зумовлені дією індукторів CYP 2E1.

Аналіз даних літератури свідчить про здатність ряду біологічно-активних речовин корегувати патогенетичні ланки ушкоджень печінки ксенобіотиками-індукторами CYP 2E1. Зокрема, відомо, що метіонін, а точніше його активоване похідне, S-аденозил-1-метіонін, взаємодіє безпосередньо з CYP 2E1, інгібуючи його каталітичну активність [А.А. Caro, А.І. Cederbaum, 2005]. За даними M.K. Aleynik та співавторів [1999], здатність знижувати рівень індукції CYP 2E1 має фосфатидилхолін, для синтезу якого необхідний метіонін. Ця амінокислота є основним джерелом метильних груп, SH-груп білків та глутатіону, що відіграє важливу роль в системі антиоксидантного захисту клітин [S.C. Lu, 1998]. б-Токоферол, реагуючи з пероксид-радикалами ліпідів, взаємодіючи безпосередньо з синглетним молекулярним киснем, діє як антиоксидант [Е. С. 2001] та як мембранопротектор, взаємодіючи з компонентами мембран, що забезпечує їх стабілізацію [П.Дж. Квинн, 2004]. Нікотинамід, безпосередньо взаємодіючи з цитохромом Р-450 та з гідроперекисами ліпідів з утворенням N-оксиду нікотинаміду, знижує, таким чином, рівень процесів ПОЛ в мікросомах [A.B. Weitberg, 1999]. Не менш важливу роль нікотинамід відіграє у складі НАД·Н та НАДФ·Н, що є універсальними донорами електронів в реакціях енергообміну в мітохондріях, окиснення-відновлення в мікросомах тощо. Піридоксин, цианкобаламін, фолієва кислота та нікотинамід – необхідні коферменти в процесі синтезу глутатіону з метіоніну та обміну цієї амінокислоти [H. Refsum еt al., 1998]. Тіамін – за умов його нестачі зростає рівень індукції CYP 2E1 [J.S. Yoo et al., 1990]. За даними Y.J. Kang, Z. Zhou [2005] цинк пригнічує активацію CYP 2E1 в печінці і, як відомо, входить до активного центру ряду важливих ферментів, зокрема, супероксиддисмутази, яка забезпечує утилізацію радикалів кисню [Hassan H.M., 1998].

На основі вищезазначених сполук було розроблено експериментальну полівітамінну композицію “МВ”, яка, на наш погляд, здатна проявляти гепатопротекторні властивості шляхом корегуючого впливу на відповідні ланки патогенезу ушкодження печінки індукторами CYP 2E1.

Внутрішньошлункове введення щурам композиції “МВ” у дозі 50 мг/кг маси тіла на тлі ксенобіотиків сприяло зниженню активності n-нітрофенолгідроксилази в мікросомах печінки на 30 - 50 %, залежно від експериментальної моделі (рис. 3 А), що свідчить про здатність композиції значною мірою попереджати індукцію етанолзалежної ізоформи CYP 2E1.

Композиція “МВ”, уведена внутрішньошлунково щурам в дозі 50 мг/кг маси тіла за аналогічних експериментальних умов, сприяла нормалізації загального вмісту цитохрому Р-450 та проявила антиоксидантні властивості, знижуючи швидкість індукованого ПОЛ в мікросомах печінки щурів в середньому на 30 % (рис. 3 Б).

Крім того, введення композиції “МВ” на тлі ізоніазиду запобігало зниженню вмісту SH-груп білків в гомогенаті печінки, що може свідчити про здатність компонентів композиції захищати сульфгідрильні групи від окисної модифікації та ушкодження інтермедіатами ізоніазиду.

Рис. 3 Вплив композиції “МВ” та референтних препаратів - піридоксину гідрохлориду і метіоніну на n-нітрофенолгідроксилазну активність (А) і швидкість індукованого утворення ТБК-реактантів (Б) мікросом печінки щурів за умов уведення ізоніазиду в дозі 50 мг/кг окремо протягом 28 днів, сумісно з рифампіцином (86 мг/кг) або на тлі експериментального алкоголізму, нмоль/хв мг білка (n = 6)

Примітки:

1. 1 – ізоніазид; 2– ізоніазид + піридоксину гідрохлорид; 3 - ізоніазид + композиція “МВ”; 4 - ізоніазид + рифампіцин; 5 – ізоніазид + рифампіцин + піридоксину гідрохлорид; 6 – ізоніазид + рифампіцин + метіонін; 7 – ізоніазид + рифампіцин + композиція “МВ”; 8 – ізоніазид + етанол; 9 – ізоніазид + етанол + піридоксину гідрохлорид; 10 – ізоніазид + етанол + метіонін; 11 – ізоніазид + етанол + композиція “МВ”;

2. * - р<0,05 порівняно з нелікованими тваринами;

3. ** - р<0,05 порівняно з піридоксином;

4. * - р<0,05 порівняно з метіоніном.

Про гепатопротекторні властивості композиції за умов її застосування на тлі внутрішньоочеревинного уведення щурам ізоніазиду у дозі 50 мг/кг, свідчить здатність “МВ” знижувати як активність АлАТ сироватки крові, так і відносну масу печінки щурів до рівня цих показників у контрольних тварин, тоді як антидот ізоніазиду, піридоксин, уведений щурам за аналогічних умов у дозі 5 мг/кг, виявився малоефективним (табл. 4).

Таблиця 4

Вплив композиції “МВ” на активність АлАТ сироватки крові та відносну масу печінки щурів на фоні внутрішньоочеревинного введення ізоніазиду (M + m; n 6)

Показники |

Контроль |

Ізоніазид |

Ізоніазид +

піридоксину гідрохлорид |

Ізоніазид + “МВ”

АлАТ,

мкмоль/год мл |

0,850,05 |

1,580,09* |

1,090,07** |

0,870,05**, х

Відносна маса печінки,

г/кг маси тіла |

31,22+2,51 |

46,5+1,80* |

43,53+1,85 |

34,18+1,80**, х

Примітки:

1. * - р<0,05 порівняно з контролем;

2. ** - р<0,05 порівняно зі щурами, яким вводили ізоніазид;

3. х - р<0,05 порівняно зі щурами, яким на тлі ізоніазиду вводили піридоксину гідрохлорид.

Одним з інтегральних показників, що характеризують стан печінки, є вміст загального білірубіну сироватки крові. Відомо, що збільшення цього показника може свідчити про порушення метаболічних процесів в гепатоцитах, застій білірубіну в печінці і нездатність переводити зв’язаний пігмент з клітин печінки у жовч [В.С. Камышников, 2004]. Отримані нами дані свідчать, що композиція “МВ”, внутрішньошлунково введена щурам у дозі 50 мг/кг, попереджала розвиток гіпербілірубінемії, яка мала місце за умов застосування ізоніазиду окремо, сумісно з рифампіцином або на тлі експериментального алкоголізму у щурів (табл. 5), що є важливим фактором збереження структурно-функціональних властивостей печінки.

Метіонін та піридоксину гідрохлорид, уведені щурам внутрішньошлунково у дозах, відповідно, 60 і 5 мг/кг маси тіла за аналогічних експериментальних умов, проявили низьку ефективність (табл. 5).

Таблиця 5

Вплив композиції “МВ” та референтних засобів на вміст загального білірубіну (ммоль/л) сироватки крові щурів за умов індукції CYP 2E1 (M + m; n 6)

Експериментальні групи

Контроль |

Індукція

CYP 2E1 | Індукція

CYP 2E1 + піридоксину гідрохлорид |

Індукція

CYP 2E1+ метіонін | Індукція

CYP 2E1+ композиція “МВ”

Ізоніазид, внутрішньоочеревинно у дозі 50 мг/кг протягом 28 днів

2,50 0,36 |

7,750,52* |

6,800,70 |

- |

4,300,41**, х

Ізоніазид + рифампіцин, внутрішньошлунково у дозах 50 мг/кг та 86 мг/кг, відповідно, протягом 28 днів

2,00 0,73 |

14,871,21* |

13,401,02 |

12,71,27 |

8,750,96**, х, хх

Ізоніазид, внутрішньошлунково у дозі 50 мг/кг протягом 28 днів на тлі експериментального алкоголізму

2,00 0,45 |

9,001,20* |

8,501,36 |

7,331,02** |

3,800,90**, х, хх

Примітки:

1. * - р<0,05 порівняно з контролем;

2. ** - р<0,05 порівняно з негативним контролем;

3. х - р<0,05 порівняно з піридоксином;

4. хх - р<0,05 порівняно з метіоніном.

Внутрішньошлункове уведення щурам композиції “МВ” у дозі 50 мг/кг на тлі застосування ізоніазиду у дозі 50 мг/кг сумісно з рифампіцином у дозі 86 мг/кг маси тіла або на тлі експериментального алкоголізму, призводило до зниження активності маркерного ферменту холестазу – ЛФ в середньому на 23 % та нормалізації активності амінотрансфераз в сироватці крові, що є підтвердженням гепатопротекторних властивостей композиції.

Отже, в результаті експериментальних досліджень встановлено наявність прямої кореляційної залежності між активацією ізоніазидом CYP 2E1 в печінці та критеріальними показниками її ушкодження. Показано, що застосування інгібітора CYP 2E1 дисульфіраму попереджало розвиток токсичного гепатиту, викликаного ізоніазидом, що підтверджує роль індукції CYP 2E1 в реалізації гепатотоксичних властивостей ізоніазиду. Виявлена гепатопротекторна активність експериментальної полівітамінної композиції метаболічної дії “МВ” обґрунтовує доцільності розробки фармакологічних засобів, здатних попереджати активацію CYP 2E1, для профілактики токсичних ушкоджень печінки ізоніазидом та іншими індукторами вказаної ізоформи цитохрому Р-450.

ВИСНОВКИ

В роботі, присвяченій актуальній проблемі токсикології – дослідженню механізмів гепатотоксичної дії туберкулостатика ізоніазиду, встановлено, що його токсичний вплив на печінку напряму пов’язаний зі здатністю ізоніазиду виступати індуктором цитохрому Р-450 2Е1. Експериментальна полівітамінна композиція метаболічної дії “МВ” попереджає індукцію цитохрому Р-450 2Е1 та проявляє гепатопротекторні властивості в умовах ушкодження печінки ізоніазидом.

1. Уведення білим щурам ізоніазиду (50 мг/кг, 28 днів) окремо та на тлі етанолу (4 місяці) або рифампіцину (86 мг/кг, 28 днів) призводить до збільшення активності анілін-N-гідроксилази та n-нітрофенолгідроксилази в мікросомах печінки у 2 - 3 рази, що свідчить про індукцію цитохрому Р-450 2Е1 в печінці за дії туберкулостатика.

2. Збільшення активності мікросомальних гідроксилаз, маркерів цитохрому Р-450 2Е1, за дії ізоніазиду супроводжується посиленням швидкості НАДФН- і аскорбат-індукованого утворення ТБК-реактантів в мікросомах печінки щурів на 70 % і 40 %, відповідно, та зменшенням вмісту SH-груп в гомогенаті печінки на 13 %, що вказує на активацію прооксидантних процесів за індукції цитохрому Р-450 2Е1, як однієї з патогенетичних ланок гепатотоксичності.

3. Наявність прямої кореляційної залежності між активністю n-нітрофенолгідроксилази, маркерного ферменту цитохрому Р-450 2Е1, і критеріальними показниками ушкодження печінки: вмістом білірубіну в сироватці крові (r= 0,82), швидкістю НАДФН-залежного утворення ТБК-активних продуктів (r= 1,00) та відносною масою печінки (r= 0,91) свідчить про прямий зв’язок між індукцією цитохрому Р-450 2Е1 та гепатотоксичною дією ізоніазиду.

4. Застосування інгібітора цитохрому Р-450 2Е1 дисульфіраму (внутрішньошлунково, 30 мг/кг, 14 днів) сумісно з ізоніазидом сприяє зниженню на 50 % n-нітрофенолгідроксилазної активності, що супроводжується зменшенням швидкості НАДФН-залежного ПОЛ в мікросомах печінки, рівня білірубіну сироватки крові та відносної маси печінки у 1,7 та 1,8 рази, відповідно, а також проявів морфологічних порушень печінки, що вказує на доцільність використання інгібіторів цитохрому Р-450 2Е1 для профілактики розвитку гепатотоксичності, зумовленої індукцією вищезазначеної ізоформи цитохромів Р-450.

5. Внутрішньошлункове уведення білим щурам експериментальної композиції “МВ” (50 мг/кг, 28 днів), яка містить метіонін, вітаміни групи В, б-токоферол та цинк на тлі застосування ізоніазиду, його комбінації з рифампіцином або етанолом запобігає зростанню активності анілін-N-гідроксилази (на 25 % ) та n-нітрофенолгідроксилази (на 30 % - 50 %) в мікросомах печінки, порівняно з тваринами, які отримували лише індуктори цитохрому Р-450 2Е1, що є підтвердженням ролі етанолзалежної ізоформи цитохрому в механізмах ушкодження печінки досліджуваними ксенобіотиками.

6. За умов токсичної дії ізоніазиду композиція “МВ” виявила антиоксидантні властивості, попереджуючи активацію індукованого утворення ТБК-реактантів на 30 % – 65 % (в залежності від експериментальної моделі), що сприяє нормалізації загального вмісту цитохромів Р-450, а отже стану детоксикуючої функції печінки.

7. За гепатопротекторними властивостями, композиція “МВ”, застосована на тлі введення індукторів цитохрому Р-450 2Е1, згідно даних активності лужної фосфатази, аланін- та аспартатамінотрансферази, вмісту загального білірубіну в сироватці крові та відносної маси печінки, переважає референтні препарати – метіонін та піридоксину гідрохлорид.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Коваленко В.М., Вороніна А.К., Шаяхметова Г.М., Волошина О.С., Блажчук І.С., Бишовець Т.Ф., Бережна Л.Г. Вплив експериментальної полівітамінної композиції на процеси детоксикації ізоніазиду в печінці щурів за умов його тривалої дії // Експерим. і клін. медицина – 2004. – №1. – С. 20-24. (Особисто проаналізовано літературу та написано окремі розділи статті, проведено основні експерименти).

2. Бережна Л.Г., Коваленко В.М., Вороніна А.К., Шаяхметова Г.М., Волошина О.С. Гепатопротекторний ефект експериментальної полівітамінної композиції за умов індукції цитохрому Р-450 2Е1 ізоніазидом і рифампіцином // Совр. пробл. токсикологии – 2005. – №3. – С. 54-58. (Особисто проаналізовано літературу, проведено основні експерименти та написано статтю).

3. Бережна Л.Г., Коваленко В.М., Вороніна А.К., Шаяхметова Г.М., Волошина О.С. Гепатопротекторні властивості полівітамінної композиції метаболічної дії за умов введення ізоніазиду щурам з експериментальним алкоголізмом // Медична хімія – 2005. – Т. 7, №3. – С. 61-64. (Особисто проаналізовано літературу, проведено основні експерименти та написано статтю).

4. Шаяхметова Г.М., Вороніна А.К., Бережна Л.Г., Коваленко В.М. Гепатопротекторна ефективність нової полівітамінної композиції за повторних введень ізоніазиду на фоні експериментального гепатиту // Лекарства – человеку. Современные проблемы создания, исследования и апробации лекарственных средств. Научно-практическая конференция с международным участием – Харьков, 2006. – С. 283-289. (Особисто проаналізовано літературу та написано окремі розділи статті, проведено основні експерименти).

5. Бережна Л.Г., Шаяхметова Г.М., Сергієнко О.В., Вороніна А.К., Матвієнко А.В., Коваленко В.М. Цитохром Р-450 2Е1 в механізмах гепатотоксичності ізоніазиду у щурів // Acta Medica Leopoliensia (Львівський медичний часопис) – 2006. – Т. 12, № 1. – С. 168-173. (Особисто проаналізовано літературу та написано окремі розділи статті, проведено основні експерименти).

6. Бережна Л.Г. Вплив інгібітора цитохрому Р-450 2Е1 дисульфіраму на деякі біохімічні показники печінки щурів за умов введення ізоніазиду // Тези доповідей Міжнародної науково-практичної конференції молодих вчених “Вчені майбутнього” – Одеса, 2005. – С.20.

7. Berezhna L.G., Voronina A.K., Voloshina O.S., Shayakhmetova H.M., Kovalenko V.M. Corrective influence of metabolic action polyvitamin composition with experimental induction of cytochrome Р-450 2Е1 // Abstracts of 42nd Congress of the European Societies of Toxicology “Eurotox” - Cracow, 2005. – Vol.158, Suppl. 1. – P.S45.

8. Бережна Л.Г. Вплив індукції та інгібування цитохрому Р-450 2Е1 на стан печінки щурів // Тези II Науково-практичної конференції молодих вчених та спеціалістів “Актуальні проблеми фармакології та токсикології” – Київ, 2005. – С.6.

9. Berezhna L. Hepatoprotective effect of a new polyvitamin composition with metabolytic acting under usage of antituberculosis drugs // Abstract book of 16th European Students Conference – Berlin, 2005. – P.275.

АНОТАЦІЯ

Бережна Л.Г. Роль індукції цитохрому Р-450 2Е1 в патогенезі гепатотоксичності ізоніазиду. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.03.06 – токсикологія. – Інститут фармакології та токсикології АМН України, Київ, 2006.

Дисертацію присвячено експериментальному дослідженню ролі індукції CYP 2E1 в патогенезі гепатотоксичної дії ізоніазиду та обґрунтуванню шляхів її корекції. Показано доцільність комплексного підходу щодо корекції активації CYP 2E1 його індукторами, здатними проявляти токсичний вплив на печінку. Показано наявність прямої кореляційної залежності між активністю фермента-маркера CYP 2E1, n-нітрофенолгідроксилази, в печінці щурів та критеріальними показниками ушкодження печінки за умов застосування ізоніазиду. На прикладі дисульфіраму, специфічного інгібітора CYP 2E1, уведеного щурам сумісно з ізоніазидом, за допомогою біохімічних та морфологічних методів доведено наявність зв’язку між здатністю останнього індукувати CYP 2E1 та проявами його гепатотоксичності. Встановлено здатність експериментальної полівітамінної композиції метаболічної дії “МВ”, яка містить ряд біологічно активних речовин, знижувати індукцію CYP 2E1, проявляти антиоксидантні та гепатопротекторні властивості.

Ключові слова: цитохром Р-450 2Е1, гепатотоксичність, печінка, ізоніазид, композиція “МВ”, метіонін, вітаміни.

АННОТАЦИЯ

Бережная Л.Г. Роль индукции цитохрома Р-450 2Е1 в патогенезе гепатотоксичности изониазида. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.03.06 – токсикология. – Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, Киев, 2006.

Диссертация посвящена исследованию роли индукции цитохрома Р-450 2Е1 (CYP 2E1) в патогенезе гепатотоксического действия изониазида и экспериментальному обоснованию путей его коррекции.

Известно, что биотрансформация в печени многих низкомолекулярных химических веществ происходит при участии CYP 2E1 и часто приводить к образованию гепатотоксических интермедиатов. Существует предположение, что к индукторам CYP 2E1 принадлежит и противотуберкулезный препарат изониазид. Наряду с этим есть данные о способности изониазида ингибировать некоторые изоформы цитохрома Р-450, в том числе и CYP 2E1. Таким образом, проблема роли индукции CYP 2E1 в реализации гепатотоксических эффектов изониазида остается открытой. Это существенно осложняет поиск путей профилактики повреждения печени изониазидом.

Целью настоящей работы было на основе экспериментальных исследований установить участие CYP 2E1 в механизмах гепатотоксического действия изониазида и обосновать пути его коррекции.

В результате проведенных исследований показано, что экспериментальный гепатит, развивающийся у крыс вследствие введения изониазида в дозе 100 мг/кг, сопровождался увеличением в 3 раза активности маркерного фермента CYP 2E1, n-нитрофенолгидроксилазы, в микросомах печени. Введение изониазида в дозе 50 мг/кг в течении 28 дней отдельно, а также на фоне индукторов CYP 2E1 - рифампицина или этанола – приводило к повышению активности данного фермента в среднем в 2,5 раза, что свидетельствует об усилении индукции CYP 2E1. При этом наблюдалось значительное увеличение скорости ПОЛ, и одновременно отмечалось нарушение содержания цитохрома Р-450 в микросомах печени.

Нами установлено, что в условиях введения крысам изониазида существует прямая корреляционная зависимость между увеличением активности маркера CYP 2E1, и n-нитрофенолгидроксилазы, и такими критериальными показателями повреждения печени, как скорость НАДФН-зависимого образования ТБК-реактантов (r=1,00), содержание общего билирубина сыворотки крови (r=0,82), относительная масса печени (r=0,91).

Введение крысам дисульфирама, селективного ингибитора CYP 2E1, в дозе 30 мг/кг, 14 дней, на фоне изониазида в дозе 100 мг/кг, способствовало снижению на 50 % n-нитрофенолгидроксилазной активности, а также индуцированного НАДФН образования ТБК-активных продуктов фракции микросом печени. Это сопровождалось улучшением морфологической картины печени, уменьшением почти в два раза уровня общего билирубина сыворотки крови и относительной массы печени крыс, что свидетельствует о способности ингибитора CYP 2E1 предупреждать развитие структурно-функциональных нарушений печени.

Внутрижелудочное введение крысам экспериментальной поливитаминной композиции “МВ” в дозе 50 мг/кг, 28 дней, за один час до введения изониазида отдельно, совместно с рифампицином или на фоне экспериментального алкоголизма способствовало снижению активности ферментов-маркеров CYP 2E1 в микросомах печени, на 25 – 50 % (в зависимости от экспериментальной модели). Эти данные указывают на способность композиции “МВ” предупреждать индукцию CYP 2E1.

Введенная крысам при указанных выше условиях опыта, композиция “МВ”, проявила антиоксидантные свойства, снижая скорость индуцированного образования ТБК-реактантов в микросомах печени при различных моделях на 30 – 60 %, а также способствовала нормализации содержания цитохрома Р-450 в печени, что говорит об улучшении ее детоксицирующей способности.

Повторное введение крысам композиции “МВ” на фоне исследуемых ксенобиотиков способствовало нормализации активности щелочной фосфатазы, аланин- и аспартатаминотрансферазы, содержанию общего билирубина сыворотки крови и уменьшению относительной массы печени, что свидетельствует об эффективном гепатопротекторном действии композиции “МВ”, превосходящем активность пиридоксина гидрохлорида, антидота изониазида, и гепатопротектора метионина.

Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют экспериментально обосновать целесообразность разработки на основе композиции “МВ” лекарственного средства для профилактики токсических поражений печени изониазидом и другими ксенобиотиками-индукторами CYP 2E1.

Ключевые слова: цитохром Р-450 2Е1, гепатотоксичность, печень, изониазид, композиция “МВ”, метионин, витамины.

SUMMARY

Berezhna L.G. Role of induction of cytochrome P-450 2E1 in pathogenesis of isoniazid hepatotoxicity. – Manuscript.

This dissertation is dedicated for obtaining a scientific degree: “Candidate of Biological Sciences”. Specialty – Toxicology (14.03.06). Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kyiv, 2006.

The main point of this dissertation is an investigation of the role of the cytochrome P-450 2E1 induction in pathogenesis of isoniazid hepatotoxicity. This research proved the importance of complex approach for correction of cytochrome P-450 2E1 induction by its inductors, which can be a cause of liver injury. Direct correlation between p-nitrophenolhydroxylasе activity (cytochrome P-450 2E1 marker enzyme) in the rat liver and criterial indices of liver injury in case of using isoniazid was shown. In case of using the cytochrome P-450 2E1 selective inhibitor disulfiram combined with isoniazid, using of the biochemical and morphological methods, have proved a direct connection between an ability of the isoniazid to induce the cytochrome P-450 2E1 an its hepatotoxicity. The research showed the ability of experimental polyvitamin composition “MV” with metabolic