НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ,

ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО

ЛИТВИН Дмитро Іванович

УДК 616-006.66:577.[152.27:218]

ЕКСПРЕСІЯ p70S6 КІНАЗИ В ТРАНСФОРМОВАНИХ КЛІТИНАХ ЕПІТЕЛІАЛЬНОГО ПОХОДЖЕННЯ ТА АДЕНОКАРЦИНОМІ ЕНДОМЕТРІЮ ЛЮДИНИ

14.01.07 – онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Науковий керівник – | доктор біологічних наук

Погрібний Петро Васильович,

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, завідувач відділу біології пухлинної клітини.

Офіційні опоненти: – |

– |

доктор біологічних наук

Сидоренко Світлана Павлівна,

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, завідувач лабораторії сигнальних каскадів;

кандидат біологічних наук

Дмитренко Володимир Володимирович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, старший науковий співробітник відділу біосинтезу нуклеїнових кислот.

Провідна установа– |

Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького МОЗ України, кафедра онкології та медичної радіології, м. Львів. |

Захист відбудеться 19 квітня 2006 року о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України за адресою: 03022, Київ, вул. Васильківська, 45.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Автореферат розісланий “ 17 ” березня 2006 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук Н.В. Бородай

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Одним із завдань сучасної фундаментальної онкології є дослідження молекулярних механізмів канцерогенезу. Розуміння механізмів порушень функціонування клітини дає змогу використовувати більш точні та високоспецифічні підходи в діагностиці пухлин та лікуванні хворих. Велика увага приділяється дослідженню ролі мітогенних факторів при виникненні порушень у функціонуванні сигнальних систем клітини при різних патологічних процесах.

В регуляції клітинного циклу, проліферації, інвазії пухлинних клітин та ангіогенезу задіяні декілька сигнальних каскадів. Застосування терапевтичних чинників, спрямованих на блокування передачі внутрішньоклітинних сигналів через такі каскади має перспективи ефективного впливу на ріст солідних пухлин та злоякісних новоутворень системи крові. До подібних потенційних мішеней безумовно відносяться компоненти мітогензалежного сигнального каскаду фосфатидилінозитол-3`-кінази (PI3K). Даний каскад часто активований при злоякісній трансформації та приймає участь в регуляції клітинного циклу, апоптозу та метастатичного потенціалу пухлинних клітин (Paez J. and Sellers W.R., 2003). Неконтрольована активація каскаду PI3K залучена до злоякісної трансформації клітин та прогресії пухлин, таких як злоякісні новоутворення мозку, рак молочної залози, яєчників та нирок (Philp A.J. et al., 2001; Neve R.M. et al., 2002; Choe G. et al., 2003). Значну увагу приділяють дослідженню кінази mTOR, що є важливою ланкою РІ3К-каскаду та одним з ключових регуляторів клітинного метаболізму (Edinger A.L. and Thompson C.B., 2002). mTOR вважається перспективною мішенню протипухлинної терапії у випадках підвищеної активації PI3K- сигнального каскаду. Одним з субстратів mTOR кінази є p70S6 кіназа (p70S6K), активація якої впливає на регуляцію таких процесів в клітині, як індукований мітогенними факторами біосинтез білка, перехід клітини з фази G1 в S, фосфорилювання рибосомного білку S6 і, як наслідок, трансляція специфічної родини матричних РНК 5’ТОР, що кодують білки - компоненти апарату білкового синтезу. Ці процеси є вирішальними для клітинного поділу, проліферації та диференціювання (Banerjee P. et al., 1990; Kozma S.C. et al., 1990; Pullen N. et al., 1997; Avruch J., 1998). Існує дві ізоформи p70S6K — p70S6Kб та p70S6Kв. Підвищену експресію та активацію даного ферменту було виявлено в пухлинах молочної та щитовидної залоз (Couch F.J. et al., 1999; Miyakawa M. et al. 2002). Вважається, що високий рівень експресії та активації p70S6K пов’язаний з залученням PI3K/mTOR/p70S6К-сигнального каскаду до регуляції проліферації пухлинних клітин (Inoki K. et al., 2003) та/або підсилення ангіогенезу пухлин шляхом індукції синтезу факторів росту ендотелію судин (El-Hashemite N. et al., 2003). p70S6К є мітогензалежним ферментом, активація якого відбувається при дії значної кількості мітогенів, одним з яких є епідермальний фактор росту (ЕФР). Відомо, що вплив ЕФР на активацію p70S6K здійснюється за участю РІ3К- та mTOR-сигнальних каскадів. Встановлено, що ЕФР впливає на проліферацію як епітеліальних, так і стромальних клітин ендометрію (Chan R.W. et al., 2004). Також ЕФР відіграє важливу роль в процесах ангіогенезу та васкуляризації ендометрію (Moller B. et al., 2001; Tamada H. et al., 2002). Підвищення рівня експресії ЕФР та його рецептора в порівнянні з нормальним епітелієм показано для деяких типів пухлин, в тому числі і раку ендометрію (Ebert A.D. et al., 2000). Отже, експресія рецептора ЕФР в пухлинах ендометрію може бути важливим чинником регуляції p70S6K-сигнального каскаду в цих пухлинах.

На теперішній час перспективним засобом впливу на пухлинні клітини шляхом пригнічення активності РІ3К-сигнального каскаду вважається застосування інгібіторів mTOR кінази. Специфічним інгібітором mTOR є рапаміцин та його аналоги, дія яких призводить до інгібування p70S6K (Burnett P.E. et al., 1998; Peterson R.T. et al., 1999; Shah S.A. et al., 2001). Для встановлення чутливості різних типів пухлин до даних інгібіторів доцільним є застосування відповідних молекулярних маркерів. Визначення рівня експресії та активності p70S6K в пухлинній тканині може бути одним з інформативних критеріїв оцінки ефективності застосування рапаміцину в клінічній практиці (Vignot S. et al., 2005).

Відомо, що нерегульована активація РІ3К-сигнального каскаду властива пухлинам, для яких характерна втрата або мутації фосфатази PTEN, функція якої полягає у підтриманні низького рівня фосфатидилінозитол 3,4,5-трифосфатів (Crackower M.A. et al., 2002; Li S. et al., 2002), що призводить до підвищення активності mTOR та посиленого фосфорилювання деяких її мішеней, однією з яких є p70S6К. Мутації цього гену виявлено в багатьох пухлинах. Близько 40% пухлин ендометрію характеризуються мутаціями гену PTEN, що вважається ознакою ранньої злоякісної трансформації ендометрію (Inaba F. et al., 2005). Тому пухлини даного походження є потенційно чутливими до пригнічення РІ3К-сигнального каскаду, а дослідження особливостей експресії та активації p70S6К при раку ендометрію є актуальним для сучасної онкології.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилась в рамках планово-бюджетної теми Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України “Експресія та ферментативна активність р70S6 кінази в клітинах експериментальних пухлин та солідних пухлинах людини” (номер державної реєстрації 0101U000671, 2001-2003), теми “Особливості функціонування онкогеному” (номер державної реєстрації 0102U003228, 2002-2006), а також гранту Президента України для обдарованої молоді на 2003 р., № 15.

Мета роботи. Метою роботи було дослідження особливостей експресії гену p70S6K та фосфорилювання рибосомного білку S6 в злоякісно трансформованих клітинах епітеліального походження у відповідь на вплив екзогенного епідермального фактору росту, а також визначення експресії p70S6K в динаміці розвитку пухлинного процесу in vivo та особливостей експресії p70S6K та фосфорилювання рибосомного білку S6 в тканинах аденокарцином ендометрію людини.

Задачі дослідження:

1.

2.

в умовах in vitro.

3.

4.

5.

6.

Об’єкт дослідження – експресія та функціонування p70S6K в злоякісно трансформованих клітинах.

Предмет дослідження – експресія генів p70S6K і p70S6K та фосфорилювання рибосомного білку S6 в злоякісно трансформованих клітинах епітеліального походження за умов екзогенного впливу епідермального фактору росту; експресія p70S6K і p70S6K в динаміці розвитку карциноми Герена; а також експресія p70S6K і p70S6K та фосфорилювання рибосомного білку S6 в клітинах аденокарцином ендометрію людини.

Методи дослідження – методи молекулярної біології (виділення та очистка нуклеїнових кислот, полімеразна ланцюгова реакція, зворотна транскриптазна реакція; біохімічні методи (електрофорез нуклеїнових кислот в агарозному гелі, електрофорез білків в поліакриламідному гелі, Вестерн-блот аналіз); культивування еукаріотичних клітин, методи експериментальної онкології (перещеплення експериментальних пухлин), імуногістохімічні методи.

Наукова новизна одержаних результатів

В процесі роботи отримано гібридні клітини, які продукують моноклональні антитіла до p70S6K, здатні високоспецифічно розпізнавати ядерну та цитоплазматичну форми p70S6Kб. Вперше було показано вплив епідермального фактору росту на рівень експресії p70S6Kб та p70S6Kв в злоякісно трансформованих клітинах та досліджено ЕФР-ініційоване фосфорилювання рибосомного білку S6 в клітинах з різним рівнем експресії рецептора ЕФР. Встановлено, що експресія p70S6Kб та p70S6Kв в тканині карциноми Герена є підвищеною, порівняно з тканинами матки, дана закономірність асоційована з початковими етапами розвитку пухлини. Виявлено підвищення рівня експресії p70S6Kб і p70S6Kв та рівеня фосфорилювання рибосомного білку S6 в аденокарциномах ендометрію людини порівняно з макроскопічно незміненим ендометрієм. При дослідженні тканин аденокарцином ендометрію показано, що ядерна локалізація p70S6Kб та p70S6Kв властива виключно пухлинним клітинам. Встановлений підвищений рівень експресії p70S6Kб та підвищення рівня фосфорилювання рибосомального S6 білку в ендотеліальних клітинах судин пухлинної тканини.

Практичне значення одержаних результатів

Результати дисертаційної роботи розширюють сучасне уявлення про механізми злоякісної трансформації клітин та можуть бути теоретичним підґрунтям для створення як діагностичних засобів, так і фармакологічних препаратів нового покоління, спрямованих на пригнічення PI3K/mTOR/p70S6K-сигнального каскаду в пухлинних клітинах раку ендометрію людини.

Особистий внесок здобувача

Автор приймав участь в отриманні та характеристиці моноклональних антитіл до p70S6Kб. Автором самостійно проведено роботу по дослідженню впливу ЕФР на активацію та експресію p70S6K та особливостей експресії p70S6K в динаміці розвитку пухлинного процесу in vivo. За допомогою зворотної транскриптазної реакції, полімеразної ланцюгової реакції, Вестерн-блот аналізу та імуногістохімічних досліджень автором досліджено експресію та активацію p70S6К та p70S6Кв в аденокарциномах ендометрію людини. Автор самостійно провів аналіз отриманих результатів та сформулював висновки роботи.

Апробація результатів досліджень

Основні положення дисертації було представлено та обговорено на: 6th John Humphrey Advanced Summer Program in Immunology. Molecular basis of immune response (Пущино, Росія, 2002); Conference for Young Scientists, PhD Students and Students on Molecular Biology and Genetics, Dedicated to the Golden Jubilee of the Double Helix of the DNA and 30 Anniversary of the Institute of Molecular Biology and Genetics, NAS of Ukraine (Київ, 2003); установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); Євроазіатському конгресі по акушерству та гінекології (Санкт-Петербург, 2004); 5th Parnas Conference (Київ, 2005); міжнародній школі-конференції молодих вчених Системная биология и биоинженерия (Москва, Росія, 2005).

Публікації

Основні положення дисертації викладені у 9 наукових роботах, в тому числі в 3 статтях у провідних фахових виданнях та 6 тезах у збірках українських та зарубіжних конференцій.

Структура та обсяг дисертації

Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, розділу матеріали та методи досліджень, п’яти розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих результатів, висновків і списку використаної літератури. Основний зміст дисертації викладений на 117 сторінках машинописного тексту, містить 3 таблиці та 50 рисунків. Список використаної літератури включає 160 джерел, з них 4 кирилицею та 156 латиницею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Отримання моноклональних антитіл (МКАТ) до p70S6Kб проводили шляхом злиття мієломних клітин лінії SP2/0 та спленоцитів мишей лінії Balb/c, що були імунізовані рекомбінантним білком p70S6Kб людини. Для імунізації використовували рекомбінантну цитоплазматичну форму p70S6Kб, кДНК якої була клонована в експресуючий бактеріальний вектор pET-23d. р70S6Kб експресували та напрацьовували в клітинах E.coli, штам BL21DE3, трансформованих експресуючим вектором pET-23d/6ХHis-р70S6Kб. Аналіз експресії генів p70S6Kб та p70S6Kв методами зворотної транскриптазної реакції та полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР) проведено на РНК-матрицях злоякісно трансформованих клітин людини ліній A431, M-HeLa та MCF7. Для культивування клітин використовували середовище RPMI-1640 (Gibco BRL, Великобританія) з додаванням 10% ембріональної сироватки крові великої рогатої худоби (ЕТС) (Gibco BRL, Великобританія). Для дослідження впливу ЕФР на експресію р70S6K та рівень фосфорилювання рибосомного білку S6 клітини вирощували на 24-лункових планшетах до 70% моношару, після чого змінювали середовище на безсироваткове на 24 год. Далі додавали до клітин ЕФР в концентрації 25 нг/мл для дослідження експресії p70S6Kб і p70S6Kв на рівні мРНК – на протязі 3 та 6 год., на рівні білка – на протязі 24 год. та для дослідження впливу ЕФР на фосфорилювання рибосомного білку S6 – на протязі 10, 20, 30, 60, 120, 180 хвилин та 24 годин.

В дослідах in vivo були використані 20 самок безпородних щурів розводки віварію ІЕПОР НАН України. В якості модельної пухлини використовували карциному Герена. Щеплення проводили на тваринах віком 1,5 місяців, вагою 140-180 г. Імплантували 2,5106 клітин у 0,5 мл фізіологічного розчину підшкірно. Проводили забір зразків пухлин (периферичні ділянки пухлини, не уражені некрозами) та тканин матки. В якості контролю використовували здорових щурів (n=2). Забір зразків проводили на 10, 14, 18, 22 та 26 добу після перещеплення пухлини, в кожній часовій точці було 4 тварини. В дослідній групі відбір тварин проводився випадково. Дослідження проводили методами ЗТ-ПЛР, Вестерн-блот аналіза та імуногістохімії. Всі роботи з тваринами виконано згідно з правилами регіонального комітету по етиці.

В експериментах по дослідженню рівня експресії p70S6K та p70S6K на рівні мРНК та білку, а також рівня фосфорилювання рибосомного білку S6 в аденокарциномах ендометрію людини було використано хірургічно видалені зразки пухлин (аденокарцином низького, помірного та високого ступеня диференціювання; стадія Т1 – (n=45), стадія Т2 – (n=3), стадія Т3 – (n=2) та умовно нормальних тканин ендометрію, що оточували пухлину. Для вирішення поставлених задач було застосовано методи ЗТ-ПЛР, Вестерн-блот аналізу (зразки нормальних та пухлинних тканин 18 пацієнтів) та імуногістохімічні методи (зразки умовно нормальної тканини ендометрію 13 пацієнтів та зразки пухлин 50 пацієнтів). Зразки хірургічного матеріалу було отримано з відділення онкогінекології Інституту онкології АМНУ (зав. відділенням проф. Воробйова Л.І.) та морфологічної лабораторії “Біонтек” м. Дніпропетровськ. Пацієнти були проінформовані та дали згоду на використання хірургічного матеріалу в дослідницьких цілях. Класифікацію пухлин проводили згідно класифікації ВООЗ.

Для проведення реакції ЗТ-ПЛР загальну РНК виділяли методом кислофенольної екстракції з використанням набору реактивів “РИБО-золь-А” (АмплиСенс, Росія). Згідно послідовності мРНК даних генів було підібрано наступні олігонуклеотидні праймери: прямі - 5`-ttggggcatttacatcaaaaggg - для кДНК p70S6Kб та 5`- ggatcgccgccctttaccgca – для кДНК p70S6Kв. Зворотній олігонуклеотидний праймер 5`- cccag(a/g)aag(a/g)cctg(a/g)ttggcact - вироджений в деяких позиціях, що задовольняє умовам компліментарності для обох генів. Отримання комплементарної ДНК проводили згідно протокола виробника набору для синтезу кДНК (Fermentas, Литва). Для підвищення специфічності ампліфікації кДНК в процесі ПЛР та зменшення виходу неспецифічного продукту використовувався принцип “Hot Start”. Ампліфікацію проводили протягом 30 циклів, температурні режими ефективної ампліфікації складали 940С – 20 сек., 640С – 30 сек., 720С – 45 сек.

Для перевірки ефективності зворотної транскриптазної реакції проводили контрольну ПЛР з олігонуклеотидними затравками до гена гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогенази (G3PDH). Оптимальні умови для ампліфікації даного фрагмента наступні: 30 циклів при температурних режимах 950С - 20 с, 640С - 30 с, 720С - 45 с.

Імуногістохімічні дослідження проводили на парафінових зрізах методом непрямого виявлення антигену з використанням специфічних моноклональних та поліклональних антитіл. Для блокування активності ендогенної пероксидази зрізи тканин інкубували 30 хв. в розчині 0,3% H2O2. Для візуалізації реакції застосовували авідин-біотинову систему (Vectastain ABC Kit, Vecor Lab, США). Зрізи інкубували з розчином ABC 30 хв. при 20 оС, відмивали, інкубували в розчині 0,003% H2O2 – 0,05% 3,3'- діамінбензидинтетрагідрохлорид (Sigma, США). Ядра клітин забарвлювали гематоксиліном Майєра. Виявлену цитоплазматичну локалізацію забарвлення оцінювали за наступною шкалою: 0 — відсутність забарвлення, 1 — слабке забарвлення, 2 — помірне забарвлення, 3 — інтенсивне забарвлення. Забарвлення в ядрах оцінювали: 0 — відсутність забарвлення, 1 — 1-20% позитивно забарвлених ядер, 2 — 20-50% позитивно забарвлених ядер, 3 — більш ніж 50% позитивно забарвлених ядер. Отримані дані підлягали непараметричному корелятивному аналізу з використанням коефіцієнту Спірмана.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Було отримано МКАТ, що виявили специфічність як до ядерної (85 кДа), так і до цитоплазматичної (70 кДа) форм p70S6Кб. Антитіла були здатні специфічно розпізнавати p70S6К в Вестерн-блот-аналізі не тільки в лізатах клітин різних ліній, а і в лізатах тканин людини, що було використано на подальших етапах даного дослідження. Крім того, продемонстровано, що отримані МКАТ до p70S6Кб можуть бути застосовані в реакції імунопреципітації ферменту з лізатів клітинних ліній та тканин людини і використані в імуногістохімічних та імунофлуоресцентних дослідженнях.

Нами було досліджено вплив ЕФР на рівень експресії генів ізоформ p70S6K в клітинних лініях, що містять різну кількість рецептора ЕФР (ЕФРр), а саме клітинах лінії А431 (107 молекул ЕФРр на клітину), М-HeLa (106 молекул ЕФРр на клітину) та MCF7 (103 молекул ЕФРр на клітину). Відомо, що клітини MCF7 конститутивно гіперекспресують p70S6Кб внаслідок ампліфікації гену p70S6Кб.

Було встановлено, що дія ЕФР в концентрації 25 нг/мл викликла підвищення рівня мРНК p70S6Кб в клітинах ліній A431 та HeLa, але майже не впливла на даний показник в клітинах MCF7. В той же час експресія p70S6Kв виявилась ЕФР-залежною в усіх трьох досліджених клітинних лініях (рис. 1). Порівняльний аналіз експресії генів ізоформ кінази показав, що рівень експресії p70S6Кб в більшій мірі залежить від впливу ЕФР, ніж рівень експресії p70S6K, і для обох ізоформ пов’язаний з кількістю ЕФРр на поверхні клітин-мішеней.

Слід зазначити, що за аналогічних умов не було виявлено різниці в експресії ізоформ p70S6K на рівні білку. Це може означати, що для активації трансляції (на відміну від транскрипції) p70S6K необхідно залучення додаткових факторів, що діють в комплексі.

При визначенні кінетики ферментативної активності p70S6K на клітинних лініях А431, М-HeLa та MCF7 встановлено, що швидкість активації кінази, яку було опосередковано оцінено за рівнем фосфорилювання субстрату p70S6K рибосомного білку S6 в позиції Ser235/236 (phS6), корелювала з динамікою фосфорилювання рецептора ЕФР, визначали за допомогою МКАТ до фосфорильованого тирозину (pY), що в свою чергу зумовлена вмістом ЕФРр в клітинах.

Найшвидше фосфорилювання білку S6 та ЕФРр при дії ЕФР спостерігалось в клітинах А431. Дані показники є синхронними та сталими в часі (рис. 2А). В М-HeLa ці процеси не були синхронними, причому різке зниження рівня фосфорилювання рецептора співпадає в часі з початком фосфорилювання білку S6 (рис. 2В). В клітинах МСF7 при відсутності фосфорилювання ЕФРр показники фосфорилювання субстрату при дії ЕФР сягали максимуму в два рази швидше, ніж такі в клітинах М-HeLa, що можна пояснити гіперекспресією p70S6K в клітинах даної лінії.

Узагальнюючи наведені дані, можна зробити висновок, що рівні транскрипції обох ізоформ p70S6К та фосфорилювання рибосомного білку S6 мають пряму кореляцію з рівнем експресії ЕФРр в досліджених лініях клітин. |

Рис. 2. Кінетика фосфорилювання рецептора ЕФР та фосфорилювання білку S6 в клітинах А431 (А), M-HeLa (В) та MCF7 (С) при стимуляції ЕФР на протязі 10 хв., 20 хв., 30 хв., 60 хв., 120 хв., 180 хв. та 24 год. Трек 0 – контроль (клітини після 24 год. культивування без ЕТС).

Експресія p70S6Кб та p70S6K в пухлинних клітинах в динаміці розвитку карциноми Герена. Наступним кроком наших досліджень стало з’ясування закономірностей експресії p70S6K в малігнізованих тканинах in vivo на різних етапах розвитку пухлини. В якості моделі було обрано спонтанну карциному матки щурів - карциному Герена. Дослідження експресії p70S6K на рівні мРНК продемонструвало, що на початкових стадіях розвитку пухлини (для p70S6Kб -10-14 доба, для p70S6Kв – 10-18 доба) вміст мРНК обох ізоформ кінази в пухлині підвищувався, але надалі (18-22 доба) рівень експресії p70S6Kб та p70S6Kв в карциномі Герена майже не відрізнявся від такого в тканинах матки. (рис. 3.А, 3.В).

Таким чином, кінетика експресії генів p70S6Kб та p70S6Kв в пухлинних тканинах була подібною, з тією різницею, що підвищений рівень експресії мРНК p70S6Kв в пухлинній тканині спостерігався більш тривалий час (до 18 діб). Як видно з рис. 3.А, рівень експресії гену p70S6Kб в тканинах матки тварин, яким перещеплено карциному Герена, знижувався порівняно з контролем після 14 доби. В той же час рівень експресії мРНК p70S6Kв в тканинах матки тварин-пухлиноносіїв впродовж усього експерименту залишався в межах контролю з незначними коливаннями.

Рис. 3. Аналіз експресії генів p70S6Kб (А) та p70S6Kв (В) методом ЗТ-ПЛР та кількісні показники експресії в тканинах карциноми Герена в динаміці розвитку пухлин. С – експресія гену G3PDH. М – стандарт розміру ДНК 1 кb ladder, Н – тканини матки тварин-пухлиноносіїв, П – пухлинна тканина, К – тканини матки здорового щура (контроль). Умовні одиниці — щільність треків при аналізі зображення в програмі TotalLab v1.10.

Дослідження кінетики експресії p70S6K на рівні білку, що було проведено методом Вестерн-блот аналізу, дозволило встановити наступні особливості. Рівень експресії p70S6Kб в пухлинній тканині на 10 добу після імплантації пухлини на 50% перевищував такий в тканинах матки цих же тварин. На 14 добу - в пухлині рівень експресії p70S6Kб був на 30% вищий ніж в тканинах матки, де цей показник теж підвищувався; на 18 добу рівень експресії p70S6Kб в пухлинній тканині мав тенденцію до зниження. В подальшому спостерігалось значне зниження рівня p70S6Kб в тканинах матки та підвищення в пухлині. На 26 добу рівень експресії p70S6Kб в пухлині на 60% перевищував цей показник в тканинах матки (рис. 4.А). Слід зазначити, що, незважаючи на коливання, середні значення експресії p70S6Kб в тканинах матки не виходили за межі сталого діапазону в порівнянні з цим показником в тканинах матки здорових щурів (контроль).

Рис. 4. Вестерн-блот аналіз експресії та кількісні показники експресії p70S6К (А) та p70S6Кв (В) в динаміці розвитку карциноми Герена. Н – тканини матки тварин-пухлиноносіїв, П – пухлинна тканина, К – контроль (тканини матки здорового щура).

- зразки пухлин,

- зразки тканин матки тварин-пухлиноносіїв,

- середній рівень експресії p70S6Kб у тканинах матки здорових щурів (контроль).

Умовні одиниці — щільність треків при аналізі зображення в програмі TotalLab v1.10.

Порівняння даних щодо експресії p70S6Kб на рівні мРНК та білку свідчить про синхронну зміну цих показників і про наявність підвищеного рівня експресії ізоформи на початкових стадіях розвитку карциноми Герена.

Аналогічні дані були отримані щодо експресії p70S6К (Рис. 4.В), хоча зміни рівня експресії даної ізоформи мали певні відмінності від таких для p70S6Kб. Рівень експресії p70S6Kв в тканинах матки майже не змінювався на протязі 22 діб з моменту імплантації пухлини та знаходився у межах такого в контролі. В зразках пухлинних тканин (10-а – 18-а доба після трансплантації пухлини) було зареєстровано підвищення рівня експресії p70S6Kв на 75% порівняно з таким в тканинах матки. Надалі спостерігалось зниження рівня експресії даної ізоформи ферменту. Порівнюючи кінетику експресії обох ізоформ p70S6K, можна зробити висновок про підвищення рівня їх експресії на початкових стадіях розвитку карциноми Герена, хоча підвищений рівень p70S6Kв є більш пролонгованим у часі (рис. 4.В).

В процесі дослідження показано появу ядерної форми p70S6Kб (85 кДа) в двох дослідних вибірках в зразках пухлин на ранніх етапах розвитку карциноми Герена (10-14 доба) (рис. 5).

Імуногістохімічні дослідження підтвердили наші дані щодо характеристики рівня експресії p70S6Kб та p70S6Kв методами ЗТ-ПЛР та Вестерн-блот аналізу. Показана ядерна локалізація обох ізоформ на початкових стадіях розвитку пухлини, хоча дана закономірність була більш властивою для p70S6Kб. Найбільша кількість пухлинних клітин з ядерною локалізацією p70S6Kб виявлена на 14 добу (10% клітин).

Для оцінки рівня проліферації клітин в досліджуваних зразках було визначено рівень експресії ядерного антигену проліферуючих клітин (PCNA). Рівень експресії PCNA по мірі прогресії пухлини знижувався. Так, якщо на 10 та 14 доби до 100% клітин мають позитивно забарвлені ядра, то на 16 і 22 добу знижувалась як інтенсивність забарвлення ядер, так і відсоток позитивних клітин.

Важливим фактом є також визначення гіперекспресії p70S6Kб в судинах пухлинної тканини при відсутності подібного явища в тканинах матки, що може вказувати на участь даної ізоформи ферменту в процесах ангіогенезу пухлини. Отримані результати вказують на можливу участь p70S6Kб та p70S6Kв в прогресії розвитку пухлини.

Дослідження рівня експресії p70S6Кб, p70S6Kв та фосфорилювання рибосомного білку S6 в тканинах аденокарцином ендометрію. Результати щодо особливостей експресії p70S6K в клітинах карциноми Герена in vivo спонукали нас до проведення дослідження експресії даного ферменту в пухлинах людини. В якості об’єкту дослідження було обрано аденокарциному ендометрію людини. Перспективність даної моделі полягає в тому, що пухлинні клітини ендометрію людини мають високу частоту мутацій PTEN, залученої до регуляції p70S6K та виявляють чутливість до рапаміцину. Нами було поставлено за мету визначити особливості експресії p70S6K на рівні мРНК та білку, а також фосфорилювання субстрату p70S6К рибосомного білку S6 в аденокарциномах ендометрію людини та з’ясувати, чи можуть зміни в експресії даного ферменту бути асоційованими зі злоякісною трансформацією.

Було виявлено, що в пухлинах ендометрію людини спостерігалась тенденція до підвищення рівня експресії як p70S6Kб, так і p70S6Kв на рівні мРНК і білку в пухлинній тканині порівняно з умовно нормальними тканинами ендометрія. Підвищений рівень експресії мРНК p70S6Kб та p70S6Kв в пухлинній тканині, порівняно з нормою, спостерігався в 44% та 72% випадків відповідно. Загальний характер експресії мРНК p70S6K в аденокарциномах ендометрію людини показано на рис. 6.

Загалом підвищений рівень експресії ферменту в пухлинній тканині виявлено в 56% та 67% випадків для p70S6Кб та p70S6Kв, відповідно (Рис. 7). Кореляція рівнів експресії гену та білкового продукту в пухлині та нормі була властива в більшій мірі для p70S6Kв, що може свідчити про більш ефективну трансляцію p70S6Kв в пухлинах даної локалізації. Отримані дані свідчать про існування в більшості випадків співпадіння між гіперекспресією p70S6Кб та p70S6Kв та наявністю злоякісного процесу.

Рис. 6. Експресія мРНК p70S6K /в в тканині ендометрію (Випадок 5). Трек 1 — стандарт розміру ДНК (100 bp ladder). Експресія мРНК G3PDH в нормі (трек 2) та пухлині (трек 3). Експресія мРНК p70S6K в нормі (трек 4) та пухлині (трек 5). Експресія мРНК p70S6Kв в нормі (трек 6) та пухлині (трек 7).

Рис. 7. Аналіз експресії p70S6K та p70S6K в тканинах ендометрію людини методом Вестерн-блотингу: К - контроль (рекомбінантний білок p70S6K при скринуванні p70S6K та лізат клітин MCF7 при скринуванні p70S6K); 1Н-18Н — умовно нормальні тканини ендометрію; 1П-18П — пухлинні тканини.

Визначення особливостей експресії p70S6Kб та p70S6Кв в пухлинних тканинах вимагає не лише кількісних, але і якісних показників внутрішньоклітинного розподілу та тканинної локалізації ферменту. Тому було додатково проведено серію імуногістохімічних досліджень експресії p70S6Kб і p70S6K та рівня фосфорилювання рибосомного білку S6 в позиції Ser235/236 (phS6) в зразках пухлин та нормальних тканин ендометрію людини. Дослідження експресії p70S6K та p70S6K було проведено з урахуванням внутрішньоклітинного розподілу ферменту.

За даними імуногістохімічного аналізу зразки нормального ендометрію, що оточують пухлину, характеризуються низьким базальним рівнем експресії p70S6K в епітеліальних клітинах. Забарвлення мало градацію від повної відсутності до слабкої інтенсивності. Експресію p70S6K було виявлено в цитоплазмі епітеліальних клітин у вигляді дифузного забарвлення з тенденцією до локалізації в зоні цитоплазматичної мембрани. В ядрах епітеліальних клітин ендометрію позитивного забарвлення не виявлено. Елементи строми ендометрію відзначались підвищеним рівнем експресії p70S6K порівняно з епітеліальним компонентом. Рівень експресії p70S6Kв в зразках нормального ендометрію визначався як низький. Стромальні елементи були слабо забарвлені при виявленні p70S6Kв.

В ендометрії, що оточував пухлину, було визначено рівень фосфорилювання субстрату обох ізоформ p70S6K, рибосомного білку S6. Найбільш високі показники мали поверхнево розташовані епітеліальні клітини, що спрямовані у порожнину матки. Більш глибоко розташовані залозисті структури не були забарвлені на phS6, а позитивне забарвлення відмічалось лише в поодиноких групах залозистих клітин. В той же час спостерігався високий рівень фосфорилювання білку S6 в клітинах аденокарцином. В периферичних ділянках пухлини спостерігалось підвищення рівня фосфорилювання білку S6, порівняно з центральними зонами пухлини. До фосфорилювання білку S6, зважаючи на характер експресії ізоформ, можуть бути причетними як p70S6Кб так і p70S6Kв. Отже, підвищена активація p70S6K може бути асоційованою з розвитком пухлинного процесу.

Імуногістохімічний аналіз зразків аденокарцином ендометрію виявив широку варіабельність рівнів експресії та локалізації p70S6Kб та p70S6Kв. Серед досліджуваних зразків зустрічались випадки домінування експресії p70S6Кв або p70S6Kб, також мали місце випадки однакової експресії обох ізоформ. Рівень експресії p70S6K в аденокарциномах ендометрію варіює: в ділянках пухлин з високим рівнем диференціювання були присутні залозисті структури, що розташовані поруч, але мали різний рівень експресії p70S6Kб. Характер локалізації p70S6K в цитоплазмі пухлинних клітин теж різний. В одних клітинах виявлено дифузне, рівномірне забарвлення цитоплазми клітин, а в інших забарвлення мало вигляд мікровезікул та гранулоподібних структур. Також поширеним явищем є локалізація p70S6K переважно на базальній або апікальній поверхні клітин. Подібні особливості властиві і експресії p70S6Кв в пухлинних клітинах.

Слід звернути увагу на те, що як при домінуванні експресії p70S6Kб, так і p70S6Kв, спостерігався високий рівень phS6. Дана закономірність може вказувати на рівну участь як p70S6Kб, так і p70S6Кв у фосфорилюванні рибосомного білку S6.

Більшість пухлин відзначалась високим рівнем експресії p70S6Kб в стромі та ендотелії судин. Серед досліджених нами зразків пухлин 32% мали велику кількість судин, позитивно забарвлених на p70S6Kб (більше 3 позитивно забарвлених судин в полі зору мікроскопу при збільшенні 400), причому всі випадки мали низький ступінь диференціювання. Серед високо диференційованих аденокарцином експресія p70S6Kб в судинах виявлена не була. Важливим спостереженням є наявність водночас високого рівня експресії p70S6Kб в ендотеліальних клітинах судин пухлинної тканини та підвищеного рівня фосфорилювання білку S6, чого не спостерігалось в нормальних тканинах. Даний факт може бути підтвердженням даних літератури про важливу роль PI3K-p70S6K-сигнального каскаду в регуляції проліферації ендотеліальних клітин.

В жодному зразку епітелію тіла матки не спостерігалась ядерна локалізація p70S6Kб та p70S6Kв (рис. 8). В непухлинних епітеліальних клітинах ендометрію цитоплазматична локалізація p70S6Kб та p70S6Kв була відсутня в 15,4% та 30,8% зразків, відповідно; була низькою в 69,2% для p70S6Kб та 46,2% для p70S6Kв. Середні рівні експресії p70S6Kб та p70S6Kв реєстрували в 15,4% та 23% зразків відповідно. Високий рівень експресії p70S6Kб та/чи p70S6Kв не був притаманним жодному зі зразків умовно нормальних тканин.

Рис. 8. Розподілення експресії p70S6Kб та p70S6Kв в досліджених зразках аденокарцином ендометрію людини. Рівні експресії: 0 – експресія не детектувалась, 1 – низький рівень експресії у цитоплазмі та 1-20% забарвлених ядер, 2 – помірний рівень експресії у цитоплазмі та 20-50% забарвлених ядер, 3 – високий рівень експресії у цитоплазмі та більше 50% забарвлених ядер.

Серед 50 зразків аденокарцином ендометрію ядерна локалізація p70S6Kб спостерігалась в 8%, а p70S6Kв – в 18% випадків. В той же час цитоплазматична локалізація p70S6Kб та p70S6Kв визначалась як низька в 64% та 34% випадків, середня – в 18% та 30% випадків, висока – в 8% та 12% випадків відповідно. Відсутність забарвлення на p70S6Kб та p70S6Kв було виявлено у 10% та 24% зразків аденокарцином ендометрію. Таким чином, у більшості досліджених зразків пухлин експресія p70S6Kв мала тенденцію до кількісного превалювання над експресією p70S6Kб.

Високий рівень експресії p70S6Kб та p70S6Kв спостерігався в пухлинах з різним рівнем диференціювання, підвищений вміст ядерних форм p70S6Kб та p70S6Kв був властивим лише пухлинам з помірним та низьким рівнем диференціювання.

Кореляційний аналіз даних імуногістохімії продемонстрував корелятивний зв’язок між підвищенням рівня експресії p70S6Kб в стромі та ендотелії судин (r = 0.33; p = 0.019), між рівнем експресії p70S6Kб та рівнем фосфорилювання рибосомного білку S6 в судинах (r = 0.41; p = 0.028). Негативна кореляція спостерігалась між рівнем диференціювання пухлин (G) та інтенсивністю експресії p70S6Kб в цитоплазмі пухлинних клітин (r = -0.31; p = 0.039).

З огляду на вищенаведені дані можна стверджувати, що p70S6K є перспективним об’єктом досліджень, як можливий фактор розвитку пухлинних процесів. Даний фермент може в подальшому бути використаний як діагностичний маркер або мішень протипухлинної терапії.

Висновки

Встановлено, що пухлинні клітини епітеліального походження характеризуються гіперекспресією ізоформ p70S6K та p70S6Kв, підвищеним рівнем фосфорилювання рибосомного S6 білку, прогресія пухлинного процесу супроводжується змінами в експресії та внутрішньоклітинній локалізації ізоформ p70S6K. Високий рівень експресії p70S6K в ендотеліальних клітинах судин пухлин ендометрію вказує на її залучення до процесів ангіогенезу пухлин.

1. Отримано та охарактеризовано моноклональні антитіла до p70S6K, які здатні специфічно розпізнавати як ядерну, так і цитоплазматичну форми p70S6K та можуть застосовуватись в біохімічних та імуногістохімічних методах.

2. Встановлено, що наслідком екзогенного впливу ЕФР на клітини епітеліального походження in vitro є підвищення рівня експресії генів p70S6K та p70S6Kв. Рівень ЕФР-індукованої транскрипції p70S6K та p70S6Kв має пряму кореляцію з рівнем експресії рецептора ЕФР в досліджених лініях клітин.

3. Дія ЕФР in vitro призводить до підвищення рівня фосфорилювання субстрату p70S6K рибосомного білку S6, динаміка якого є різною в клітинах А431, HeLa та МСF7, що характеризуються різним рівнем експресії рецептора ЕФР.

4. З’ясовано, що підвищений рівень експресії p70S6K та p70S6Kв в пухлинній тканині карциноми Герена корелює з проліферацією пухлинних клітин та прогресією пухлинного процесу. Визначено, що найвищі показники експресії та ядерна локалізація обох ізоформ властиві раннім етапам розвитку пухлини, показано гіперекспресію p70S6K в клітинах судин пухлинної тканини карциноми Герена на початкових етапах розвитку пухлини.

5. Виявлено гіперекспресію p70S6K та p70S6Kв на рівні мРНК та білку у більшості зразків пухлин ендометрію людини, а також відмінності в локалізації та рівні фосфорилювання білку S6 в нормальній та пухлинній тканині.

6. Показано, що характерною для пухлинних клітин ендометрію людини є ядерна локалізація p70S6K та p70S6Kв.

7. Гіперекспресія p70S6K та високий рівень фосфорилювання рибосомного білку S6 в ендотеліальних клітинах судин пухлинної тканини ендометрію людини вказує на можливу участь p70S6K в процесах ангіогенезу пухлинної тканини.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Lytvyn D.I., Dudchenko T.N., Filonenko V.V., Savinskaya L.A., Pogrebnoy P.V. Expression of p70S6 kinase in Guerin’s carcinoma cells upon tumor development // Experimental Oncology. – 2003. - V.25, №2. – С. 149-151. (Дисертант приймав участь в дослідженні експресії ізоформ p70S6K в динаміці розвитку карциноми Герена методом Вестерн-блот аналізу).

2. Lytvyn D.I., Dudchenko T.M., Lizogubov V.V., Usenko V.S., Nespryadko S.V., Vinnitskaya A.B., Vorobyova L.I., Pal`chevskiy S.S., Filonenko V.V., Pogrebnoy P.V. Expression of - and -isoforms of р70S6 kinase in human endometrial tumors // Experimental Oncology. – 2003. - V.25, №4, – 274-279. (Дисертант проводив дослідження методами Вестерн-блотинга та ЗТ-ПЛР, приймав участь в аналізі отриманих даних та написанні статті).

3. Lizogubov V.V., Lytvyn D.I., Dudchenko T.M., Lubchenko N.V., Pogrybniy P.V., Nespryadko S.V., Vinnitska A.B., Usenko V.S., Gout I.T., Filonenko V.V. Immunohistochemical analysis of S6K1 and S6K2 expression in endometrial adenocarcinomas // Experimental Oncology. – 2004.- V.26, №4, – 287-293. (Дисертант приймав участь в проведенні імуногістохімічних досліджень, аналізі результатів та написанні статті).

4. Gorbenko H.N., Litvin D.I., Savinskaya L.A., Filonenko V.V. Generation and characterization of monoclonal antibodies to P70 S6 kinase // Abstract book 6th John Humphrey advanced summer programme in immunology. Molecular basis of immune response. Pushchino. - Russia, 2002. - P.40.

5. Lytvyn D.I., Dudchenko T.M., Filonenko V.V., Savins’ka L.O., Pogribniy P.V. Expression of p70S6 kinase in tumor cells upon the development of Guerin’s carcinoma in vivo // Abstract book Conference for Young Scientists, PhD Students and Students on Molecular Biology and Genetics, Dedicated to the Golden Jubilee of the Double Helix of the DNA and 30 Anniversary of the Institute of Molecular Biology and Genetics NAS of