НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут молекулярної біології та генетики

НЕГРУЦЬКА Валентина Володимирівна

УДК 574:539+577.21

РОЗРОБКА БІНАРНОЇ ФУНКЦІОНАЛЬНО АСИМЕТРИЧНОЇ БАКТЕРІАЛЬНОЇ СИСТЕМИ ЯК СПОСОБУ ОДЕРЖАННЯ БІОПРЕПАРАТІВ ДЛЯ РОСЛИННИЦТВА

03.00.20 – біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Науковий керівник: кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник

Козировська Наталія Олексіївна,

Інститут молекулярної біології та генетики

НАН України, старший науковий співробітник

відділу регуляторних механізмів клітини.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

cтарший науковий співробітник

Пирог Тетяна Павлівна,

Національний університет харчових технологій

МОН України,

завідувач кафедри біотехнології мікробного синтезу;

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник

Спірідонова Катерина Василівна,

Інститут молекулярної біології та генетики

НАН України, старший науковий співробітник

відділу генетики клітинних популяцій.

Провідна установа: Київський національний університет

імені Тараса Шевченка МОН України.

Захист дисертації відбудеться " 20 " червня 2006 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м. Київ, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України: 03680, м. Київ, вул. Заболотного, 150.

Автореферат розіслано 19 травня 2006 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук О. В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема вирощування високих врожаїв екологічно чистої сільськогосподарської продукції є актуальною сьогодні в світі і Україна не є винятком. Болючим питанням для аграрного господарства нашої країни є погіршення екологічного стану орних земель як за рахунок забруднення промисловими відходами, в тому числі і радіаційними, так і надмірного використання мінеральних добрив та пестицидів. Їхні залишки можна знайти в сільськогосподарській продукції, і, як наслідок цього, маємо значний негативний вплив на здоров’я людини. З екологічної точки зору, неконтрольоване використання різноманітного спектра мінеральних добрив та засобів боротьби зі шкідниками та хворобами рослин призводять до зменшення кількості корисних мікроорганізмів у ґрунті, а в цілому – зниження родючості ґрунтів (Дегодюк та ін., 1992; Шикула та ін., 2001).

Одним із заходів, що має сприяти вирішенню цих проблем є створення біопрепаратів, як повної або часткової альтернативи агрохімічним засобам. Біодобрива є безпечними та економічно доцільнішими (Дятлова, 2001; Tanvar et al., 2002).

Перші бактеріальні препарати було застосовано майже сто років тому, але на науковій основі вони створюються із 50-х років. Основною складовою біодобрива є корисні ґрунтові, ризосферні та ендофітні бактерії (Hallman et al., 1997; Vessey, 2003). Найперспективнішими є бактерії, які здатні локалізуватися в тканинах рослини не завдаючи їй шкоди, забезпечуючи її біологічно активними речовинами та попереджаючи проникнення рослинних патогенів (Козировська, 2001).

Найбільш ефективним для обробки посівного матеріалу є використання мікробної маси (живих мікроорганізмів). Проблема життєздатності живої неспо-роутворювальної культури бактерій, які є основою біопрепаратів, вирішується у світовій практиці двома основними шляхами: іммобілізацією на твердих носіях (торфі, стерильному ґрунті, активованому вугіллі, керамічних гранулах) або інкап-суляцією бактерії у м’який біосумісний полімер – альгінат (Bashan et al., 2002). Технологія альгінування бактерій поліпшує не тільки життєздатність, а й їхню конкурентноздатність. Цей підхід надійний, але трудомісткий і має велику собівартість. Недоліками використання бактерій на твердофазних носіях є їхня погана розчинність, суттєве вимивання клітин, невисоке приживлення мікроорганізму, енергетичні витрати. Застосування нових технологій гельової та хітозанової мікроіммобілізації на основі природних полісахаридів дозволило суттєво підвищити якість існуючих біопрепаратів і поліпшити їхні властивості.

Дана робота спрямована на пошук нового технологічного підходу до виробництва біопрепаратів. Цей підхід базується на розробці двокомпонентної бактеріальної системи, в якій один із компонентів несе корисні властивості для рослин, а інший продукує метаболіти для пролонгованого забезпечення життєдіяльності першого.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Виконана робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу регуляторних

механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за бюджетними темами № 2.2.4.23 “Вивчення підходів до створення асоціації господарсько-цінних рослин з ендофітними бактеріями” (№ державної реєстрації 0199U000725, 1999-2002 рр.) та № 2.2.4.23 “Роль ендемних ендофітних популяцій бактерій у розвитку рослин, що розмножуються мікроклонуванням” (№ державної реєстрації 0103U000338, 2003-2006 рр.).

Мета та завдання дослідження. Метою роботи була розробка двокомпонентної бактеріальної системи, як прототипу біопрепарату для рослинництва, на основі бінарних культур бактерій.

Для виконання цієї роботи необхідно було вирішити такі завдання:

1. Розробити основні теоретичні критерії існування двокомпонентної бактеріальної системи.

2. Виділити штами бактерії – потенційного продуцента екзополісахариду (ЕПС); ідентифікувати виділену бактерію, визначити її вплив на ростові параметри рослини; ідентифікувати і визначити деякі фізико-хімічні властивості синтезованого нею ЕПС, як складової бактеріальної системи.

3. Розробити модель бактеріальної системи на прикладі бінарної культури ЕПС-синтезувальна бактерія - Klebsiella oxytoca ІМБГ 26.

4. Розробити умови створення бінарних культур ЕПС-синтезувального штаму із бактеріями-партнерами шляхом спільного культивування.

Об’єкт дослідження – процес розробки основних критеріїв існування бактеріальної системи, що забезпечують довгострокове функціонування мікроорганізму, який має корисні для рослин властивості.

Предмет дослідження – ізоляція та ідентифікація ЕПС-синтезувальної бактерії; характеристика культивованих in vitro клітин Paenibacillus sp. ІМБГ 156, як суб’єкта бактеріальної системи; пошук оптимальних умов культивування для отримання бінарних культур Paenibacillus sp.ІМБГ 156 з бактеріями, що несуть корисні для рослин властивості, а саме, K. oxytoca ІМБГ 26, Pseudomonas fluorescens ATCC 13525, P. aureofaciens ІМБГ 228, Pseudomonas sp. ІМБГ 168 , Pseudomonas sp. ІМБГ 163, Pantoea agglomerans 1a, Agrobacterium sp. ІМБГ 260, як можливих прототипів біопрепаратів; дослідження збереження K. oxytoca ІМБГ 26 властивостей бактерії мінерального живлення у складі бінарної культури Paenibacillus sp.ІМБГ 156 + K. oxytoca ІМБГ 26.

Методи дослідження – мікробіологічні, цитологічні, біохімічні та молекулярні методи для ідентифікації бактерій; метод визначення молекулярно-масової неоднорідності мікробних полісахаридів, методи ідентифікації окремих ділянок бактеріальної ДНК із використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) для детекції бактерій у рослинах, статистичні методи аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Теоретично обґрунтовано основні критерії існування функціонально асиметричної бактеріальної системи, де один із компонентів має корисні властивості для рослин, а інший продукує метаболіти для забезпечення життєдіяльності першого. Запропоновано новий підхід до створення біопрепаратів для рослинництва, суть якого полягає у розробці двокомпонентної бактеріальної системи на основі бінарних культур бактерій, яка просторово

структурується за рахунок ЕПС і цеоліту. Вперше розроблено умови створення такої бактеріальної системи на основі Paenibacillus sp. ІМБГ 156, ЕПС якої є джерелом вуглецевого живлення і енергії для бактерії-партнера. Співіснування бактеріальних компонент системи відбувається за принципом коменсалізму. Розроблено новий принцип спільного культивування, при якому спочатку здійснюється вирощування “базової” культури до стаціонарної фази росту із подальшим інокулюванням бактерії-партнера. Базову ЕПС-синтезувальну бактерію було виділено із природного джерела – цеоліту та ідентифіковано як Paenibacillus sp. Поруч із цим мінерал цеоліт було використано у ролі іммобілізувального агента у розробленій нами системі. Розроблено систему тестування K. oxytoca ІМБГ 26 у кореневій системі рослини. Вивчення одержаних асоціацій і таких, що можуть бути складені з іншими одним чи декількома природними ізолятами ризосферних і ендофітних бактерій і Paenibacillus sp. ІМБГ 156, дозволить моделювати процеси, що мають місце в довкіллі, особливо, якщо суб’єкти таких асоціацій будуть добиратися за попереднім скринінгом природних мікробних спільнот ґрунтів.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено принципово новий тип бактеріальної системи для створення широкого кола біопрепаратів для рослин. Функціональна асиметричність цієї системи забезпечує довготривале існування бактерій у гельовій формі та відповідає усім технологічним вимогам до біопрепарату. Підібрано оптимальні умови синтезу ЕПС Paenibacillus sp. ІМБГ 156 для існування бінарного асоціату з азотфіксувальною K. oxytoca ІМБГ 26, за яких подовжується термін життєздатності останньої до трьох місяців зі збереженням її корисних властивостей. Це є достатнім для використання пари Paenibacillus sp. ІМБГ 156 – К. oxytoca ІМБГ 26 як прототипу біопрепарату для живлення рослин. На основі спільного культивування Paenibacillus sp. IМБГ 156 із різними корисними для рослин бактеріями показано можливість створення бактеріальних препаратів із заданими властивостями (біодобрива, біозахист рослин, тощо), залежно від вибору бактерії–партнера. За загальними результатами досліджень було розроблено основні стадії технологічного процесу отримання біопрепарату на базі спільного культивування Paenibacillus sp. ІМБГ 156 з бактерією-партнером. Принцип створення даної бактеріальної системи на основі Paenibacillus sp. ІМБГ 156 може бути рекомендовано для виробництва біопрепаратів для рослинництва.

Особистий внесок здобувача. Дисертанткою разом із керівником розроблено програму проведення експериментів та підібрано методи вирішення поставлених завдань. Огляд літератури, написання тексту дисертації та аналіз отриманих резуль- татів виконано безпосередньо здобувачем. Основний обсяг експериментальної роботи виконано здобувачем особисто або за її безпосередньої участі. Дисертанткою особисто підібрано умови отримання штучних бінарних культур бактерій шляхом їхнього спільного культивування, проведено ідентифікацію природного ізоляту Paenibacillus sp. ІМБГ 156, досліджено деякі властивості K. oxytoca ІМБГ 26 у складі бінарної культури та в асоціації з рослиною. У дисертаційну роботу внесено частину опублікованих матеріалів, які містять результати, отримані здобувачем особисто і у співавторстві. Визначення нуклеотидної послідовності здійснено у Лейденському університеті (Нідерланди),

визначення молекулярно-масового розподілу (ММР) ЕПС Paenibacillus sp. ІМБГ 159 здійснено у співробітництві з к.б.н. С.К. Воцелко, співробітником відділу фітопатології мікроорганізмів Інституту мікробіології та вірусології імені Д.К. Заболотного НАНУ. Визначення моносахаридного складу ЕПС Paenibacillus sp. проведено у співробітництві з к.х.н. А.Г. Терентьєвим, співробітником відділу комбінаторної хімії біологічно активних сполук Інституту молекулярної біології та генетики НАНУ. Розробка праймерів для тестування K. оxytoca за наявністю специфічних ПЛР-фрагментів гена полігалактуронази (pehX) і визначення умов ПЛР належить к.б.н. Г.Л. Ковтуновичу. Польові досліди з визначення дії бінарної культури Paenibacillus sp ІМБГ 156 – K. oxytoca ІМБГ 26 на урожайність: бобово-злакових травосумішів здійснені на ділянках Інституту землеробства УААН к.б.н. П.І. Кухарчуком, пшениці – на ділянках ІМБГ НАНУ Т.М. Вознюк. Отримані результати інтерпретовані дисертантом. Обговорення результатів досліджень здійснено спільно із науковим керівником – к.б.н., с.н.с. Н.О. Козировською, а також із к.б.н. М.В. Ковальчук, із якими автор має спільні публікації.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи доповідались на міжнародних наукових семінарах „Fourth European Nitrogen Fixation Conference”, (Севілья, Іспанія, 2000), “Природні екосистеми Карпатських гір в умовах інтенсивного антропогенного навантаження” (Ужгород, Україна, 2001), „5th European Nitrogen Fixation Conference” (Норвіч, Велика Британія, 2002), „First Ukrainian Congress for Cell Biology” (Львів, Україна, 2004).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 статей у фахових наукових виданнях та тези 6 доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел та додатків. Повний обсяг складає 128 сторінок друкованого тексту, що включає 17 рисунків, 10 таблиць, 2 додатки та перелік використаних джерел, який охоплює 147 наіменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. У роботі було використано штами природних ізолятів бактерій: Paenibacillus sp. ІМБГ 156, K. oxytoca ІМБГ 26, Pseudomonas sp. ІМБГ 163, 168, штами Agrobacterium sp. ІМБГ 260, Pseudomonas aureofaciens ІМБГ 228, Pantoea agglomerans 1a, люб’язно наданий д.б.н., проф. Р.І. Гвоздяком (Інститут мікробіології та вірусології імені Д.К. Заболотного НАН України), Pseudomonas fluorescens ATCC 13525 з колекції Інституту мікробіології та вірусології імені Д.К. Заболотного НАН України.

Для вирощування бактерій, за винятком Paenibacillus sp. ІМБГ 156, використовували середовище LB (Miller, 1972). Для вирощування Paenibacillus sp. ІМБГ 156 використовували рідке і агаризоване середовище Ешбі (Шеболина и др., 1997), у нашій модифікації, такого складу (г/л): K2HPO4 – 1; MgSO4Ч7 H2O - 0,2;сахароза – 10; цеоліт – 0,35, рН 7,0; і рідке, і агаризоване мінеральне середовище

А-3 (Александров, 1950) у нашій модифікації (г/л): KNO3 – 1,75; MgSO4Ч7 H2O – 1,3; Na2HPO4Ч12 H2O – 1, 4; цеоліт – 0,35 і 1%; сахароза –10; pH 7,0. Отримання бінарних культур проводили на середовищі MZ, яке відрізнялось від А-3 10 % вмістом цеоліту. Титри бактерій визначали за методом Коха на агаризованих середовищах: Paenibacillus sp. – Ешбі, а бактерії-партнера – на LB.

Виділення природних ізолятів ЕПС-синтезувальних бактерій здійснювали за традиційними методами (Аристовская и др., 1962). Ідентифікацію штамів здійсню- вали за визначником Берджі (1986) і аналізом нуклеотидної послідовності гена 16S рРНК за допомогою ПЛР із використанням універсальних праймерів рА (8 – 27) і рН (1542 – 1523) (Edwards et al., 1989) при температурі гібридизації 54 0С у стан-дартній реакційній суміші в присутності 1,5 мM MgCL2 (“Sigma”, США). Аналіз отриманих нуклеотидних послідовностей здійснювали за допомогою програм: Blastn електронної служби BLAST Національного центру біотехнологічної інфор-мації (NCBI, http://www.ncbi.nih.gov), Clustal W 1.83 (.su/ genebee.html). Визначення сумісності Paenibacillus sp. ІМБГ 156 з вибраними грам- негативними бактеріями здійснювали спільним висівом на тверде поживне середо- вище (Аристовськая и др., 1962). Можливість споживання ЕПС Paenibacillus sp. ІМБГ 156 бактеріями-партнерами визначали за наявністю їхнього росту у середови- щі з 0,5 % ЕПС як єдиного джерела вуглецю. Визначення моносахаридного складу ЕПС Paenibacillus sp. ІМБГ 156 здійснювали методом газорідинної хроматографії з попереднім кислотним гідролізом (Захарова, Косенко, 1982). Визначення ММР і середньо вагової молекулярної маси () здійснювали за методом визначення молекулярно-масової неоднорідності мікробних полісахаридів (Воцелко и др., 1989). Виділення плазмід та хромосомної ДНК, гідроліз ендонуклеазами рестрикції, лігування, гель-електрофорез, елюцію ДНК з гелю здійснювали за стандартними методиками (Sambrook et al., 1989). Визначення фрагмента гена полігалактуронази (pehX) K. oxytoca ІМБГ 26 у тканинах прикореневої зони картоплі здійснювали методом ПЛР (94 0C/20 c – 59 0C/30 c – 72 0C/30 c, з кінцевим синтезом – 72 0С/7 хв) у стандартній реакційній суміші (“Sigma”, США) у присутності 1,5 мM MgCL2, із використанням праймерів PEH-C (5'-gatacggagtatgcctttacggtg-3') i PEH-D (5'-tagcctttatcaagcggatactgg-3').У ділянкових дослідах використано насіння пшениці сорту "Рання-93" і бобово-злакову травосуміш. Насіння обробляли K. оxytoca ІМБГ 26 (монокультурою та у складі бінарної культури) у кінцевій концентрації 1Ч106 КУО/мл, 0,5 мл/г насіння.

Визначену нуклеотидну послідовність гена 16S рДНК Paenibacillus sp. ІМБГ 156 зареєстровано в GenBank за номером AY645946.

Наведені результати є середнім значенням дослідів, здійснених не менш, як у трьох повторах. Математичну обробку результатів досліджень здійснювали методами математичної статистики (Плохинский, 1980; Лакин, 1990) із застосуванням програми “SigmaPlot 8.0”. Вірогідність різниці оцінювали за допомогою критеріїв Стьюдента або Фішера при Р=0,05.

Результати дослідження та їх обговорення

Основні теоретичні критерії існування двокомпонентної бактеріальної системи.У попередніх розробках, що проводилась у відділі і стали передумовами

даної роботи, було показано можливість застосування цеоліту як твердофазного носія для клітин K. oxytoca, використовуючи такі його природні властивості, як наявність алюмокремнекисневого каркасу, що утворює системи порожнин і каналів на кшталт мікрокристалічної „губки”.

Дана робота спрямована на створення бактеріальної системи, яка б забезпечувала довготривале існування бактерій у рідкому поживному середовищі. Теоретичний аналіз мікробних процесів у ґрунті показує багатокомпонентне структурування мікробних спільнот, у яких одні забезпечують умови життя іншим. Одними із основних компонентів стабільності таких систем є структуроутворювальні метаболіти. Найбільш розповсюдженими у природних мікробних системах такими структуроутворювальними метаболітами є полісахариди, які виконують захисні функції та слугують джерелами живлення (Roberts, 1986). За аналогією до природних асоціацій, експериментальна бактеріальна система має включати такі складові: бактерію з корисними для рослин властивостями, ЕПС-синтезувальну бактерію, як компоненту, що пролонгує життя першої та іммобілізувальний агент. Використання як останнього природних цеолітів Сокирницького родовища було обрано зважаючи на структурний (алюмокремнекисневий каркас) і хімічний склад (SiO2 – 71,5 %; Al2O3 – 13,1 %; Fe2O3 – 0,9 %; MnO – 0,19 %; MgO – 1,0 7 %; CaO – 2,1 %; Na2O – 2,41 %; K2O – 2,96 %; P2O5 – 0,033 %; SO3 – сліди, як мікродомішки: нікель, ванадій, молібден, мідь, олово, свинець, кобальт і цинк). Виходячи з цього, виділена саме з цеоліту, як природного середовища існування, ЕПС-синтезувальна бактерія, з нашої точки зору, за рахунок складання з нею різних бінарних культур, має розширити можливості експериментальної бактеріальної системи. Це обумовлено її сумісністю з цеолітом при культивуванні, і природною здатністю вивільняти, за необхідністю, макро- і мікроелементи, які знаходяться у цеоліті у депонованому стані та завжди присутні на відміну від складових поживного середовища.

Отже, дана двокомпонентна бактеріальна система включає одну бактерію, яка несе корисні властивості для рослин, і другу – продуцента метаболітів для забезпечення життєдіяльності першої. Ця система є функціонально асиметричною на відміну від існуючих на сьогодні, де дія всіх суб’єктів спрямована на рослину.

Таким чином, бактеріальна система як спосіб одержання біопрепаратів для рослинництва має налічувати: —

бактерію (чи бактерії) з корисними для рослин властивостями, яка є основною складовою з огляду на цілеспрямованість системи (далі ці бактерії для зручності мають назву “бактерія-партнер”. Цей термін визначає їхнє місце у складі бактеріальної системи);—

бактерію, ЕПС якої має забезпечити джерела вуглецю та енергії і сприяти покращенню мінерального живлення бактерій-партнерів у складі бінарної культури in vitro, структурувати мікробну асоціацію, виконувати захисну функцію для бактерій-партнерів для поліпшення їхньої конкурентоспроможності та життєздатності, і, таким чином, є складовою, яка забезпечує функціональність системи; —

цеоліт як іммобілізатор, природне середовище ЕПС-синтезувальної бактерії

і постачальник макро- і мікроелементів для бактерії (чи бактерій) з корисними для рослин властивостями.

Все це, за аналогією з природною мікробною спільнотою, забезпечує сталість системи в цілому. Існування такої бактеріальної системи можливе за урахування умови відсутності антагонізму між її бактеріальними компонентами.

Виділення та ідентифікація природного ізоляту ЕПС-синтезувальної бактерії. Виходячи з наведеного вище і орієнтуючись на літературні дані про силікатні слизоутворювальні бактерії, природним джерелом для виділення ЕПС-синтезуваль- ної бактерії, було обрано цеоліт і кремінь. Після роздільного інкубування у рідкому мінеральному середовищі А-3 цеоліту та кременю, на агаровому середовищі Ешбі були отримані накопичувальні культури, з яких вилучено чотири штами, що відрізнялися від інших форм. Одержані чисті культури характеризувалися відсутністю росту на LB- і МПА-середовищах. Для скорочення кількості отриманих штамів перед подальшою ідентифікацією проведено їхню порівняльну характеристику за рестрикційним аналізом ПЛР-копій 16S рДНК.

За допомогою універсальних праймерів до 16S рДНК для кожного штаму було синтезовано ДНК-копії rrs-генів, розміром приблизно 1500 н.п., що відповідає такому за літературними даними. Виявлено, що за чотирма рестриктазами, а саме, AluI, AvaI, HaeIII, TagI, рестрикційні фрагменти 16S рДНК штамів 1, 2, 3 є однаковими між собою за розміром, кількістю та інтенсивністю смуг і різняться від штаму 4 за тими ж самими ознаками. Це свідчить про якщо не повну подібність штамів 1, 2, 3, то дуже значну спорідненість їхнього видового положення і, відповідно, на відмінність від штаму 4. Для подальшої роботи було обрано штам 1, виділений з цеоліту. Крім здатності желювання культуральної рідини (синтезу ЕПС), на користь обрання даного ізоляту 1 також свідчила експериментально встановлена відсутність плазмід у складі геному бактерії.

Виділена бактерія підбиралася як складова для створення бінарних культур із грамнегативними бактеріями, які сприяють росту рослин з метою використання як біодобрива для вирощування рослин. Тому неодмінним тестом мала бути перевірка штаму 1 на відсутність негативного впливу на ростові показники рослини, оскільки за наявності такого подальші розробки втрачали б сенс. Дані, які наведено у табл. 1, свідчать, що даний бактеріальний штам може бути прийнятним

Таблиця 1

Визначення впливу штаму 1 на ростові показники пшениці
(30-денні паростки)

Варіант | Суха маса однієї рослини, г | Довжина стебла, см | Довжина коріння,

см

Контроль | 0,0375±0,0023 а | 40,466±1,0032 а | 9,215±0,434 а

Штам 1 | 0,0369±0,0085 а | 44,856±1,2120 б | 10,960±0,460 б

Примітка. Показники, представлені в межах однієї колонки, які позначені однаковою літерою, не мають достовірних розбіжностей.

як складова бактеріальної системи для створення бінарної культури з корисною для рослини бактерією.

Ідентифікація штаму 1. Згідно визначника бактерій Берджі даний штам за біль- шістю культурально-морфологічних та фізіолого-біохімічних ознак належить до родини Bacillaceae роду Bacillus, але за своїми характеристиками повністю не збігається із описаними у визначнику представниками. Додатковою характерною ознакою досліджуваного ізоляту є відсутність росту на загально прийнятних багатих природних середовищах – МПА та LB.

Подальшу ідентифікацію було проведено за загально визнаним на сьогоднішній день аналізом нуклеотидної послідовності rrs-гена. ПЛР продукт 16S рДНК було секвеновано і отримано дві нуклеотидні послідовності довжиною 705 і 621 нуклеотидів, що загалом становило 88,4 % від загальної довжини гена.

Отримані послідовністі були проаналізовані і встановлено спорідненість досліджуваного штаму 1 представникам родів Васillus та Paenibacillus. Найбільшу гомологію, яка становила 97 %, досліджувані послідовності мають до депонованої послідовності Paenibacillus velasolus. На основі матриці рівня подібності, одержаної за використання гомологічних ділянок побудовано філогенетичне дерево (рис.1).

Рис. 1. Філогенетичне дерево, яке показує положення штаму 1 (Paenibacillus sp. ІМБГ 156). Корінь визначено залученням Escherichia coli як зовнішньої групи. Масштаб відповідає 5 нуклеотидним замінам на кожні 100 нуклеотидів

Примітка. Верхнім індексом Т позначено типові штами.

Виходячи з вищенаведеного, штам 1 було ідентифіковано як Paenibacillus sp. (; ; ; ; ; Paenibacillus; Paenibacillus sp. ІМБГ 156).

Розробка моделі бактеріальної системи на прикладі бінарної культури Paenibacillus sp ІМБГ 156 – K. оxytoca ІМБГ 26. Характеристика ЕПС Paenibacillus sp. ІМБГ 156 за моносахаридним складом та визначення оптимальних умов її культивування шляхом дослідження реологічних властивостей ЕПС. Оскільки виділена бактерія є складовою бінарної бактеріальної системи, в якій їй відведена роль джерела полісахаридів, було виявлено природу синтезованого нею полімеру. Це може бути одним із факторів визначення кола бактерій, що мають використовувати його як джерело вуглецю і енергії.

Встановлено, що ЕПС Paenibacillus sp. ІМБГ 156 є гетерополісахаридом, який складається з глюкози, галактози, маннози, фукози і невизначених фракцій у співвідношенні 63:5:31:0,7:1,5. Наступним етапом було визначення оптимальних умов культивування Рaenibacillus sp. ІМБГ 156, як продуцента ЕПС. Умови визначались, виходячи із вимог до бактеріальної системи, а саме, наявності ЕПС, як джерела вуглецю та енергії для бактерії-партнера і його кількості. Кількість ЕПС має бути такою, щоб забезпечувати рівномірний розподіл наявного цеоліту і, відповідно, бактерій, які сорбуються на ньому, по всьому об’єму культуральної рідини у вигляді суспензії. Тому на першому етапі достатність рівня синтезу ЕПС визначали за суспензійним станом цеоліту.

Для визначення оптимальних умов культивування Рaenibacillus sp. ІМБГ 156, вирощували на модифікованих поживних середовищах А-3 і Ешбі з подальшим дослідженням властивостей екзополісахариду (ММР) та в’язкості культуральної рідини. Поживні середовища відрізнялися наявністю джерела азоту у середовищі А-3 і були однакові за джерелом та кількістю вуглецю.

Виявлено відмінність ММР двох зразків ЕПС (рис. 2), який аналізували після 30 та 48 годин культивування на стадії монокультури (середовище А-3, 1 % сахароза). Це можна пояснити деструкцією ЕПС, яка обумовлює зменшення вмісту високо та середньо молекулярних фракцій та збільшення за рахунок цього низькомолекулярних. Це є суттєвим при розгляданні ЕПС Paenibacillus sp. ІМБГ 156 як кандидата джерела енергії та живлення для бактерій-партнерів.

Рис. 2. Залежність ММР ЕПС Paenibacillus sp. ІМБГ 156 від умов культивування:

1 - середовище Ешбі, 48 год культивування;

2 - середовище A-3, 30 год культивування;

3 - середовище A-3, 48 год культивування

Експериментально було визначено схему культивування Рaenibacillus sp. ІМБГ 156: вирощування бактеріальної культури на агаризованому середовищі, вирощування посівного матеріалу (ПМ) у пробірках на качалці (24 год), вирощування монокультури Рaenibacillus sp. у колбах на качалці (кількість ПМ становила 1/10 від загального об’єму поживного середовища). Встановлено, що оптимальні умови культивування Paenibacillus sp. ІМБГ 156 збігаються з такими для синтезу ЕПС і забезпечуються параметрами: поживне середовище А-3, рН 7,0, температура 28 0С, у режимі постійного перемішування.

Таким чином, показано, що для отримання оптимальної кількості ЕПС Paeni- bacilus sp. ІМБГ 156, найбільш прийнятним є використання середовища А-3, яке відповідає вимогам надлишку вуглецю відносно азоту (N/C 1:17,3). Термін культи- вування становить 30 год на етапі отримання монокультури. За цих умов культуральна рідина має в’язкість 150 мм2/с, що забезпечує підтримку цеоліту у стані суспензії.

Створення бінарної культури Paenibacillus sp. ІМБГ 156 – K. oxytoca ІМБГ 26 і дослідження властивостей бактерії-партнера. Модельним об’єктом для створення бінарної культури з Paenibacillus sp. ІМБГ 156 взято K. oxytoca ІМБГ 26, яку було тестовано на здатність споживання ЕПС як джерела вуглецю і енергії. K. oxytoca ІМБГ 26 може переводити атмосферний азот у доступну для рослин форму, виділяти ауксини, які стимулюють розвиток рослини, успішно конкурує з іншими бактеріями за рахунок проникнення у кореневу систему рослин (Козировська, 2001). Після визначення сумісності бактеріальних культур, була отримана бінарна культура Paenibacillus sp. ІМБГ 156 – K. oxytoca ІМБГ 26.

Культивування проводили на поживному середовищі MZ, яке відрізняється від середовища А-3 за кількісним (10 %) вмістом цеоліту. Враховуючи підвищення навантаження на ЕПС, а саме, збільшення кількості цеоліту в системі, наявність бактерії-партнера, як споживача ЕПС, і збільшення загального терміну культивування, вміст сахарози у поживному середовищі було збільшено до 1,5 %.

Враховуючи, що, максимальна питома швидкість росту цих бактерій не збі- гається у часі, процес отримання бінарної культури шляхом спільного культивуван- ня складається із двох етапів. Перший – вирощування Paenibacillus sp. ІМБГ 156 до стаціонарної фази, оскільки максимальна швидкість утворення ЕПС не збігається у часі із максимальною питомою швидкістю росту бактерії. Орієнтуючись на дані, одержані при визначенні ММР ЕПС Paenibacillus sp. ІМБГ 156 залежно від умов культивування, підсів бактерії-партнера доцільно було здійснювати після 30 год вирощування, оскільки на цей час має місце найбільший вихід ЕПС (в’язкість 170 – 140 мм2/с). Другий етап – подальше спільне культивування впродовж 18 год. Титр бактерії-партнера (K. oxytoca ІМБГ 26) при такому способі вирощування становить не менш ніж (1,4 ± 0,5)Ч109 КУО/мл. Культуральна рідина має консистенцію гелю (в’язкість розчину становить 110 – 85 мм2/с).

На основі отриманих даних визначені основні стадії технологічного процесу отримання бінарної культури Paenibacillus sp. ІМБГ 156 + K. oxytoca ІМБГ 26: підготовка ПМ, вирощування монокультури Paenibacillus sp. ІМБГ 156, вирощування бінарної культури Paenibacillus sp. ІМБГ 156 + K. oxytoca ІМБГ 26. Всі операції, включаючи фасування, здійснюються в асептичних умовах. Контроль: мікробіологічний (висів на поживні середовища, мікроскопіювання) і технологічний (температура, рН, аерація).

При вивченні тривалості збереження активності K. оxytoca ІМБГ 26 було встановлено, що при 10 0С її титр протягом трьох місяців знижується на порядок на відміну від чистої культури, де через місяць він вже не визначається (табл. 2).

Таблиця 2

Тривалість збереження активності K. оxytoca ІМБГ 26 при 10 0С

Варіант | Титр, Ч109 КУО/мл

Вихідний | 1 місяць | 2 місяці | 3 місяці

K. оxytoca ІМБГ 26 + Paenibacillus sp.ІМБГ 156 (MZ -середовище) | 5,4 | 4,1 | 1,12 | 0,59

K. оxytoca ІМБГ 26

(LB-середовище + цеоліт) | 44,2 | 1,02 | 5,93 | 0,207

K. оxytoca ІМБГ 26

(LB-середовище) | 13,6 | 0,04––

Для відповіді на питання про збереження K. оxytoca ІМБГ 26 у складі бінарної культури з Paenibacillus sp. ІМБГ 156 властивостей колонізувати внутрішні тканини рослини і зберігати метаболічну активність, було використано ПЛР. Присутність K. оxytoca ІМБГ 26 визначали за наявністю специфічного PEHС/PEHD (344 н.п.) фрагмента гена полігалактуронази (pehX). Унікальна нуклеотидна послідовність цього гена є диференційною ознакою K. оxytoca серед інших представників родини Klebsiella. Тестування сумарної рослинної ДНК показало наявність (рис. 3) специфічного PEHС/PEHD фрагмента у дослідних зразках (обробка бінарною культурою Paenibacillus sp. ІМБГ 156 – K. oxytoca ІМБГ 26) і відсутність його у контролі (без обробки). Проведений ЕcoRI-рестрикційний аналіз одержаних ампліконів підтвердив внутрішню локалізацію K. оxytoca ІМБГ 26 в тканинах дослідних рослин.

Рис. 3. Визначення K. oxytoca ІМБГ 26 у внутрішніх тканинах прикореневої зони картоплі за наявністю pehX-гена методом ПЛР:

1– амплікон з ДНК K. оxytoca;

2 – амплікон з ДНК картоплі (контроль);

3 – амплікон з ДНК картоплі (K. оxytoca +

Paenibacillus sp. ІМБГ 156);

4 – ДНК картоплі (K. oxytoca);

5 – маркер ДНК (н.п.);

6 – ЕcoR1-рестрикт амплікону 1;

7 – контроль ПЛР;

8-9 – ЕcoR1-рестрикт ампліконів 3-4

Отримання специфічного PEHС/PEHD ПЛР-продукту полігалактуроназного
гена K. oxytoca в досліджуваних рослинах картоплі методом RT-ПЛР дозволило допустити наявність метаболічної активності бактерії-партнера.

Отримані дані демонструють ефективність використання даного методу для моніторингу K. oxytoca у природному середовищі.

В експериментах на дослідних ділянках показано збереження бактерією K. oxytoca ІМБГ 26 здатності до забезпечення мінерального живлення рослин у складі бінарної культури з Paenibacillus sp. ІМБГ 156 (табл. 3).

Таблиця 3

Вплив бінарної культури Paenibacillus sp. ІМБГ 156 – K. oxytoca ІМБГ 26
на урожайність пшениці сорт "Рання-93"

Варіант | Вага 1000 зерен, г | Відсоток

Контроль | 23,598 | 100,0

Paenibacillus sp.- K. oxytoca | 28,214 | 119,5

K. oxytoca | 28,147 | 119,3

Примітка. Схожість насіння становила 98 %.

Про це свідчить збільшення ваги зерен при обробці насіння бінарною культурою відносно контрольних (обробка насіння водою), залишаючись на рівні дії чистої культури.

Проведені дворічні випробування бінарної культури Paenibacillus sp. ІМБГ 156 – K. oxytoca ІМБГ 26 на злаково-бобових травосумішах показали збільшення виходу кормових одиниць на 26 % щодо контролю при застосуванні мінеральних добрив Р60К90 та на 13 % (порівняно до контролів відповідного мінерального живлення) при мінеральному живленні Р60К90N30 (рис. 5).

Рис. 5. Урожайність багатокомпонентних бобово-злакових сумішей:

1 - Р60К90;

2 - Р60К90N30;

3 - Р60К90N30+30+30;

4 - K. оxytoca – Paenibacillus sp. + Р60К90;

5 - K. оxytoca – Paenibacillus sp. + Р60К90N30;

6 - K .оxytoca – Paenibacillus sp. + Р60К90N30+30+30

Таким чином, на модельній бінарній культурі Paenibacillus sp. ІМБГ 156 – K. oxytoca ІМБГ 26 показано принципову можливість створення двокомпонентної бактеріальної системи як біопрепарату, оскільки він за своїм впливом на вихід кор-мових одиниць не поступається добривам. Показано, що бактерія-партнер у складі
асоціації не втрачає своєї життєздатності та корисних для рослини властивостей.

Вивчення можливості спрямованого дизайну бактеріальної системи на основі Paenibacillus sp. ІМБГ 156 за рахунок заміни бактерії-партнера. Виходячи з потреб сільського господарства у різноманітних біопрепаратах, які застосовуються для мінерального живлення, захисту рослин, стимулювання їхнього розвитку, тощо, було досліджено можливість спрямованого дизайну бактеріальної системи, тобто заміни бактерії-партнера. Бінарні культури Paenibacillus sp. ІМБГ 156 з широким колом партнерів були створенні за тією ж схемою, що і Paenibacillus sp. ІМБГ 156 – K. oxytoca ІМБГ 26, тобто через спільне культивування двох бактерій після нарощування базової, Paenibacillus sp. ІМБГ 156, до стаціонарної фази. Цьому передував тест на сумісність кожної бактерії-партнера з основною бактерією.

Під час виконання роботи було розроблено основну схему технологічного процесу, яка складається з трьох стадій: підготовка ПМ Paenibacillus sp. ІМБГ 156 ("базової" культури), вирощування монокультури до стаціонарної фази та спільне культивування з бактерією-партнером (рис. 6). У цьому полягає відмінність запропонованої нами схеми культивування від класичної, за якої посів бактерій здійснюється одночасно.

Рис. 6. Схема отримання бінарної культури Paenibacillus sp. ІМБГ 156 –

бактерія партер шляхом спільного культивування

З таблиці 4 видно, що бактерії при такому способі вирощування, мають концентрацію (1–10)Ч109 КУО/мл. Такий спосіб вирощування надає змогу використання дешевого мінерального середовища (MZ), яке стає прийнятним для бактерій-партнерів завдяки наявності продуктів метаболізму базової бактерії. При вивченні властивостей бінарних асоціацій Paenibacillus sp ІМБГ 156 із псевдомонадами, показано, що комбінації мікроорганізмів були стабільними (збереження вихідного титру 1Ч109 КУО/мл до 6 місяців при 10 0С). При спільному вирощуванні також зберігалася антимікробна активність бактерій-партнерів.

Таблиця 4

Спільне культивування Paenibacillus sp. ІМБГ156 з бактеріями-партнерами

Варіант | Титр бактерії-партнера, 109 КУО/мл

наприкінці спільного культивування | наприкінці індивідуального культивування

K. oxytoca ІМБГ26 | 140,5 | 0,680,4

Pseudomonas sp. ІМБГ163 | 3,20,1 | 0,690,8

Pseudomonas sp. ІМБГ168 | 7,10,9 | 0,950,4

P. fluorescens ATCC 13525 | 160,7 | 0,930,2

P. aureofaciens ІМБГ288 | 3,70,7 | 0,590,8

P. agglomerans ІМВ56 | 5,00,3 | 0,630,2

Agrobacterium sp. ІМБГ260 | 3,70,7 | 0,150,5

Paenibacillus sp. ІМБГ156 | 0,240,3 | 0,240,3

Примітка. Поживне середовище MZ, термін культивування – 18 годин.

Аналізуючи створені бінарні культури на основі Paenibacillus sp. ІМБГ 156, взаємодію бактеріальних компонент системи можна визнати як коменсалізм, оскільки бактерія-партнер отримує вигоду, не завдаючи шкоди основній бактерії. Про це свідчить наявність живих клітин Paenibacillus sp. ІМБГ 156 на різних термінах існування бінарних культур. Збереження властивості Paenibacillus sp. ІМБГ 156 продукувати ЕПС, що за літературними даними є критичним фактором для природних ізолятів ЕПС-синтезувальних бактерій при тривалому культивуванні у лабораторних умовах, забезпечує присутність цеоліту у поживному середовищі, який, власне, і є її природним середовищем.

Результат експерименту із спільного культивування Paenibacillus sp. ІМБГ 156 з різними грамнегативними бактеріями показав можливості створення на основі даної системи бактеріальних препаратів різного типу (біодобрива, антимікробний агент тощо) залежно від вибору бактерії-партнера.

ВИСНОВКИ

Запропоновано новий підхід до створення біопрепаратів для рослинництва, суть якого полягає у розробці двокомпонентної бактеріальної системи на основі бінарних культур бактерій.

1.

2.

3.

4.

5.

6.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Negrutska V.V., Kozyrovska N.O. Ecologically-friendly crop production with microbial inoculants. I. The Dual, technology for inoculant production // Науковий вісник Ужгородського університету. Серія “Біологія”. – 2001. – № 9. – С. 76-79.

Особистий внесок здобувача – виділено природний ізолят ЕПС-синтезувальної бактерії і частково охарактеризовано як Paenibacillus sp., показано можливість її спільного культивування з грамнегативними бактеріями.

2. Kovalchuk M.V., Negrutska V.V., Zaetz I.E., Pasechnik L.A., Gvozdyak R.I., Kozyrovska N.O. Ecologically-friendly crop production with microbial inoculants. II. Biocontrol capacity of bacterial isolates, candidates for inoculant development // Науковий вісник Ужгородського університету. Серія “Біологія”. – 2001. – № 9. – С. 82-85.

Особистий внесок здобувача – підбір умов культивування і експериментальне одержання бінарних культур на основі Paenibacillus sp.

3. Негруцька В.В., Ковальчук М.В., Козировська Н.О. Технологія "Дуал" для виробництва широкого спектра біопрепаратів // Агроекологічний журнал. – 2003. – № 3. – С. 54-58.

Особистий внесок здобувача – експериментально створено бінарну культуру Paenibacillus sp.- K. oxytoca і показано можливість її використання як біопрепарату
мінерального живлення рослин, визначено основні стадії процесу культивування, показано можливість дизайну системи Paenibacillus sp. – бактерія-партнер, формування висновків.

4. Kovtunovych G., Lytvynenko T., Negrutska V., Lar O., Brisse S., Kozyrovska N. Identification of Klebsiella oxytoca using a specific PCR assay targeting the polygalacturonase pehX gene // Research in Microbiol.–2003.– V.154, № 8. – P.587-592.

Особистий внесок здобувача – проведення лабораторних досліджень із визначення можливості детекції K. oxytoca за наявністю pehX-гена, методом ПЛР.

5.