МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ДАНИЛА ГАЛИЦЬКОГО

ПЕЧЕНИК СЕРГІЙ ОЛЕГОВИЧ

УДК 616 - 053.2 - 08:575.224:577.21:612.014.4

ОСОБЛИВОСТІ ПАТОГЕНЕЗУ ТА МАНІФЕСТАЦІЇ СИМПТОМОКОМПЛЕКСУ, ЩО ВИНИК У ДІТЕЙ В УМОВАХ КОМБІНОВАНОГО ЗАБРУДНЕННЯ ДОВКІЛЛЯ СОЛЯМИ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ ТА ФТОРУ

14.01.10 – педіатрія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Львів – 2006

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в Інституті спадкової патології АМН України

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор Гнатейко Олег Зіновійович, Інститут спадкової патології АМН України, директор інституту

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Няньковський Сергій Леонідович, Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького МОЗ України, завідувач кафедри факультетської та шпитальної педіатрії

доктор медичних наук, професор Сорокман Таміла Василівна, Буковинський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри факультетської педіатрії та медичної генетики

Провідна установа:

Інститут охорони здоров’я дітей та підлітків АМН України, м. Харків

Захист дисертації відбудеться “25” лютого 2006 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К .600.04 при Львівському національному медичному університеті імені Данила Галицького (79000, м. Львів, вул. Пекарська, 69).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького (79010, м. Львів, вул. Січових стрільців, 6).

Автореферат розісланий “19” січня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат медичних наук А.І. Попович

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Динаміка екологічної ситуації в Україні зумовлює появу та збільшення площ територій з підвищеними концентраціями токсичних речовин у довкіллі (Сердюк А.М., 1996). Зростає частота захворювань, що виникають у дітей в умовах тривалого контакту з токсичними чинниками (Фесенко М.Є., 2000). Такі захворювання характеризуються латентним перебігом, ураженням декількох систем організму, важко піддаються діагностиці та лікуванню, часто приводять до хронізації патологічного процесу та інвалідизації. (Priceта ін. 1999, Баранов А.А. 1999, Лук’янова О.М. та ін. 2003).

Анатомо-фізіологічні особливості та характер поведінки роблять дітей більш чутливими до впливу ксенобіотиків (Faustmanта ін. 2000). Важкість клінічного перебігу екопатології в кожному окремому випадку визначається здатністю організму до детоксикації ксенобіотиків. Ефективність детоксикації залежить від функціональної повноцінності ферментних систем, що кодуються відповідними генами (Баранов В.С. 2000).

Патогенез екологічно обумовлених захворювань та фактори, що сприяють їх маніфестації залишаються маловивченими. Це гальмує розробку ефективних методів ранньої діагностики, профілактики та лікування таких захворювань. Визначення маркерів схильності до виникнення важких форм захворювань, пов’язаних із шкідливим впливом довкілля, залишається актуальним, оскільки дозволить формувати групи дітей підвищеного ризику та проводити їм адекватні профілактичні заходи (Козакевич В.К., 2000).

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках комплексних науково-дослідних робіт Інституту спадкової патології АМН України “Розробка принципів діагностики, лікування та профілактики захворювання, що пов’язане з інтоксикацією генотоксичними чинниками” № держреєстрації 0199U001344 та “Дослідження клініко-генетичного поліморфізму екопатології у дітей м. Соснівка, забрудненого генотоксичними чинниками” № держреєстрації 0102U001775.

Мета роботи: покращити ранню діагностику та профілактику екологічно детермінованого симптомокомплексу дітей із регіону, забрудненого генотоксичними чинниками, шляхом встановлення окремих патогенетичних механізмів та виявлення факторів, що обумовлюють важкість клінічного перебігу екопатології.

Завдання дослідження:

1. Оцінити динаміку частоти та спектру природжених вад розвитку в забрудненому регіоні.

2. Дослідити варіанти клінічного перебігу екологічно детермінованого симптомокомплексу у дітей із забрудненого регіону.

3. Визначити вплив епігенетичних факторів на маніфестацію екопатології у дітей, що постійно проживають у забрудненому регіоні.

4. Оцінити вплив особливостей генотипу на формування екологічно детермінованого симптомокомплексу та важкість його клінічного перебігу.

5. Визначити особливості регулювання гомеостазу кальцію в організмі дітей в умовах забруднення довкілля солями важких металів та фтору.

6. Дослідити активність статевих гормонів в організмі підлітків із забрудненого регіону.

7. Дослідити збалансованість механізмів регуляції життєвого циклу клітин в умовах впливу генотоксичних чинників.

Об’єкт дослідження: симптомокомплекс, що виник у дітей в умовах проживання на території з підвищеним вмістом солей важких металів та фтору в довкіллі.

Предмет дослідження: – патогенетичні механізми та фактори, що збільшують ризик маніфестації екологічно детермінованого симптомокомплексу у дітей.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні проведено комплексну оцінку ролі епігенетичних факторів у маніфестації захворювання дітей в умовах забруднення довкілля солями важких металів (СВМ) та фтору.

Отримані нові дані щодо розподілу алелей гена DQA1 головного комплексу гістосумісності у дітей, що проживають на забрудненій території. Встановлено зв’язок між особливостями GSTM-генотипу та важкістю перебігу екопатології.

Уточнено особливості гормональної регуляції гомеостазу кальцію в організмі дітей при їх тривалому контакті з СВМ та фтору.

Оцінено вплив генотоксичних чинників на активність статевих гормонів у підлітків із забрудненого регіону.

Вперше проведено комплексний аналіз частоти явищ повного передчасного розділення центромер (ПРЦ) та апоптозу лімфоцитів (АЛ) у дітей із екологічно несприятливого регіону (ЕНР).

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати можуть бути застосовані для ранньої діагностики та прогнозування екологічно детермінованих симптомокомплексів (ЕДС) в умовах проживання в техногенно забруднених регіонах. Розроблені оптимальні методи прогнозування важкості клінічного перебігу ЕДС. Надано практичні рекомендації педіатрам та лікарям сімейної медицини щодо формування груп дітей підвищеного ризику для проведення цілеспрямованих профілактичних та лікувальних заходів. Впровадження запропонованих заходів дозволить знизити частоту важких, хронічних форм ЕДС дитячого віку, зменшити відсоток інвалідизації.

Запропоновано модифікований метод дослідження апоптозу лімфоцитів крові, що дозволяє реєструвати явище на прижиттєвих препаратах клітин.

Впровадження результатів дослідження відбувалось на базі Львівської обласної дитячої клінічної лікарні, Львівського міжобласного медико-генетичного центру та міської поліклініки м. Соснівка Львівської області. Результати досліджень використовують у навчальному процесі на кафедрі пропедевтики дитячих хвороб Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено патентно-інформаційний пошук та узагальнення даних літератури за проблемою, визначено напрямок, мету, завдання та методологію дослідження. Самостійно проведено клінічні спостереження та ультразвукову діагностику хворих, виконано забір і підготовку біологічного матеріалу для досліджень. Здійснено статистичну обробку, аналіз та узагальнення отриманих результатів, сформульовано висновки та практичні рекомендації, реалізовано їх впровадження в роботу закладів охорони здоров’я.

Всі розділи дисертації написані здобувачем особисто. У друкованих роботах, опублікованих у співавторстві, дисертанту належить самостійне проведення обстежень, опрацювання та аналіз результатів, підготовка статей до друку.

Автор висловлює подяку керівнику відділення клінічної генетики Інституту спадкової патології АМН України к.м.н. Г.Р. Акопян, старшому науковому співробітнику к.б.н. І.А. Сєднєвій, старшому науковому співробітнику Інституту онкології АМН України Н.М. Храновській, завідувачу відділу регуляторних систем клітини Інституту біології клітини НАН України проф. Р.С. Стойка, старшому лаборанту О.Ю. Ключівській за допомогу в проведенні досліджень.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, виконаних в рамках дисертаційної роботи, відображені у виступах на Міжнародній конференції “Placentologic monitoring studies & ecotoxicologic aspects of genetic diseases”, що відбувалась в м. Краків (Польща) у 2000 р., на 3-му З’їзді медичних генетиків України (Львів, 2002), на конференції “Вікові аспекти чутливості організму до ксенобіотиків” (Чернівці, 2002), на Всеукраїнському симпозіумі педіатрів “Вплив екопатологічних чинників на стан здоров’я дітей” (Тернопіль, 2004), на конференціях з проблем медичної генетики (Харків, 2003; Москва 2003; Берлін 2004).

Публікації. Основні положення дисертації викладені у 18 публікаціях, з яких 9 – статті у фахових журналах, рекомендованих ВАК України, 9 – тези доповідей у матеріалах конференцій.

Об’єм та структура дисертації. Робота викладена на 156 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 24 таблицями, 21 рисунками. Складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, 6 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих результатів, висновків, практичних рекомендацій та переліку використаних літературних джерел (214, із них 160 - іноземних), що займає 21 сторінку.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Динаміку частоти та спектра ПВР вивчали за даними документації пологових установ. Проаналізовано стан 348942 новонароджених (Н) за 1986-2001 рр., в т.ч. у Сокальському районі – 32783, у Львівській області – 316159.

Клінічно обстежено 280 дітей із ЕНР (м. Соснівка, Сокальський район Львівської області), де зареєстровано підвищені концентрації СВМ та фтору в довкіллі (Смоляр Н.І. та ін. 1996; Рудько Г.І. та ін. 1997). Група контролю – 57 дітей з екологічно чистого регіону (ЕЧР). 40 із них взято за методом випадкової вибірки (Сидоренко Г.И. 1986). Вони склали загально-популяційну групу контролю (ЗПГК). Решта 17 дітей у неважкому клінічному стані знаходились на обстеженні у Львівській обласній дитячій клінічній лікарні.

Усім дітям проводили збір анамнезу, клінічний огляд, УЗД внутрішніх органів та щитовидної залози, ряд лабораторних тестів. Проведено ретроспективний аналіз стану здоров’я 1062 дітей диспансерної групи із ЕНР.

47 дітям із ЕНР визначено вміст токсичних металів у сироватці крові шляхом атомно-абсорбційної мас-спектрометрії (Yourd E. 2002) за допомогою обладнання Perkin Elmer.

У 27 дітей із ЕНР вивчали розподіл алелей гена GSTM1 та у 36 дітей – гена DQA1. Детекція алельних варіантів проводилася за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) (Иващенко Т.Є. 1999).

Активність лужної фосфатази (ЛФ) визначали 39 дітям за допомогою спектрофотометрії. Вміст кісткового ізоферменту (КІ) ЛФ визначали після інкубації сироватки крові протягом 5 хв. при t °С. Величина, на яку при цьому зменшується рівень загальної ЛФ, відповідає рівню КІ (Камышнинов В.С. 2000). Са++ сироватки крові визначали за допомогою арсеназо-III-метода, неорганічний фосфор – УФ детекцiєю фосфомолiбдатного комплексу; Mg++– кольоровою реакцією з магоном (Меншиков В.В. 1987). Активність паратгормону (ПТГ) та кальцитоніну (КТ) дослідили 35 дітям з ЕНР шляхом імуноферментного аналізу (ІФА) (Milesта ін. 1974) на апаратурі Multiscanз використанням наборів ACTIVE®PTHACTIVE® DSL. Активність естрадіолу дослідили у 80 дівчат, а тестостерону – у 30 хлопців з ЕНР. Контроль – 20 дівчат та 20 хлопців із ЕЧР. Використовували набори для ІФА Estradiol EIA DSL та Testosterone EIA DSL.

Для дослідження повного ПРЦ виготовляли препарати метафазних хромосом (Hungerford1965). Обстежено 26 дітей віком від 3 до 14 років із ЕНР.

Апоптоз лімфоцитів досліджували 3-ма способами. Проводили люмінесцентну мікроскопію 39 зразків нативної крові дітей із ЕНР із прижиттєвим забарвленням акридином оранжевим (Sigma, США) за методом (Крищишин Н.В., Луцик М.Д. 1978) в авторській модифікації. Застосовували мікроскоп ЛЮМАМ-Р2 (ЛОМО, Росія), при збільшенні у 500 разів. Вірогідними ознаками АЛ вважали зменшене поглинання барвника та фрагментацію ядра (Gasiorowski2001).

Цитологічний аналіз фіксованих мазків крові проводили на матеріалі 21 проби дітей із ЕНР. Фрагментацію ядер та наявність апоптичних тілець вважали достовірними ознаками апоптозу (Keesey1995).

Проточну цитофлуориметрію проведено на 15 зразках крові дітей із ЕНР за допомогою приладу FACScan (“Becton Dickinson”, USA), з використанням програми CellQuest (Фильченков А.А. 2001).

Статистична обробка результатів проводилась за допомогою програм “Statistica 5” та Microsoft Excel – 2000 (Боровиков В. 2001).

Результати дослідження та їх обговорення. Встановлено, що концентрації заліза, марганцю та свинцю у сироватці крові перевищували допустимі у кожної третьої дитини із ЕНР, а концентрації кадмію та кобальту – у кожної п’ятої.

Для оцінки тератогенних ефектів в умовах хімічного забруднення визначено частоту та спектр ПВР новонароджених в ЕНР в динаміці 1986–2001 років. Частота аномалій розвитку в ЕНР (423,3 на 104 Н) була вірогідно вищою, ніж по Львівській області (216,4 на 104 Н) протягом усього періоду спостереження (p<0,001). В період 1995-2001 рр., після початку масового захворювання дітей, середня частота ПВР в ЕНР була достовірно вищою (604,4 на 104 Н), ніж у період 9 років до його початку (282,3 на 104 Н) (p<0,001). Показник частоти зріс в ЕНР більш, як у 2 рази, тоді як у Львівській області – в 1,6 рази.

Після початку масового захворювання дітей в ЕНР зареєстровано достовірне підвищення частоти аномалій опорно-рухового апарату та статевої системи. Частота останніх сягнула 185 на 104 Н і стала достовірно вищою, ніж до 95 року (40,4 на 104 Н) (p<0,001), а також перевищила середні показники популяції України (17,5 на 104 Н) (p<0,001). Частота аномалій кістково-м’язової системи в ЕНР (287,2 на 104 Н) також була достовірно вищою від частоти у контрольній популяції (122,2 на 104 Н) (p<0,01) та по Україні в цілому (58,4 на 104 Н) (p<0,001).

Проведено комплексне обстеження дітей із ЕНР. Віковий діапазон обстежених 7-15 років. Серед обстежених незначно переважали дівчатка.

У дітей із ЕНР зареєстровано достовірно вищу, ніж у контролі, частоту скарг: втомлюваності, головного болю, зниження апетиту (p<0,001). Достовірно частіше реєструвались нудота та болі в животі (p<0,001). Відмічались скарги, характерні для інтоксикації, викликаної фтором, – носові кровотечі та болі в нижніх кінцівках, проте частота їх не була високою.

Загальний стан практично всіх дітей оцінено як задовільний. Блідість шкірних покривів достовірно частіше реєструвалась у дітей із ЕНР (p<0,001). У третини дітей із ЕНР виявлено мікрополіаденіт та ознаки алергійного діатезу, частота яких була достовірно вищою, ніж у контролі (p<0,001). Відмічено вищу, ніж у контролі, частоту болючості при пальпації живота (p<0,001). У значної частини дітей із ЕНР при огляді невролога виявлено прояви неврозу та вегето-судинної дистонії, частота яких достовірно перевищувала показники здорових дітей із ЕЧР (p<0,001).

При УЗД достовірно частіше, ніж в контролі, реєстрували ознаки зобу, холециститу, нагромадження кристалів солей у вивідній системі нирок (p<0,001).

Комплексне клінічне та ультразвукове обстеження дозволило встановити, що у дітей із ЕНР реєструвались зміни ряду систем організму: кісткової, сечовивідної, ендокринної та системи травлення, які часто відбувались на фоні алергійних реакцій та зниження імунологічної реактивності (табл. ).

Таблиця 

Частота захворювань в групах дітей за даними анамнезу, клінічного обстеження та УЗД

Виявлені захворювання | Частота захворювань в групах дітей (q)

Дослідна група | Контрольна група

ЕЧР– здорові | ЕЧР– хворі

n = 280 | n = 40 | n = 17

Гіпоплазія емалі зубів | 0,77* | - | -

Дисметаболічні нефропатії | 0,67** | - | 1,0

Хронічний тонзиліт | 0,63** | 0,25 | 0,40

Зоб I-II ст. | 0,39* | 0,05 | 0,08

Алергійний діатез | 0,37* | 0,21 | 0,22

Дискінезія жовчних шляхів | 0,18** | 0,07 | 0,2

Нічний енурез | 0,16 | 0,06 | 0,06

Примітки: 1. *– вірогідна різниця показника порівняно із контрольною групою

2. **– вірогідна різниця показника порівняно із групою ЕЧР – здорові

У своїх дослідженнях ми виділили 2 типи клінічного перебігу ЕДС. І тип характеризувався загальною інтоксикацією, функціональними розладами системи травлення, дисметаболічною нефропатією та ГЕЗ І ст. II тип характеризувався ураженням декількох систем органів, наявністю 3-х чи більше хронічних захворювань та ГЕЗ II–III ступеню. Такий поліморфізм ЕДС спонукав до пошуку факторів, що обумовлюють важчий перебіг екопатології.

Проведено ретроспективний аналіз стану здоров’я 1062 дітей диспансерної групи із ЕНР. Достовірно вищу частоту ГЕЗ важкого ступеня реєстрували в підгрупі дітей з масою тіла при народженні <2,5 кг (p<0,05). В підгрупі з тривалістю природного вигодовування 5 місяців і більше частота важких форм ГЕЗ була достовірно нижчою (p<0,05), ніж в підгрупах з менш тривалим природним вигодовуванням. Підтверджено достовірно нижчу частоту важких форм ГЕЗ в підгрупі дітей з прорізуванням перших зубів до 6 місяців у порівнянні з підгрупою з більш пізньою появою перших зубів (p<0,02). Більш пізнє прорізування перших зубів у дітей, в яких потім розвинулись важкі форми ГЕЗ, може бути результатом порушення мінералізації кісткової тканини в результаті дії підвищених концентрацій СВМ та фтору на ранніх етапах розвитку.

Значну роль у виникненні захворювань, пов’язаних з інтоксикацією, відіграє функціональна здатність ферментів, задіяних у біотрансформації ксенобіотиків, зокрема – глютатіон-S-трансферази (Lohmueller K.E. 2003). Нами досліджено особливості розподілу алелей гена GSTM1, що кодує цей фермент. При обстеженні 27 дітей із ЕНР з важким перебігом ЕДС (ГЕЗ, зоб 1-2 ст., хронічний дисметаболічний пієлонефрит, розлади гепато-біліарної системи), в 74% випадків зареєстровано генотип GSTМ1 /0, при якому фермент не продукується. Тільки у 26% дітей виявлено генотип GSTМ1 АВ, що забезпечує продукцію повноцінного ферменту. Встановлено достовірність різниці частоти патологічних змін у дітей в залежності від їх GSTМ– генотипу. Так, в підгрупі дітей з алеллю GSTМ1 /0 зоб зустрічався у 3 рази частіше, ніж у підгрупі носіїв алелі GSTМ1 АВ (р<0,001), патологія нирок у 2,5 рази (р<0,001), ГЕЗ у 2 рази (р<0,01), а частота захворювань ШКТ та ЖВШ – у 1,5 рази (р<0,01).

Схильність організму до того чи іншого захворювання в певній мірі обумовлена розподілом алелей генів головного комплексу гістосумісності. Ген DQA1 є представником цього сімейства генів. Відомі асоціативні зв’язки його алелей *0301 та *0501 з розвитком аутоімунних захворювань. Такі алелі визначають як “агресори”. З іншого боку, в організмі наявні алелі “протектори”, які визначають резистентність до захворювання. Для гена DQA1 прикладом є алель *0102 (Petrone2001). Проаналізовано частоту реєстрації алелей *0501 та *0102 у дітей із ЕНР. В усіх 36 дітей дослідної групи діагностовано “важчий” перебіг ЕДС.

Частота реєстрації алелі *0501 у хворих з проявами ГЕЗ та патологією нирок не відрізнялись від частот в контролі. Виявлено зростання відсотку носіїв “агресивної” алелі *0501 в дослідній підгрупі дітей з ознаками зобу (63,6% проти 54% в контролі), що співпадає з даними інших дослідників (Zantut-Wittmann1999). Зареєстровано зниження відсотку носіїв “протекторної” алелі *0102 серед хворих із важчими ураженнями нирок (17,4% проти 33% у контролі). Більшу кількість носіїв алелі *0501 відмічено в підгрупі дітей з ураженням жовчовивідної системи (70,6% проти 54% у контролі). В цій же підгрупі менше, ніж у контролі, носіїв алелі *0102 (11,8% проти 33%).

Наявність у дітей із ЕНР ознак пошкодження кісткової системи дозволило припустити, що в патогенезі ЕДС важливу роль відіграє порушення обміну кальцію. Це обумовило доцільність визначення активності паратгормону (ПТГ) та кальцитоніну (КТ), як головних кальцій-регулюючих чинників, на фоні визначення рівнів кальцію, магнію, фосфору, лужної фосфатази та її кісткового ізоферменту в сироватці крові.

Активність гормонів визначали 35 дітям із ЕНР та 43 дітям із ЕЧР. Остання група складалась із 2-х підгруп. 23 дитини перебували в хірургічному відділі стаціонару для усунення вроджених аномалій. Решта – 20 дітей знаходились в травматологічному відділенні з приводу переломів кісток. В цій підгрупі можна було очікувати змін регуляції обміну кальцію, не пов’язаних з екологічними чинниками. У 29% обстежених дітей із ЕНР клінічний перебіг ЕДС охарактеризовано як більш легкий, у 71% як більш важкий.

Вміст КТ в сироватці крові дітей із ЕНР, незалежно від важкості ЕДС, був достовірно вищим, ніж в групі контролю (хірургічне відділення) – p<0,05. В підгрупі дітей, що знаходились на лікуванні в травматологічному відділі, зареєстровано достовірно вищі рівні КТ, ніж в контролі (p<0,01), що можна пояснити реакцією організму на пошкодження кісткової тканини, необхідністю гальмування кісткової резорбції та прискорення репаративних процесів. Активність ПТГ в сироватці крові дітей із ЕНР була достовірно вищою, як у порівнянні з групою контролю (хірургічне відділення), p<0,02, так і з контингентом травматологічного відділення (p<0,01). Не виявлено різниці активності ПТГ в підгрупах із різною важкістю ЕДС. Особливості активності гормонів в обстежених групах відображені на рисунку 1.

Рис. . Активність КТ та ПТГ у дослідній (n=35) та контрольній (n=23) групах

У дітей із ЕНР виявлено зниження активності лужної фосфатази та її кісткового ізоферменту. При важчому перебігу ЕДС це спостерігали у 43% обстежених дівчат та у 33% хлопців. При легшому перебігу відповідно у 33% дівчат та 17% хлопців. За середніми значеннями активність ЛФ в підгрупі із важчим перебігом була достовірно нижчою, ніж у підгрупі з легшим перебігом (р<0,02).

У 75% обстежених дітей з важкими проявами ЕДС нами виявлено знижений рівень неорганічного фосфору та у 67% – магнію в сироватці крові. В той же час вміст кальцію у 88% обстежених дітей залишався в межах норми, що свідчить про підтримку цього показника за рахунок компенсаторних механізмів. Зареєстровані відхилення свідчать про порушення у дітей із ЕНР метаболізму як основних компонентів органічного матриксу так і мінеральної фази кісткової тканини. Враховуючи підвищений вміст фтору у довкіллі, можна припустити, що порушення процесів оссифікації у постраждалих дітей пов’язане з впливом його солей на активність кісткової фосфатази, здатністю іонів фтору заміщати іон гідроксилу в апатиті кісткової тканини, а також в активних центрах ферментів (Levy2003). З іншого боку, підвищення концентрацій СВМ у довкіллі може приводити до порушення функцій ниркових канальців, а відтак до дисбалансу кальцію, фосфору і магнію внаслідок зміни екскреції їх із сечею (Ігнатова М.С. 1996).

Для оцінки впливу ксенобіотиків на процеси статевого дозрівання дослідили активність статевих гормонів. Визначення активності естрадіолу не виявило достовірних відмінностей в групах дівчат із ЕНР та ЕЧР. Активність тестостерону за середніми показниками достовірно не відрізнялась в групах хлопців із ЕНР та в контролі. В той же час, у групі з легшим перебігом ЕДС відмічено тенденцію до зниження активності у порівнянні з групою із ЕЧР.

Виявлено порушення механізмів регуляції життєвого циклу клітин в організмі дітей із ЕНР, зокрема – підвищену частоту явища повного передчасного розходження центромер, а також коливання інтенсивності апоптозу лімфоцитів. Враховуючи контакт дітей із ЕНР з підвищеними концентраціями СВМ та фтору, в них можна було очікувати явищ хромосомної нестабільності (Major1999). Проведене дослідження є особливо актуальним, оскільки повне ПРЦ вважається одним із патогенетичних механізмів неопластичного процесу (Mehes2002). В дослідній групі повне ПРЦ реєстрували з частотою 4,9 на 100 метафазних клітин. В контролі частота складала 1,8 на 100 і була достовірно нижчою (P<0,01). Не виявлено різниці частоти ПРЦ в залежності від важкості ЕДС.

Апоптоз спрямований на елімінацію клітин з проявами хромосомної нестабільності. Ми вважаємо, що конституція метафазних хромосом у вигляді повного ПРЦ може бути передвісником апоптозу клітини. Оскільки у дітей із ЕНР виявлено підвищену частоту ПРЦ, логічним було очікувати в них коливань інтенсивності апоптозу. Враховували також повідомлення про індукцію цього явища під впливом солей свинцю (Oberto1996).

У нашому дослідженні рівень АЛ визначали за допомогою непроточної цитометрії із прижиттєвим забарвленням клітин акридином оранжевим. Апоптична трансформація клітин супроводжується конденсацією хроматину і деструкцією органел, що зменшує здатність поглинати флюорохром. Клітини набувають тьмяно-зеленого забарвлення, “гаснуть” лізосоми, реєструється фрагментація ядра (Gasiorowskiта ін. 2001).

Рівень апоптозу в об’єднаній дослідній групі був достовірно вищим, ніж в контролі. Хоча в групах дітей з більш важким (ВПС) та легшим (ЛПС) клінічним перебігом ЕДС не виявлено достовірної різниці у частоті АЛ, із 95% вірогідністю можна говорити про тенденцію до важчого перебігу у дітей із низькою інтенсивністю апоптозу (табл. ).

Таблиця 2

Порівняння частоти реєстрації апоптозу в групах дітей із забрудненого регіону та ЕЧР

Назва групи, чисельність | % апоптичних клітин (М±м) | Назва групи, чисельність | % апоптичних клітин (М±м) | Достовірність різниці (р)

ЕНР, м. Соснівка, n = 40 | 19,76±1,25 | Контроль, n = 15 | 12,92±1,36 | р<0,01

ЕНР, ВПС, n = 24 | 19,28±2,41 | ЕНР, ЛПС, n = 16 | 21,24±1,74 | р>0,05

ЕНР, ВПС, n = 24 | 19,28±2,41 | Контроль, n = 15 | 12,92±1,36 | р<0,02

ЕНР, ЛПС, n = 16 | 21,24±1,74 | Контроль, n = 15 | 12,92±1,36 | р<0,001

Частота реєстрації АЛ у зразках крові дітей із важчим перебігом ЕДС коливалась в межах 7–48% клітин. Виділено 3 когорти дітей: з показниками АЛ, відповідними до контролю (67%), з високими показниками (21%) і з дуже високими (12%). Коливання частоти апоптозу в групі дітей з ЛПС знаходились в інтервалі 10–33% клітин. У 40% дітей цієї групи частота апоптозу не відрізнялась від контролю, високі й дуже високі показники частоти реєстрували відповідно – у 40 та 20% дітей (рис. ).

Рис. . Розподіл когорт із різними частотами люмінесцентних ознак апоптозу в групах із важчим та легшим перебігом ЕДС

Збільшення чисельності когорт із підвищеним рівнем АЛ в групі дітей з ЛПС, на нашу думку, свідчить про ефективність процесів елімінації клітин з порушеною, внаслідок дії токсичних чинників, генетичною програмою. Наростання апоптозу, таким чином, захищає організм, запобігає онкогенній трансформації пошкоджених клітин і сприяє зменшенню клінічних проявів ЕДС.

Частоту реєстрації клітин з апоптичною морфологією досліджено у фіксованих мазках крові дітей дослідної та контрольної груп. Фрагментацію ядра та відшарування апоптичних тілець вважали достовірними ознаками апоптозу (TrauthKeesey1995). В мазках крові дітей із ЕНР частота реєстрації АЛ коливалась в межах 2–18% лімфоцитів, в мазках крові контрольної групи – 5–16%. За середніми значеннями частота апоптозу в групі із забрудненого регіону виявилась достовірно нижчою, ніж у контролі. В дослідній групі виділено 3 когорти дітей: з частотою реєстрації АЛ менше 5% лімфоцитів, з частотою на рівні 5–10% клітин та з високими показниками – >10% лімфоцитів. В контрольній групі не спостерігалось частоти апоптозу менше 5% лімфоцитів.

В групі з ВПС переважали діти зі зниженою частотою ознак АЛ – більше половини. При легшому перебігу захворювання знижену частоту цитологічних ознак апоптозу зареєстровано у 30% дітей. Висока частота спостерігалась лише у 9% дітей із важким перебігом, у 20% – з легким та у 40% в контролі (рис. ). Встановлено позитивний корелятивний зв’язок між важкістю перебігу ЕДС і напруженістю АЛ, визначеного за допомогою цитологічного аналізу – коефіцієнт кореляції –0,39 при р<0,05.

Рис. . Розподіл когорт із різною частотою апоптозу при дослідженні фіксованих мазків крові в залежності від клінічної важкості ЕДС.

При застосуванні методу лазерної проточної цитометрії частота реєстрації АЛ у зразках крові дітей з ЕНР коливалась в межах 1–15% лімфоцитів. У 33% обстежених зареєстровано високі показники АЛ (>10%), у 58% – його мінімальні значення (1–5%). Середні значення реєструвались у 8%. Не виявлено достовірної різниці у середній частоті АЛ в групах дітей із ЕНР та ЕЧР, проте, із 80% вірогідністю проглядалась тенденція до більш високих показників у дослідній групі. В групі дітей із ЕНР майже відсутні особи з середньою частотою апоптозу на рівні 5–10% клітин, тоді як у контролі таких осіб 33% (рис. ).

Рис. . Розподіл когорт із різною частотою апоптозу в дослідній і контрольній групах при застосуванні проточної цитометрії

В дослідній групі також реєстрували випадки підвищеної частоти апоптозу (>10% клітин), що не спостерігалось у контролі. Середня частота АЛ у когорті дітей з м. Соснівка з показниками <5% була вірогідно нижчою від контрольної. Отже, в групі дітей із ЕНР визначились 2 тенденції. У 1/3 дітей частота АЛ зростала до рівня, який не реєстрували в контролі, в інших (58%) – навпаки вірогідно знижувалась у порівнянні з групою ЕЧР.

Незважаючи на відмінності в отриманих результатах при застосуванні різних методів реєстрації апоптозу, слід виділити одну спільну тенденцію. Діти із забрудненого регіону поділились на 2 підгрупи. В одній частота АЛ мала тенденцію до зниження у порівнянні з контролем, у другій – навпаки була достовірно вищою. У дітей першої підгрупи клінічний перебіг ЕДС був більш важким, у другій підгрупі, навпаки – спостерігався легший перебіг ЕДС.

Таким чином, комплексне обстеження дітей з проявами ЕДС, що виник в умовах контакту з підвищеними концентраціями СВМ та фтору, виявило залучення в патологічний процес кісткової, сечовидільної, ендокринної систем, а також – шлунково-кишкового тракту. Підтверджено роль порушення гомеостазу кальцію в патогенезі екопатології. Визначено, що низька маса тіла при народженні, недостатньо тривале грудне вигодовування, наявність у генотипі дитини алелі 0/0 гена GSTM1, алелі *0501 гена DQA1 та відсутність алелі *0201 гена DQA1 сприяють більш важкому клінічному перебігу ЕДС. У дітей із ЕНР зареєстровані прояви хромосомної нестабільності у вигляді повного ПРЦ, а також – коливання інтенсивності процесів апоптозу, що корелює із важкістю перебігу екопатології. Результати дослідження доцільно враховувати при формуванні груп ризику розвитку ЕДС у дітей в умовах забрудненого довкілля. Це дозволить підвищити ефективність ранньої діагностики екопатології та уникнути розвитку важких клінічних форм, що зменшить відсоток інвалідизації.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення та нове вирішення актуальної наукової задачі сучасної педіатрії, що полягає у підвищенні ефективності ранньої діагностики, прогнозування та профілактики екологічно детермінованого симптомокомплексу, що виникає у дітей в умовах контакту з підвищеними концентраціями солей важких металів та фтору в довкіллі.

1. У забрудненому регіоні в динаміці 1986-2001 рр. відмічалась достовірно вища частота природжених вад розвитку серед новонароджених дітей, ніж в цілому по Львівській області – 423,3±51,2 проти 216,4±18,3 на 10000 (р<0,001). Зареєстровано зростання частоти ПВР в період після початку масового захворювання дітей із м. Соснівка з 282,3±37,1 до 604,4±53,7 на 10000 Н, р<0,001. Темпи зростання частоти ПВР в контрольній популяції Львівської області за той же період часу були достовірно повільнішими. В спектрі природжених аномалій, що дали достовірний приріст частот переважали вади розвитку статевої системи (з 40,4±7,7 до 185,5±29,8 на 10000 Н, р<0,001) та опорно-рухового апарату (з 138,0±22,3 до 287,2±38,8 на 10000 Н, р<0,01).

2. У дітей, що проживають на забрудненій території, достовірно частіше, ніж у ЗПГК, виявляли ознаки хронічної неспецифічної інтоксикації. Встановлено, що залучення в патологічний процес кісткової, сечовидільної, шлунково-кишкової та ендокринної систем є характерним для симптомокомплексу, що виник у дітей із м. Соснівка.

3. Порушення гомеостазу кальцію є важливою ланкою патогенезу екологічно детермінованого симптомокомплексу. У дітей, що постійно проживають на забрудненій території, незалежно від важкості клінічних проявів екопатології, зареєстровано вищі рівні активності паратгормону та кальцитоніну в порівнянні з контролем (p<0,02 та p<0,05 відповідно). Активність лужної фосфатази та її кісткового ізоферменту була достовірно зниженою у 31% обстежених дітей. У 75% обстежених дітей з важчими проявами симптомокомплексу виявлено знижений вміст неорганічного фосфору та у 67% – магнію в сироватці крові.

4. Наявність у генотипі дитини алелі 0/0 гена GSTM1, алелі *0501 гена DQA1 та відсутність алелі *0201 гена DQA1 сприяють більш важкому клінічному перебігу симптомокомплексу. Визначення згаданих алелей може бути використаним для прогнозування важкості екопатології.

5. Важкі форми гіпоплазії емалі зубів достовірно частіше зустрічались у дітей, що мали низьку масу тіла при народженні, у таких, що не отримували природного вигодовування, або отримували його нетривалий час. В цій групі спостерігали пізнє прорізування перших зубів в результаті порушення мінералізації кісткової тканини на ранніх етапах розвитку.

6. У дітей із забрудненого регіону зареєстровано прояви хромосомної нестабільності у вигляді підвищеної частоти повного передчасного розділення центромер. Частота цього явища в розрахунку на 100 метафазних клітин була достовірно вищою, ніж в контрольній групі осіб – 4,92±0,65 проти 1,83±0,32 (P<0,01).

7. Встановлено корелятивний зв’язок між важкістю перебігу захворювання у дітей із забрудненого регіону й напруженістю апоптозу, визначеного за допомогою цитологічного аналізу – коефіцієнт кореляції –0,39, при p<0,05. Знижена частота апоптозу асоціювалась із більш важким, а підвищена – з легшим перебігом симптомокомплексу.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Печеник С.О. Фактори, що сприяють маніфестації екологічного захворювання у дітей, які від народження проживають в умовах забрудненого довкілля // Одеський медичний журнал.– 2002.– №4(72).– С. .

2. Гаврилюк Ю.Й., Кіцера Н.І., Федоришин З.М., Геник-Березовська С.О., Печеник С.О., Грузинцева Н.А. Дослідження динаміки природжених вад розвитку серед новонароджених як складова частина генетичного моніторингу (огляд літератури та власні дані) // Перинатологія та педіатрія.– 2002.– №3.– С. . Автор брав участь у зборі клінічного матеріалу, підготовці роботи до друку.

3. Лук’яненко Н.С., Печеник С.О., Сєднєва І.А., Гнатейко Н.О. Порушення обміну кальцію при хімічному захворюванні дітей в умовах забруднення довкілля солями важких металів та фтору // Буковинський медичний вісник. – 2002.– №3.– С. . Автором зібрано клінічний матеріал, проведено статистичну обробку отриманих результатів, підготовлено роботу до друку.

4. Лук’яненко Н.С., Чайковська Г.С., Печеник С.О., Косцик Н.Р. Стан ендогенної інтоксикації у дітей, які проживають на території, забрудненій солями важких металів та фтору // Вісник Сумського Державного університету. Серія “Медицина” – 2002.– №11.– С. . Автор брав участь у зборі клінічного матеріалу, підготовці роботи до друку.

5. Печеник С.О., Акопян Г.Р., Сєднєва І.А., Ключівська О.Ю. Цитологічне та цитогенетичне дослідження явища апоптозу в клітинах крові при екопатології // “Актуальні проблеми акушерства і гінекології, клінічної імунології та медичної генетики”. Збірник наукових праць. Випуск 9. Київ – Луганськ. – 2003.– С. . Автором зібрано клінічний матеріал, проведено статистичну обробку результатів, підготовлено роботу до друку.

6. Печеник С.О., Федоришин З.М., Кіцера Н.І., Грузинцева Н.А. Динаміка частоти природжених вад розвитку серед новонароджених у регіоні, забрудненому солями важких металів та фтору // Одеський медичний журнал.– 2003.– №5(79).– С. . Автором зібрано клінічний матеріал, проведено статистичну обробку результатів, підготовлено роботу до друку.

7. Гнатейко О.З., Лук’яненко Н.С., Акопян Г.Р., Печеник С.О., Ковалів І.Б., Косцик Н.Р., Чайковська Г.С. Принципи медико-генетичного консультування сімей, що проживають на території, забрудненій солями важких металів та фтору // Вісник наукових досліджень. – №2(35).– 2004.– С. . Автор брав участь у формулюванні основних положень статті, підготовці роботи до друку.

8. Гнатейко О.З., Лук’яненко Н.С., Акопян Г.Р., Печеник С.О., Косцик Н.Р., Кашин О.І. Молекулярно-генетичні маркери екологічно детермінованого захворювання нирок у дітей, що проживають на території, забрудненій солями важких металів // Вісник Вінницького Національного медичного університету.– 2004.– №8(2).– С. . Автором зібрано клінічний матеріал, проведено статистичну обробку результатів, підготовлено роботу до друку.

9. Печеник С.О., Акопян Г.Р., Сєднєва І.А., Лук’яненко Н.С., Ключівська О.Ю., Храновська Н.М. Особливості каріотипу та рівень апоптозу лімфоцитів периферійної крові у дітей із регіону, забрудненого солями важких металів та фтору // Збірник наукових праць співробітників _ікт ім. Шупика. Випуск 13.– Книга 5.– Київ – 2004.– С. . Автором зібрано матеріал, проведено статистичну обробку результатів, підготовлено роботу до друку.

10. Гаврилюк Ю.Й., Печеник С.О., Сатурська А.Б., Давидов Л.Я., Кіцера Н.І., Невзгода Н.В., Колодка З.М., Гєник- Березовська С.О. Частота і спектр природжених вад розвитку серед новонароджених у Львівській області // Матеріали 2-го з’їзду медичних генетиків України. Львів, 18–20 жовтня 1995 р.– С. . Автор брав участь у зборі матеріалу, підготовці роботи до друку.

11. LukyanenkoPechenickWilczokNogaj P. Hypoplasia in Lviv regional north-west district // Placentologic monitoring studies and ecotoxicologic aspects of genetic disease. International Conference. May 13–15, 2000, Krakow, Poland.– P. Автор брав участь у зборі матеріалу, підготовці роботи до друку.

12. Лук’яненко Н.С., Печеник С.О., Сєднєва І.А., Гнатейко Н.О. Порушення обміну кальцію при хімічному захворюванні дітей в умовах забруднення довкілля солями важких металів та фтору // Матеріали 3-го з’їзду медичних генетиків України. Львів, 2–4 жовтня 2002 р.– С. . Автором зібрано клінічний матеріал, проведено статистичну обробку результатів, підготовлено роботу до друку.

13. Федоришин З.М., Гаврилюк Ю.Й., Кіцера Н.І., Печеник С.О., Грузинцева Н.А., Гєник-Березовська С.О., Єфіменко О.К. Епідеміологічні дослідження частоти природжених вад розвитку у районах Львівської області // Матеріали 3-го з’їзду медичних генетиків України. Львів, 2–4 жовтня 2002 р.– С. . Автор брав участь у зборі клінічного матеріалу, підготовці роботи до друку.

14. Сєднєва І.А., Печеник С.О., Гнатейко Н.О., Лук’яненко Н.С., Рудак А.В. Вивчення біохімічних маркерів