НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦІЙНОЇ МЕДИЦИНИ АМН УКРАЇНИ

Стрижельчик Ніна Георгіївна

УДК 575.224.4/.6:[576.8+595.773.4+599.32]:578.083.5

ГЕНЕТИЧНІ особливості мутагенезу, індукованого новими ІММОБІЛІЗОВАНИМИ сполуками

03.00.15 – генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі генетики і цитології Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна (м. Харків)

Наукові керівники: | доктор біологічних наук, професор,

академік АН Вищої школи

Шахбазов Валерій Гайович,

Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна МОН України,

професор кафедри генетики і цитології (м. Харків)

доктор медичних наук, професор

Бариляк Ігор Романович,

Науковий центр радіаційної медицини

АМН України,

завідувач відділу медичної генетики (м. Київ)

Офіційні опоненти: | доктор біологічних наук, професор

Дуган Олексій Мартем‘янович

Національний технічний університет України “КПІ” МОН України,

професор кафедри промислової біотехнології

кандидат біологічних наук, доцент

Боднар Лідія Степанівна,

Львівський національний університет імені Івана Франка МОН України,

доцент кафедри генетики і біотехнології (м. Львів)

Провідна установа: | Київський національний університет імені Тараса Шевченка Міністерства освіти і науки України

Захист відбудеться 02.06.2006 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.562.02 в Науковому центрі радіаційної медицини АМН України (04050, м. Київ, вул., Мельникова, 53).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Наукового центру радіаційної медицини АМН України (04050, м.Київ, вул., Мельникова, 53)

. | Автореферат розісланий 30.04.2006 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради |

Г.В. Стефанович

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Виявлення причинного зв’язку індукованих мутацій з появою злоякісних новоутворень, вроджених вад розвитку та спадкових хвороб обумовили необхідність пошуку ефективних засобів захисту людини від мутагенних впливів (М.П. Дубінін, 1999; М.П. Бочков, 1996; 1997; IARC, 1993; І.Р. Бариляк, 2001; 2003). Профілактика канцерогенезу або його інгібування реальні лише на початкових стадіях цього процесу. Вплив у передініціаційний період спрямований на недопущення канцерогенних агентів у клітину і, таким чином, на захист генетичних структур (Т.Д. Кужир, 1995; 1999). Одним з підходів до рішення цієї проблеми є іммобілізація мутагенних препаратів на полімерних матрицях. Іммобілізація з точки зору мутагенного процесу є фактором, модифікуючим мутагенну дію цих речовин (В.С. Міхеєв і співавт., 1993).

Особливе місце у життєдіяльності людини займають такі широко розповсюджені речовини як харчові добавки, багато з яких виявилися сильними канцерогенами (А.Д. Дурнєв, 1998; 2001).

Актуальним вважається як створення й впровадження у харчову промисловість нових безпечних харчових добавок, так і розробка інформативних схем і своєчасне тестування новостворених і вже існуючих харчових добавок на мутагенність. Ряд авторів вважають одним із найбільш перспективних напрямів у галузі пошуку нових безпечних барвників іммобілізацію різноманітних хромофорів на полімерних матрицях (Б.Ю. Ясницький, 1985). Однак насторожує той факт, що при створенні іммобілізованих барвників у ролі хромофору використані канцерогенні барвники. Неминуче виникає питання щодо універсальності захисного ефекту іммобілізації та правомірності його широкого застосування у різних галузях. З іншого боку, аналіз мутагенності нових іммобілізованих барвників надає інформацію про рівень генетичної небезпеки їх застосування як харчових добавок і є необхідною умовою при вирішенні питання щодо їх впровадження у практику. Виникає необхідність комплексної оцінки впливу іммобілізованих барвників на основні стадії мутагенезу/канцерогенезу: метаболізм, створення аддуктів ДНК-мутаген, репарація пошкоджень ДНК, експресія пошкоджень.

Важливим є також виявлення хімічних речовин, здатних модифікувати мутагенну дію саме іммобілізованих барвників. У зв’язку з тим, що мутагенний ефект антрахінонових барвників обумовлений вільно-радикальними процесами, особливий інтерес викликає вивчення впливу на мутагенний ефект іммобілізованих барвників антиоксидантів, що широко використовуються як харчові добавки.

Актуальність таких досліджень полягає в їх спрямованості на рішення таких задач, як охорона геному та первинна профілактика раку.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Наукові дослідження здійснювали у руслі кардинального напряму робіт кафедри генетики і цитології ХНУ в межах теми “Вивчення мутагенної активності нових допоміжних фармацевтичних речовин”, номер державної реєстрації 01.9.10046278.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є вивчення можливості інгібування мутагенної дії канцерогенних азо- й антрахінонових барвників шляхом їх іммобілізації на полімерних матрицях, оцінка інформативності схеми, яка включає використання чотирьох тест-об’єктів (мікроорганізми, культура клітин, комахи, ссавці) для тестування харчових добавок на мутагенність (на прикладі іммобілізованих барвників і гелєутворюючих речовин) та пошук модифікаторів мутагенної дії іммобілізованих барвників.

Для досягнення мети досліджень були поставлені наступні задачі:

1. Вивчити на індикаторних бактеріях в умовах з метаболічною активацією in vitro мутагенні і модифікуючі властивості нових іммобілізованих барвників та гелєутворюючих речовин.

2. Оцінити в системі in vitro на культурі лімфоцитів людини та в системі in vivo на клітинах кісткового мозку мишей закономірності цитогенетичного ефекту нових іммобілізованих харчових добавок.

3. Вивчити особливості мутагенного ефекту нових іммобілізованих сполук у статевих клітинах комах і ссавців залежно від дози, часу дії та стадії сперматогенезу.

4. Дослідити залежність мутагенного ефекту нових іммобілізованих сполук від наявності канцерогенних угруповань азо- й антрахінонової структури у ролі хромофору.

5. Оцінити рівень генетичної небезпеки для людини нових іммобілізованих барвників та гелєутворюючих речовин.

6. Проаналізувати інформативність окремих тест-об’єктів і всієї схеми тестування в цілому для оцінки мутагенності харчових добавок.

7. Дослідити сумісну дію азо- й антрахінонових барвників з модифікаторами хімічного мутагенезу.

Об’єктом дослідження є індукований мутагенез та його патогенетичні наслідки.

Предметом дослідження є модифікація мутагеної дії хімічних канцерогенів.

Методи дослідження: в основу методичного підходу в роботі покладена схема, яка включає поетапне використання в системах in vitro й in vivo чотирьох тест-об’єктів (мікроорганізми, культура клітин, комахи, ссавці).

Наукова новизна отриманих результатів–

Вперше проведено дослідження інформативності поетапної схеми тестування, яка включає чотири тест-об’єкти (мікроорганізми, культура клітин, комахи, ссавці) для оцінки харчових добавок на мутагенність.–

Визначена залежність мутагенного ефекту нових іммобілізованих сполук від наявності канцерогенних угруповань азо- й антрахінонової структури.–

Одержані якісні та кількісні характеристики цитогенетичного ефекту іммобілізованих барвників у системах in vitro й in vivo.–

Визначені особливості мутагенного ефекту нових іммобілізованих харчових добавок у статевих клітинах комах і ссавців.–

Встановлено, що іммобілізація проціонових канцерогенних барвників азо- й антрахінонової структури на полімерних матрицях не спроможна обмежити їх метаболізм і, таким чином, інгібувати індукцію мутагенного ефекту. –

Виявлена мутагенна активність іммобілізованих барвників – червоного крохмалю 5 СХ, червоної целюлози 5 СХ, червоного желатину 5 СХ та синього желатину ЧХ. Одержані результати надають інформацію про нові сполуки-мутагени.–

Установлено рівень генетичної небезпеки нових іммобілізованих барвників для людини.–

Показана спроможність деяких антиоксидантів та речовин, які мають мембранотропні властивості, модифікувати мутагенний ефект іммобілізованих барвників.

Практичне значення отриманих результатів. Одержані в процесі виконання роботи результати мають теоретичне і практичне значення для генетики, онкології, гігієни, харчової токсикології та фармакології.

Дані про наявність мутагенної активності у нових іммобілізованих барвників – червоного крохмалю 5 СХ, червоної целюлози 5 СХ, червоного желатину 5 СХ і синього желатину КХ – у рамках доклінічних випробувань були використані у ДНЦЛЗ при вирішені питання про можливість (або неможливість) упровадження цих барвників у харчову промисловість.

Дані дослідження потенційної мутагенної активності натрій-карбоксиметилкрохмалю (у рамках доклінічних випробувань) представлені у Фармкомітет МОЗ України. Натрій-карбоксиметилкрохмаль дозволений до застосування як допоміжна фармацевтична речовина (протокол № від 27.11.1994 р.).

Результати оцінки потенційної мутагенної активності натрій-карбоксиметилцелюлози використані у Державному науковому центрі лікарських засобів (ДНЦЛЗ) при впровадженні її у фармацевтичну промисловість.

У зв’язку з відсутністю на сьогодні розроблених методичних і методологічних підходів до оцінки харчових добавок на мутагенність у процесі виконання роботи запропонована та апробована інформативна схема тестування, яка включає поетапне використання чотирьох тест-об’єктів – мікроорганізми, культура клітин, комахи, ссавці. Показана висока інформативність та адаптованість нової схеми тестування до об’єктів дослідження.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно здійснено планування і організацію наукової роботи, розроблена (та апробована) інформативна схема тестування харчових добавок на мутагенність.

Автором безпосередньо проведені експериментальні дослідження ефекту іммобілізації на різних тест-об’єктах (мікроорганізмах, культурі клітин, комахах, ссавцях), визначено рівень генетичної небезпеки іммобілізованих барвників для людини, проведена статистична обробка, інтерпретація і теоретичне обґрунтування одержаних результатів. Автором дисертаційної роботи особисто сформульовані основні положення і висновки роботи, проведено апробацію та впровадження одержаних результатів.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень за темою дисертації були апробовані на: Всесоюзній конференції з генетики комах (Москва, 1991); VI з’їзді Українського товариства генетиків та селекціонерів ім. М.І. Вавілова (Полтава, 1992); науково-практичній конференції „Лікарські засоби України” (Харків, 1992); Першому (третьому) Російському з’їзді медичних генетиків (Москва, 1994); I Національному конгресі анатомів, гістологів, ембріологів та топографоанатомів України “Актуальні питання морфології” (Івано-Франківськ, 1994); науковій конференції, присвяченій 180-річчю від дня народження заслуженого професора Харківського університету Л.С. Ценковського (Харків, 2002), VIII Міжнародній науковій екологічній конференції ”Актуальні проблеми збереження стійкості живих систем” (Бєлград, 2004), науковій конференції “Генетика в сучасному суспільстві” (Харків, 2004), наукових семінарах відділу генетики НДІ біології ХНУ імені В.Н. Каразіна (Харків, 2004, 2005).

Публікації. Основні положення дисертації викладені у 30 наукових працях, в тому числі у 21 статті у наукових журналах (з них фахових – 20), 8 збірниках тез доповідей на міжнародних та національних конференціях і з’їздах, а також в одному депонованому рукописі.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, 8 розділів, висновків, і списку використаних джерел. Повний обсяг дисертації складає 200 сторінок, містить 28 таблиць і 34 рисунки. Список використаних джерел включає 331 найменування.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність обраної теми, сформульовані мета та задачі дослідження, визначені наукова новизна та практична цінність одержаних результатів.

Перший розділ містить аналітичний огляд даних літератури щодо сучасних уявлень про мутагенність/канцерогенність харчових добавок (в тому числі і барвників) та можливість модифікації мутагенного ефекту цих речовин.

Другий розділ дисертації присвячений характеристиці тест-об’єктів, методів дослідження та хімічних сполук, які досліджуються у роботі.

Основними тест-об’єктами досліджень були: мікроорганізми, культура клітин, комахи, ссавці. Дослідження в тесті Еймса проводили на штамах Salmonella typhimurium ТА і ТА . Для досліджень в культурі лімфоцитів людини використовували венозну кров практично здорових донорів чоловічої статі. У дослідах на Drosophila melanogaster використані лінії дикого типу Canton-S, D-32 та лінія Меллер-5. Цитогенетичні дослідження в системі in vivo провадили на мишах лінії C57BL/6. При оцінці ефектів у статевих клітинах обробці піддавали самців мишей F1 ?.

Методи. В роботі застосована батарея тестів. У дослідах in vitro – тест Еймса-Salmonella/мікросоми ссавців (B.N. Ames, 1975) та облік хромосомних

аберацій у культурі лімфоцитів периферійної крові людини (D.A. Hungerford, 1965). У дослідах in vivo – облік рецесивних, зчеплених зі статтю летальних мутацій (РЗСЛМ), облік домінантних летальних мутацій (ДЛМ) у дрозофіли (М.М. Тихомирова, 1990) та облік хромосомних аберацій (ХА) у клітинах кісткового мозку мишей (C.E. Ford et al., 1956) і облік домінантних летальних мутацій у зародкових клітинах мишей (А.М. Малашенко, 1978).

Хімічні речовини. У роботі досліджено: чотири іммобілізованих барвники – червоний крохмаль 5 СХ (ЧК), червона целюлоза 5 СХ (ЧЦ), червоний желатин 5 СХ (ЧЖ) та синій желатин ЧХ (СЖ), при створенні яких у ролі хромофору використано канцерогенні органічні барвники (азобарвник яскраво-червоний 5 СХ і антрахіноновий барвник яскраво-блакитний ЧХ), а в ролі матриць – натуральні полімери (крохмаль, целюлоза, желатин) та дві гелєутворюючі речовини (ГУР) – натрій-карбоксиметилкрохмаль (Na-КМК) і натрій-карбоксиметилцелюлоза (Na-КМЦ), які не містять канцерогенних угруповань.

Використані еталонні мутагени: 2-нітрофлуорен (20 мкг/чашку), 2-амінонітрофлуорен (40 мкг/чашку) та нітрозометилсечовина (НММ) (100 мкг/чашку) і (0,25%). В якості модифікаторів застосовані: аскорбінова кислота (0,1та іонол (10-5 М).

Статистичний аналіз отриманих результатів проводили за допомогою критерію ?2 та критерію Стьюдента t (Е.В. Гублер і співавт., 1973; Г.Ф. Лакін, 1980). Здійснювали кореляційний аналіз залежності мутагенного єфекту ІБ від дози (використовували спеціальні програми Microsoft Word, Microsoft Excel).

У третьому розділі наведено результати вивчення мутагенних та модифікуючих властивостей нових іммобілізованих сполук у тесті Еймса-Salmonella/мікросоми ссавців. Практично всі відомі схеми тестування включають тест Еймса (B.N.1975; Л.М. Фонштейн, 1987, 1988, О.М. Дуган, 1998).

В роботі за допомогою тесту Еймса в умовах метаболічної активації in vitro фракцією S-9 печінки щурів з кофакторами встановлено, що Nа-КМК та Nа-КМЦ у концентраціях 0,1–1000,0 мкг/чашку не є мутагенами для Salmonella typhimurium штамів ТА і ТА . Не виявлена модифікаційна (комутагенна) активність Nа-КМК та Nа-КМЦ у концентрації 100 мкг/чашку у відношенні мутагенного ефекту, що індукований стандартним мутагеном 2-нітрофлуореном (20 мкг/чашку) в клітинах штаму ТА (рис. 1).

Згідно з одержаними у роботі результатами, азо- та антрахінонові ІБ (ЧК, ЧЦ, ЧЖ і СЖ) у концентраціях 0,1–1000,0 мкг/чашку також не виявляють мутагенної активності в умовах як без, так і з метаболічною активацією фракцією S-9 печінки щурів. Ці результати вказують на те, що утворення мутагенних похідних (на початковій стадії біотрансформації ІБ) не пов’язане з системою мікросомального окиснення і не моделюється при активації in vitro.

Однак в умовах хімічно індукованого мутагенезу ІБ (ЧК і ЧЦ) у концентрації 10 мкг/чашку виявляють модифікуючу (комутагенну) активність – достовірно підвищують частоту генних мутацій, індукованих стандартним мутагеном 2-нітрофлуореном у концентрації 20 мкг/чашку в клітинах штаму ТА (рис. 2).

Рис. . Вплив Na-KMK і Na-KMЦ на частоту генних мутацій, індукованих 2-нітрофлуореном в клітинах Salmonella typhimurium:

1 – 2-нітрофлуорен; 2– 2-нітрофлуорен + Na-KMK; 3 – 2-нітрофлуорен + Na-KMЦ. | Рис. . Вплив червоного крохмалю і червоної целюлози на частоту генних мутацій, індукованих 2-нітрофлуореном в клітинах Salmonella:

1 – 2-нітрофлуорен; 2 – 2-нітрофлуорен + червоний крохмаль; 3 – 2-нітрофлуорен + червона целюлоза.

Таким чином, у результаті проведених експериментальних досліджень встановлено, що канцерогенні барвники азо- й антрахінонової структури,

іммобілізовані на полімерних матрицях, не виявляють мутагенної активності в тесті Еймса як в умовах без метаболічної активації, так і з метаболічною

активацією фракцією S-9 печінки щурів, однак проявляють комутагенну активність щодо мутагенів прямої дії (стандартного мутагену 2-нітрофлуорену).

Четвертий розділ присвячений вивченню цитогенетичного ефекту іммобілізованих барвників у культурі лімфоцитів периферійної крові людини в системі in vitro. Відомо, що канцерогени здатні метаболізуватися в клітинах, які культивуються поза організмом (IARC, 1980; D. Govani et al., 1982).

На підставі проведених експериментальних досліджень встановлена спроможність канцерогених барвників, іммобілізованих на полімерних матрицях, дозозалежним чином індукувати цитогенетичний ефект в культурі лімфоцитів периферійної крові людини (табл. 1). Виявлена висока позитивна кореляційна залежність між частотою виникнення аберантних метафаз та концентрацією ІБ – “доза-ефект”. Коефіцієнт кореляційної залежності складає: rЧК ,803; rЧЦ ,812; rЧЖ ,846; rСЖ ,811. Збільшення частоти ХА відбувається, головним чином, за рахунок одиночних та парних фрагментів. З інших типів аберацій спостерігали аберації обмінного типу та дицентричні хромосоми.

Встановлені на різних тест-об’єктах у дослідах in vitro суперечливі результати (негативні в тесті Еймса та позитивні в культурі лімфоцитів людини), обумовлені тим, що спектри метаболітів канцерогенів, які активуються субклітинними фракціями, не ідентичні тим, що утворюються при метаболічній активації цих речовин у цільній клітині (JARC, 1980). Згідно з даними літератури, барвники спроможні активуватися не тільки мікросомальними оксидазами, але й іншими ферментами (ядерними ферментами) (Г.А. Белицький, 1981).

Таблиця 1

Частота і типи хромосомних аберацій в культурі лімфоцитів людини, індукованих канцерогенними барвниками, іммобілізованими на різних полімерних матрицях

Концен.

барв-

ників,

мкг/мл | Про-анал. мета-фаз | Метафази

з абера-

ціями, %,

М±m | На 100 клітин | Метаф.

з про-

білами,

%,

одиноч.

фраг-

ментів | об-

мі-

нів | парн. фраг-ментів | дицен.хро-

мосом

Червоний крохмаль 5 СХ

Контроль | 600 | 1,16±0,30 | 0,8 | 0 | 0,3 | 0 | 2,6

8 | 300 | 2,3±0,32 | 2,0 | 0 | 0,3 | 0 | 3,3

80 | 320 | 2,8±0,68 | 1,6 | 0,3 | 0,6 | 0,3 | 4,3

800 | 300 | 8,3*±0,87 | 6,3 | 0,3 | 2,3 | 0,6 | 11,0

Червона целюлоза 5 СХ

Контроль | 700 | 1,28±0,20 | 1,0 | 0 | 0,28 | 0 | 2,8

16 | 300 | 2,6±0,33 | 2,0 | 0,3 | 0,3 | 0 | 3,0

160 | 300 | 3,0±0,91 | 2,0 | 0 | 0,6 | 0,3 | 4,5

1600 | 300 | 10,3*±0,87 | 8,0 | 0,6 | 2,3 | 0,6 | 13,0

Червоний желатин 5 СХ

Контроль | 700 | 1,14±0,33 | 0,8 | 0 | 0,2 | 0 | 2,3

7 | 300 | 2,0±0,57 | 1,7 | 0 | 0,3 | 0 | 2,6

70 | 350 | 2,5±0,67 | 2,0 | 0 | 0,5 | 0 | 3,1

700 | 300 | 7,3*±0,32 | 5,3 | 0,3 | 2,0 | 0,6 | 9,6

Синій желатин ЧХ

Контроль | 700 | 1,14±0,33 | 0,8 | 0 | 0,3 | 0 | 2,3

7 | 300 | 1,6±0,87 | 1,3 | 0 | 0,3 | 0 | 3,0

70 | 310 | 2,2±0,84 | 1,9 | 0 | 0,3 | 0 | 3,8

700 | 300 | 6,6*±0,66 | 5,6 | 0,3 | 1,5 | 0,3 | 8,0

Примітка. * P<0,01 (у порівнянні з контролем).

Таким чином, у ході проведених експериментальних досліджень встановлена здатність ІБ (незалежно від характеру полімерної матриці) дозозалежним чином індукувати цитогенетичний ефект у культурі лімфоцитів людини.

У п’ятому розділі наведена оцінка мутагенних властивостей нових іммобілізованих сполук в дослідах на Drosophila melanogaster. На дрозофілі можна вивчати весь спектр генетичних змін як у соматичних, так і в статевих клітинах (K.K. Patrnalk et al, 1992; Г.І. Мендельсон і співавт., 1990).

Згідно з одержаними у роботі результами, ІБ при обробці дорослих самців (концентрація 500 мг/мл) індукують достовірне підвищення частоти РЗСЛМ у зрілих сперматозоїдах дрозофіли лінії Canton-S порівняно з контролем (рис. 3).

Рис. 3. Частота РЗСЛМ у Drosophila при впливі ІБ:

1 – контроль; 2 – іммобілізовані барвники (ЧК, ЧЦ, ЧЖ, СЖ); 3 – ПК (НММ).

За допомогою методу обліку ДЛМ виявлена залежність мутагенної дії нових іммобілізованих сполук від особливостей їх хімічної будови – наявності канцерогенних угруповань. Дані, представлені на рис. 4 і 5, свідчать про те, що при обробці дорослих самців лінії Canton-S Na-КМК і Na-КМЦ не є мутагенними для статевих клітин дрозофіли. Однак, створені на тих же полімерних матрицях за допомогою активних канцерогенних азо- та антрахінонових барвників ІБ (ЧК, ЧЦ, ЧЖ та СЖ) достовірно підвищують (у концентрації 500 мг/мл) частоту ДЛМ у зрілих сперматозоїдах дрозофіли

Рис. 4. Вплив гелєутворюючих речовин та іммобілізованих барвників на частоту ДЛМ у Drosophila:

1 – контроль; 2 – гелєутворюючі речовини, 3 – іммобілізовані барвники (червоний крохмаль, червона целюлоза). | Рис. 5. Вплив іммобілізованих барвників на частоту ДЛМ у Drosophila melanogaster:

1 – контроль; 2 – іммобілізовані барвники (червоний желатин, синій желатин).

Відомо, що ДЛМ реалізуються на різних стадіях онтогенезу дрозофіли – як на ембріональній, так і на постембріональній. Згідно з одержаними результатами, при аналізі самців лінії Д-32, вирощених на середовищах, що містять різні концентрації ІБ (0,3; 0,4; 0,6%), виявлено дозозалежний мутагенний ефект. Встановлена висока позитивна кореляційна залежність між величиною концентрації ІБ і частотою ембріональної летальності (rЧК,846, rЧЦ,849, rЧЖ,879, rСЖ +0,855), постембріональної летальності (rЧК,827,

Рис. 6. Вплив різних концентрацій ІБ на частоту ембріональної та постембріональної летальності у Drosophila melanogaster:

1 – контроль; 2 – іммобілізовані барвники. | Рис. 7. Вплив різних концентрацій ІБ на плодючість дрозофіли за кількість лялечок та імаго:

1 – контроль; 2 – іммобілізовані барвники.

Реалізація ДЛМ на ембріональній та постембріональній стадіях онтогенезу в результаті призводить до дозозалежного зниження плодючості дрозофіли за кількістю лялечок та імаго. Встановлена висока негативна кореляційна залежність між величиною сумарної летальності та показниками виходу імаго (rЧК – 0,913, rЧЦ – 0,867, rЧЖ – 0,803, rСЖ – 0,885).

Таким чином, на підставі проведених експериментальних досліджень встановлено, що канцерогенні барвники, іммобілізовані на різних полімерних матрицях, здатні індукувати РЗСЛМ та ДЛМ як при обробці дорослих самців, так і личинок дрозофіли. Виявлена висока позитивна кореляційна залежність мутагенного ефекту від концентрації ІБ. Показана негативна залежність плодючості дрозофіли за кількістю імаго від величини сумарної летальності.

Здатність ІБ індукувати мутагенний ефект у дрозофіли обумовлена тим, що ферменти дрозофіли, які метаболізують проканцерогени, мають значну подібність до ферментів ссавців. Згідно з даними літератури, цитохром Р-450 та багато інших монооксигеназних активностей виявлені у мікросомальній фракції клітин як личинок, так і дорослих мух (A., 1987; В.А. Сидоренко, 2000).

Шостий розділ присвячений вивченню ефекту іммобілізації в системі in vivo на ссавцях. Найбільш передбачливі можливості мають тести з використанням соматичних та статевих клітин у дослідах in vivo (М.П. Бочков і співавт., 1975, І.Р. Бариляк і співавт., 2000).

У відповідності з одержаними в роботі результатами встановлена різна чутливість соматичних і статевих клітин до дії ІБ.

Як видно з табл. 2, при пероральному введенні в дозах 0,5 та 1,0 г/кг ІБ не

Таблиця 2

Частота хромосомних аберацій у клітинах кісткового мозку мишей С57ВL/6 за впливу різних доз іммобілізованих барвників

Доза

барв-

ників,

г/кг

Проана-аналіз. мета-

фазМетафази

з абераціями,

%,

М±m | На 100 клітин | Частота абер. на 1 абер.

метаф. | Частота метаф. з пробіл., % | Рівень значущості

Р | одиноч. фраг-

ментів | об-

мі-

нів | парн. фраг-

ментів

Контроль | - | 600 | 0,6±0,26 | 0,6 | 0 | 0 | 1,0 | 0,8 | - | Червоний крохмаль 5СХ | 0,5 | 500 | 0,6±0,24 | 0,6 | 0 | 0 | 1,0 | 1,0 | >0,05 | 1,0 | 500 | 1,4±0,40 | 1,4 | 0 | 0 | 1,0 | 1,2 | >0,05 | Червона целюлоза 5СХ | 0,5 | 500 | 0,8±0,32 | 0,8 | 0 | 0 | 1,0 | 0,8 | >0,05 | 1,0 | 500 | 1,2±0,52 | 1,2 | 0 | 0 | 1,0 | 1,0 | >0,05 | Червоний желатин 5СХ | 0,5 | 500 | 0,6±0,24 | 0,6 | 0 | 0 | 1,0 | 1,2 | >0,05 | 1,0 | 500 | 1,0±0,50 | 1,0 | 0 | 0 | 1,0 | 1,4 | >0,05 | Синій желатин КХ | 0,5 | 500 | 0,8±0,37 | 0,8 | 0 | 0 | 1,0 | 0,8 | >0,05 | 1,0 | 530 | 1,5±0,60 | 1,5 | 0 | 0 | 1,0 | 1,0 | >0,05 | викликають достовірного підвищення частоти метафаз з абераціями в клітинах кісткового мозку мишей лінії С57ВL/6. Основним типом ХА як у контрольних, так і в дослідних групах тварин, є одиночні фрагменти. Одержані результати узгоджуються з даними літератури, які вказують на низьку чутливість клітин кісткового мозку до мутагенної дії азосполук (A.D. Tates et al., 1980; F.1995; А.Д. Дурнєв, 1998).

Слід відзначити, що ушкоджуюча дія деяких мутагенів/канцерогенів відрізняється високою видовою та тканинною специфічністю.

У зв’язку з цим, оцінку мутагенної дії ІБ проводили також за допомогою методу обліку ДЛМ у зародкових клітинах мишей F1 CВА ? С57 ВL/6 при пероральному введенні в дозах 0,5 та 1,0 г/кг протягом 10 днів. Аналізували постмейотичні стадії сперматогенезу (табл. 3). При введенні дози 1,0 г/кг відзначено зниження кількості живих та підвищення кількості мертвих ембріонів на 1 вагітну самку.

Таблиця 3

Частота ДЛМ у зародкових клітинах мишей F1 CВА ? С57 ВL/6, індукованих канцерогенними барвниками, іммобілізованими на різних полімерних матрицях

Стадії

сперма то-

генезу |

Фер-

тіль-ність,

% | Кількість

ембріонів на 1 вагітну самку | Частота

ДЛМ,

% | Рівень значущості

ЖЕ | МЕ | ?2 | P

Контроль

Зрілі спермії | 86,6 | 8,15 | 0,34 | 4,0±0,78––

Пізні сперматиди | 75,0 | 8,22 | 0,37 | 4,3±0.54––

Ранні сперматиди | 83,3 | 7,90 | 0,32 | 3,8±0,69––

Червоний крохмаль 5 СХ

Зрілі спермії | 85,0 | 6,11 | 1,17 | 16,1±1,15 | 33,6 | <0,01

Пізні сперматиди | 73,3 | 7,02 | 0,97 | 12,2±1,35 | 14,9 | <0,01

Ранні сперматиди | 79,6 | 6,90 | 0,88 | 11,3±1,29 | 13,4 | <0,01

Червона целюлоза 5 СХ

Зрілі спермії | 80,0 | 6,04 | 0,91 | 13,1±1,30 | 21,5 | <0,01

Пізні сперматиди | 81,8 | 6,95 | 0,83 | 10,7±0,85 | 11,0 | <0,01

Ранні сперматиди | 78,9 | 7,33 | 0,63 | 8,3±1,22 | 6,7 | <0,01

Червоний желатин 5 СХ

Зрілі спермії | 84,7 | 6,28 | 1,12 | 15,1±1,04 | 16,8 | <0,01

Пізні сперматиди | 76,6 | 6,67 | 0,82 | 11,0±0,98 | 11,4 | <0,01

Ранні сперматиди | 82,1 | 6,89 | 0,70 | 9,4±1,12 | 9,6 | <0,01

Синій желатин ЧХ

Зрілі спермії | 88,3 | 5,90 | 1,22 | 17,1±1,27 | 29,6 | <0,01

Пізні сперматиди | 74,5 | 6,77 | 1,11 | 14,1±1,37 | 20,8 | <0,01

Ранні сперматиди | 77,5 | 7,04 | 0,80 | 10,1±1,11 | 12,7 | <0,01

Згідно з одержаними у роботі експериментальними даними, в дозі 1,0 г/кг ІБ індукують достовірне підвищення частоти ДЛМ на постмейотичних стадіях сперматогенезу у порівнянні з контролем. Найбільші зміни виявлені на стадії зрілих сперміїв.

Таким чином, у результаті досліджень на ссавцях у системі in vivo встановлено, що статеві клітини більш чутливі до впливу барвників азо- й антрахінонової структури порівняно з соматичними.

Водночас результати експериментальних досліджень свідчать про те, що Na-КМК і Na-КМЦ (які не містять канцерогенних угруповань) в дозах, що в 10 та 100 разів перевищують рекомендовану добову дозу (для харчової промисловості), не індукують цитогенетичний ефект у клітинах кісткового мозку мишей лінії С57 ВL/6 при однократному пероральному введенні як у дозі 6 мг/кг (експозиція 24 год.), так і 60 мг/кг (експозиція 6, 24 і 48 год.). Ці речовини у дозі 60 мг/кг не викликають достовірного підвищення частоти ДЛМ на постмейотичних стадіях сперматогенезу при однократному введенні самцям мишей F1 ВА ? С57 ВL/6.

Здатність ІБ індукувати мутагенний ефект у ссавців обумовлена тим, що, потрапляючи в організм, іммобілізовані барвники (як і неіммобілізовані) зазнають складних біохімічних перетворень під впливом ферментів мікрофлори кишечника (Д.Б. Парк, 1973; Г.М. Шатров і співавт., 1996). Продукти бактеріального розщеплення барвників (анілін та інші) спроможні всмоктуватися в кров та підлягати подальшому метаболізму (Г.Б. Плисс, 1991; Т. Г. С’яксте і співавт., 1991). Основним шляхом метаболізму похідних канцерогенних барвників є N-гідроксилювання мікросомальним цитохромом Р-450 (T. Kimura et al., 1985; Б.Л. Рубенчик, 1990; V., 1994; Л.Ф. Глущенко, 2000).

Не виявлено достовірного зниження мутагенної активності ІБ при зміні полімерних матриць (крохмаль, целюлоза, желатин).

У сьомому розділі викладено аналіз інформативності окремих тест-об’єктів та всієї схеми тестування в цілому при оцінюванні харчових добавок на мутагенність та визначенні рівня їх генетичної небезпеки для людини. Запропонована й апробована в роботі поетапна схема тестування дозволила встановити, що досліджувані іммобілізовані сполуки виявляють різну генетичну активність, залежну як від їх специфічності, так і від специфічності тест-об’єкта, на якому проводяться дослідження.

За результатами тестування досліджувані речовини можна розділити на дві групи: 1) немутагенні сполуки; 2) сполуки, які проявляють достовірну мутагенну активність, але не в у всіх тестах.

До першої групи речовин слід віднести нові гелєутворюючі речовини, що не містять канцерогенних угруповань, – Na-КМК та Na-КМЦ. Ці речовини не викликають мутагенного ефекту як у системі in vitro, так і in vivo.

До другої групи речовин належать нові іммобілізовані барвники (ЧК, ЧЦ, ЧЖ та СЖ), які створені на тих же полімерних матрицях, що і ГУР (крохмаль, целюлоза, желатин), але які містять канцерогенні угруповання азо- й антрахінонової структури у ролі хромофору. Ці речовини виявили мутагенну активність на трьох тест-об’єктах (табл. 4). Одержані нами результати (згідно з сучасними уявленнями щодо механізмів канцерогенного ефекту) обумовлені наявністю в структурі ІБ конденсованих бензольних кілець. Очевидно, основною помилкою дослідників, які створювали ІБ, є використаня у ролі хромофору барвників з канцерогенною активністю. Надія на те, що хімічне зв’язування з високомолекулярною полімерною матрицею відверне біодеструкцію барвника, і продукти бактеріального розщеплення не потраплять в кров і не включаться до подальшого метаболізму, не виправдалася.

З іншого боку, велике значення для оцінки мутагенності проканцерогенів має вибір тест-об’єктів, чутливість яких визначається характером метаболічної активації, що обумовлена видовими, тканинними та функціональними особливостями (Б.Л. Рубенчик, 1990).

Таблиця 4

Аналіз інформативності окремих тест-об’єктів при оцінці нових іммобілізованих харчових добавок на мутагенність

Назва досліджуваних

сполук | In vitro | In vivo

мікро-орга-

нізми,

ГМ | культур. лімфоц.

людини,

ХА | кома-

хи,

РЗСЛМ/

ДЛМ | клітини кістков.

мозку

ссавців,

ХА | зародк. клітин.

ссавців,

ДЛМ

Гелєутворюючі речовин

Na-карбоксиметилкрохмаль–– | / –––

Na-карбоксиметилцелюлоза–– | / –––

Іммобілізовані барвники

Червоний крохмаль 5 СХ– | +* | +* / +*– | +*

Червона целюлоза 5 СХ – | +* | +* / +*– | +*

Червоний желатин 5 СХ– | +* | +* / +*– | +*

Синій желатин КХ– | +* | +* / +*– | +*

Примітки:

1. + – наявність мутагенного ефекту;

2. * – P<0,01 (у порівнянні з контролем).

Порівняльний аналіз показав, що максимально виражений рівень мутагенного ефекту ІБ у різних тестах був різним і коливався від 0 до 2 балів. У тесті Еймса відзначена відсутність мутагенного ефекту (бал ). При аналізі цитогенетичної активності ІБ установлено слабкий ефект у культурі лімфоцитів людини (бал  ). Найвищий рівень мутагенного ефекту (середній ефект) відзначено в тестах з обліку: ДЛМ у зародкових клітинах мишей та РЗСЛМ і ДЛМ у дрозофіли (бал 2). Дози, за яких відбувалися достовірні зміни більш ніж в 15 разів перевищують рекомендовані добові дози ІБ для харчової промисловості. За рівнем генетичної небезпеки для людини ІБ відносяться до категорії “слабкий мутаген”.

Суперечливі результати тестування на мутагенність з використанням різних тест-систем обумовлені їх різною спроможністю до активації проканцерогенів, яка, в свою чергу, обумовлена наявністю і неоднаковою інтенсивністю функціонування ряду ферментних систем.

Таким чином, запропонована та апробована в роботі схема оцінки харчових добавок на мутагенність, яка включає поетапне використання в системах in vitro та in vivo чотирьох тест-об’єктів (мікроорганізми, культура клітин, комахи, ссавці), відрізняється високою інформативністю та адаптованістю щодо об’єктів тестування (табл. 8).

Рис. 8. Схема тестування харчових добавок на мутагенність

Отже, на підставі проведених експериментальних досліджень доведено, що іммобілізація канцерогенних азо- й антрахінонових барвників на різноманітних полімерних матрицях неспроможна усунути їх мутагенну дію.

Враховуючи, що ІБ створені для харчової промисловості (забарвлення ковбасних виробів), а також велику чутливість до впливу ІБ статевих клітин (у разі їх застосування) виникає загроза як індивідуального генетичного ризику, так і популяційного ризику (генетичної обтяжливості популяції). Згідно з

одержаними в роботі результатами, нами було заборонено подальшу розробку нових і впровадження у виробництво вже створених ІБ.

Восьмий розділ присвячений вивченню дослідження сумісної дії азо- й антрахінонових іммобілізованих барвників з модифікаторами хімічного мутагенезу. Відомо, що протекторний ефект щодо мутагенних впливів можливий і на стадії ініціації – у фазі метаболічної активації промутагенів (Р.М. Арутюнян, 1986; JARC, 1990; В.В. Худолей, 1998; Т.Д. Кужир, 1999). Виявлено, що велика кількість речовин (у тому числі й деякі харчові добавки) спроможні запобігати взаємодії генотоксичних продуктів з молекулами-мішенями і таким чином впливати на процеси становлення мутацій (В.В. Худолей, 1998; С.Б. Середєнін, А.Д. Дурнєв, 1992, 1998).

У зв’язку з цим в роботі була проведена серія досліджень щодо вивчення сумісної дії ІБ і модифікаторів хімічного мутагенезу. Дослідження проводили на дрозофілі лінії Д-32. Аналізували самців, вирощених на середовищах, які містили модифікатори (аскорбінову кислоту або іонол) та ІБ (ЧЖ або СЖ).

У результаті сумісного впливу іммобілізованого азобарвника червоного желатину і модифікаторів хімічного мутагенезу спостерігається достовірне зниження частоти ДЛМ при використанні: аскорбінової кислоти – на 29%, іонолу – на 24% (рис. 9). Аналогічні результати були одержані в ході вивчення сумісного впливу іммобілізованого антрахінонового барвника синього желатину і визначених модифікаторів. Спостерігалося достовірне зниження частоти ДЛМ у дрозофіли при використанні: аскорбінової кислоти – на 40%, іонолу – на 31% (рис. 10).

Рис. . Вплив модифікаторів хімічного мутагенезу на частоту ДЛМ у дрозофіли, індукованих червоним желатином:

1 – червоний желатин; 2 – червоний желатин + аскорбінова кислота; 3 – червоний желатин + іонол. | Рис. . Вплив модифікаторів хімічного мутагенезу на частоту ДЛМ у дрозофіли, індукованих синім желатином:

1 – синій желатин; 2 – синій желатин + аскорбінова кислота; 3 – синій желатин + іонол.

Таким чином, одержані експериментальні дані вказують на здатність ІБ біотрансформуватися в клітинах еукаріотів з утворенням реакційно-спроможних метаболітів, здатних вступати у взаємодію з модифікаторами хімічного мутагенезу, наслідком чого є ослаблення мутагенної дії ІБ. В результаті спостерігається достовірне зниження частоти виникнення ДЛМ, індукованих ІБ у зрілих сперматозоїдах дрозофіли.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведене теоретичне обґрунтування і представлена оцінка ефекту іммобілізації – нового вирішення наукової проблеми щодо профілактики мутагенного ефекту канцерогенних сполук. Встановлено, що іммобілізація канцерогенних органічних активних дихлортриазинових барвників на натуральних полімерних матрицях (крохмаль, целюлоза, желатин) не є універсальним засобом модифікації, здатним обмежити їх метаболізм і, таким чином, інгібувати індукцію мутагенного ефекту.

1. Мутагенний ефект іммобілізованих барвників залежить як від особливостей їх біотрансформації, так і від можливостей трансформуючих систем різних тест-об’єктів. Іммобілізовані барвники в концентраціях 0,1– 1000,0 мкг/чашку не виявляють мутагенної активності у тесті Еймса-Salmonella/мікросоми ссавців в умовах метаболічної активації фракцією S-9 печінки щурів, але проявляють комутагенну активність, достовірно підвищуючи (в концентрації 10 мкг/чашку) частоту генних мутацій, що індуковані в клітинах Salmonella typhimurium 2-нітрофлуореном.

2. Іммобілізовані барвники, які не проявили мутагенної активності у тесті Еймса-Salmonella/мікросоми ссавців, у дослідах на Drosophila melanogaster індукують рецесивні, зчеплені зі статтю летальні мутації і домінантні летальні мутації при обробці дорослих самців (500 мг/мл), а при дії на личинки (у концентраціях 0,3; 0,4; 0,6%) дозозалежним чином підвищують частоту ембріональної і постембріональної летальності в F1 та достовірно знижують показники плодючості дрозофіли за кількістю лялечок і імаго.

3. Цитогенетичні ефекти іммобілізованих барвників мають ряд особливостей в системах in vitro та in vivo. В культурі лімфоцитів людини червоний крохмаль 5 СХ (8; 80; 800 мкг/мл), червона целюлоза 5 СХ (16; 160; 1600 мкг/мл), червоний желатин 5 СХ і синій желатин КХ (7; 70; 700 мкг/мл) дозозалежним чином підвищують частоту хромосомних аберацій. Виявлена висока позитивна кореляційна залежність мутагенного ефекту від концентрації іммобілізованих барвників – “доза-ефект”.

4. В системі in vivo на ссавцях показана висока тканинна специфічність ушкоджуючої дії іммобілізованих барвників – встановлена більша чутливість статевих клітин до впливу іммобілізованих барвників, ніж соматичних. При пероральному введенні самцям в дозі 1,0 г/кг протягом 10 днів іммобілізовані барвники достовірно підвищують частоту домінантних летальних мутацій в зародкових клітинах мишей F1 CBA х C57BL/6, але не індукують достовірних змін частоти хромосомних аберацій у клітинах кісткового мозку самців мишей С57BL/6.

5. Мутагенний ефект нових іммобілізованих сполук залежить від особливостей їх хімічної будови – наявності канцерогенних угруповань азо- й антрахінонової структури.

6. Гелєутворюючі речовини – натрій-карбоксиметилкрохмаль і натрій-карбоксиметилцелюлоза – не є мутагенами. Ці сполуки в концентраціях 0,1–1000,0 мкг/чашку не індукують генних мутацій в тесті Еймса; при концентрації 100 мкг/чашку не виявляють комутагенної активності відносно мутагенного ефекту, індукованого 2-нітрофлуореном (20 мкг/чашку); при концентрації 500 мг/мл не підвищують спонтанний рівень домінантних летальних мутацій у дрозофіли; при пероральному введенні в дозах, які перевищують рекомендовану до застосування добову дозу в 10 та 100 разів (6 і 60 мг/кг), не індукують підвищення частоти хромосомних аберацій у клітинах кісткового мозку самців мишей C57BL/6 і домінантних летальних мутацій у зародкових клітинах мишей F1 CBA х C57BL/6.

7. Нові іммобілізовані барвники (червоний крохмаль 5 СХ, червона целюлоза 5 СХ, червоний желатин 5 СХ і синій желатин ЧХ), при створенні яких у ролі хромофору використані канцерогенні барвники азо- й антрахінонової будови, за рівнем генетичної небезпеки для людини відносяться до категорії “слабкий мутаген”. Не досягнуто достовірного зниження рівня мутагенної активності іммобілізованих барвників при зміні неспецифічних модифікаторів (полімерних матриць – крохмалю, целюлози, желатину).

8. Розроблена та апробована у процесі виконання роботи схема тестування харчових добавок на мутагенність, яка включає поетапне використання чотирьох тест-об’єктів (мікроорганізми, культура клітин, комахи, ссавці), відрізняється високою інформативністю й адаптованістю до досліджуваних речовин. Найбільш інформативним тестом для оцінки мутагенності сполук, які містять канцерогенні угруповання азо- й антрахінонової структури, є облік домінантних летальних мутацій у зародкових клітинах мишей у хронічному експерименті. Зручними відбірковими тестами є облік рецесивних, зчеплених зі статтю летальних мутацій і домінантних летальних мутацій у дрозофіли.

9. Модифікатори хімічного мутагенезу –