Національний аграрний університет

Акулов

Олександр Юрійович

УДК 582.288+663.421:581.2 (477.54)

БІОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ BІPOLARІS SOROKІNІANA (SACC. ІN SOROKІN) SHOEMAKER І ДІАГНОСТИКА ЗБУДНИКІВ КОРЕНЕВОЇ ГНИЛІ ТА ЧОРНОГО ЗАРОДКУ ЯРОГО ЯЧМЕНЮ

06.01.11 – фітопатологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі мікології та фітоімунології Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна

Науковий керівник – кандидат біологічних наук, професор

Глущенко Василь Іванович,

Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна,

завідувач кафедри мікології та фітоімунології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, доцент

Слюсаренко Олександр Миколайович, Одеський національний університет імені І.І. Мечникова,

професор кафедри мікробіології та вірусології

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Крючкова Лариса Олексіївна, Інститут фізіології рослин і генетики НАНУ, старший науковий співробітник відділу фізіології росту і розвитку рослин

Провідна установа – Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ, відділ фізіології та систематики мікроміцетів, м. Київ

Захист відбудеться „20” квітня 2007 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.02 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 15, навчальний корпус № , аудиторія 65.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 13, навчальний корпус № , к. 28.

Автореферат розісланий 6 березня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Мороз М.С.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Фітопатогенний гриб Bіpolarіs sorokіnіana (Sacc. іn Sorokіn) Shoemaker, донедавна відомий як Helmіnthosporіum satіvum Pammel, C.J.іng et Bakke, є повсюдно розповсюдженим і небезпечним збудником хвороб хлібних злаків. Він здатний інфікувати всі надземні та підземні органи рослини й викликає темно-буру плямистість листя, гельмінтоспоріозну кореневу гниль та чорний зародок насіння. Найбільш уражуваною цим грибом культурою є ярий ячмінь, втрати врожаю якого досягають 30% для плямистості листя та 50% і більше для кореневої гнилі.

Протягом більше ста років, що пройшли з часу першоописання B. sorokіnіana, цей гриб неодноразово привертав увагу фітопатологів, таксономістів, біохіміків, генетиків і молекулярних біологів. Проте, незважаючи на це, багато аспектів його біології залишаються мало вивченими або суперечливими. Згідно з традиційною точкою зору, B. sorokіnіana – це дуже поліморфний, але цілісний вид, який не має органо-тканьової спеціалізації. Однак в останні роки ця позиція викликає все більші сумніви. Рядом авторів була висловлена думка, що в межах виду B.іnіana є щонайменше дві форми: листова, що викликає темно-буру плямистість і коренева, що викликає гельмінтоспоріозну кореневу гниль. Але дотепер існування цих форм залишається скоріше припущенням, ніж загальновизнаним науковим фактом.

На жаль, дотепер форми B. sorokіnіana не охарактеризовані кількісно та відсутні чіткі критерії їх розпізнавання. Відповідно залишається неясним, що являє собою життєвий цикл патогена; які джерела поновлення інфекції кожної з форм; яка роль форм у виникненні захворювань насіння; чи відрізняються форми за агресивністю та фізіолого-біохімічними властивостями. Тому всебічне дослідження біологічних особливостей B. sorokіnіana у зв'язку з паразитизмом на надземних і підземних органах ячменю є актуальним науковим завданням.

В уражених органах рослин ячменю звичайно розвивається не лише B.іnіana, а цілий комплекс супутніх інфекцій. Для прогнозу розвитку хвороб і можливих втрат урожаю, розробки захисних заходів, селекції стійких сортів, а також розуміння механізмів функціонування захисних систем рослини в цілому, важливо диференціювати внесок кожного з патогенів у розвиток захворювання. У зв'язку із цим існує потреба в точних та не трудомістких методах кількісної діагностики B.іnіana на тлі розвитку супутніх фітопатогенів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в межах держбюджетної наукової теми № 16/16/03 "Дослідження та підтримка біорізноманіття природних систем Лівобережної України" (Номер держреєстрації 0103U004271), що розробляється на кафедрі мікології та фітоімунології Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна.

Мета і завдання досліджень. Мета роботи – вивчення біологічних особливостей Bipolaris sorokіnіana у зв'язку з паразитизмом на надземних і підземних органах рослин ярого ячменю й удосконалення методів діагностики збудників при кореневій гнилі та чорному зародку насіння.

Для досягнення поставленої мети вирішувались наступні завдання:

– вивчити морфологічні особливості B. sorokіnіana при паразитизмі на надземних і підземних органах ярого ячменю, а також у чистій культурі;

– дослідити токсигенні властивості, а також активність целюлозолітичних і пектолітичних ферментів моноконідіальних ізолятів B. sorokіnіana з листя, насіння та коріння ярого ячменю;

– вивчити агресивність (некрогенну та спорогенну активність) моноконідіальних ізолятів B.іnіana з різних органів рослин ячменю;

– кількісно охарактеризувати форми B. sorokіnіana і визначити їх роль у виникненні темно-бурої плямистості листя, гельмінтоспоріозної кореневої гнилі та чорного зародку насіння;

– уточнити видовий склад фітопатогенних грибів при ураженні коріння та насіння ярого ячменю;

– вивчити закономірності розвитку B. sorokіnіana у підземних і навколоземних частинах рослин ярого ячменю та удосконалити метод диференційованої діагностики гельмінтоспоріозної кореневої гнилі;

– провести порівняльний аналіз основних методів діагностики чорного зародку насіння ячменю та удосконалити метод диференційованої діагностики B.іnіana на тлі розвитку супутніх патогенів.

Об’єкт дослідження: 60 моноконідіальних ізолятів Bipolaris sorokiniana, а також 38 сортів та гібридів ярого ячменю.

Предмет дослідження: внутрішньовидова структура, морфолого-культуральні, фізіолого-біохімічні та паразитичні особливості Bipolaris sorokiniana, методи кількісної діагностики B.іnіana на тлі розвитку супутніх інфекцій.

Методи дослідження: мікроскопічні – ідентифікація видів збудників хвороб та дослідження морфологічних особливостей конідій; фізіолого-біохімічні – вивчення динаміки накопичення біомаси, вмісту білку в культуральній рідині, а також активностей целюлаз та пектиназ; хроматографічні – дослідження складу вторинних метаболітів B. sorokiniana; біотестування – порівняння токсигенних властивостей культуральної рідини B. sorokiniana; фітоімунологічні – вивчення агресивності ізолятів B. sorokiniana на відрізках листя сортів-диференціаторів; фітопатологічні – діагностика ураженості та розвитку збудників при кореневій гнилі та чорному зародку насіння (візуальний метод, вологої камери, мікробіологічний та рулонний); розрахункові – обчислення розвитку хвороб; математично-статистічні – дослідження мінливості ізолятів B. sorokiniana (факторний аналіз), встановлення зв'язку між досліджуваними показниками (кореляційний аналіз), оцінка достовірності отриманих результатів (дисперсійний аналіз).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне порівняльне дослідження морфолого-культуральних, фізіолого-біохімічних і паразитичних особливостей ізолятів B. sorokіnіana з листя, насіння та коріння ярого ячменю. Виявлені та кількісно охарактеризовані дві форми збудника, названі нами довгоспорова та короткоспорова. Розроблено критерії розпізнавання довгоспорової та короткоспорової форм B. sorokіnіana при паразитизмі, а також у чистій культурі. Встановлено, що перша форма більше пристосована до розвитку на надземних органах рослини, а друга – на підземних. Показано, що властивості будь-якого ізоляту B. sorokіnіana визначаються не органом рослини, з якого він був виділений, а його приналежністю до однієї з форм.

Уточнено видовий склад збудників кореневої гнилі ярого ячменю. Досліджено закономірності розвитку B. sorokіnіana та видів роду Fusarіum на підземних і навколоземних органах ярого ячменю та запропоновано метод диференційованої оцінки розвитку гельмінтоспоріозної та фузаріозної кореневих гнилей.

На 38 сортах і гібридах ярого ячменю в однакових стаціонарних умовах уперше був проведений порівняльний аналіз чотирьох найпоширеніших методів діагностики чорного зародку. Охарактеризовано переваги й недоліки кожного з досліджених методів. Розроблено рекомендації з кількісної діагностики B.іnіana у насінні ярого ячменю на тлі розвитку супутніх патогенів.

Практичне значення результатів. Результати роботи ввійшли у звіт по держбюджетній науковій темі № 16/16/03 "Дослідження та підтримка біорізноманіття природних систем Лівобережної України", а також були використані при проведенні науково-дослідної роботи в рамках договору № 27-05/CG 255-05 KІ "Фітопатологічна експертиза насіння ячменю" за замовленням україно-французької компанії "Malteurop Ukraіne" Ltd. Отримані дані можуть бути використані в сільськогосподарській практиці для пошуку сортів-донорів стійкості до гельмінтоспоріозу, для прогнозу розвитку хвороб, а також при розробці захисних заходів. Запропоновані методи використовуються в навчальному процесі при проведенні практикумів до курсів "Сільськогосподарська фітопатологія" та "Метод чистих культур" у Харківському Національному університеті ім. В.Н. Каразіна.

Особистий внесок здобувача. Робота є самостійним дослідженням. Планування та проведення експериментів, обробка, аналіз і узагальнення результатів, а також підготовка матеріалів дисертації до друку здійснені безпосередньо автором.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи були представлені на 14-му Конгресі європейських мікологів (Ялта, 2003); 10-му З'їзді Українського ботанічного товариства (Полтава, 1997); 1-му З'їзді мікологів Росії (Москва, 2002); конференціях молодих учених-ботаніків України (Одеса, 2003; Канів, 2004; Умань, 2005); 8-й Молодіжній конференції ботаніків у Санкт-Петербурзі (Санкт-Петербург, 2004), Пущинскій школі-конференції молодих учених (Пущино, 2002); Міжнародній науково-практичній конференції "Генетичні ресурси культурних рослин" (Санкт-Петербург, 2001); Міжнародній конференції молодих вчених "Рослина та середовище" (Харків, 2001); 2-й Міжнародній конференції "Методологические основы познания биологических особенностей грибов продуцентов физиологически-активных соединений и пищевых продуктов" (Донецьк, 2002); Всеукраїнській конференції "Еколого-біологічні дослідження на природних та антропогенно-змінених територіях" (Кривій Ріг, 2002). Доповідь на тему "Популяційна структура та напрямки мікроеволюції Bіpolarіs sorokіnіana (Sacc.) Shoemaker" посіла перше місце на Всеросійському конкурсі наукових праць, проведеному в рамках Конференції молодих учених "Экологические механизмы динамики и устойчивости биоты", що була організована Уральським відділенням РАН (Єкатеринбург, 2004). Доповідь на тему "Внутрішньовидова структура Bіpolarіs sorokіnіana у зв'язку з паразитизмом на над- і підземних частинах рослини-хазяїна" було заслухано на розширеному засіданні кафедри ботаніки Київського національного університету ім. Т. Шевченка.

Публікації. За результатами роботи опубліковано 17 наукових праць, з них три статті в журналі "Вісник Харківського університету" і одна в збірнику "Й.К. Пачоський та сучасна ботаніка" (Херсонський державний університет і Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного, 2004 р.). Тринадцять робіт є тезами доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертація загальним обсягом 264 сторінки складається з вступу, 5 розділів, висновків, списку використаних джерел (485 джерел) і 4 додатків. Основна частина роботи займає 216 сторінок, ілюстрована 11 таблицями та 38 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Розділ 1. Історія дослідження та сучасний стан вивченості

фітопатогенного гриба Bіpolarіs sorokіnіana (Sacc. іn Sorokіn) Shoemaker

Огляд літератури висвітлює історію описання та класифікування гриба Bіpolarіs sorokіnіana. Охарактеризовані морфологічні, фізіолого-біохімічні та генетичні особливості збудника. Підсумовано сучасні погляди на гельмінтоспоріозну кореневу гниль, темно-буру плямистість листя та чорний зародок насіння. Узагальнено відомості про особливості сапротрофного живлення гриба в природі та в умовах чистої культури. На основі аналізу сучасної вітчизняної та іноземної літератури показано актуальність теми дисертаційної роботи та визначено доцільність проведених досліджень.

Розділ 2. Об’єкти та методи досліджень

Дисертаційна робота виконувалася на базі кафедри мікології та фітоімунології впродовж 1997-2005 рр. Відбір інфікованих грибом Bіpolarіs sorokіnіana рослин для виділення чистих культур збудника та проведення всіх наступних лабораторних досліджень здійснювали на базі Дослідного господарства "Елітне" Інституту рослинництва ім. В.Я. Юр'єва УААН (Харківський р-н, Харківська область). Об'єктом досліджень були 38 різних за стійкістю до гельмінтоспоріозів сортів і гібридів ярого ячменю (Hordeum vulgare L.), люб'язно надані співробітниками лабораторій імунітету рослин і селекції ячменю Харківського інституту рослинництва ім. В.Я. Юр'єва УААН. Також об'єктом дослідження були 60 моноконідіальних ізолятів B. sorokіnіana, виділені нами з листя, коріння та насіння ярого ячменю (по 20 кожного типу).

Ідентифікацію збудників хвороб проводили за спеціалізованими визначниками (Хасанов Б.А., 1992; Booth C., 1971; Ellis M.B., 1971 та ін.) Виділення моноспорових ізолятів B.іnіana, їх подальше культивування та зберігання проводили за загальноприйнятими методиками (Методы экспериментальной микологии, 1982; Семёнов С.М., 1990). Дослідження морфологічних особливостей конідій збудника проводили методом мікроскопування, а аналіз одержаних даних – з залученням факторного аналізу (Van Den Berg A.P., 2000).

Активності ?-1,4-ендоглюканаз та пектиназ в культуральній рідині визначали віскозіметричним методом по розрідженню 1% розчину карбоксиметилцелюлози та бурячного пектину, відповідно. Активності ?-1,4–екзоглюканази та целобіази проводили шляхом визначення вмісту глюкози, що утворилася після впливу культуральної рідини на мікрокристалічну целюлозу та целобіозу, відповідно. Визначення вмісту глюкози проводили фото електроколориметричним методом Дюбуа. Вміст білку визначали спектрофотометричним методом Калькара (Методы биохимического исследования растений, 1987).

Токсичність культуральної рідини B. sorokіnіana визначали на 10-ту добу культивування гриба методом біотестування на насінні проса сорту Мироновское (Методы экспериментальной микологии, 1982). Склад вторинних метаболітів B.іnіana досліджували методами тонкошарової та газової хроматографії, а також хроматомас-спектрометрії на базі кафедри хімічної метрології Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна (Гиошон Ж., Гийемен К., 1991).

Агресивність ізолятів B. sorokіnіana визначали за двома показниками: некрогенною та спорогенною активністю на відрізках листя 9-ти сортів-диференціаторів. Розвиток некрозу розраховували за 4-бальною шкалою (Fetch T.G., Steffenson B.J., 1999; Meldrum S.I., 2004). Кількість спор, що сформувалися на інфікованих відрізках листя, підраховували з використанням гемоцитометра Горяєва (Методы экспериментальной микологии, 1982).

Розрахунок розвитку гельмінтоспоріозної та фузаріозної кореневої гнилі проводили в фазу воскової стиглості за 5-ти бальною шкалою обліку (Шамрай С.Н., 1989). Дослідження насіннєвої інфекції B. sorokіnіana та супутніх фітопатогенів проводили з використанням чотирьох альтернативних методів діагностики: візуального, вологої камери, мікробіологічного та рулонного (Методы экспериментальной микологии, 1982). Результати досліджень оброблені статистично методами кореляційного, дисперсійного та факторного аналізів з використанням програмного пакета Statіstіca 6.0 (Гланц С., 1999).

Розділ 3. Біологічні особливості Bіpolarіs sorokіnіana у зв'язку з паразитизмом на різних органах ярого ячменю

Проведеними дослідженнями було доведено, що в межах виду Bіpolarіs sorіkіnіana існують дві форми, названі нами довгоспорова та короткоспорова. Ці форми істотно відрізняються за морфолого-культуральними ознаками, а також фізіолого-біохімічними і паразитичними властивостями. Встановлено, що надійним критерієм для розмежування форм B.іnіana служить усереднене відношення довжини конідій до їх ширини. Для довгоспорової форми при паразитизмі цей показник варіює в межах 3,7 - 4,1, а на штучному середовищі Чапека - 2,6 - 3,4. Для короткоспорової форми цей показник варіює в межах 2,8 - 3,4 і 1,9 - 2,5, відповідно (рис. 1).

Рис. 1. Варіювання середньої довжини та ширини конідій у довгоспорової та короткоспорової форм Bipolaris sorokіnіana при паразитизмі.

Примітка: нижній овал – довгоспорова форма, верхній – короткоспорова.

Встановлено, що на штучному поживному середовищі кількість септ в конідіях, їх довжина, ширина та відношення довжини до ширини дещо відрізняються у порівнянні з аналогічними параметрами конідій, які сформувалися при паразитизмі. Проте, приналежність ізолятів до довгоспорової чи короткоспорової форми простежується при культивуванні гриба в стандартних умовах. Таким чином, ми вважаємо, що ознака довго- та короткоспоровості не є результатом проявлення модифікаційної мінливості.

Показано, що розміри окремих конідій у представників довгоспорової та короткоспорової форм B.іnіana можуть співпадати. Тому віднесення будь якого ізоляту до однієї з форм не може проводитися на основі замірів кількох випадково

виявлених спор і має спиратись на середнє значення, що розраховано для не менше ніж 60 конідій.

Проведені фізіолого-біохімічні дослідження довели, що довгоспорова форма B.іnіana характеризується достовірно більш високою швидкістю накопичення біомаси в чистій культурі, вмістом білку у культуральній рідині, а також активністю ендоглюканаз, екзоглюканаз, целобіаз і пектиназ на 4-8 добу культивування. Згідно з літературою, целюлази та пектинази відіграють вагому роль при інфікуванні рослин B. sorokіnіana та подальшому живленні гриба при паразитизмі та на рослинних залишках. Тому виявлені фізіолого-біохімічні розходження між довгоспоровою та короткоспоровою формами B. sorokіnіana є додатковим важливим свідченням обґрунтованості відокремлення цих форм.

Результати біотестування на насінні проса сорту Мироновское 16 довели, що токсигенні властивості довгоспорових ізолятів у середньому в 1,8 рази вище, ніж короткоспорових. Схожість насіння проса після замочування в дистильовану воду становила 81%, у поживне середовище Чапека – 86,9%, у культуральну рідину представників короткоспорової форми – 71,9%, а довгоспорової лише 39,5%.

Порівняння тонкошарових хроматограм екстрактів культуральної рідини різних форм B.іnіana не дозволило нам виявити істотних розходжень. Порядок розміщення плям, їх розмір і фарбування для всіх досліджених ізолятів збудника були однакові. Використання методу газової хроматографії по відношенню до п’ятої фракції хлороформного екстракту екзометаболітів B.іnіana показало, що виявлені методом тонкошарової хроматографії плями є сумішшю кількох речовин, які мають подібну рухомість у хлороформі та через це не розділюються на хроматографічних пластинках. Таким чином було доведено, що для дослідження вторинних екзометаболітів B. sorokіnіana треба використовувати більш сучасні та точні методи ніж тонкошарова хроматографія. Хроматомас-спектрометричне дослідження хлороформного екстракту культуральної рідини довгоспорового ізоляту Л дозволило виявити у його складі 56 компонентів.

Штучне інфікування відрізків листя 9-ти сортів-диференціаторів ярого ячменю показало, що форми B. sorokіnіana істотно відрізняються за показником агресивності. Для довгоспорової форми характерна менша інтенсивність спороутворення на відрізках листя (у середньому в 2,5 рази в порівнянні з короткоспоровою), але більша некрозоутворююча здатність (у середньому 3 бали в порівнянні з 2,2 бала у короткоспорової). В той же час, треба зауважити, що значення активності некротизації та спороутворення для окремих довго- та короткоспорових ізолятів перекриваються, що не дозволяє використовувати ці показники для визначення приналежності ізоляту до однієї з форм (Рис. 2).

Встановлено, що у кількісному відношенні довгоспорова форма домінує на надземних органах рослини, а короткоспорова – на підземних. Частота виявлення довгоспорової форми на листі становить 85%, насінні – 65%, а на корінні – 25%.

Рис. 2. Варіювання агресивності (некрогенної та спорогенної активності) довгоспорової та короткоспорової форм Bipolaris sorokіnіana.

Примітка: сірий овал – довгоспорова форма.

Виявлено, що достовірна різниця між листовими та кореневими ізолятами B.іnіana за довжиною конідій не є доказом єдності цих груп і пов’язана з кількісним домінуванням довгоспорової форми на листях та короткоспорової на корінні. Доведено, що властивості будь-якого ізоляту B.іnіana визначаються не органом рослини, з якого він був виділений, а його приналежністю до однієї з форм.

Спираючись на одержані результати ми вважаємо, що терміни „листова” та „коренева” форми B., що запропоновані Л.В. Молодих та М.В. Рочевим, мають кілька суттєвих недоліків. По-перше, відповідно з назвою, будь-який ізолят, що виділений з листя, має вважатися представником листової форми, а коріння – кореневої. Проте, нами доведено, що і листові, і кореневі ізоляти є гетерогенними. По-друге, терміни „листова” та „коренева” форми не відображують можливості збудника інфікувати насіння та інші органи рослини. Спираючись на це, ми вважаємо необхідним відмовитися від уживання назв „листова” та „коренева” форми.

Ґрунтуючись на частотах виявлення довгоспорової та короткоспорової форм B.іnіana у різних органах ярого ячменю, можна припустити, що первинним джерелом поновлення цих форм у життєвому циклі патогена є хворе насіння (рис. ). Ми вважаємо, що інфекція насіння, яка викликана довгоспоровою формою збудника, згодом реалізується переважно у вигляді темно-бурої плямистості листя, а короткоспорової – у вигляді гельмінтоспоріозної кореневої гнилі. Джерелом насіннєвої інфекції B.іnіana, на нашу думку, є конідії гриба, що сформувалися як на листях (переважно довгоспорова форма), так і на основі стебел живлячої рослини (переважно короткоспорова форма).

Листя Насіння Коріння

- довгоспорова форма - короткоспорова форма

Рис. 3. Зміна субстратів в життєвому циклі довгоспорової та короткоспорової форм Bipolaris sorokiniana.

Примітка: суцільна стрілка – основний шлях інфікування, переривчаста стрілка – додатковий шлях інфікування.

Розділ 4. Розвиток збудників звичайної кореневої гнилі ячменю та їх диференційована діагностика на рослинах ярого ячменю

Однією з найнебезпечніших хвороб ярого ячменю є звичайна коренева гниль, що викликається грибом Bipolaris sorokiniana та видами роду Fusarium. Проведений нами аналіз ураженості рослин 38 сортів та гібридів ярого ячменю показав, що в умовах Харківської області збудниками кореневої гнили є фітопатогенні гриби: Bipolaris sorokiniana (26,1%), Fusarium graminearum (74,1%), F. culmorum (2,3%), F. moniliforme (0,3%) та F. oxysporum (0,7%). Встановлено, що основною причиною розвитку кореневої гнилі на всіх без виключення сортах та гібридах є види Fusarium graminearum та Bipolaris sorokiniana.

Термін „коренева гниль” має широке значення й охоплює не лише хвороби коріння, а усіх підземних та навколоземних органів рослини. У зв'язку із цим нами було досліджено закономірності розвитку двох домінуючих збудників хвороби у підземних та навколоземних органах рослин. Для дослідження динаміки колонізації рослини відбір проб проводили двічі, в фазу воскової та повної стиглості.

Для ідентифікації збудників та визначення ураженості ними різних органів рослини, фрагменти коріння, вузлів кущення та основ стебел ярого ячменю розміщували на поживний агар Чапека. Встановлено, що на невеликих за розміром фрагментах коріння однаково добре розвивалися як F. graminearum, так і B. sorokiniana. На фрагментах стебел та вузлах кущіння був помітний переважно міцелій F. graminearum, який майже повністю маскував B. sorokiniana. Візуальне виявлення B. sorokiniana в таких випадках було можливим лише після дослідження реверзуму колоній.

В результаті проведених досліджень було встановлено, що в фазу воскової стиглості на навколоземних органах рослин домінує B. sorokiniana, а на підземних – F. graminearum. Аналогічне дослідження, проведене в фазу повної стиглості показало, що на цьому етапі розвитку рослин відбувається посилення розвитку обох збудників, при цьому F. graminearum інтенсивно розселюється у стебла і кількісно домінує над B. sorokiniana як в надземних, так і в навколоземних органах рослин (Рис. 4).

Рис. 4. Порівняльна характеристика ураженості ярого ячменю збудниками звичайної кореневої гнилі Bipolaris sorokiniana та Fusarium в фазу воскової та повної стиглості.

В умовах виробничого вирощування зернових культур важливо впроваджувати сорти, які є комплексно стійкими до гельмінтоспоріозу та фузаріозу. Тому у сільськогосподарській практиці не прийнято розділяти вищеназвані компоненти звичайної кореневої гнилі. Відповідно, загальноприйнята методика обліку розвитку кореневої гнилі оцінює ступінь ураження підземних та навколоземних органів рослин в цілому. Проте, за для дослідження специфічних рис та особливостей розвитку збудників, важливо вміти диференціювати кожний з компонентів інфекції та визначати його внесок в загальний розвиток хвороби.

Виявлене нами розмежування екологічних ніш, які займають види Fusarium graminearum та Bipolaris sorokiniana в фазу воскової стиглості, дозволяє модифікувати використання традиційної шкали обліку. На нашу думку, диференційоване оцінювання ступеню загнивання основ стебел, проведене в фазу воскової стиглості, дозволяє виявити переважно розвиток гельмінтоспоріозу, а коріння – фузаріозу. Ми вважаємо, що такий прийом дозволяє селективно оцінити роль Bіpolarіs sorokіnіana і видів роду Fusarіum у патогенезі звичайної кореневої гнилі та вивчити закономірності стійкості рослин ярового ячменю до цих збудників.

Завдяки модифікованому використанню шкали обліку кореневої гнилі нами було встановлено, що ступені гниття стебел та коріння досліджених сортів та гібридів ярого ячменю не корелюють (коефіцієнт кореляції 0,26). На нашу думку, це може свідчити про те, що стійкість рослин до гельмінтоспоріозу та фузаріозу визначається різними факторами і, можливо, успадковується незалежно.

Кореляційної залежності між ураженістю рослини патогенним грибом і ступенем розвитку захворювання, що їм викликається, також встановлено не було. Так, коефіцієнт кореляції між ураженістю основ стебел грибом B.іnіana та ступенем розвитку на них гельмінтоспоріозу склав -0,28, а між ураженістю коріння F.іnearum і ступенем розвитку на них фузаріозу – -0,37. Отримані результати свідчать про те, що навіть при однаковій ураженості різні сорти по-різному протистоять розвитку патогенів, що призводить до різного ступеня розвитку захворювань.

Серед досліджених нами сортів і гібридів ярого ячменю 11 (28,9%) виявилися високостійкими до гельмінтоспоріозу, 20 (52,7%) – стійкими та 7 (18,4%) – середньостійкими. Жодного сорту, що є нестійким до гельмінтоспоріозної кореневої гнилі, виявлено не було. Стосовно фузаріозної кореневої гнилі високостійкими виявилися 5 (13,2%) сортів і гібридів, стійкими – 13 (34,2%), середньостійкими – 16 (42,1%) і нестійкими – 4 (10,5%). Таким чином, вивчені сорти й гібриди виявилися менш стійкими до фузаріозу, ніж до гельмінтоспоріозу. Серед досліджених сортозразків нами було виявлено лише два, що є комплексно стійкими до гельмінтоспоріозу та фузаріозу: сорт Одеський 115 та складний гібрид 6902. Рекомендації з обліку кореневої гнилі та дані про реакції досліджених сортів і гібридів передані в лабораторію селекції ячменю Інституту рослинництва ім. В.Я. Юр'єва УААН.

Розділ 5. Методи диференційованої діагностики

Bіpolarіs sorokіnіana у насінні ярого ячменю

Основним джерелом поновлення темно-бурої плямистості листя та гельмінтоспоріозної кореневої гнилі ячменю є хворе насіння. Тому вміння виявити та кількісно охарактеризувати насіннєву інфекцію Bіpolarіs sorokіnіana конче потрібно для вирішення цілого ряду фундаментальних і прикладних завдань. Зараз розроблений і активно використовується цілий ряд методів діагностики хвороб насіння хлібних злаків: візуальний, вологої камери, мікробіологічний та рулонний. На жаль, глибокий порівняльний аналіз цих методів досі не проводився.

На нашу думку, лише комплексне дослідження інфекції B. sorokіnіana і супутніх фітопатогенних грибів у насінні великої кількості сортів і гібридів ячменю в тих самих стаціонарних умовах дозволить оцінити переваги та недоліки цих методів і підібрати оптимальний метод кількісної діагностики B. sorokіnіana у насінні.

Застосування візуального методу діагностики показало, що цей метод дозволяє отримати лише попередні й дуже неточні дані про стан насіння. Доказано, що цей метод не дозволяє диференціювати різні компоненти насіннєвої інфекції, а також виявити приховану інфекцію. Показано, що при використанні візуального методу значний вплив на виявлення інфекції робить режим зберігання насіння. Навіть короткострокове замочування зерна у воду перед проведенням обліку приводить до істотного збільшення частки насіння, які діагностуються як хворі.

Використання методу вологої камери дозволило нам виявити цілий ряд фітопатогенних та сапротрофних грибів, що асоційовані з насінням. Серед фітопатогенів нами були зареєстровані види Alternarіa alternata, Bіpolarіs sorokіnіana, Fusarіum monіlіforme, F. culmorum, F. oxysporum, Drechslera teres і D.іnea. Крім цього, у насінні нами було виявлено ряд видів цвілевих грибів: Aspergіllus clavatus, A. flavus, A. fumіgatus, A. parasіtіcus, Mucor elegans, Penіcіllіum vertіcіllatum і Rhіzopus stolonіfer var. stolonіfer. При використанні методу вологої камери було встановлено, що домінуючими видами є збудники чорного зародку насіння Bipolaris sorokiniana та Alternaria alternata.

Показано, що головною причиною виникнення чорного зародку насіння на усіх без виключення сортах та гібридах є Alternaria alternata. В середньому гриб A. alternata інфікував 79,3% насіння, в той час як Bipolaris sorokiniana лише 27,5%. При цьому, в середньому на 58,0% насіння було виявлено A. alternata, на 6,2% – B.іnіana, на 21,3% – обидва гриби одночасно й лише 14,5% насінин не мали ознак захворювання. Сумарна ураженість насіння цими збудниками на деяких сортах сягала 100%.

Використання мікробіологічного методу діагностики показало, що дані про ураженість насіння істотно залежать від вибраного режиму стерилізації їх поверхні. Згідно з традиційною методикою, перед розкладанням на поживний агар поверхню насіння протягом 5 хвилин стерилізують 1% розчином гіпохлориту натрію. При використанні цієї методики нами було встановлено, що ураженість насіння грибом A. alternata становить у середньому 67,1%, що в 1,2 рази нижче, ніж при використанні методу вологої камери. Для гриба B. sorokіnіana була виявлена та ж тенденція – усереднена ураженість насіння склала 20,4%, що в 1,4 рази нижче, ніж при використанні методу вологої камери. Порівняння результатів застосування методу вологої камери та мікробіологічного методу при режимі стерилізації 5 хвилин показало значну подібність одержаних результатів: коефіцієнт кореляції між даними про ураження насіння грибом A. становив 0,98, а B. sorokіnіana – 0,84.

З літератури відомо, що в насінні міцелій Alternaria alternata локалізований лише у покровах зерна, в той час як Bipolaris sorokiniana може розвиватися глибоко у середині насіння. Саме глибока насіннєва інфекція найбільш небезпечна для рослин, через що її виявлення є найбільш важливим. Ми припустили, що збільшення періоду протруєння насіння повністю знищить інфекцію, що асоційована з покривами, і дозволить краще виявити гриби, локалізовані в середині насіння. Згідно з цим припущенням, ми модифікували традиційну методику та збільшили термін протруєння насіння до 15 хвилин.

В результаті використання модифікованого методу аналізу частота виявлення A. alternata знизилась до 0,4%, в той час як B. sorokiniana збільшилась до 54,1%. Таким чином, нам вдалося довести, що інтенсивний розвиток A. alternata в покровах зерна заважає розвитку глибокої насіннєвої інфекції B. sorokiniana.

Непрямим методом діагностики B. sorokiniana в насінні вважається рулонний метод, коли висновки про інфікування насіння робляться на основі даних про ураженість проростків. При використанні цього методу нами було встановлено, що досліджені сорти та гібриди ячменю дуже відрізняються за ступенем розвитку гниття проростків, що може свідчити про різній ступінь розвитку в них насіннєвої інфекції. Висів інфікованих фрагментів проростків на поживний агар показав, що причиною їх гниття є як B. sorokiniana, так і види роду Fusarium. Таким чином, встановлено, що рулонний метод дозволяє визначати змішану фузаріозно-гельмінтоспоріозну інфекцію насіння. Ми вважаємо, що результати застосування рулонного методу придатні для виявлення насіннєвої інфекції B. sorokіnіana лише при відсутності або незначному розвитку супутньої фузаріозної інфекції. Також доведено, що точність застосування цього методу значно знижується в міру зростання частки несхожих насінин.

Таблиця 1

Порівняльна характеристика основних методів діагностики Bipolaris sorokіnіana у насінні ярого ячменю (за коефіцієнтом кореляції Пірсона)

Метод діагностики | Вологої камери | Мікробіологічний (протруєння

5 хв.) | Мікробіологічний (протруєння 15 хв.) | Рулонний

Вологої камери | 1

Мікробіологічний (протруєння 5 хв.) | 0,84 | 1

Мікробіологічний (протруєння 15 хв.) | 0,58 | 0,56 | 1

Рулонний | 0,52 | 0,48 | 0,88 | 1

Порівняльний аналіз традиційних лабораторних методів діагностики B. sorokіnіana у насінні (таблиця 1) дозволив виявити значні розходження в одержуваних за допомогою цих методів результатів. На нашу думку, це може бути основною причиною суперечливості літературних даних про насіннєву інфекцію B. sorokіnіana, а також закономірності спадкування стійкості рослин до гельмінтоспоріозів. Коефіцієнти кореляції Пірсона наочно демонструють, що при короткочасному протравленні насіння, так само як і при використанні методу вологої камери, вдається виявити в першу чергу ту частину насіннєвої інфекції, що локалізована в покривах насіння. В той же час, інтенсивне загнивання сходів у рулонах є результатом прояву глибокої насіннєвої інфекції, що локалізована в зоні зародку. Спираючись на одержані результати для кількісної діагностики глибокої інфекції B. sorokіnіana у насінні ячменю, ми рекомендуємо використовувати мікробіологічний метод аналізу з попередньою стерилізацією поверхні 1% розчином гіпохлориту натрію протягом 15 хвилин.

ВИСНОВКИ

1. Проведеними комплексними дослідженнями встановлено, що в межах виду Bіpolarіs sorokіnіana (Sacc. іn Sorokіn) Shoemaker існують дві форми, названі нами довгоспорова та короткоспорова. Ці форми відрізняються за морфолого-культуральними ознаками, а також фізіолого-біохімічними і паразитичними властивостями. Властивості будь-якого ізоляту B.іnіana визначаються не органом рослини, з якого він був виділений, а його приналежністю до однієї з форм.

2. У кількісному відношенні довгоспорова форма домінує на надземних органах рослини, а короткоспорова – на підземних. Частота виявлення довгоспорової форми на листі становить 85%, насінні - 65%, а на корінні -25%.

3. Надійним критерієм для розмежування форм B. sorokіnіana служить усереднене відношення довжини конідій до їх ширини. Для довгоспорової форми на ураженій рослині цей показник варіює в межах 3,7 - 4,1, а на штучному середовищі Чапека - 2,6 - 3,4. Для короткоспорової форми цей показник варіює в межах 2,8 - 3,4 і 1,9 - 2,5, відповідно.

4. Довгоспорова форма характеризується більш високою швидкістю накопичення біомаси в чистій культурі, а також активністю ендоглюканаз, екзоглюканаз, целобіаз і пектиназ на 4-8 добу культивування. Токсигенні властивості довгоспорових ізолятів у середньому в 1,8 рази вище, ніж короткоспорових.

5. Форми B. sorokіnіana істотно відрізняються за показником агресивності. Для довгоспорової форми характерна менша інтенсивність спороутворення на відрізках листя сортів-диференціаторів (у середньому в 2,5 рази в порівнянні з короткоспоровою), але більша некрозоутворююча здатність (у середньому 3 бали в порівнянні з 2,2 бала у короткоспорової).

6. Досліджено видовий склад збудників кореневої гнилі ярого ячменю. Встановлено, що основними збудниками є Bіpolarіs sorokіnіana і Fusarіum gramіnearum. При паразитизмі на ячмені B.іnіana і F. gramіnearum займають відособлені екологічні ніші: перший збудник асоційований з основами стебел, а другий – з корінням та вузлами кущіння. Під час відмирання рослин відбувається розселення B.іnіana у коріння, а F.іnearum – у стебла. У фазу повної стиглості на всіх підземних і навколоземних частинах рослин кількісно домінує фузаріозний компонент.

7. Встановлено, що ступінь загнивання основ стебел у фазу воскової стиглості свідчить про переважний розвиток гельмінтоспоріозної кореневої гнилі, а коріння – фузаріозної. На підставі виявлених особливостей збудників запропоновано метод діагностики збудників звичайної кореневої гнилі ярого ячменю.

8. Встановлено, що інфекція насіння ярого ячменю представлена комплексом збудників. У покривах зерна розвиваються переважно Alternarіa alternata і Bіpolarіs sorokіnіana, а глибока насіннєва інфекція представлена B. sorokіnіana і видами роду Fusarіum.

9. На 38 сортах і гібридах ярого ячменю в тих самих умовах проведено порівняльний аналіз основних методів діагностики чорного зародку: візуального, вологої камери, мікробіологічного та рулонного. Встановлено, що ці методи дозволяють у різній мірі виявити різні компоненти насіннєвої інфекції.

10. Для діагностики збудників, асоційованих з покровами насіння ячменю, рекомендується використовувати метод вологої камери та мікробіологічний метод з режимом стерилізації 1% розчином гіпохлориту натрію протягом 5 хвилин. Для виявлення глибокої фузаріозно-гельмінтоспоріозної інфекції насіння ячменю рекомендується використовувати рулонний метод діагностики.

11. Встановлено, що життєздатність інфекції в покривах насіння залежить від тривалості їх протруєння. Для кількісної діагностики глибокої інфекції B.іnіana в насінні ячменю ми рекомендуємо використовувати мікробіологічний метод аналізу з попередньою стерилізацією поверхні 1% розчином гіпохлориту натрію протягом 15 хвилин.

СПИСОК праць, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Акулов О.Ю. Структура виду Bipolaris sorokiniana (Sacc. in Sorokin) Shoem. за морфологічними ознаками // Й.К. Пачоський та сучасна ботаніка. ? Херсон: Айлант. ? 2004. ? С. 372-382.

2. Акулов А.Ю. Влияние сроков посева и искусственного инфекционного фона на развитие гельминтоспориозной корневой гнили ячменю // Вісник Харківського университету. ? 2001. ? № 506. ? С. 236-238.

3. Акулов А.Ю., Леонтьев Д.В. Сокращение почвенной инфекции Bipolaris sorokiniana в условиях лесостепи Украины // Вісник Харківського университету. ? 2002. ?№ . ? С.  (особистий внесок: планування та виконання експерименту, участь в обробці та аналізі результатів).

4. Азарков А.М., Акулов А.Ю. Проблема диагностики “чёрного зародыша” семян // Вісник Харківського университету. ? 2001. ? № 506. ? С. 238-241 (особистий внесок: планування експерименту, безпосередня участь у виконанні експерименту, обробка та аналіз результатів).

5. Акулов О.Ю., Переверзєва В.Ф. Про гетерогенність популяції Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoem. у Харківській області // Мат. Х з`їзду Украінського ботанічного товариства „Проблеми ботаніки і мікології на порозі третього тисячоліття” (22-23 травня 1997 р., Полтава), Київ-Полтава. ? 1997. ? С. (особистий внесок: виконання експерименту, участь в обробці та аналізі результатів).

6. Акулов А.Ю., Леонтьев Д.В. Анализ современных методов диагностики “черного зародыша” семян злаков // Тез. докл. Межд. научно-практ. конф. „Генетические ресурсы культурных растений” (13-16 ноября 2001 г., Санкт-Петербург). – СПб: ВИР. ? 2001. ? С. (особистий внесок: планування та виконання експерименту, участь в обробці та аналізі результатів).

7. Акулов А.Ю., Азарков А.М. О расоспецифическом взаимодействии в патосистеме ячмень ? Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Schoem. // Мат. Міжн. конф. молодих вчених „Рослина і середовище” (26-28 вересня 2001 р., Харків). ? Харків: ХДАУ. ? 2001. ? С. (особистий внесок: планування експерименту, безпосередня участь у виконанні експерименту, аналіз результатів).

8. Акулов О.Ю., Азарков А.М. Оценка устойчивости злаков к заболеваниям вызываемым Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker // Тез. докл. 1-го Съезда микологов России. ? М.: Национальная Академия Микологии. ? 2002. ? С. (особистий внесок: планування експерименту, безпосередня участь у виконанні експерименту, обробка та аналіз результатів).

9. Акулов А.Ю., Леонтьев Д.В. Проблема поиска доноров устойчивости ячменю к гельминтоспориозной корневой гнили на стадии проростков // Матер. наук. конф. “Еколого-біологічні дослідження на природних та антропогенно-змінених територіях” (13-16 травня 2002 р., Кривий Ріг). ? Кривий Ріг: Криворізький бот. сад, 2002. ? С. (особистий внесок: планування та виконання експерименту, участь в обробці та аналізі результатів).

10. Акулов А.Ю. Современные концепции защиты хлебных злаков от заболеваний, вызываемых Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker // Биология – наука XXI века: 6-я Пущинская школа-конференция молодых ученых (20-24 мая 2002 г., Пущино): Сборник тезисов. Т. 3. – Тула: Изд-во Тул. гос. пед. ун-та им. Л.Н. Толстого, 2002. ? С. .

11. Акулов А.Ю., Леонтьев Д.В. Терпеноидные экзометаболиты Bipolaris sorokiniana: история и перспективы исследдования // Матер. ІІ Межд. конф. „Методологические основы познания биологических особенностей грибов продуцентов физиологически-активных соединений и пищевых продуктов” (25-27 ноября 2002 г., Донецк). – Донецк: Норд компьютер, 2002. – С. (особистий внесок: аналіз сучасних відомостей про токсини збудника).

12. Akulov A.Yu. Intraspecific structure of Bipolaris sorokiniana (Sacc. In Sorokin) Shoemaker // Proc. XIV Congress of European Mycologists (22-27 September 2003, Yalta). – Kiev: ST DRUK, 2003. – P. 65-66.

13. Акулов А.Ю. Внутривидовая структура фитопатогенного гриба Bipolaris sorokiniana (Sacc. In Sorokin) Shoemaker // Мат. конф. молодих вчених-ботаніків „Актуальні проблеми ботаніки та