ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені В.Н.КАРАЗІНА

Борискіна Олена Петрівна

УДК 577.322

Енергії водневих зв’язків, що стабілізують конформацію

гідратованих колагенових структур

03.00.02 – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Харків – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова

НАН України (м. Харків)

Науковий керівник:

доктор фізико-математичних наук, професор

Семенов Михайло Олексійович, Інститут радіофізики та електроніки

ім. О.Я. Усикова НАН України, старший науковий співробітник

відділу біофізики

Офіційні опоненти:

доктор фізико-математичних наук, Рубін Юрій Вадимович,

Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б.І.Вєркіна НАНУкраїни, старший науковий співробітник відділу молекулярної біофізики (м. Харків);

доктор біологічних наук, професор Перський Євген Ефроїмович,

Харківській національній університет імені В.Н. Каразіна

завідувач кафедри біохімії.

Провідна установа:

Інститут теоретичної фізики ім. М. М. Боголюбова НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться " 11 " 05 2007 року о 1500 годині на

засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному

університеті імені В.Н. Каразіна, 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 7-4.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці

Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна, 61077, м. Харків,

пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий " 06 " 04 2007 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Колагенові білки становлять особливий клас фибрілярних білків з третинною структурою у вигляді правої суперспіралі, що звита із трьох лівоспіральних поліпептидних ланцюжків, які складаються із трипептидних фрагментів -Gly-X-Y-. Унікальні механічні властивості потрійноспіральних колагенових молекул, їх здатність до самоорганізації у фібрили та утворення складних просторових мереж, які можуть бути матрицями для нуклеації та росту кристалів гідроксиапатиту, дозволяють колагеновим білкам виконувати в організмі людини опорну та морфогенетичну функції. Крім того, колагени використовуються як основа біологічно сумісних композитних матеріалів, що застосовуються для заміщення дефектів сполучної тканини.

Важливими факторами стабілізації потрійної спіралі колагену є водневі зв’язки, що виникають між N–H групою гліцина та C=O групою амінокислоти Х сусідніх поліпептидних ланцюжків (пептид-пептидні зв’язки), а також між гідратноактивними центрами потрійної спіралі та молекулами води (зв’язки пептид-вода).

Незважаючи на те, що колаген вивчається на протязі багатьох років, молекулярні механізми стабілізації нативної конформації його потрійної спіралі до кін-ця незрозумілі, зокрема невідомі кількісні значення ентальпій водневих зв’язків у колагенових структурах з різним амінокислотним складом. Залишаються нез’ясованими також механізми взаємодії між органічною та мінеральною фазами мінералізованого колагену та вплив гідроксиапатиту на процес формування гідратної оболонки колагену та його конформаційний стан. Такі знання потрібні для розуміння структурної організації, динамічних характеристик і термодинамічної стабільності потрійноспіральних колагенових молекул та впливу на ці характеристики біологічно активних речовин, у тому числі гідроксиапатиту.

Для розрахунку енергетичних характеристик водневих зв’язків можна використовувати дані про частотні зсуви смуг поглинання, які віднесені до коливань груп атомів, що приймають участь у їх формуванні. Це можливо завдяки наявній пропорційній залежності між ентальпією водневого зв’язку та величиною частотного зсуву відповідної смуги поглинання. Дані про частотні зсуви можуть бути отримані експериментально або розраховані теоретично.

Теоретичною основою для розрахунку частотних зсувів, що викликані утворенням водневих зв’язків, може служити теорія збурень Міядзави, на підставі якої раніше була розрахована тонка структура смуги Амід I для -спіралі і -конформації. За допомогою чисельного аналізу частотних характеристик коливань карбонільних груп колагенових структур можливо не тільки отримати кількісну оцінку частотних зсувів, що викликані динамічними резонансними взаємодіями електричних коливальних дипольних моментів переходу і утворенням водневих зв’язків, а також виконати віднесення компонент тонкої структури смуги Амід I коливальних спектрів колагену та модельних колагенових політрипептидів з урахуванням їх первинної структури. Ці дані є необхідними для розширення можливостей ІЧ спектроскопії у дослідженні колагенових білків.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження за темою дисертації проводилися згідно з планом науково–дослідних робіт відділу біофізики Інституту радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова НАН України в рамках держбюджетної НДР "Дослідження енергетичних та гідратаційних характеристик взаємодії біологічно активних речовин з полінуклеотидними і колагеновими матрицями", що виконувалася у 2004-2006 рр. (шифр "Спіраль", номер держреєстрації 0103U002268, постанова Бюро ВФА НАН України від 27.11.2003, протокол № )

Мета и задачі дослідження. Метою роботи є експериментальне та теоре-тичне вивчення властивостей гідратованих потрійноспіральних колагенових структур та визначення енергетичних характеристик їх водневих зв’язків. Для досягнення зазначеної мети поставлені та вирішені наступні наукові задачі:

- Розробити алгоритм чисельного аналізу частотних характеристик валентних коливань карбонільних груп у колагенових структурах з урахуванням динамічних резонансних взаємодій електричних коливальних дипольних моментів переходу.

- Провести чисельний аналіз тонкої структури смуги Амід I в ІЧ і Раман спектрах модельних колагенових політрипептидів; виконати віднесення цих компонент в експериментальних спектрах poly(Gly-Pro-Pro) та колагену. Розрахувати зсуви частот валентних коливань С=О груп, що викликані утворенням пептид-пептидних водневих зв’язків та зв’язків типу пептид-вода.

- Розрахувати ентальпію гідратації модельного колагенового політрипептиду poly(Gly-Pro-Pro) та колагену на підставі аналізу ізотерм гідратації по моделі адсорбції ДАрсі і Ватта.

- Вивчити та описати конформаційні перебудови потрійної спіралі poly(Gly-Pro-Pro) та колагену під час формування їх гідратної оболонки.

- Визначити вплив гідроксиапатиту на конформаційний стан та гідратну оболонку колагену методами коливальної спектроскопії и п’єзогравіметрії.

- Визначити ентальпію пептид-пептидних водневих зв’язків у модельному колагеновому політрипептиді poly(Gly-Pro-Pro) і колагені методами коливальної спектроскопії з використанням результатів розрахунку.

Об’єкт дослідження – конформація та стабільність гідратованих колагенових структур, зокрема модельного колагенового політрипептиду poly(Gly-Pro-Pro), колагену I типу, мінералізованого колагену I типу.

Предмет дослідження – енергетичні характеристики пептид-пептидних водневих зв’язків та гідратної оболонки політрипептиду poly(Gly-Pro-Pro), колагену I типу та мінералізованого колагену I типу.

Методи дослідження – ІЧ спектроскопія, Раман спектроскопія, п’єзогравіметрія, диференціальна КВЧ діелектрометрія, чисельний аналіз частотних характеристик валентних коливань карбонільних груп.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі створена та апробована нова методика чисельного аналізу частотних характеристик валентних коливань карбонільних груп потрійноспіральних колагенових структур, в якій враховується первинна послідовність поліпептидних ланцюжків, резонансні взаємодії коливальних дипольних моментів переходу, а також наявність пептид-пептидних водневих зв’язків та зв’язків типу пептид-вода.

Розраховані частоти компонент тонкої структури смуги Амід I в коливальних спектрах політрипептидів, що моделюють різні за амінокислотним складом ділянки природного колагену, та виконані віднесення компонент смуги Амід I в експериментальних ІЧ та Раман спектрах poly(Gly-Pro-Pro)та колагену.

Визначена кількість молекул води, що входять до складу різних та типом та енергіями зв’язування шарів гідратної оболонки модельного колагенового політрипептиду poly(Gly-Pro-Pro), чистого та мінералізованого та колагену у плівці та у водному розчині, визначено величини ентальпії гідратації.

Встановлено взаємозв’язки між процесом утворення гідратної оболонки та конформаційними перебудовами потрійної спіралі колагену.

Вперше експериментально та теоретично отримано величину ентальпії пептид-пептидних водневих зв’язків у політрипептиді poly(Gly-Pro-Pro) та колагені. Визначено енергетичні внески пептид-пептидних водневих зв’язків та гідратації у загальну енергію стабілізації потрійної спіралі колагену та модельного колагенового політрипептиду poly(Gly-Pro-Pro).

Практичне значення одержаних результатів. Розроблений алгоритм чисельного аналізу дозволяє по даним рентгеноструктурного аналізу розраховувати частоти компонент тонкої структури смуги Амід I в ІЧ та Раман спектрах колагенових структур з різним амінокислотним складом. Віднесення компонент тонкої структури смуги Амід I в ІЧ та Раман спектрах колагену та модельних колагенових політрипептидів, що були виконані з використанням результатів розрахунку, суттєво розширюють можливості методів ІЧ та Раман спектроскопії при дослідженні колагенових білків.

Отримані величини ентальпії пептид-пептидних водневих зв’язків та ен-таль-пії гідратації поглиблюють існуючі уявлення про роль водневих зв’язків та гідратації у стабілізації потрійноспіральних структур колагенового типу. Крім того, розраховані величини ентальпії можуть бути використані для верифікації результатів комп’ютерного моделювання колагенових білків та політрипептидів.

Результати дослідження впливу гідроксиапатиту на конформацію та гідратну оболонку колагену необхідні для розуміння молекулярних механізмів взаємодії між мінеральною та органічною фазами мінералізованого колагену та можуть бути використані в технологіях створення композитних матеріалів на основі колагену та апатиту, що застосовуються у медицині.

Особистий внесок здобувача. В опублікованих зі співавторами наукових працях особистий внесок здобувача полягає в наступному:

– у роботах [1-3, 6-9, 11] у розробці алгоритму та проведенні чисельного аналізу частотних характеристик валентних коливань карбонільних груп у модельних колагенових політрипептидах, розкладанні смуги Амід I в ІЧ спектрі колагену на елементарні смуги, одержанні ІЧ і Раман спектрів poly(Gly-Pro-Pro) та колагену та виконанні їх віднесень, а також в узагальненні результатів та обґрунтуванні висновків;

– у роботах [4,5, 10, 12-15] у приготуванні зразків та проведенні ІЧ спектроскопічних вимірів, одержанні та математичній обробці ізотерм гідратації, розрахунку ентальпій пептид-пептидних водневих зв’язків та ентальпії гідратації, а також в узагальненні результатів та обґрунтуванні висновків.

Апробація результатів роботи. Основні результати дисертаційної роботи представлені на десяти вітчизняних та міжнародних конференціях, серед яких:

– І-а Українська наукова конференція "Проблеми біологічної і медичної фізики", Харків, 2004;

– III-th International Conference on Hydrogen Bonding and Molecular Interactions, Kyiv, 2006;

– Workshop on the Structure and Functions of Biomolecules II, Bedlewo, Poland, 2006;

– IV-й з’їзд Українського біофізичного товариства, Донецьк, 2006;

– 3-я, 4-та, 5-та та 6-та Харківські конференції молодих вчених "Радіофізика та СВЧ електроніка", Харків, 2004, 2005 та 2006 роки;

– Конференція молодих вчених "Фізика низьких температур", Харків, 2004;

– II-а Всеукраїнська науково-технічна конференція студентів, аспірантів і молодих вчених “Актуальні питання теоретичної та прикладної фізики і біофізики” Фізика. Біофізика. – 2006“, Севастополь, 2006;

та на вітчизняних і закордонних наукових семінарах, серед яких:

– семінар у Bilkent University, Анкара, Туреччина, 2005;

– семінар у Institut fur Hochfrequenztechnik, Technische Universitat Hamburg-Harburg, м. Гамбург, Німеччина, 2006;

– семінар у Institut d’Electronique et de Tйlйcommunications de Rennes, Universitй de Rennes – 1, м. Рен, Франція, 2006;

– семінари відділу біофізики ІРЕ НАН України.

Публікації. За результатами досліджень, що ввійшли в дисертацію, опубліковано 15 наукових праць, у тому числі 5 статей у фахових українських та міжнародних журналах і 10 тез доповідей на національних та міжнародних наукових конференціях, з’їздах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, шести розділів і висновків та списку використаних джерел. Повний обсяг дисертації складає 147 сторінок. Дисертація містить 29 рисунків, 18 таблиць, з них 4 рисунки та 3 таблиці займають повні сторінки. Список використаних джерел містить 211 найменувань на 21 сторінках.

Основний зміст роботи

У вступі обґрунтовано актуальність теми роботи, сформульовано мету і задачі дослідження, показано зв’язок роботи з науковими програмами та темами та особистий внесок здобувача, визначено наукову новизну і практичне значення отриманих результатів, наведено відомості про апробацію результатів.

У розділі 1 представлено огляд літератури за темою дисертації. Наведено загальну характеристику колагенів та їх функції в організмі людини. Показано надмолекулярну організацію, структуру потрійної спіралі та особливості гідратної оболонки модельних колагенових політрипептидів, чистого та мінералізованого колагену I типу. Наведено відомості про фактори стабільності потрійної спіралі колагену. Особливу увагу приділено факторам стабільності ентальпійної природи, до яких зокрема належать водневі зв’язки між атомами пептидних груп сусідніх ланцюжків потрійної спіралі (пептид-пептидні зв’язки) та водневі зв’язки між атомами пептидних груп та молекулами води (зв’язки пептид-вода) (рис. 1).

Рис. 1. Схема водневих зв’язків, що формуються за участі атомів пептидних груп а) poly(Gly-Pro-Pro), б) та колагену.

Наведено основні методи, що застосовуються для одержання енергетичних параметрів водневих зв’язків у білках. Запропоновано та теоретично обґрунтовано використання даних про частотні зсуви валентних коливань С=О груп при утворенні водневих зв’язків (H-bond) для розрахунку їх ентальпії (HH-bond) згідно з лінійною залежністю

HH-bond =CH-bond, (1)

де значення коефіцієнту пропорційності C=0,205 кДж•см/моль було отримано М.О. Семеновим емпіричним шляхом.

У розділі 2 детально описано розроблений у роботі алгоритм чисельного аналізу частотних характеристик валентних коливань С=О груп потрійноспіральних колагенових структур, розглянуто фізичні основи експериментальних методів, що були використані в роботі, наведено характеристики вивчених препаратів.

Алгоритм чисельного аналізу частотних характеристик валентних коливань С=О груп у колагенових структурах є модифікацією алгоритму, розробленого Чіргадзе та Крімом для -спіралі та -конформації і базується на теорії збурювань Міядзави і теорії молекулярних екситонів Давидова, згідно з якими найближчі карбонільні групи можуть бути розглянуті як слабо зв’язані осцилятори з частотою валентних коливань

, (2)

де 0 - частота незбуреного карбонільного коливання, - різниця фаз коливань сусідніх карбонільних груп одного поліпептидного ланцюжку, а ` - сусідніх ланцюжків; Ds - коефіцієнт взаємодії коливань атомних груп одного поліпептидного ланцюжку, а Ds` - сусідніх ланцюжків.

Частоти максимумів спектральних смуг, що віднесені до валентних коливань С=О груп колагенових білків, можуть бути розраховані як

, (3)

, (4)

де А та Е – частоти повністю симетричного коливання типу А, що поляризоване уздовж осі спіралі та активне у Раман спектрі, та двічі виродженого коливання типу Е, що поляризоване перпендикулярно осі спіралі та активне в ІЧ спектрі, изо – частота коливання ізольованої С=О групи, що була визначена у роботах Лазарєва, а Н-св та рез – частотні зсуви коливання С=О груп завдяки утворенню ними водневих зв’язків та в результаті динамічних резонансних взаємодій електричних коливальних дипольних моментів переходу, відповідно.

З урахуванням коефіцієнтів симетрії коливань карбонільних груп у спіральних структурах резонансні частотні зсуви валентних коливань С=О груп колагенових білків розраховуються як:

(5)

(6)

де , –номери поліпептидних ланцюжків, k, l – номери С=О груп у поліпептидному ланцюжку, – кут повороту спіралі, Vl,k – матричний елемент оператора диполь-дипольної взаємодії електричних коливальних моментів переходу, що локалізовані на двох карбонільних групах.

Значення рез розраховуються з використанням координат атомів гідратованих кристалів poly(Gly-Pro-Pro) та коротких фрагментів природного колагену, що були отримані за допомогою рентгенструктурного аналізу (РСА) та відомих величин дипольних моментів переходу валентних коливань С=О груп.

У розділі розглянуто фізичні основи методів ІЧ та Раман спектроскопії, які використовувались для вивчення процесу гідратації poly(Gly-Pro-Pro) та колагену. Описано методики одержання та обробки спектрів. Наведено віднесення основних смуг поглинання в спектрах до коливань атомних груп. Погрішність визначення оптичної щільності складала 2%, частот 2 см-1.

Для оцінки кількості молекул води (n), що зв’язуються з досліджуваними колагеновими структурами в умовах відомої відносної вологості (ВВ) оточуючого середовища, використовувався метод п’єзогравіметрії. Погрішність визначення n складала 0,1 моль H2O/моль -Gly-X-Y-.

Гідратна оболонка колагену у розчині вивчалася методом диференціальної КВЧ діелектрометрії на довжині хвилі 7,6 мм. Погрішність визначення кількості молекул води, що входять до її складу, становила 1 моль H2O/моль -Gly-X-Y-.

В якості зразків для ІЧ спектроскопії та п’єзогравіметрії використовувалися зволожені плівки модельного колагенового політрипептиду poly(Gly-Pro-Pro), чистого та мінералізованого колагену I типу, а для Раман спектроскопії та КВЧ діелектрометрії – розчини цих речовин.

У розділі 3 наведено результати чисельного аналізу частотних характеристик валентних коливань карбонільних груп модельного колагенового політрипептиду poly(Gly-Pro-Pro) та колагену.

Частотні зсуви, що викликані резонансними взаємодіями електричних коливальних дипольних моментів переходу валентних коливань типів А та Е карбонільних груп poly(Gly-Pro-Pro) та колагену, розраховано згідно з формулами (5, 6) з використанням даних РСА. Оскільки первинна структура колагенових білків є послідовністю фрагментів , одержані значення та були усереднені для трьох типів С=О груп: С1=О1 гліцина, а також С2=О2 та С3=О3 груп аміно- та імінокислот Х та Y. Результати наведені в табл. , 2.

Частоти Е та изо валентних коливань груп С1=О1, С2=О2 та С3=О3 політрипептиду poly(Gly-Pro-Pro) відомі, тому після обчислення можливо розрахувати Н-св за формулою (4). Значення Н-св, та використовуємо для знаходження частот А валентних коливань груп С1=О1, С2=О2 та С3=О3 poly(Gly-Pro-Pro) згідно з (5) та резонансного частотного розщеплення (табл. 1).

Таблиця 1.

Розраховані та експериментальні частоти та частотні зсуви валентних коливань С=О груп poly(Gly-Pro-Pro) (см-1). Середнє значення  стандартне відхилення (погрішність експерименту).

Група | Розрахунок | Експеримент

- | - | - | -Н-св | А | А

С1О1 | 1,51,2 | 9,60,7 | 5,90,4 | 240,7 | 16200,7 | 16182

С2О2 | 20,00,9 | 12,50,5 | 7,50,3 | 370,5 | 16360,5 | 16362

С3О3 | 15,51,1 | 9,70,7 | 5,90,4 | 240,7 | 16580,7 | 16542

Враховуючи, що потрійні спіралі poly(Gly-Pro-Pro) та колагену мають схожі геометричні параметри, справедливо припустити, що значення частотних зсувів Н-св валентних коливань груп С1=О1, С2=О2 та С3=О3 колагену та близькі. Тому для знаходження частот А і Е колагену використані частотні зсуви та , що обчислені для колагену (табл. ), та значення Н-св, що розраховані для poly(Gly-Pro-Pro). Для груп С1=О1 та С3=О3 колагену частоти А і Е розраховані для випадків, коли ці групи приймають участь у формуванні водневих зв’язків з молекулами води (b) або лишаються вільними (f).

Таблиця 2.

Розраховані та експериментальні частоти та частотні зсуви валентних коливань С=О груп колагену (см-1). Середнє значення  стандартне відхилення (погрішність експерименту).

Група | АК | Розрахунок | Експеримент

- | - | А | Е | А | Е

С1О1 | Gly | 15,2±1,7 | 10,4±1,4 | 1645±2 (f) 1621±2 (b) | 1650±2 (f) 1626±2 (b) | 16512 16222 | 16552 16312

С2О2 | Pro | 19,6±1,6 | 12,9±1,6 | 1636±2 | 1643±2 | 16422 | 16502

Х | 19,9±1,6 | 14,5±1,5 | 1603±2 | 1608±2 | 15982 | 16062

С3О3 | Hyp | 15,8±1,2 | 10,3±1,0 | 1682±2 (f) 1658±2 (b) | 1687±1 (f) 1663±1 (b) | 16802 16582 | 16862 16682

Y | 14,2±1,5 | 10,7±1,1 | 1646±3 (f) 1622±3 (b) | 1650±2 (f) 1626±2 (b) | 16512

16222 | 16552 16312

Оскільки валентні коливання карбонільних груп дають основний внесок у інтенсивність смуги Амід I в ІЧ та Раман спектрах поліпептидів та білків, для порівняння розрахованих частот А і E з даними експерименту були одержані Раман та ІЧ спектри poly(Gly-Pro-Pro) та колагену (рис. 2). Смуги в Раман спектрах колагену та poly(Gly-Pro-Pro) розділені добре, тому можливе безпосереднє порівняння значень А та частот компонент смуги Амід I у Раман спектрі. Як видно (таб. 1,2), вони дуже близькі. Навпаки, смуги поглинання в ІЧ спектрі сильно перекриваються, що суттєво ускладнює пряме порівняння розрахованих та експериментальних значень Е. Для порівняння результатів розрахунку та даних експерименту було проведено апроксимацію контуру виділеної зі спектру смуги Амід I елементарними смугами, максимуми яких відповідали результатам розрахунку з урахуванням стандартного відхилення, а інші спектральні параметри знайдені за допомогою програми оптимізації. Як видно з рис. б, експериментальний контур добре описується вибраними елементарними смугами. На підставі розрахунків були виконані віднесення компонент смуги Амід I в ІЧ та Раман спектрах poly(Gly-Pro-Pro) та колагену до коливань відповідних С=О груп (табл. 1,2).

За співвідношенням інтегральних інтенсивностей окремих компонент смуги Амід I, що були віднесені до валентних коливань С=О груп амінокислот, проліну чи гідроксіпроліну було розраховано процентний вміст амінокислот, проліну та гідроксипроліну у колагені. Одержане співвідношення добре корелює з відомим (76:12:12 та 78:12:10 відповідно), що підтверджує справедливість виконаних в роботі віднесень.

Рис. 2. Експериментальні спектри poly(Gly-Pro-Pro) та колагену: а) Раман спектр розчину poly(Gly-Pro-Pro) у D2O, б) смуга Амід I, що була виділена з ІЧ спектру колагену (плівка, 86% ВВ в атмосфері D2O) (1), нев’язка між експериментальним та розрахованим контурами (2), в) Раман спектр колагену, розчиненого в 0,01 M DCl у D2O.

У розділі 4 представлено результати аналізу процесів гідратації і конформаційних переходів poly(Gly-Pro-Pro) та колагену методами ІЧ спектроскопії, п’єзогравіметрії та КВЧ дієлектрометрії.

Для дослідження енергетичних параметрів гідратації poly(Gly-Pro-Pro) і колагену були отримані ізотерми гідратації у вигляді залежностей кількості сорбованої зразком води n (моль H2O/моль три пептидів –Gly-X-Y-), від відносної вологості навколишньої середовища х ( %) за допомогою п’єзогравіметрічного мікрозважування плівок зразків (рис. 3).

Рис. 3 Ізотерми гід-ратації (1) та їх розкладання на криві адсорбції за законами: (2) – Ленгмюра, (3) Генрі та (4) мультишарової адсорбції для а) poly(Gly-Pro-Pro) та б) колагену.

Аналітичний опис процесу гідратації здійснювався згідно з моделлю адсорбції Д’Арсі і Ватта, що враховує гетерогенність центрів адсорбції

, (5)

де перший доданок описує стадію адсорбції сильно зв’язуючими центрами монослою по закону Ленгмюра; другий – адсорбцію молекул води слабо зв’язуючими центрами по закону Генрі; третій - мультишарову адсорбцію; Vm – ємність монослою; aL, aL та b– активності води на стадіях ленгмюрівської, генриївської та мультишарової адсорбції, відповідно. Добір параметрів рівняння Д’Арсі і Ватта Vm, aL, aL та b здійснювався за допомогою програми оптимізації.

Одержані параметри рівняння Д’Арсі і Ватта були використані для представлення ізотерм гідратації та колагену у вигляді суми трьох кривих, що відповідають сорбції води за законами Ленгмюра, Генрі та мультишарової адсорбції. Виявилося, що при ВВ=90% внутрішній шар гідратної оболонки, де молекули води сорбуються за законами Ленмгюру та Генрі, у poly(Gly-Pro-Pro) та колагену складається з 2,5±0,1 та 3,2±0,1, а зовнішній – з 4,7±0,1 та 5,3±0,1 моль Н2О/моль –Gly-X-Y-, відповідно. За результатами КВЧ діелектрометрії гідратна оболонка колагену у водному розчині складається з 8,80,5 моль Н2О/моль . Це значення добре корелює з кількістю молекул води n=8,50,1 моль Н2О/моль , що сорбуються плівкою колагену при ВВ=90%.

З використанням одержаних параметрів рівняння Д’Арсі і Ватта були розраховані величини теплоти адсорбції води згідно з законом Ленгмюра QL та законом Генрі QH, а також величина загальної ентальпії гідратації, Hhydr, poly(Gly-Pro-Pro) та колагену. Отримані дані наведені в таблиці 3.

Таблиця 3.

Кількість молекул води у внутрішньому шарі гідратної оболонки, теплоти сорбції води за законами Ленгмюра та Генрі, загальна ентальпія гідратації (кДж/моль ) та ентальпія гідратації на одну молекулу води (кДж/моль Н2О) для та колагену

Речовина | n | QL | QH | Hhydr

poly(Gly-Pro-Pro) | 2,50,1 | 9,20,2 | 1,70,1– | 10,90,4– | 4,30,2

Колаген | 3,20,1 | 9,50,2 | 2,70,1– | 12,20,4– | 3,90,2

Знайдено також ентальпію гідратації на одну молекулу води внутрішнього шару гідратної оболонки poly(Gly-Pro-Pro) та колагену (табл. 3). Значення можна порівняти з HH-св, ентальпією водневого зв’язку групи С1=О1 політрипептиду poly(Gly-Pro-Pro) з однією молекулою води, яку можна отримати за формулою (1) з використанням розрахованих значень Н-св. Одержано, що значення HH-св (С1=О1)= –5,01,0 кДж/моль –Gly-X-Y- досить близьке до значення = –4,30,2 кДж/моль Н2О.

З метою вивчення процесу утворення водневих зв’язків атомними групами гідратноактивних центрів poly(Gly-Pro-Pro) та колагену з молекулами води та конформаційних перебудов потрійної спіралі, що були викликані її гідратацією, були одержані ІЧ спектри плівкових зразків досліджуваних речовин в атмосфері H2O та D2O у широкому інтервалі значень ВВ (рис. 4).

Враховуючи, що основними гідратноактивними центрами poly(Gly-Pro-Pro) та колагену за даними РСА є С=О та N–H групи (рис. 1), основна увага приділялася вивченню частотних зсувів смуг Амід I та Амід II (Амід II) (рис. 5), що віднесені до валентних коливань груп С=О та деформаційних коливань груп N–H (N–D), відповідно. Згідно з даними ІЧ спектроскопії, гідратація poly(Gly-Pro-Pro) та колагену викликає низькочастотний зсув смуги Амід I на величину = 9см-1 та = 13 см-1, відповідно, та зростання її інтенсивності, а також високочастотний зсув смуги Амід II на =17 см-1 та =14 см-1 та Амід II на =18 см-1 та =16 см-1, відповідно. Ці частотні зсуви є наслідком формування пептид-вода водневих зв’язків групами С=О та N–H, а також відображають зміцнення міжланцюжкових пептид-пептидних водневих зв’язків N1H1•••O2=C2, до якого призводять конформаційні перебудови потрійної спіралі, що викликані її гідратацією. Явище зміцнення пептид-пептидних водневих зв’язків N1H1•••O2=C2 в процесі формування гідратної оболонки потрійної спіралі можна легко простежити по високочастотних зсувах смуг Амід II (Амід II) у ІЧ спектрі poly(Gly-Pro-Pro), де ці смуги відображають стан тільки груп N–H (N–D) гліцину, оскільки залишки проліну не мають N–H (N–D) груп. Насичення усіх частотних зсувів постерігається в інтервалі 50-60% ВВ, що за даними п’єзогравіметрії відповідає закінченню формування внутрішнього шару гідратної оболонки потрійної спіралі.

Рис. 4. ІЧ спектри сухих та зволожених плівок зразків: а) – poly(Gly-Pro-Pro) в атмосфері H2O; б) – D2O; в) – колаген в H2O; г) – D2O; для суцільної лінії ВВ = 0%, для штрихованої ВВ = 15%, для штрих-пунктирної ВВ = 86%.

Конформаційні перебудові потрійної спіралі колагену під час гідратації також вивчалися на основі аналізу показника R, співвідношення інтенсивностей смуг поглинання Амід III та смуги з частотою 1450 см-1 в ІЧ спектрах плівкових зразків колагену в процесі формування його гідратної оболонки. Відомо, що для нативного колагену R>1,38. Було виявлено, що показник R досягає значення 1,38 тільки в умовах ВВ  %, що відповідає сорбції 4-5 молекул води на один  фрагмент. Це свідчить про важливість повного заповнення внутрішнього та часткового формування зовнішнього шарів гідратної оболонки колагену для підтримки його нативної конформації.

У розділі 5 представлено результати розрахунків ентальпії HН-св пептид-пептидних водневих зв’язків N1H1•••O2=C2 у poly(Gly-Pro-Pro) та колагені.

Величина HН-св у poly(Gly-Pro-Pro) обчислена за результатами чисельного аналізу частотних характеристик валентних коливань карбонільних груп. Так, частотний зсув Н-св валентного коливання групи C2=O2, що пов’язаний з формуванням цією групою пептид-пептидного водневого зв’язку, за результатами розрахунку складає –370,5 см-1 (таб. 1), отже за формулою (1) отримуємо, що НН-св = -7,6+1,0 кДж/моль –Gly-X-Y-.

Оскільки під час чисельного аналізу частот компонент смуги Амід I колагену частотний зсув Н-св не розраховувався, величина HН-св для колагену може бути обчислена з використанням даних експериментів. Для цього представимо HН-св у наступному вигляді

, (8)

де Hdry – ентальпія водневого зв’язку N1H1•••O2=C2 в дегідратованому колагені, – зміна величини ентальпії водневого зв’язку N1H1•••O2=C2 при конформаційному переході, що індукований гідратацію.

Оскільки термічна денатурація дегідратованого колагену супроводжується тільки розривом його пептид-пептидних зв’язків, величина  кДж/моль  може бути одержана з відомої залежності ентальпії переходу колагену від рівня його гідратації. Величина  кДж/моль розрахована за формулою (1) за даними ІЧ спектроскопії про частотний зсув максимуму смуги Амід I при гідратації колагену  см-1. Отже, повна ентальпія водневого зв’язку N1H1•••O2=C2 в колагені дорівнює НН-св = -5,6+0,6 кДж/моль . Оскільки при визначенні Hdry з використанням кривих плавлення не враховується екзотермічний процес агрегації С=О груп у денатурованому колагені, абсолютна величина Hdry є дещо заниженою, тобто  кДж/моль  є нижньою границею HН-св. Верхню границю HН-св можна також знайти з використанням відомої залежності ентальпії денатурації колагену від рівня його гідратації. Для цього значення ентальпії денатурації гідратованого колагену зменшуємо на середню величину теплоти, що необхідна для процесу руйнування гідратної оболонки. У такому випадку HН-св дорівнює -6,5+0,4 кДж/моль –Gly-X-Y-. Середнє значення ентальпії складає HН-св =-6,0+0,6 кДж/моль .

Отримано також, що співвідношення енергетичних внесків пептид-пептидних водневих зв’язків та гідратації у загальну ентальпію нативної спіралі складає 1:1,4 для poly(Gly-Pro-Pro) та 1:2 для колагену. Знайдене співвідношення ще раз підкреслює значення гідратної оболонки для стабілізації потрійної спіралі колагенового типу.

У розділі 6 вивчено вплив кристалів гідроксиапатиту на формування гідратної оболонки та конформаційний стан колагену. При порівняльному аналізі ізотерм гідратації чистого і мінералізованого колагену (рис. а, ) видно, що сорбційна здатність колагену у присутності гідроксиапатиту зменшується. За результатами математичної обробки ізотерми гідратації мінералізованого колагену згідно з моделлю адсорбції Д’Арсі і Ватта (рис. ) знайдено, що кількість молекул води у внутрішньому шарі гідратної оболонки потрійної спіралі складає 2,00,1 моль Н2О/моль , що дещо нижче у порівнянні з чистим колагеном та з . Це пов’язано зі зменшенням кількості води, що сорбується за законом Генрі. Крім того, мінералізація колагену гідроксиапатитом блокує формування зовнішнього шару гідратної оболонки потрійної спіралі. Так, навіть при ВВ=90% у мультишарі потрійної спіралі зв’язується тільки 0,30,1 моль Н2О/моль . Обчислені теплоти сорбції води за законами Ленгмюра та Генрі та загальна ентальпія гідратації становлять –9,60,2, 1,00,1 та –10,60,4 кДж/моль , відповідно. Зниження величини загальної ентальпії

гідратації мінералізованого колагену у порівнянні з чистим колагеном відбуваються завдяки зменшенню кількості молекул води, що сорбуються за законом Генрі. Ентальпія гідратації на одну молекулу води дорівнює = -5,3+0,2 кДж/моль Н2О.

Рис. 5 Ізотерма гідратації мінералізованого колагену (1) та її розкладання на криві адсорбції: (2) - за законами Ленгмюра, (3) - Генрі та (4) - мультишарової адсорбції.

Рис. 6. ІЧ спектри плівок мінералізованого колагену: а) в атмосфері H2O; б) D2O; для суцільної лінії ВВ = 0%, для штрихованої ВВ = 15%, штрих-пунктирної ВВ = 86%.

За даними ІЧ спектроскопії (рис.6), в процесі гідратації мінералізованого колагену відбувається низькочастотний зсув смуги Амід I на величину  11 см-1 та високочастотний зсув смуг Амід II та Амід II на величини   см-1 та   см-1, відповідно. Як і у випадку чистого колагену, у мінералізованого колагену ці частотні зсуви пов’язані з формуванням пептид-вода водневих зв’язків групами C=O та N–H та зміцненням міжланцюжкових пептид-пептидних водневих зв’язків N1H1•••O2=C2, яке відбувається під час конформаційної перебудови потрійної спіралі в процесі утворення її гідратної оболонки. Насичення частотних зсувів відбувається одночасно із закінченням формування внутрішнього шару гідратної оболонки потрійної спіралі. Проте, неповне утворення зовнішнього шару гідратної оболонки потрійної спіралі призводить до того, що навіть при високих значеннях ВВ конформація потрійної спіралі відрізняється від нативної. Про це свідчить те, що у всьому вивченому інтервалі ВВ 0-90% показник R < ,2.

Висновки

У дисертаційній роботі зроблено внесок у вирішення важливої проблеми в області молекулярної біофізики – визначення фізичних механізмів стабілізації потрійної спіралі колагенового типу у водному оточенні. На основі аналізу експериментальних даних, що були отримані за допомогою спектроскопічних (ІЧ та Раман спектроскопія) методів, п’єзогравіметрії, КВЧ діелектрометрії, та теоретичних розрахункі, були визначені енергії водневих зв’язків різних типів та співвідношення їх внесків у стабілізацію нативної конформації колагенових структур, зроблено аналіз структури гідратної оболонки потрійної спіралі та описані взаємозв’язки між утворенням гідратної оболонки та формуванням нативної конформації колагену. Отримані результати суттєво поглиблюють уявлення про механізми взаємодії у системі колаген-вода та колаген-гідроксиапатит-вода та відкривають нові можливості для використання колагену у медицині та біології.

Основні результати та висновки, отримані в даній роботі, можна сформулювати таким чином:

1. Розроблено та апробовано новий метод чисельного аналізу частотних характеристик валентних коливань карбонільних груп у колагенових структурах з урахуванням динамічних резонансних взаємодій електричних коливальних моментів переходу. Обчислено частоти компонент тонкої структури смуги Амід I в ІЧ та Раман спектрах модельних колагенових політрипептидів з різним амінокислотним складом. Виконано віднесення компонент смуги Амід I в експериментальних ІЧ та Раман спектрах модельного політрипептиду poly(Gly-Pro-Pro) та колагену I типу до відповідних валентних коливань. Раман спектри розчину політрипептиду poly(Gly-Pro-Pro) у оксиді дейтерію одержані вперше.

2. Методами п’єзогравіметрії та ІЧ спектроскопії установлено, що внутрішній шар гідратної оболонки poly(Gly-Pro-Pro), чистого та мінерализованого колагену вміщує відповідно 2,5±0,1, 3,2±0,1 і 2,0±0,1 моль Н2О/моль -Gly-X-Y-, ці молекули води сорбуються за законами Лєнгмюра та Генрі та формують водневі зв’язки з С=О і N–H групами потрійної спіралі. Вперше показано, що гідратна оболонка чистого колагену в водному розчині містить 8,8±1,0 моль Н2О/моль -Gly-X-Y-. Обчислено ентальпії гідратации poly(Gly-Pro-Pro), чистого і мінералізованого колагену, що становлять відповідно –10,9, –12,2 і –10,6 кДж/моль -Gly-X-Y-.

3. Методом ІЧ спектроскопії докладно досліджено конформаційні перебудови потрійної спіралі колагену, що викликаються формуванням його гідратної оболонки та супроводжуються зміцненням прямих пептид-пептидних водневих зв’язків. Показано, що нативна конформація колагену формується в умовах повного заповнення внутрішнього шару його гідратної оболонки, та часткового заповнення зовнішнього шару.

4. Виявлено, що мінералізація колагену гідроксиапатитом призводить до часткового закриття центрів гідратації колагену та блокує формування зовнішнього шару гідратної оболонки потрійної спіралі, а також викликає зміни конформації колагену.

5. Вперше одержано величини ентальпії пептид-пептидних водневих зв’язків у політрипептиді poly(Gly-Pro-Pro) та колагені I типу, які дорівнюють –7,61,0 та –6,01,0 кДж/моль , відповідно.

6. Розраховано співвідношення енергетичних внесків пептид-пептидных водневих зв’язків та гідратації у ентальпію нативної потрійної спіралі, воно дорівнює 1:2 у колагена, и 1:1,4 у poly(Gly-Pro-Pro).

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Мележик Е.П., Семенов М.А. Резонансные взаимодействия карбонильных колебаний в коллагеновых структурах // Вісник ХНУ № 606. Біофізичний вісник. – 2003. Вип. 13. С.62-68.

2. Мележик Е.П., Семенов М.А., Иванов А.Ю. Исследование тонкой структуры полосы Амид I ИК-Фурье спектра коллагена // Вісник ХНУ № 665. Біофізичний вісник. – 2005. Вип. 15. – С.62-67.

3. Борискина Е.П., Больбух Т.В., Семенов М.А. Валентные колебания карбонильных групп в Раман спектрах коллагена и poly(Gly-Pro-Pro): расчет и эксперимент // Вісник ХНУ № 716. Біофізичний вісник. 2005. –Вип. 16. С. 5-9.

4. Борискина Е.П., Больбух Т.В., Семенов М.А., Малеев В.Я.. Физические факторы стабильности трехспиральных структур колагенового типа // Біополімери та клітина. – 2006. – Т. 22, № 6. – C. 458-467.

5. Boryskina O.P., Bolbukh T.V., Semenov M.A., Gasan A.I., Maleev V.Ya. Energies of peptide-peptide and peptide-water hydrogen bonds in collagen: evidences from infrared spectroscopy, quartz piezogravimetry and differential scanning calorimetry // J. Mol. Struct. – 2007. – Vol. 827. – P. 1-10.

6. Мележик Е.П., Семенов М.А. Резонансные взаимодействия карбонильных колебаний в коллагеновых структурах // Сб. тезисов докладов 3-й Харьковской конференции молодых ученых "Радиофизика и СВЧ Электроника". Харьков (Украина). – 2004. – С. 28-29.

7. Мележик Е.П., Семенов М. А. Исследование динамического резонансного взаимодействия карбонильных колебаний в модельной коллагеновой структуре [(PRO-PRO-GLY)10]3 // Зб. тез доповідей конференції молодих вчених "Фізика низьких температур". Харків (Україна). – 2004. – С. 11.

8. Мележик Е.П., Семенов М. А. Резонансные взаимодействия карбонильных колебаний в модельной коллагеновой структуре [(PRO-PRO-GLY)10]3 // Зб. тез доповідей І Української наукової конференції "Прoблеми біологічної і медичної фізики". – Харків (Україна). – 2004. – С. 74.

9. Мележик Е.П., Семенов М.А. Расчет тонкой структуры полосы Амид I в ИК – спектре коллагена с учетом резонансного взаимодействия карбонильных колебаний // Сб. тезисов докладов 4-й Харьковской конференции молодых ученых "Радиофизика и СВЧ Электроника". – Харьков (Украина). – 2004. – С. 32-33.

10. Мележик Е.П. Исследование межпептидной водородной связи в коллагеновых структурах // Сб. тезисов докладов 5-й Харьковской конференции молодых ученых "Радиофизика и СВЧ Электроника". – Харьков (Украина). – 2005. – С. 18.

11. Борискина Е.П. Расчет тонкой структуры полосы Амид I в Раман спектрах poly(Gly-Pro-Pro) и коллагена // Сб. тезисов докладов II-й Всеукраинской научно-технической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых “Актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики” Физика. Биофизика. - 2006“. - Севастополь (Украина). 2006. С.87-89.

12. Boryskina O.P., Semenov M.A. Peptide-peptide and peptide-water hydrogen bonds in collagen: estimation of energies on the basis of IR spectroscopy, quartz piezogravimetry and differential scanning calorimetry // Proc. III-th International Conference on Hydrogen Bonding and Molecular Interactions. Kyiv (Ukraine). 2006. P. 34.

13. Boryskina O.P., Bolbukh T.V., Semenov M.A. Factors of stabilization of collagen structures: quantitative estimations of energies of peptide-peptide and peptide-water hydrogen bonds // Proc. Workshop on the Structure and Functions of Biomolecules II. Bedlewo (Poland). 2006. P. 54.

14. Борискина Е.П., Семенов М.А., Больбух Т.В., Суходуб Л.Б. Влияние минерализации на формирование гидратной оболочки тройной спирали коллагена // Сб. тезисов докладов 6-й Харьковской конференции молодых ученых "Радиофизика и СВЧ Электроника". – Харьков (Украина). – 2006. – С. 35.

15. Борискина Е.П., Семенов М.А., Больбух Т.В., Суходуб Л.Б. Oсобенности гидратации и конформационных переходов чистого и минерализованного коллагена // Зб. тез IV з’їзду Українського біофізичного товариства. – Донецьк (Україна). 2006. – С. 275-276.

АНОТАЦІЯ

Борискіна О.П. Енергії водневих зв’язків, що стабілізують конформацію гідратованих колагенових структур. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02  біофізика. – Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, м. Харків, 2007.

У роботі вивчені енергетичні характеристики водневих зв’язків, що приймають участь у стабілізації конформації потрійної спіралі гідратованих колагенових структур, зокрема модельного колагенового політрипептиду poly(Gly-Pro-Pro), колагену I типу та мінералізованого колагену I типу. Робота виконана з використанням комплексу експериментальних методів (ІЧ та Раман спектроскопії, п’єзогравіметрії, диференціальної КВЧ діелектрометрії), а також розробленого алгоритму чисельного аналізу частотних характеристик валентних коливань карбонільних груп колагену. Розрахована тонка структура смуги Амід I в ІЧ та Раман спектрах модельних колагенових політрипептидів та виконані віднесення компонент смуги Амід I в експериментальних спектрах poly(Gly-Pro-Pro) та колагену I типу. Вивчені та описані конформаційні перебудови потрійної спірали колагенових структур, що викликані гідратацією. Визначені величини ентальпії гідратації. Знайдено,