НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ДЕМ’ЯНЧУК НАТАЛІЯ ПЕТРІВНА

УДК 631.147:595.792:632.913

БІОТЕХНОЛОГІЧНІ АСПЕКТИ ВИРОБНИЦТВА
ЕНТОМОЛОГІЧНОГО ПРЕПАРАТУ ТРИХОГРАМИ (HYMENOPTERA, TRICHOGRAMMATIDAE)
ДЛЯ БІОЛОГІЧНОГО ЗАХИСТУ РОСЛИН

03.00.20 – біотехнологія

Автореферат на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному аграрному університеті Кабінету Міністрів України

Науковий керівник – | доктор біологічних наук

Мельничук Максим Дмитрович,
Національний аграрний університет,
проректор з наукової та інноваційної діяльності

Офіційні опоненти: | доктор сільськогосподарських наук,

старший науковий співробітник

Постоєнко Володимир Олексійович,
Державний науково-контрольний інститут

біотехнології і штамів мікроорганізмів,

заступник директора з наукової роботи

доктор біологічних наук, професор,

членкор УААН
Сігарьова Діна Дмитрівна,
Інститут захисту рослин УААН,

завідувач лабораторії нематології |

Захист відбудеться “06” грудня 2007 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.15 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 15, навчальний корпус 3, ауд. 65

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 13, навчальний корпус 4, к. 28

Автореферат розісланий “02” листопада 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Ю.В. Коломієць

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вітчизняний та зарубіжний досвід переконливо засвідчує перспективність використання трихограми проти комплексу лускокрилих (Бейбутов, 1971; Исаева, 1976; Караджов, Пулев, 1980; Толстова, 1980; Шелестова, 1985; Chenglung, 1988; Дрозда, 1991; Ткачов, Онищенко, 1992; Smith, 1994, 1996). Проте широка варіабельність даних, отриманих в експериментах з використання трихограми на практиці, ставить перед наукою нові завдання, пов'язані з критичною переоцінкою і вдосконаленням технологій її виробництва та використання.

Виникає гостра необхідність пошуку напрямків і методів для підвищення якості ентомологічного препарату трихограми, що в умовах техноценозу забезпечується шляхом створення високоякісних маточних та товарних культур. У цьому відношенні на особливу увагу заслуговує правильне визначення видового складу місцевих популяцій трихограми, що важко зробити без застосування молекулярно-генетичного методу. Проте в Україні відсутні молекулярно-генетичні дослідження видового складу роду Trichogramma Westw. Вирішення зазначених проблем вимагає глибоких комплексних досліджень елементів технології напрацювання ентомологічного препарату трихограми, від яких залежать його якість та ефективність.

З огляду на вищезазначене, вивчення цих питань для розвитку біологічного захисту рослин в Україні має актуальне наукове і практичне значення. Важливо не тільки нарощувати застосування трихограми, але й досліджувати її видове різноманіття і біоекологічні особливості, що в підсумку буде сприяти збільшенню виходу, підвищенню якості та польової ефективності трихограми.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота виконувалась у навчально-науково-виробничій лабораторії промислової біотехнології, біозахисту та біоенергетики Національного аграрного університету, згідно з темою “Розробка технічних та біологічних характеристик для масового отримання лабораторних культур ентомофагів та мікроорганізмів для потреб захисту рослин”, номер держреєстрації 0104U005243.

Мета і задачі досліджень. Мета досліджень – підвищення якісних показників ентомологічного препарату трихограми, зменшення матеріальних і енергетичних витрат для його виробництва шляхом розробки й удосконалення заходів та методів, що сприяють поліпшенню показників життєздатності популяцій.

Для досягнення мети поставлені такі задачі:

– визначити основні параметри біотехнології ентомологічного препарату трихограми та чинники, які обумовлюють його якісні показники;

– підібрати сприйнятну для умов промислового виробництва номенклатуру показників якості трихограми та розробити методи їх визначення;

– ідентифікувати види роду Trichogramma Westw. польових і плодових агробіоценозів за морфологічними й молекулярно-генетичними показниками та здійснити пошук генетичних маркерів;

– встановити кількісні та якісні показники різних популяцій трихограми в регіонах України;

– дослідити основні параметри технологічних операцій процесу виробництва ентомологічного препарату трихограми, які спрямовані на підвищення якісних показників (спрямований відбір та селекція популяцій у виробничих умовах, культивування на штучному живильному середовищі, забезпечення сприйнятної щільності утримання біоматеріалів трихограми в техноценозі);

– вдосконалити біотехнологічний процес виробництва і здійснити виробничу перевірку ентомологічного препарату трихограми;

– розробити спосіб селекції трихограми за пошуковою здатністю в умовах промислового виробництва ентомологічного препарату для потреб біологічного захисту рослин;

– провести біоенергетичну оцінку вдосконаленого процесу виробництва ентомологічного препарату трихограми;

– з’ясувати економічну ефективність вдосконаленого біотехнологічного процесу.

Об’єкт дослідження – біотехнологічний процес виробництва ентомологічного препарату трихограми для біологічного захисту рослин.

Предмет дослідження – біотичні і абіотичні параметри процесу виробництва ентомологічного препарату трихограми та їх вплив на показники його якості.

Методи досліджень. Для досягнення поставленої мети і виконання завдань використовували загальноприйняті методи (аналітично-синтетичний, логічний, структурно-функціональний, статистичний, математичне моделювання). Оцінювали достовірність отриманих результатів і економічну ефективність із застосуванням спеціальних біотехнологічних методів (лабораторні і виробничі методи, морфологічні та молекулярно-генетичні методи ідентифікації видів, системний аналіз біотехнічних систем, біоенергетична оцінка).

Наукова новизна одержаних результатів. Вдосконалено біотехнологічний процес виробництва ентомологічного препарату трихограми. Вперше підібрано показники якості ентомологічного препарату трихограми, отриманого в промислових умовах, розроблено та стандартизовано методи їх визначення. Вперше ідентифіковано види роду Trichogramma Westw. польових і плодових агробіоценозів України молекулярно-генетичним способом та запропоновано генетичні маркери. Показано, що культивування трихограми на штучному живильному середовищі сприяє підвищенню її плодючості. Розроблено спосіб селекції трихограми за пошуковою здатністю в умовах промислового виробництва ентомологічного препарату. Встановлено біоенергетичну і економічну ефективність використання вдосконаленого біотехнологічного процесу виробництва ентомологічного препарату трихограми для біологічного захисту рослин.

Наукова новизна підтверджена деклараційними патентами України на корисні моделі “Спосіб селекції трихограми“ № та “Пристрій для виробництва ентомологічного препарату трихограми“ № .

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених досліджень використано при розробці Державних стандартів України ДСТУ “Ентомологічні препарати трихограми. Загальні технічні умови”, „Техніка сільськогосподарська. Обладнання для вирощування ентомоакарифагів. Методи випробувань” та „Продукція ентомологічна для сільського господарства. Номенклатура показників якості”. Нормативно-технічна документація передана для використання виробничим, науково-дослідним, проектно-конструкторським та випробувальним установам країни.

Результати досліджень використано при створенні віварію для селекції трихограми за темою № .01/004 „Створити дослідний зразок модульного комплекту технологічного обладнання для промислового розведення трихограми” (ДР № U005709). В рамках цієї роботи розроблено конструкторську документацію 198/16.00.00.000, виготовлено експериментальний зразок, який пройшов Державні випробування в Укр. НДІПВТ ім. Л. Погорілого (реєстраційний номер 41-06, протокол № ).

Результати також використані при виконанні НДР за темою .6 „Провести дослідження та екологічну експертизу перспективної технології виробництва екологічно чистої продукції рослинництва на основі створення агроекосистеми та застосування механізованих біотехнологічних альтернатив” в УкрНДІПВТ ім. Л. Погорілого.

Наукові розробки впроваджено у ВП НДГ „Великоснітинське” ім. Музиченка на площі 1,2 га та ВСП НАУ „Агрономічна дослідна станція” Київської області на площі 20 га.

Вперше розроблений, запатентований і впроваджений в Україні спосіб селекції трихограми за ознакою пошукової здатності й пристрій для виробництва ентомологічного препарату трихограми, що дозволяє ефективно отримувати маточну культуру одночасно з промисловим виробництвом ентомологічного препарату трихограми без додаткових витрат біологічних матеріалів завдяки використанню рухомого спонукального джерела освітлення та значного зменшення або повного усунення загибелі найбільш біологічно активної частини самок трихограми. Винахід може бути масштабно використаний на біофабриках при масовому промисловому виробництві ентомологічного препарату трихограми.

Особистий внесок здобувача. Обґрунтовано науковий напрям досліджень, здійснено планування, складено схеми експериментів. Здобувачем особисто опрацьовано інформаційні джерела за темою дисертації, проведено лабораторні експерименти, узагальнено результати досліджень, виконано статистичну обробку експериментального матеріалу, сформульовані висновки та підготовлено матеріали до друку.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційного дослідження оприлюднені автором у доповідях і повідомленнях на семінарі в рамках ІХ Міжнародної виставки-ярмарку “Екологія-2006” на тему “Біологізація і якість життя: сучасний стан та перспективи агроекологічної освіти в Україні” (Київ, 2006); ІХ Всеукраїнській науково-практичній конференції “Молодь, освіта, наука, культура і національна самосвідомість” (Київ, 2006); Другій Міжнародній науково-технічній конференції “Екобіотехнології та біопалива в АПК” (Київ, 2006); Х Міжнародній виставці-ярмарку “Екологія-2007” (Київ, 2007); 5 Международной научно-практической конференции “Экология и сельскохозяйственная техника” (Санкт-Петербург, 2007); 5 Міжнародній науково-практичній конференції Інститутів аграрної інженерії країн Центральної та Східної Європи (Київ, 2007); ІІ Міжнародній науково-практичній конференції „Екотрофологія – міст у майбутнє харчування людини” (Біла Церква, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 статей, з яких 5 – у фахових наукових журналах, 1 – збірнику наукових праць, 2 тези доповідей, 2 деклараційні патенти України на корисні моделі.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, 6 розділів, висновків та рекомендацій виробництву, додатків, списку використаних джерел із 276 найменувань, з них 74 латиницею. Робота викладена на 157 сторінках комп’ютерного тексту і включає 10 таблиць та 34 рисунки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

У вступі обґрунтовано актуальність дисертаційної роботи, сформульовано її мету і завдання, подано наукову новизну та практичну цінність результатів роботи.

Огляд досягнень у галузі виробництва трихограми

(Огляд літератури)

Проаналізовано літературні джерела щодо особливостей отримання ентомологічного препарату трихограми високої якості залежно від технологічних заходів та параметрів біотехнологічного процесу. Визначено стан та перспективи біологічного методу захисту рослин. Наведено застосування заходів, спрямованих на підвищення якісних показників трихограми в процесі її розведення і виробництва, вплив умов культивації трихограми на динаміку її популяцій. Висвітлено селекційні та генетичні проблеми біотехнології розведення трихограми, акцентовано увагу на недостатності досліджень для удосконалення біотехнологічного процесу отримання ентомологічного препарату трихограми, висунуто робочу гіпотезу.

Умови, матеріали та методи проведення досліджень

Дослідження трихограми і параметрів, що визначають її життєздатність й ефективність в агробіоценозах проводили протягом 2005–2007 рр. у навчально-науково-виробничій лабораторії промислової біотехнології, біозахисту і біоенергетики та молекулярних досліджень Української лабораторії якості і безпеки продукції АПК Національного аграрного університету, дослідному господарстві “Гатне” Інституту землеробства УААН, на територіях навчального господарства НАУ „Агростанція”, ВП НДГ “Великоснітинське” ім. Музиченка НАУ, стаціонарних садових ділянках кафедри плодівництва та ділянках кафедри овочівництва НАУ.

Виявлення видів трихограми в агроценозах проводили за загальноприйнятими методиками (Мейер, 1941; Щепетильникова, 1972; Методические указания, 1974; Фурсов, Сторожева, 1990; Зубко, 2005). Якісні показники трихограми досліджували за методиками, наведеними в “Методичних рекомендаціях” (2004) та в ДСТУ „Ентомологічні препарати трихограми. Загальні технічні умови”.

Вплив застосування підживлення трихограми та зміни лабораторного живителя на плодючість самок видів Trichogramma рintoi, Т. еvanescens, T. еmbrуophagum (Trichogrammatidae, Hymenoptera), культивованих на яйцях зернової молі, вивчали за трьома факторами. Дослідження можливостей застосування підживлення з метою підвищення показників життєздатності та ефективності трихограми здійснювали на 6 видах, культивованих на яйцях зернової молі. Визначали фактичну плодючість трихограми (Ясинська, 2006).

Вплив щільності утримання трихограми на ступінь паразитованості яєць лабораторного живителя та, як наслідок, на плодючість самок у популяції виконували за схемою: 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 і 4 г трихограми виду T. pintoi Voeg. на 10 г яєць зернової молі. Досліди проводили в трикратній повторності.

Для отримання лабораторних популяцій гібридів F1 схрещували трихограму Таращанської, Миронівської, Сумської, Тетіївської, Кіровоградської, Одеської популяцій та популяції НАУ виду T.Voeg. Для оцінки ефекту гетерозису використовували основні показники життєздатності яйцеїда (Методичні рекомендації, 2004).

Для дослідження впливу перегонки трихограми на внутрішню поверхню балона чи пластини віварія наносили свіжовідкладені яйця зернової молі і на днищі розміщували трихограму у льотному стані у співвідношенні на кожні 10 г живителя – 2,37 г трихограми. Через дві доби на дослідний скляний балон зверху ставили другий скляний консервний балон об`ємом 3 л з накатаними свіжовідкладеними яйцями живителя або ж, у випадку віварія – другий віварій (Методичні рекомендації, 2004).

Матеріалом для виділення ДНК у молекулярно-генетичних дослідженнях видового складу трихограми слугувало імаго одного ентомофага, отримане на другу добу після відродження. Геномну ДНК виділяли за загальноприйнятою методикою (Boom, 1990) з попередньою обробкою протеіназою К. Амліфікацію ITS2 ділянки в полімеразній лацюговій реакції (ПЛР) рибосомальної ДНК трихограми проводили на приладі 2720 (Applied Biosystems, США) з використанням таких праймерів –
5?-TGTGAACTGCAGGACACATG-3?; 5?-GTCTTGCCTGCTCTGCTCTGAG-3?. Реак-цій-на суміш об’ємом 25 мкл містила 50 нг ДНК, 10 ммоль Tris-HCl (pH 8,3), 50 ммоль KCl, 3 мМ MgCl2, 0,2 ммоль dNTP суміші, 5 пмоль кожного з праймерів та 1U Taq-полімерази (Амплисенс, Россия). Температурний режим включав початкову денатурацію 1 хв при 95 0С з наступними 40 циклами: денатурація – 10 с при 95 0С, гібридизація праймерів – 10 с при 60 0С та синтез – 15 с при 72 0С. Завершував реакцію кінцевий синтез – 5 хв при 72 0С. Продукти ампліфікації ідентифікували методом електрофорезу в 2 %-му агарозному гелі.

Нуклеотидну послідовність ПЛР фрагментів ITS2 ділянки визначали на генетичному аналізаторі ABІ PRІSM 3130 (Applіed Bіosystems, США), з використанням набору BіgDye®termіnator, v.3.1, відповідно до інструкції виробника. Для цього отримані ПЛР фрагменти клонували у вектор pBlueskript KS(+) за стандартною методикою (Marchuk, 1991). Отриману плазмідну ДНК очищали з використанням комерційного набору фірми QІAGEN (Німеччина). Концентрацію і якість ДНК визначали спектрофотометрично.

Реакцію секвенування проводили на приладі Thermal Cycler 2400 (Applіed Bіosystems, США). Реакційна суміш об’ємом 20 мкл містила 8 мкл BіgDye®termіnator mix, 1 мкл універсального М13 праймера (3,2 пмоль), 1 мкл зразка (5–20 нг) і 10 мкл деіонізованої води. Умови реакції складалися з початкової денатурації 96 0С – 1 хв і наступних 25 циклів, що включали денатурацію 96 0С – 10 с, гібридизацію праймеру 50 0С – 5 с і синтез ланцюга 60 0С – 4 хв. Продукти сиквенсової реакції очищали шляхом Етанол/EDTA/NaAc преципітації та розчиняли у 10 мкл формаміду. Аналіз кожного зразка проводили у двох повторах, із правим і лівим праймером. Отримані послідовності ДНК, з обох праймерів, зводили до консенсусної послідовності. Результат вважали достовірним, якщо при співставленні ДНК послідовностей, отриманих з обох праймерів, не було виявлено відмінностей хоча б в один нуклеотид.

Статистичний аналіз результатів досліджень здійснювали методами дисперсійного, кореляційного і регресивного аналізів на персональному комп’ютері (Доспехов, 1985).

Енергетичну ефективність виробництва розраховували для одного модуля комплекту обладнання за один цикл виробництва ентомологічного препарату
(40 діб). Визначали прямі і уречевлені витрати енергії згідно методів біоенергетичної оцінки технологічних процесів у сільськогосподарському виробництві (Медведовський, Іваненко, 1988). Коефіцієнти повних і часткових енерговитрат (коефіцієнти біоенергетичної ефективності) розраховували за формулою

; , (1)

де КЕ – коефіцієнт повних енерговитрат;

Еn – повні енерговитрати нового варіанта технології, ГДж/т;

Еb – повні енерговитрати базового варіанта технології, ГДж/т;

КЕі - коефіцієнт і-го елементу енерговитрат;

Еnі - енерговитрати і-го елементу нового варіанта технології, ГДж/т;

Еbі- енерговитрати і-го елементу базового варіанта технології, ГДж/т.

Інші критерії ефективності – показники рівня інтенсифікації (ІE, ІЕi), що характеризують науково-технічний рівень розробки, визначали за співвідношеннями:

; . (2)

Економічну оцінку елементів технології виробництва ентомологічного препарату трихограми проводили за методиками оцінки ефективності наукових досліджень (Методика, 1982; Методические указания, 1984; Єрмаков, 2000).

Шляхи удосконалення біотехнологічного процесу виробництва
ентомологічного препарату трихограми

Системний аналіз процесу виробництва ентомологічного препарату трихограми як біотехнологічної системи. Основними чинниками, що визначають якісні показники ентомологічного препарату трихограми, отриманого в умовах промислового виробництва є якість яєць зернової молі, якісні показники життєздатності культури трихограми та показники супутніх технологічних процесів.

Враховуючи, що процес виробництва ентомологічного препарату трихограми є багатостадійним і комплексним, його оцінку проводили за кінцевою стадією – ефективністю трихограми, яку оцінювали за якістю ентомологічного препарату.

Вся система функціонує з метою досягнення вихідних виробничо-економічних показників при отриманні основної продукції. В даному випадку це високоякісний ентомологічний препарат трихограми. Високого рівня виробництва можна досягнути шляхом впливу функціонально-технологічних факторів на біологічні об'єкти з метою отримання вищих вихідних біотехнологічних показників. Якість культури трихограми характеризується такими параметрами: кількість паразитованих яєць, відродження трихограми, кількість самок і деформованих особин, плодючість та пошукова здатність трихограми.

На підставі даних показників можна вирахувати узагальнюючий критерій якості та клас ентомологічного препарату трихограми, що дає змогу отримати дані очікуваної біологічної ефективності трихограми в агроценозі. Висока якість і ефективність ентомологічного препарату трихограми неможлива без визначення видової приналежності імаго та генетичного різноманіття популяції.

Основними функціонально-технологічними факторами процесу виробництва ентомологічного препарату трихограми є параметри самого процесу: температура (0С), відносна вологість повітря (%), фотоперіод та ряд інших. Але це відомі і вивчені рядом дослідників фактори (Заславский, Май Фу Кви, Умарова, 1988). На нашу думку, оптимізація параметрів процесу виробництва щодо показників якості біоматеріалу можлива за рахунок детального дослідження раціонального співвідношення паразит–живитель та використання штучних живильних середовищ.

Значний вплив на стабільність функціонування даної біотехнічної системи є використання зворотного зв'язку, тобто зміни функціонально-технологічних факторів за умов зниження вихідних біотехнологічних показників процесу. Для підвищення ефективності процесу виробництва ентомологічного препарату трихограми, зменшення матеріальних і енергетичних витрат при виробництві товарної і маточної культур трихограми даний біотехнологічний процес необхідно досліджувати у взаємозв'язку з видовим статусом імаго, співвідношенням паразит–живитель, генетичним різноманіттям популяції, використанням штучних живильних середовищ.

Нами визначено основні керовані параметри технологічного процесу виробництва ентомологічного препарату трихограми, що дозволять у подальшому збільшити вихід якісного препарату.

Удосконалення методики визначення якості ентомологічного препарату трихограми. Методи визначення якості ентомологічного препарату трихограми, які удосконалено шляхом вибору і апробації, висувають жорсткіші вимоги до визначення якості. Після визначення виду нами проведено послідовні дії для визначення інших показників життєздатності культури трихограми.

Метод визначення кількості паразитованих яєць полягав у підрахунку паразитованих та незаражених яєць лабораторного живителя. Відродження трихограми підраховували за кількістю імаго трихограми, які відродились з паразитованих яєць. Кількість самок визначали шляхом підрахунку тих, що відродились з паразитованих яєць. Метод визначення кількості деформованих особин полягав у підрахунку кількості морфологічно ненормальних комах, отриманих при відродженні з паразитованих яєць зернової молі. Суть методу визначення плодючості – у розрахунку кількості паразитованих яєць живителя на одну самку трихограми. Пошукову здатність трихограми визначали шляхом підрахунку кількості паразитованих яєць природного живителя в камерах інтегрального визначника якості ОКИ-2. За результат випробувань брали середнє арифметичне двох паралельних визначень, допустиме розходження між якими не перевищувало ±3–5 %. Абсолютна похибка вимірювань показників становила ±0,01–0,02 % за довірчої ймовірності Р=0,95. За вищевказаними показниками визначали узагальнений критерій якості.

Дослідження частки кожного з використаних критеріїв у характеристиці окремої партії трихограми за допомогою кластерного аналізу показало, що найзначущими біологічними характеристиками, що визначають ефективність ентомологічного препарату трихограми, є відродження трихограми із паразитованих яєць, плодючість самок і пошукова здатність. Зараженість трихограмою яєць живителя необхідна для розрахунку норми випуску ентомологічного препарату трихограми на 1 га в одиницях маси (г).

За використання різних математичних функцій при регресійному аналізі для окремих показників отримано істотний зв'язок з критерієм якості та відродженням трихограми з паразитованих яєць – r ,730651, плодючістю – г ,828581, пошуковою здатністю – r ,691035. Узагальнений критерій якості (Д) розраховували за рівнянням множинної регресії, на підставі якого визначали клас трихограми та очікувану ефективність Т. рintoi.

Якість окремих партій яйцеїду більше відповідала вимогам першого, а також другого класу. Відродження трихограми з яєць лабораторного живителя, котрим в усіх зразках виявилася зернова міль, коливалося у межах 76,0–90,2 %, кількість самок в популяціях становила 50,6–66,0 %, пошукова здатність – 60–90 %. Тривалість життя особин за окремими партіями була 2,5–4,3 доби. Плодючість самок спостерігали в межах 24,7–60,0 яєць на самку. Якість окремих популяцій яйцеїду відповідала вимогам більше першого класу.

Таким чином, цілеспрямований науковий пошук методів підвищення життєздатності трихограми, а також отримання стандартної продукції в умовах масового напрацювання ентомологічного препарату трихограми на біофабриках неможливі без об’єктивної оцінки її якості. Нами вперше підібрано, обґрунтовано та узгоджено з виробниками методику оцінки якості ентомологічного препарату трихограми, яка стандартизована (ДСТУ „Ентомологічні препарати трихограми. Загальні технічні умови”) і відповідає вимогам Державного стандарту України.

Молекулярно-генетична ідентифікація видів у біотехнологічному процесі
виробництва ентомологічного препарату трихограми

Нами проведено ПЛР ITS ділянки рДНК зі зразками трихограми різних видів. Два види трихограми (T.іae і T.) мали схожі розміри ПЛР-продуктів – 586 і 583 п.н. відповідно. Представники виду T. semblіdіs відрізнялися від них і мали розмір 528 п.н. Вид T.іntoі відзначався наявністю одного амплікону розміром 698 п.н. (рис. 1).

Рис. 1. Електрофоретичний поділ продуктів ампліфікації ITS ділянки рДНК
п’яти видів трихограми у 2 %-му агарозному гелі:

1 – T. (698 п.н.);

2 – T. (700, 500 п.н.);

3 – T. (586 п.н.);

4 – T. (528 п.н.);

5 – T. (583 п.н.);

М – маркер молекулярних мас GeneRulerтм 100 bp DNA Ladder.

Виявлено відмінності генетичної структури у представників різної статі виду T.іmі. Самки характеризувалися наявністю двох продуктів ампліфікації розміром 700 і 500 п.н., водночас у самців був виявлений тільки один – 500 п.н. Отримані нами міжвидові відміни дозволяють чітко диференціювати види T.іntoі, T.іmі та T.іdіs.

Для одержання детальнішої характеристики видів нами проведено визначення нуклеотидної послідовності ІTS ділянки. Отримані дані оброблено з використанням комп'ютерної програми SeqAnalyses5.2 (Applіed Bіosystems) і проаналізовано в міжнародній базі даних (www.ncbі.nlm.nіh.gov/BLAST/). Так, як і за ПЛР-аналізу, досліджувані види розділялися на два кластери. Перший кластер включав види T. pіntoі і T. dendrolіmі, другий – T.іae, T.іdіs та T. (рис. 2). Нуклеотидна послідовність ІTS області T.іntoі і T.іmі має 98 % подібності, 16 розходжень у 12 ділянках. Порівняння нуклеотидної послідовності видів T. cacoecіae, T.іdіs і T. виявило 87–98 % подібності між ними, водночас обидва кластери мали між собою подібність, яка знаходилась в межах лише 61–65 %.

Рис. 2. Дендрограма, побудована на основі аналізу нуклеотидних послідовностей ITS ділянки рДНК п’яти видів ентомофага роду Trichogramma Westw. (1 PAM відповідає одній точковій мутації на 100 нуклеотидних залишків)

Отже, проведені нами дослідження дозво-лили відпрацювати метод видоспецифічної ПЛР, що дозволяє диференціювати три морфологічно подібні види роду Trіchogramma – T. pіntoі, T.іmі та T. semblіdіs.

Для отримання детальнішої характеристики виду Trichogramma рintoi Voeg. визначали нуклеотидну послідовність ITS ділянки. Нуклеотидна послідовність ITS ділянки T. рintoi з послідовністю, взятою з GenBank (Accession No.), мають 98 % збігу та 15 відмінностей в 10 ділянках. Проведений BLAST-aналіз свідчить, що поліморфізм даної ділянки можна використовувати як маркер видової приналежності, який дозволяє диференціювати даний вид від інших представників роду Trichogramma Westw.

Дослідження мають наукову і практичну доцільність, оскільки розмноження виду T. рintoi, який є домінуючим, налагоджено в біологічних лабораторіях України, а саме в Київській (Національний аграрний університет), Черкаській, Тетіївській, Одеській, Чернівецькій, Сумській, Таращанській та ряді інших, і застосовується виробниками в овочевих агроценозах. Метод секвенування ITS ділянки рДНК нами рекомендовано використовувати для генетичної паспортизації виду T.Voeg.

Основні параметри технології виробництва ентомологічного препарату трихограми

Ефект підживлення штучними живильними середовищами на життєздатність трихограми. Проведені до цього часу наукові дослідження вітчизняних вчених Л.П. Зильберга, А.Ф. Руснак, Н.Н. Балашової, К.В. Тэрыце, Э.М. Менчера та інших щодо застосування розчинів цукру і меду для підвищення продуктивності самок трихограми ще не дають повної чіткої відповіді на це питання. В дослідженнях застосування штучного живильного середовища на шести видах трихограми, де як лабораторний живитель брали Sitotroga cerealella Oliv., найвищі значення показника плодючості відмічали за підживлення самок 20 %-м розчином меду. У цьому випадку спостерігали найінтенсивнішу плодючість самок яйцеїда досліджуваних видів трихограми. За підживлення 25 %-м розчином меду життєздатність самок яйцеїда згасала (табл. 1).

Таблиця 1 – Плодючість самок трихограми залежно від концентрації
розчину меду (М±m; n=4)

Вид трихограми

фактор А | Тип підживлення фактор В | контроль | 15%-й р-н меду | 20%-й р-н меду | 25%-й р-н меду | T. | 29,5±1,83 | 36,1±2,24 | 38,9±2,41 | 36,5±2,26 | T. еvanescens | 20,0±1,24 | 29,6±1,83 | 36,7±2,27 | 32,0±1,98 | T. | 16,9±1,05 | 31,4±1,95 | 34,8±2,16 | 33,7±2,09 | T. | 16,1±1,00 | 21,3±1,32 | 23,6±1,16 | 21,7±1,35 | T. | 11,8±0,73 | 19,7±1,22 | 21,0±1,30 | 20,3±1,26 | T. embryophagum | 15,7±0,97 | 18,8±1,17 | 20,0±1,24 | 19,1±1,18 | НІР05 = фактор А 0,63; фактор В 0,52; взаємодія АВ 1,26.

У T. плодючість за умов підживлення 20 %-м розчином меду досягала у середньому 38,9 яєць на самку, що перевищувало цей показник у T. на 2,2 яйця. Зараження яєць зернової молі трихограмою видів T. і T.semblidis, яку додатково підживлювали вуглеводами, становило 34,8 та 23,6 яєць на самку. Трихограма виду T. виявилася менш сприйнятливою до підживлення розчином меду і заражала в середньому 21 яйце на самку. Найменше заражала яйця живителя T. –20 яєць. На підставі отриманих нами експериментальних значень складено рівняння регресії у виді полінома другого порядку. Шляхом визначення екстремуму були отримані значення найефективніших концентрацій розчину меду.

Доцільна концентрація розчину меду для всіх досліджуваних видів трихограми коливалась у межах від 19,1 до 23,2 %. Так, для трихограми виду T. рintoi індекс детермінації становив 0,94, відповідно ефективна концентрація розчину меду – 22,7 %, водночас індекс детермінації T. еvanescens склав 0,93, а найдоцільнішою для підживлення була концентрація розчину меду 19,1% – найменша серед усіх досліджуваних видів. Індекси детермінації T.dendrolimi і T.semblidis становили відповідно 0,99 й 0,94, а точки екстремуму та ефективної концентрації розчину меду – 23,8 % для T. dendrolimi і 20,4 % для T.. У самок трихограми виду T. індекс детермінації був найвищим і становив 1,00, а раціональна концентрація розчину меду для підживлення – 21,3%; у T. еmbryophagum індекс детермінації – 0,95, найефективніша концентрація розчину меду – 20,9%.

Таким чином, нами експериментально виявлено суттєві відмінності за показником фактичної плодючості самок яйцеїда, що свідчить про доцільність підживлення трихограми. Для цілеспрямованого підвищення плодючості самок, з метою використання для подальшого створення маточної чи товарної культури трихограми, нами рекомендовано підживлювати їх розчином меду в специфічних для кожного виду концентраціях. Рекомендовано проводити оптимізацію харчового субстрату для підвищення плодючості самок у лабораторних умовах з використанням розчину меду різнотрав’я, характерного для регіону випуску трихограми з метою підвищення життєздатності та продуктивності імаго.

Дослідження раціональної щільності утримання трихограми в техноценозі. Висока щільність утримання трихограми значно знижує плодючість самок яйцеїда, а відтак і зараженість яєць живителя ентомофагом, але знижена щільність утримання виявляє значніший вплив на показники.

Експериментальним шляхом нами отримана закономірність (рис. ), згідно з якою максимум зараженості яєць живителя трихограмою настає при співвідношенні в скляному балоні 2,37 г трихограми на 10 г яєць зернової молі.

Рис. 3. Залежність зараженості яєць лабораторного живителя трихограмою від щільності посадки

Застосування методів селекції для підвищення продуктивності технології масового розведення трихограми. Нами досліджена доцільність ефективності поетапного розмноження трихограми шляхом пасажування через дві доби на свіжовідкладені яйця зернової молі. Отримані дані свідчать, що пасажування трихограми доцільне, оскільки воно сприяє повнішій реалізації репродуктивної спроможності трихограми і підвищує продуктивність процесу масового розведення в середньому на 29,5% з коливанням від 33% до 26%.

Згідно із закономірністю (рис. 4), за умов культивації трихограми в часовому інтервалі від 0,5 до 2,6 діб кількість отриманого ентомологічного препарату трихограми збільшується, і тільки після 2,6 діб знижується. Максимум отриманого ентомологічного препарату трихограми відповідає значенню часу 2,6 доби. Максимум отриманого додатково після пасажування ентомологічного препарату трихограми відповідає значенню часу 2,1 доби.

Рис. 4. Кількість зібраного ентомологічного препарату трихограми залежно від тривалості утримання і часу пасажування

Отже, найраціональніше проводити пасажування трихограми на свіжовідкладені яйця лабораторного живителя через 2,1 доби після посадки трихограми в першу ємкість.

З огляду на це, виникла необхідність проведення селекції трихограми за пошуко-вою здатністю в умовах промислового виробництва ентомологічного препарату для по-треб біологічного захисту рослин. Спосіб селекції трихограми за ознакою пошукової здатності, запропонований нами, поля-гає в створенні рухомої спонукальної освітленої зони, що рухається за дов-жиною або висотою поверхні з нане-сеними яйцями від точки виходу три-хограми до найвіддаленішої точки, яка розташована на відстані не меншій, ніж радіус ефективної дії три-хограми в польових умовах – 3 м. При цьому час руху освітленої зони від початкової до кінцевої точки збіга-ється з періодом активного виходу трихограми і зараження яєць комахи-шкідника і не перевищує часу цього періоду.

Рис. 5. Спосіб селекції трихограми за ознакою пошукової здатності

Дослідження показали, що після подолання трихограмою відстані 300 см, зараженість яєць зернової молі відбувається за всією відстанню лабіринту (рис. 5). Найбільшу кількість заражених яєць живителя нами отримано на перших 100 см, далі зараженість яєць трихограмою згасала, а яйця, що були заражені трихограмою, яка пройшла максимальну відстань, використовували як маточну культуру трихограми.

Стає очевидним, що запропонований нами винахід забезпечує селекцію трихограми за ознакою пошукової здатності, ефективне отримання маточної культури одночасно з промисловим виробництвом ентомологічного препарату трихограми без додаткових витрат біологічних матеріалів. Це досягається шляхом використання рухомого спонукального джерела освітлення та значним зменшенням або повним усуненням загибелі найбільш біологічно активної частини самок трихограми. Винахід може бути масштабно використаний на біофабриках при масовому промисловому виробництві ентомологічного препарату трихограми.

Ефективність застосування ентомофагів роду Trichogramma в процесі масового розведення. В наших експериментах гібриди трихограми першого покоління характеризувалися більш високими показниками плодючості самок, тривалістю життя і пошуковою здатністю порівняно з батьківськими популяціями.

Результати, отримані при схрещуванні популяцій, свідчать про наявність ефекту гетерозису. Вивчення впливу гетерозису на підвищення життєздатності і продуктивності маточних і товарних культур трихограми дозволяє дійти висновку, що гібриди F1 майже за всіма досліджуваними показниками якості перевищували батьківські популяції. Популяція трихограми Тетіївська 1 і 2 значно перевершують майже за всіма якісними показниками інші популяції. Узагальнюючий критерій якості Одеської та популяції НАУ був нижчим і становив 0,58 і 0,60 відповідно.

Дослідження довели, що застосування явища гетерозису при розведенні трихограми значно підвищило якісні показники біоматеріалу у гібридів першого покоління. Гібриди трихограми F1, що відрізнялися найвищими якісними показниками, нами використано як вихідний біологічний матеріал для створення маточної культури при розведенні яйцеїда в лабораторії.

Енергетична та економічна оцінка вдосконаленого біотехнологічного процесу виробництва ентомологічного препарату трихограми

Біоенергетична оцінка біотехнологічних процесів виробництва ентомологічного препарату трихограми. Перелік заходів, які знижують біоенергетичні витрати удосконаленого нами процесу виробництва ентомологічного препарату трихограми порівняно з базовою біотехнологією:

1. Забезпечення сприйнятних параметрів щільності біологічних матеріалів з культивування трихограми, що індукує збільшення виходу товарного ентомологічного препарату на 12 %.

2. Використання методу селекції трихограми за пошуковою здатністю безпосередньо в процесі виробництва ентомологічного препарату, що дозволяє підтримувати необхідний рівень промислової культури трихограми і зменшити витрати на стартову маточну культуру в 4 рази.

3. Застосування підживлення трихограми розчином меду різнотрав`я, яке характерне саме для зони подальшого використання ентомологічного препарату, що сприяє зменшенню рівня стресу за умов промислового культивування трихограми та збільшенню виходу товарного ентомологічного препарату на 17 %.

4. Використання високоякісної стартової маточної культури трихограми, яка відібрана на основі проведення генетично-молекулярної ідентифікації видів роду Trichogramma Westw. в польових та плодових агроценозах.

Проведено порівняльну біоенергетичну оцінку витрат прямої та уречевленої енергії при виробництві ентомологічного препарату трихограми за 1 цикл (40 діб) на одному модулі комплекту технологічного обладнання для вирощування трихограми (ІТІ “Біотехніка”). Визначено енергетичний еквівалент ентомологічного препарату трихограми за відношенням його енергоємності до норми внесення, що становить 33502,46 МДж/кг.

Нами розраховано біоенергетичні показники базової та нової технології виробництва ентомологічного препарату трихограми (табл. 2).

Таблиця 2 – Біоенергетичні показники базової та нової технології
виробництва ентомологічного препарату трихограми

Елементи
енерговитрат | Базова
технологія, ГДж/кг | Нова
технологія, ГДж/кг | Співвідношення показників нової технології
до базової | коефіцієнт енерговитрат | рівень інтенсифікації, %Прямі | 31,31 | 17,15 | 0,547 | 45,3 | Уречевлені | 0,03 | 0,03 | 1,0 | 0 | Повні | 31,34 | 17,18 | 0,548 | 45,2 |

Рівень інтенсифікації, який досягнуто за рахунок використання нового варіанта технології виробництва ентомологічного препарату трихограми за повними енерговитратами становив 45,2 %.

Енерговитрати, які уречевлені в будівлях і спорудах, механізмах та обладнанні, практично не змінились. Лише в комплекті обладнання віварій для вирощування трихограми ВТ-2 замінено на віварій, який оснащено пристроєм з рухомим спонукальним джерелом освітлення. Це дозволило усунути загибель найбільш біологічно активної частини самиць трихограми та отримувати маточну культуру для власних потреб у процесі виробництва ентомологічного препарату. Введення в технологічний процес додаткових операцій з відбору маточної культури трихограми для власних технологічних потреб, застосування підживлення трихограми медом вимагають збільшення витрат праці обслуговуючого персоналу на 1876 люд.-год, що становить 5,6 % від загальних енерговитрат, але дозволяє інтенсифікувати процес виробництва ентомологічного препарату майже в півтора раза з одночасним підвищенням його якісних показників. Витрати меду різнотрав’я за один цикл складають лише 140 г і також дозволяють значно інтенсифікувати процес та підвищити якість ентомоло-гічного препарату трихограми.

За результатами порівняльної біоенергетичної оцінки базової і нової технологій, основним джерелом значної інтенсифікації біотехнологічного процесу виробництва ентомологічного препарату трихограми є зменшення енерговитрат на маточну культуру трихограми та підвищення виходу товарного ентомологічного препарату. Вперше розраховано біоенергетичний еквівалент ентомологічного препарату трихограми, виробленого в промислових умовах.

Економічна ефективність елементів біотехнологічного процесу виробництва ентомологічного препарату трихограми. Застосування нового варіанта технології виробництва ентомологічного препарату трихограми підвищує вартість продукції на 2700 грн/кг та її рентабельність з 43,3  до 97,7 %. У свою чергу, собівартість продук-ції знижується до 7850,75 грн/кг, а прибуток від виробництва збільшується до 4446,57 грн.

Отримані додаткові економічні ефекти від застосування заходів нового варіанта технології:

– виродження культури трихограми не через 4–5 циклів (базовий варіант),
а через 8 циклів, отже, додаткове пасажування через яйця природного господаря
доцільно проводити в 2 рази рідше;

– відсутність витрат на закупівлю маточної культури трихограми в новій технології;

– підвищення класу трихограми за рахунок зростання якості продукції;

– збільшення виходу ентомологічного препарату трихограми в процесі вироб-ництва;

– зниження витрат на захист рослин від шкідників.

Застосування удосконалених елементів у біотехнологічному процесі виробництва ентомологічного препарату трихограми підвищує рентабельність виробництва на 54,4 % порівняно з базовим варіантом технології. Аналіз отриманих даних дозволяє дійти висновку, що суттєві відмінності в структурі економічних витрат базового і нового варіантів технології, а також факт збільшення виходу ентомологічного препарату трихограми, зниження його собівартості та підвищення рівня рентабельності вказують на доцільність впровадження вдосконаленого біотехнологічного процесу виробництва ентомологічного препарату трихограми.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється у розробці та удосконаленні заходів та методів для поліпшення показників життєздатності популяцій трихограми з метою підвищення якості ентомологічного препарату трихограми, а також зменшення матеріальних і енергетичних витрат для його виробництва.

1. Проведений нами аналіз процесу виробництва ентомологічного препарату трихограми як біотехнологічної системи свідчить, що висока якість і ефективність препарату неможлива без визначення видового статусу імаго, забезпечення генетичного різноманіття популяції, без раціонального кількісного співвідношення між паразитом та живителем, використання штучних живильних середовищ.

2. Шляхом вибору і апробації удосконалено методи визначення кількості паразитованих яєць зернової молі, інтенсивності відродження з них трихограми, частки самок у новій популяції, кількості деформованих особин, плодючості самок та пошукової здатності комах.

3. За використання кластерного та регресійного аналізу розроблено методику розрахунку узагальненого критерію якості, на підставі якого можна визначити клас трихограми та очікувану ефективність. Методика стандартизована і відповідає вимогам Державного стандарту України.

4. Диференційовано три види роду Trіchogramma – T.іntoі, T.іmі та T.іdіs удосконаленим нами методом видоспецифічної ПЛР. Вперше встановлено, що поліморфізм ділянки ITS можна використовувати як маркер видового статусу T.іntoі для його диференціювання виду від інших представників роду Trichogramma Westw.

5. Вперше визначено найефективніші концентрації розчину меду для підживлення видів T. рintoi – 22,7 %, T. еvanescens – 19,1, T. – 23,8, T. – 20,4, T. – 21,3, T. еmbryophagum – 20,9 %.

6. З’ясовано раціональне співвідношення щільності утримання паразита і господаря в умовах техноценозу. Результати випробувань засвідчують, що найдоцільнішим є співвідношення, в якому 2,37 г трихограми припадає на 10 г яєць зернової молі.

7. Вперше розроблено спосіб селекції трихограми за пошуковою здатністю в умовах промислового виробництва для потреб біологічного захисту рослин, що забезпечує можливість отримання маточної культури без додаткових витрат біологічних матеріалів та значного зменшення або повного усунення загибелі найбільш біологічно активної частини самок трихограми.

8. Доведено доцільність застосування явища популяційного гетерозису при розведенні трихограми, що ефективно на фоні загальної тенденції до зниження життєздатності популяцій за тривалого лабораторного розведення. Вдосконалення біотехнологічного процесу виробництва ентомологічного препарату трихограми значно підвищує якісні показники біоматеріалу у гібридів першого покоління. Результати досліджень підтверджують наявність ефекту гетерозису.

9. Вперше розраховано біоенергетичний еквівалент ентомологічного препарату трихограми в промислових умовах. Результати порівняльної біоенергетичної оцінки базової і нової технологій показали, що основним джерелом інтенсифікації біотехнологічного процесу виробництва ентомологічного препарату трихограми є зменшення енерговитрат на маточну культуру та підвищення виходу товарного препарату.

10. Застосування нового вдосконаленого біотехнологічного процесу виробництва ентомологічного препарату трихограми сприяє зростанню прибутковості виробництва на 2544,08 грн та рентабельності до 97,7 %. При цьому зафіксовано зниження собівартості продукції порівняно з базовим варіантом технології біотехнологічного процесу виробництва ентомологічного препарату трихограми.

Рекомендації виробництву

1. Рекомендовано використовувати розчин меду в певній концентрації для кожного виду трихограми для оптимізації харчового субстрату з метою підвищення життєздатності та продуктивності імаго в лабораторних умовах.

2. Запропоновано спосіб підвищення життєздатності популяцій трихограми за умов тривалого лабораторного розведення шляхом міжпопуляційних