КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Філіппов Ігор Борисович

УДК 577.612.815:612.73

Метаботропна регуляція синаптичного пуринергічного гальмування в вісцеральних гладеньких м’язах

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Київському національному університеті імені Тараса Шевченка на кафедрі біофізики біологічного факультету

Науковий керівник:

академік НАН України, доктор медичних наук, професор Шуба Михайло Федорович

доктор біологічних наук, професор

Остапченко Людмила Іванівна

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, декан біологічного факультету

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Лях Юрій Єремійович

Донецький національний медичний університет ім. М. Горького, завідувач кафедри медичної біофізики, медапаратури та клінічної інформатики

кандидат біологічних наук, доцент

Манько Володимир Васильович

Львівський національний університет імені Івана Франка, доцент кафедри фізіології людини і тварин

Захист відбудеться 20 лютого 2008 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, пр. акад. Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 215)

Поштова адреса: 01033, Київ – 33 , вул. Володимирська, 64

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка (01033, Київ – 33, вул. Володимирська, 58)

Автореферат розісланий 16 січня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Цимбалюк О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В останнє десятиріччя фізіологія, біофізика та фармакологія гладеньких м’язів травного тракту приділяє значну увагу дослідженню активації специфічних G-білків, спряжених з внутрішньоклітинними ферментами або іонними каналами. Вважається, що гальмівна дія аденозинтрифосфорної кислоти (АТФ), вивільненої із нервових терміналей, на гладенькі м’язи шлунково-кишкового тракту опосередкована через метаботропні Р2У- пуринорецептори [Marhy and Makhlouf, 1998; Kong et al., 2000]. На превеликий жаль, на сьогодні немає достатньо селективних фармакологічних засобів, які б з високою вибірковістю активували або пригнічували метаботропні Р2У-пуринорецептори, що не дозволяє остаточно визначити їх функціональну роль.

Активація Р2У-пуринорецепторів через Gq/11-білки та фосфоліпазу С [Marhy and Makhlouf, 1998; Communi et al., 2001] призводить до утворення інозитол-1,4,5-трифосфату (ІР3) і, як наслідок його дії, вивільнення іонів кальцію із внутрішньоклітинного кальцієвого депо з наступною активацією процесів за участі цього вторинного посередника. Відомо також, що передача сигналів від Р2У11-пуринорецепторів здійснюється із залученням різних G-білків (Gq/11 і Gs) і спряжена з подальшою активацією як аденілатциклазного, так і Са2+-поліфосфоінозитольного регуляторних каскадів [Ralevic and Burnstock, 1998; Kegelgen and Wetter, 2000; Abbracchio et al., 2006]. У зв’язку з вище наведеним, метаболічна регуляція клітинних процесів стає головною у дослідженні пуринергічної синаптичної передачі в інтестинальних гладеньких м’язах.

У гладеньких м’язах шлунково-кишкового тракту, згідно даних літератури, Р2У гальмівні пуринорецептори пов’язані, з тим же типом G білків (а можливо й однаковою системою внутрішньоклітинних посередників), що і збуджувальні мускаринові холінорецептори (М3) [Unno, 2003]. Можна припустити, що цілеспрямоване виділення Са2+ із саркоплазматичного ретикулума повинне мати першорядне значення для того, щоб при активації М-холінорецепторів виникало збудження і скорочення, а при активації Р2У-рецепторів – гальмування і розслаблення. Тому, можна очікувати, що при сумісній або селективній активації певного типу мускаринових холіно- і пуринорецепторів повинні бути відмінності в процесах регуляції клітинних механізмів функціонування гладеньких м’язів.

Зв'язок роботи з науковими програмами. Робота виконана в рамках науково-дослідних робіт кафедри біофізики біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка (тема №01БФ036-02 "Дослідження та моделювання молекулярних та клітинних процесів у збудливих біологічних системах") та гранту INTAS №01-0093 "Мембранні та внутрішньоклітинні механізми пуринергічного гальмування гладеньких м’язів шлунково-кишкового тракту".

Мета роботи полягала у з’ясуванні клітинних механізмів регуляції синаптичного пуринергічного гальмування у вісцеральних гладеньких м’язах при активації метаботропних рецепторів.

Для досягнення даної мети слід було вирішити наступні завдання:

Дослідити участь фосфоліпази С у генерації неадренергічного синаптичного гальмування в гладеньких м’язах.

Визначити роль тирозинкінази в процесах генерації синаптичного гальмування.

Визначити участь внутрішньоклітинних кальцієвих депо ГМК в пуринергічному синаптичному гальмуванні.

Дослідити можливу участь аденілатциклази в модуляції пуринергічного гальмування.

Дослідити особливості клітинних механізмів передачі сигналу при одночасній активації збуджувальних мускаринових холінорецепторів і гальмівних пуринорецепторів мембрани ГМК.

Об'єкт дослідження: поздовжні та кільцеві м’язи товстого кишечнику, а також гладенькі м’язи фундального відділу шлунка.

Предмет дослідження: метаботропна регуляція пуринергічного гальмування гладеньких м’язів.

Методи дослідження: модифікований сахарозний місток і тензометричний метод реєстрації скорочення.

Наукова новизна одержаних результатів. У дисертаційній роботі вперше виявлена участь залежних від фосфоліпаза С компонентів неадренергічних гальмівних синаптичних потенціалів. Показано, що вивільнення іонів кальцію із інозитолтрифосфатчутливого та ріанодинчутливого внутрішньоклітинного кальцієвого депо пов’язане із генерацією швидкого і повільного компонентів неадренергічних гальмівних потенціалів, відповідно. Знайдено різницю між клітинними механізмами гальмування, викликаного дією АТФ, за умов селективної активації М3- або М2-холінорецепторів та сумісної синергічної активації холінорецепторів обох вказаних підтипів.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Одержані в роботі дані значно поглиблюють та розширюють уявлення про механізми регуляції синаптичного неадренергічного пуринергічного гальмування в інтестинальних гладеньких м’язах. Результати роботи можуть бути застосовані для розробки фармакологічних засобів корекції патологічних станів, пов’язаних з гіперактивністю гальмівної синаптичної передачі в гладеньких м’язах шлунково-кишкового тракту.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем було самостійно виконано аналіз наукової літератури, проведені експериментальні дослідження та обробка отриманих результатів, їх викладення та порівняння з даними інших авторів. Розробку концепції роботи, планування експериментів, обговорення та формування висновків було проведено за участі наукового керівника та співавторів робіт.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідались на ІІ конференції Українського товариства нейронаук (30 травня – 3 червня, Донецьк, 2001р.), Second Bogomoletz-Nencki Symposium "Intracellular Signaling in Excitable Cells" (Kiev, Ukraine, September 1 - 2, 2002), 2nd Kiev Symposium "Smooth Muscle Physiology and Biophysics” (Kiev, Ukraine, 28 - 31 October), Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 25 - 28 квітня, 2004 р.), Europen congress on pharmacologu (Porto, Portugal, 14 - 17 Joly, 2004), III конференции украинского общества нейронаук с международным участием, посвященной 75-летию Донецкого государственного медицинского университета им. М. Горького (23 - 27 мая, 2005 г.), XVII з’їзді Українського фізіологічного товариства з міжнародною участю (Чернівці, 18 - 20 травня 2006 р).

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковані в трьох статтях і шести тезах доповідей в матеріалах наукових зібрань.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів дослідження та їх обговорення, висновків і списку використаних джерел із 233 посиланнями. Робота викладена на 129 сторінках та ілюстрована 3 таблицями і 31 рисунком.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали та методи досліджень

У дослідах використовувались морські свинки невеликих розмірів (вагою 250 - 300 г) незалежно від статі. Тварин наркотизували медичним ефіром, декапітували та проводили розтинання черева. Об’єктом дослідження були поздовжні (taenia coli) та кільцеві (cacum) м’язи сліпої кишки, кільцеві м’язи дистального відділу товстого кишечнику (colon), а також гладенькі м’язи фундального відділу шлунка. Після очищення від слизового й підслизового шару видалені ділянки шлунка і кишечнику, під бінокуляром у розчинні Кребса, нарізали на м’язові смужки поздовжнього та кільцевого шарів довжиною 0,7 – 1,2 см, шириною 0,2 – 0,3 см. Далі м’язові смужки закріпляли шовковою лігатурою з обох кінців та поміщали у свіжий розчин Кребса, де вони витримувалися до початку експерименту протягом 2 годин.

Як основний метод досліджень використовували модифіковану методику одинарного сахарозного містка [Артьоменко и др., 1982], яка дозволяє одночасно відводити електричну та реєструвати скоротливу активність гладеньких м’язів і адекватно подразнювати м’язові смужки. Перевагою цього методу, у порівнянні з методом подвійних сахарозних містків, є можливість реєстрації синаптичних потенціалів у відповідь на подразнення інтрамуральної нервової системи інтестинальних гладеньких м’язів електричним струмом. Подразнення гладеньком’язових клітин і відведення електричних потенціалів здійснювали за допомогою хлор-срібних електродів, які з’єднувалися з розчинами через агарові містки, заповненні 2,5 мМоль/л КСl. Один з подразнюючих електродів розміщували в тест-ділянці, а другий електрод з’єднували з розчином Кребса, що заповнює поліетиленову трубку. З метою зменшення шунтуючої дії зазору між м’язовою смужкою і поліетиленовою трубкою, устя трубки змазували вакуумною змазкою. Синаптичні потенціали в гладеньких м’язах морської свинки викликали подразненням інтрамуральних нервових утворень, які знаходяться в товщі м’язових смужок прямокутними імпульсами електричного струму вхідного або вихідного напрямків тривалістю 0,5 – 1 мс. Джерелом струму служив стимулятор ЕСУ-1. Для відведення електричних потенціалів від гладеньком’язових клітин один із електродів поміщали в ділянку камери, яка була заповнена ізотонічним розчином КСl, а інший - у тест-ділянку. Електричну активність, що відводилась, подавали на вхід катодного повторювача, який з’єднувався із автоматичним потенціометром КСП-4. Реєстрацію скоротливої активності м’язових смужок проводили в ізометричному режимі за допомогою ємнісного датчика сили. Електричні сигнали від якого передавалися на другий канал КСП-4. Запис електричних та скоротливих реакцій проводили на діаграмній стрічці КСП-4. У тестуючій ділянці камери м’язова смужка обмивалася проточним розчином Кребса (рН якого знаходився в межах 7,2 - 7,3), температура підтримувалася на рівні 36,5 0,5 С.

Для дослідження взаємодії збуджувальних та гальмівних впливів при одночасній активації холінорецепторів, з одного боку, і гальмівних пуринорецепторів – з іншого, використовували м’язові смужки подовжніх м’язів сліпої кишки морської свинки в умовах тензометричної реєстрації скорочення. Скорочення м’язових смужок викликали аплікацією 10 мкМоль/л карбахоліну протягом 10 хв, у ході тонічного компонента цього скорочення (приблизно на 5-й хвилині) в оточуючий розчин Кребса, додавали 1 мМоль/л АТФ, дія якої продовжувалася 2 хв. Потім препарати протягом 3 хв відмивали розчином Кребса без АТФ, але як і раніше він містив карбахолін. Ефекти перших двох аплікацій до уваги не брали. Інтервал між послідовними аплікаціями карбахоліну складав не менше 30 - 40 хв.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Участь фосфоліпази С у генерації неадренергічного синаптичного

гальмування гладеньких м’язів кишечнику

Відомо, що мембранні та внутрішньоклітинні процеси відіграють важливу роль у регуляції скоротливої активності вісцеральних гладеньких м’язів. ATP вважається нейромедіатором, гальмуюча дія якої на гладенькі м’язи кишечника опосередкована через метаботропні пуринорецептори. Ці рецептори спряжені через Gq/11-білок з фосфоліпазою С-. Для дослідження ролі внутрішньоклітинних посередників і функції фосфоліпази C у механізмах генерації гальмівних синаптичних потенціалів, ми використовували U73122 - як більш специфічний інгібітор цього ферменту. Показано, що U73122 в концентрації 10 мкMоль/л зменшував амплітуду гальмівних синаптичних потенціалів, викликаних поодиноким електричним подразненням, і АТФ-індуковану гіперполяризацію мембран гладенько-м’язових клітин (ГМК), викликану в усіх досліджуваних гладеньком’язових смужках незалежно від відділу кишечнику (рис.1). U 73122 не мав значного впливу на мембранний потенціал гладеньком’язових клітин. Більш ефективно блокатор фосфоліпази С пригнічував гальмівні синаптичні потенціали (ГСП) подовжніх та кільцевих гладеньких м’язів сліпої кишки (табл. 1).

Рис. 1. | Вплив блокатора фосфоліпази С U73122 (10 мкМоль/л) на генерацію гальмівних синаптичних потенціалів і екзогенну дію АТФ (1 мМмоль/л) у кільцевих гладеньких м'язах товстої кишки

А - безперервний запис синаптичних потенціалів (а) і скорочення (б); Б – ГПС у контролі (1) та зменшення його амплітуди на 30 хв дії U73122 (2); В - екзогенна дія АТФ у контролі (1) та на 30 хв дії U73122 (2) |

Таблиця 1

Вплив інгібітору фосфоліпази С U73122 на амплітуду гальмівних синаптичних потенціалів, викликаних поодиноким електричним подразненням і АТФ-індуковану гіперполяризації мембрани ГМК м'язових препаратів кишечнику морської свинки

Умови експерименту | Амплітуда ГСП, мВ (М±m, n=9) | Амплітуда АТФ-викликаної

гіперполяризації, мВ

(M±m, n=5) | Подовжні гладенькі м’язи сліпої кишки | контроль | 14,9 ± 2,5 мВ | 7,2 ± 3,1 мВ | 30 хв дії U 73122

(10 мкМоль/л) | 6,1 ± 2,8 мВ | 3,0 ± 1,9 мВ | пригнічення , % | 60,4 ± 8,7 | 61,3 ± 7,9 | Кільцеві гладенькі м’язи сліпої кишки | контроль | 12,8 ±3,2 мВ | 9,5 ± 3,2 мВ | 30 хв дії U 73122

(10 мкМоль/л) | 6,0 ± 2,2 мВ | 3,7 ± 2,1 мВ | пригнічення, % | 53,2 ± 4,9 | 63,4 ± 7,6 | Кільцеві гладенькі м’язи товстого кишечнику | контроль | 13,1 ± 2,6 мВ | 4,5 ± 1,6 мВ | 30 хв дії U 73122

(10 мкМоль/л) | 8,1 ± 2,7 мВ | 1,9 ± 0,7 мВ | пригнічення , % | 38,5 ± 5,1 | 42,1 ± 0,4 | U 73122 не впливав на амплітуду збуджуючих синаптичних потенціалів (ЗСП), викликаних на фоні дії апаміну. Останнє дозволило нам зробити висновок, що функціонування фосфоліпази С необхідне, головним чином, для генерації пуринергічного синаптичного гальмування, а не збудження.

Враховуючи те, що майже в усіх ділянках шлунково-кишкового тракту в складі пуринергічного гальмування завжди є NO-залежний компонент [Dalziel et al., 1991; Bennett, 1997], то було важливо з’ясувати вплив на нього блокатора фосфоліпази С. У присутності апаміну м’язові смужки товстої кишки морської свинки генерують ГСП повільної кінетики NO-ергічної природи [Владимирова и Шуба, 1978; Владимирова и др, 1993]. Наступне додавання до розчину Кребса з апаміном U73122 істотно не впливало на амплітуду і кінетику NO-ергічного гальмівного синаптичного потенціалу. Більше того, спонтанні коливання мембранного потенціалу ГМК, що виникали після ГСП, також не зазнавали суттєвих змін. Усе це вказує на присутність незалежного від фосфоліпази C NO-активованого гальмування в інтестинальних ГМК. Необхідно зазначити, що пригнічуюча дія блокатора фосфоліпази С не залежить від наявності чи відсутності атропіну в розчині Кребса. Ці дані свідчать про те, що активація мускаринових рецепторів ендогенним нейропередавачем при інтрамуральному подразненні не впливає на залежні від фосфоліпази С шляхи пуринергічного гальмування.

Участь тирозинкінази в процесах генерації нехолінергічних

неадренергічних гальмівних синаптичних потенціалів

Генерації ГСП за участі незалежного від фосфоліпази C шляху може мати інший механізм трансдукції, наприклад залучення тирозинкінази. Активація фосфоліпази C-iзоформи пов’язана зі стимуляцією G-білка зв’язаного з рецептором, тоді як, активація фосфоліпази C-ізоформи активується прямим фосфорилювання тирозину каталітичного домену. З активацією тирозинкінази пов'язано підвищення внутрішньоклітинної концентрації іонів Ca2+ або внаслідок прямого фосфорилювання тирозину ІР3-рецепторів саркоплазматичного ретикулума, або активації специфічної фосфоліпази C-ізоформи, яка, у свою чергу, буде ініціювати утворення ІР3 і діацилгліцеролу [Mikoshiba, 1997]. Неможна виключити і прямого фосфорилювання тирозинкіназою іонних каналів плазматичної мембрани ГМК, яке спричиняє модифікацію роботи каналів [Smirnov and Aaronson, 1995; Li et al., 2006].

У наших експериментах використовувався інгібітор тирозинкінази геністеїн [Akiyuma, et al., 1987] у концентрації 10 мкМоль/л. Він зменшував амплітуду ГСП, викликаних поодиноким інтрамуральним подразненням, у м’язових препаратах сліпої та товстої кишки. ATФ-викликана гіперполяризація в гладеньких м’язах також значно пригнічувалась геністеїном. Він, як і U 73122, більш ефективно пригнічував ГСП та АТФ-викликану гіперполяризацію мембрани ГМК у кільцевих препаратах гладеньких м’язів сліпої кишки ніж у кільцевих препаратах дистального відділу товстого кишечнику.

Ці дані показують, що в генерацію неадренергічних синаптичних потенціалів гладеньких м’язів кишечнику може залучатися тирозинкіназа. На відміну від блокатора фосфоліпази С, геністеїн поряд з пригніченням амплітуди, також значно зменшує і тривалість ГСП (табл. 2). Останнє вказує на здатність тирозинкінази впливати не тільки на генерацію "швидкого", але й "повільного" компонента неадренергічного гальмівного синаптичного потенціалу.

Таблиця 2

Вплив блокатора тирозинкінази геністеїну на гальмівні синаптичні потенціали, викликані поодиноким електричним подразненням і АТФ-викликану гіперполяризацію мембрани гладеньком’язових клітин кишечника морської свинки

Умови експерименту | Параметри ГСП | Амплітуда АТФ-викликаної

гіперполяризації, мВ

(M±m, n=5) | амплітуда, мВ

(M±m, n=9) | тривалість, с

(M±m, n=9) | Кільцеві препарати гладеньких м’язів сліпої кишки | контроль | 11,7 ±2,6 | 2,0 0,5 | 9,2 ± 2,3 | 30 хв дії геністеїну

(10 мкМоль/л) | 6,7 ± 1,7 | 1,2 0,3 | 3,9 ± 1,8 | пригнічення, % | 48,1 ± 7,1 | 40,0 4,5 | 60,1 ± 9,7 | Кільцеві препарати гладеньких м’язів товстого кишечника | контроль | 13,3 ± 3,0 | 4,18 ± 0,1 | 6,2 ± 1,9 | 30 хв дії геністеїну

(10 мкМоль/л) | 8,7 ± 2,2 | 2,0 0,1 | 1,9 ± 0,6 | пригнічення, % | 35,1 ± 2,1 | 52,2 3,1 | 67,3 ± 2,5 |

Здатність геністеїну пригнічувати ГСП навряд чи можна пов’язати із блокуванням синтезу або вивільненням нейромедіаторів гальмування з нервових терміналей, а також з утворенням ІР3 чи фосфорилюванням його рецепторів у саркоплазматичному ретикулумі ГМК. Також, не можна виключити того, що в блокуванні геністеїном АТФ-викликаної гіперполяризації і неадренергічних гальмівних синаптичних потенціалів залучені різні механізми. Скоріше за все дія геністеїну на генерацію ГСП обумовлена безпосереднім впливом на калієві канали плазматичної мембрани ГМК [Smirnov et al., 1995; Shi-Ying Li et al., 2006].

Дослідження дії блокаторів інозитолтрифосфатних та ріанодинових рецепторів на пуринергічне гальмування в гладеньких м’язах кишечника

Оскільки активація різних ізоформ фосфоліпази C супроводжується збільшенням внутрішньоклітинного рівня ІР3, то було важливим дослідити дію блокатора ІР3-рецепторів на неадренергічні гальмівні синаптичні потенціали та ATФ-викликану гіперполяризацію плазматичної мембрани ГМК. Для цього використовували мембраннопрониклу форму блокатора ІР3-рецепторів - 2-аміноетоксідифенілборат (2-APB) [Maruyma et al., 1997]. Результати експериментів показали, що 2-APB у межах концентрацій 50 -100 мкМоль/л, майже повністю пригнічує ГСП і ATФ-викликану гіперполяризацію в атропінізованих гладеньком’язових препаратах сліпої та товстої кишки (рис.2). Імовірно, що локальне вивільнення іонів Ca2+ із ІР3-чутливого внутрішньоклітинного депо може бути сполучною ланкою між P2Y- пуринорецепторами й активацією кальційзалежних калієвих каналів малої провідності. Треба зауважити, що в присутності 2-APB не генерується збудження на інтрамуральне подразнення або на екзогенну дію ATФ, подібне до того, що спостерігається в присутності апаміну.

Рис. 2. | Дія блокатора ІР3-рецепторів 2-АРВ (100 мкМоль/л) на гальмівний синаптичний потенціал (А) і гіперполяризацію мембрани ГМК викликану 1 мМоль/л АТФ (Б) в кільцевих м'язових препаратах сліпої кишки морської свинки.

1 - контроль; 2 - 20-та хв аплікації 2-АРВ; а і b електричні та механічні записи, відповідно.

Можна припустити, що блокування вивільнення іонів Ca2+ з ІР3-чутливого внутрішньоклітинного кальцієвого депо, яке обумовлене дією 2-APB, впливатиме на мобілізацію цього катіону з ріанодин(кофеїн)-чутливої частини саркоплазматичного ретикулума ГМК. Відповідні експерименти показали, що аплікація ріанодину (10 мкMоль/л) не призводить до помітних змін пуринергічних гальмівних синаптичних потенціалів у м’язових препаратах сліпої кишки. У кільцевих гладеньких м’язах товстої кишки ріанодин зменшував тільки повільний NO-ергічний компонент ГСП.

Дослідження впливу збільшення рівня внутрішньоклітинної концентрації

іонів кальцію в гладеньком’язових клітинах на генерацію гальмівних синаптичних потенціалів

Для дослідження ролі внутрішньоклітинної концентрації іонів Ca2+ в генерації ГСП, яка не пов’язана з мобілізацією із внутрішньоклітинного кальцієвого депо, ми використали активатор кальцієвих каналів - Вау K 8644. Дія Вау K 8644 у концентрації 0,1 мкMоль/л призводила до деполяризації мембрани ГМК, активації спонтанної електричної та скоротливої активності й до зменшення амплітуди ГСП та ATФ-індукованої (1мМоль/л) гіперполяризації мембрани ГМК. Усі ці зміни в ГМК було відновлено після блокування потенціалзалежних кальцієвих каналів L-типу ніфедипіном у концентрації 10 мкMоль/л. Додавання ніфедипіну до розчину Кребса з Вау K 8644 супроводжувалося реполяризацією мембрани ГМК, відновленням амплітуди ГСП і ATФ-індукованої гіперполяризації мембрани ГМК. У наших експериментах було встановлено, що блокуюча дія Вау K 8644 на ATФ- і NO-ергічне гальмування не залежить від природи нейромедіаторів, які приймають участь у генерації ГСП.

Таким чином, отримані результати показали, що активація метаботропних Р2У- пуринорецепторів плазматичної мембрани ГМК АТФ, яка опосередкована через G-білки і систему внутрішньоклітинних посередників, викликає вивільнення іонів Са2+ із ІР3-чутливого внутрішньоклітинного кальцієвого депо. І тільки, власно, вивільнення іонів Са2+ із цього депо цілеспрямовано активує кальційзалежні калієві канали малої провідності, які приймають участь у генерації швидкого (пуринергічного) компонента ГСП. Збільшення концентрації внутрішньоклітинного Са2+ вище фізіологічного рівня, ймовірно, може викликати інактивацію кальційчутливих білків, які беруть участь у синаптичній передачі.

Дослідження можливої модуляції аденілатциклазою

пуринергічного гальмування гладеньких м’язів

Відомо, що в багатьох процесах регуляції функціонування нервових і м'язових клітин беруть участь цАМФ-залежні внутрішньоклітинні механізми. Показано, наприклад, що клоновані Р2У11-рецептори за допомогою різних G-білків (Gq/11 і Gs) бінарно сполучені з фосфоліпазою С і аденілатциклазою [Boeynaems et al., 2000]. Приймаючи до уваги складну медіаторну природу неадренергічних ГСП, можна припустити, що не залежний від фосфоліпази C його компонент, обумовлений цАМФ-залежними внутрішньоклітинними механізмами. Крім того, АТФ, вивільнена із нервових закінчень, може частково розщеплюватися до аденозину, який, взаємодіючи з аденозиновими рецепторами, активуватиме аденілатциклазу. Тому метою даної частини роботи було дослідити значення аденілатциклази і внеску цАМФ-залежних внутрішньоклітинних процесів у синаптичне збудження й гальмування гладеньких м'язів шлунково-кишкового тракту.

Експерименти показали, що активація аденілатциклази форсколіном виявила складний і неоднозначний характер дії на синаптичну передачу збудження й гальмування гладеньких м'язів шлунково-кишкового тракту. Так, аплікація форсколіну (0,1 – 10,0 мкМоль/л) викликала гіперполяризацію мембрани ГМК і пригнічення спонтанної активності. Цей ефект форсколіну не залежав від наявності або відсутності неспецифічного блокатора мускаринових рецепторів - атропіну в позаклітинному середовищі. В атропінізованих м'язових смужках під впливом форсколіну ГСП не зазнавали істотних змін, незважаючи на зниження рівня мембранного потенціалу ГМК. В експериментах на неатропінізованих препаратах ефективність гальмуючої синаптичної передачі при дії форсколіну була більш вираженою. За цих умов, у міру дії форсколіну, ГСП зазнавали істотних змін: амплітуда і час наростання ГСП поступово зменшувалися й у переважній більшості випадків з'являлися ЗСП. ЗСП, що виникали на фоні дії форскаліну, були складної форми і складалися з початкового ЗСП і подальшим виникненням слідової деполяризації або слідової гіперполяризації.

Необхідно зазначити, що виникнення ЗСП при дії форсколіну не можна пояснити тільки зсувом рівня мембранного потенціалу вбік гіперполяризації. Якщо на фоні гіперполяризації в зовнішній розчин Кребса додати атропін, то ЗСП пригнічувалися. Однак амплітуда ГСП не тільки відновлювалася та перевищувала вихідний рівень без зміни мембранного потенціалу гладеньком’язових клітин. Збільшення амплітуди ГСП, у порівнянні з вихідною величиною, при дії атропіну свідчить про маскування процесів збудження з одночасним розвитком гальмуванням гладеньких м'язів (рис. 3).

Рис. 3. | Пригнічення неадренергічних ГСП неатропінізованої м’язової смужки дистального відділу товстого кишечнику під впливом форсколіну (0,1 мкМоль/л).

а – ГСП у контролі; в, г – ЗСП, які виникають на 15 хв дії форскаліну у гладеньком’язових клітинах на поодиноке інтрамуральне подразнення; безперервний запис синаптичних потенціалів на фоні дії форскаліну (б) та після додавання до розчину Кребса з форсколіном 1 мкМоль/л атропіну (д); е – ГСП, що виникає на 5 хв дії атропіну (і на 20 хв дії форсколіну). |

Якщо при інтрамуральному подразненні гладеньком’язові клітини генерували складну відповідь типу ЗСП – ГСП, то під впливом форсколіну ЗСП збільшувалися, а ГСП зменшувалися аж до повного їхнього зникнення. Подальші експерименти показали, що описаний вище пригнічуючий ефект форсколіну на синаптичну передачу гальмування не обумовлений підвищенням внутрішньоклітинної концентрації цАМФ. Нами було досліджено дію мембраннопрониклої форми цАМФ – дибутирил-цАМФ (100 мкМоль/л) – на неадренергічні ГСП неатропінізованих гладеньких м’язів. Експерименти показали, що він суттєво не змінював рівень мембранного потенціалу ГМК й амплітудно-кінетичні параметри ГСП, і тим самим не імітував вищеописану дію форсколіну.

Особливості клітинних механізмів передачі сигналу при одночасній активації холіно- і пуринорецепторів у гладеньких м’язах

Результати приведених вище експериментів показали, що в ГМК шлунково-кишкового тракту збудливі й гальмівні впливи взаємодіють між собою складним і неоднозначним чином. Однак, виявити взаємодію внутрішньоклітинних сигнальних шляхів у випадку спільної активації холіно- і пуринорецепторів неможливо у зв'язку з тим, що дослідження синаптичних потенціалів в умовах тривалого інтрамурального подразнення ускладнюється пресинаптичними ефектами. Тому ми досліджували дію збудливих і гальмівних нейропередавачів при їхній екзогенній аплікації на м'язові смужки. Тривала аплікація, агоніста мускаринових холінорецепторів, карбахоліну 10 мкМоль/л супроводжувалася стійкою деполяризацією мембрани ГМК і скороченням м'язових смужок. Необхідно зазначити, що, незважаючи на стійкий характер деполяризації мембрани ГМК, початкове фазне скорочення швидко зменшувалося, а тонічний компонент скорочення (що становить приблизно третину початкової скорочувальної реакції) підтримувався на постійному рівні протягом усього часу (10 хв) аплікації карбахоліну. Тривала преінкубація препаратів з блокатором фосфоліпази С U 73122 (10 мкМоль/л) суттєво не впливала ні на рівень деполяризації мембрани ГМК, ні на карбахолін-індуковане скорочення. Отриманий результат свідчать про те, що участь фосфоліпази С у збудливій дії карбахоліну (деполяризації мембрани ГМК і скороченні м'язової смужки) незначна.

Як вже було зазначено раніше, в генерації пуринергічних ГСП і АТФ-викликаній гіперполяризації беруть участь як залежні (приблизно 50%), так і незалежні від фосфоліпази С механізми. Тому важливо було дослідити участь фосфоліпази С у гальмівній дії АТФ в умовах тривалої активації холінорецепторів. Карбахолін (10 мкМоль/л) викликав фазно-тонічне скорочення м'язових смужок (рис. 4, А), а наступне додавання 1 мМоль/л АТФ у розчин Кребса з карбахоліном супроводжувалося розслабленням м'язової смужки до вихідного рівня.

Варто зазначити, що після видалення АТФ із розчину Кребса з карбахоліном завжди спостерігалося транзієнтне скорочення м'язової смужки, що перевищувало по своїй амплітуді тонічний компонент карбахолін-індукованого скорочення постгальмівне скорочення. Преінкубація м'язових смужок у розчині Кребса з блокатором фосфоліпази С U 73122 не призводило до статистично достовірних змін амплітуди й форми карбахолін-індукованого скорочення, а також не впливало на розслаблення м'язових смужок, викликане екзогенною дією АТФ. Таким чином, створюється враження, що в умовах преактивації холінорецепторів розслаблююча дія АТФ опосередковується незалежним від фосфоліпази С шляхом. Оскільки активація фосфоліпази С супроводжується підвищенням внутрішньоклітинного рівня ІР3 у міоцитах, тому важливо було дослідити дію мембранопрониклого антагоніста ІР3-рецепторів 2-АРВ (100 мкМоль/л) при одночасній активації холіно- і пуринорецепторів. У присутності в розчині Кребса блокаторів фосфоліпази С і ІР3-рецепторів (U 7312 + 2-АРВ) карбахолін-індуковане скорочення змінювалося несуттєво, у той час як за цих умов АТФ-індуковане розслаблення в середньому зменшувалося на 50 %, у порівнянні з контролем, а постгальмівне збудження повністю пригнічувалося. Отже, у вище розглянутому випадку внутрішньоклітинна сигналізація опосередковується шляхами, незалежними від фосфоліпази С.

Рис. 4. | Відсутність пригнічення за дії блокатора інозитолтрифосфатних рецепторів 2-АРВ (100 мкМоль/л) на викликане АТФ (1 мМоль/л) розслаблення гладеньких м’язів на фоні холінергічного скорочення, зумовленого активацією М3-холінорецепторів.

А – індуковане карбахоліном (КХ, 10 мкМоль/л) скорочення та наступне розслаблення м’язових смужок, викликане дією АТФ, у контролі; Б – теж саме, але після попередньої 30-и хвилинної інактивації М2-холінорецепторів трипітраміном (1мкМоль/л); В – відсутність змін АТФ-викликаного розслаблення м’язової смужки taenia coli після 30-и хвилинної преінкубації препарату в розчині Кребса, до складу якого входили трипітрамін і блокатор ІР3-рецепторів 2-АРВ; штрихова лінія – вихідний рівень м'язового тонусу. |

У зв'язку з тим, що шляхи передачі внутрішньоклітинної сигналізації в умовах активації М2- і М3-холінорецепторів різні, важливо було дослідити взаємодію збудливих і гальмівних впливів на ГМК в умовах активації одного з підтипів мускаринових рецепторів. Виходячи з того, що М3-холінорецептори й Р2У-пуринорецептори сполучені з однаковими G-білками й у випадку дії агоністів, активується фосфоліпаза С при одночасній активації цих рецепторів, внутрішньоклітинні шляхи повинні в тому або іншому ступені взаємодіяти. Експерименти показали, що виключення активації М2-холінорецепторів за допомогою 1мкМоль/л трипітраміну суттєво не позначилося ні на холінергічному скороченні, ні на АТФ-індукованому розслабленні (рис. 4, Б). Таким чином, розслаблююча дія АТФ на фоні М3-викликаного холінергічного скорочення не змінюється. Окрім того, виявилося, що на фоні цього холінергічного скорочення блокування ІР3-рецепторів саркоплазматичного ретикулума ГМК за допомогою 100 мкМоль/л 2-АРВ не змінювало амплітуди АТФ-викликаного розслаблення (рис. 4, В). Усе це говорить про те, що в умовах одночасної активації М3-холінорецепторів і пуринорецепторів процес розслаблення м'язових смужок здійснюється не через активацію ІР3-рецепторів саркоплазматичного ретикулума ГМК, а за допомогою інших внутрішньоклітинних шляхів сигналізації.

За умов інактивації М3-рецепторів селективним блокатором pF-HHSiD не змінюється ні збудлива дія карбахоліну, ні гальмівна дія АТФ на ГМК. Преінкубація препаратів у розчині Кребса з 2-АРВ не призводила до достовірних змін М2-обумовленого холінергічного скорочення гладеньких м'язів, а також викликаного на його фоні АТФ-викликаного розслаблення.

Рис. 5. | Відсутність пригнічення за дії блокатора інозитолтрифосфатних рецепторів 2-АРВ (100 мкМоль/л) на викликане АТФ (1 мМоль/л) розслаблення гладеньких м’язів на фоні холінергічного скорочення, зумовленого активацією М2-холінорецепторів.

А – індуковане карбахоліном (КХ, 10 мкМоль/л) скорочення та наступне розслаблення м’язових смужок, викликане дією АТФ, у контролі;

Б – теж саме, але після попередньої 30-и хвилинної інактивації М3-холінорецепторів високоселективним блокатором pF-HHSiD (1мкМоль/л);

В, Г – відсутність змін АТФ-викликаного розслаблення м’язової смужки taenia coli після 30-и та 60-ти хвилинної преінкубації препарату в розчині Кребса, до складу якого входили pF-HHSiD і блокатор ІР3-рецепторів 2-АРВ; штрихова лінія – вихідний рівень м'язового тонусу. |

Таким чином, можна вважати, що в описаних вище умовах розслаблення гладеньких м`язів обумовлене вивільненням іонів кальцію із саркоплазматичного ретикулума ГМК, яке опосередковане іншими внутрішньоклітинними вторинними посередниками за рахунок переключення відповідних шляхів або виключення деяких клітинних механізмів.

ВИСНОВКИ

Дослідження неадренергічної синаптичної передачі гладеньких м’язів шлунково-кишкового тракту методом модифікованого сахарозного містка і тензометричної реєстрації скорочення, показало, що в генерації гальмівних синаптичних потенціалів і АТФ-викликаної гіперполяризації приймають участь як залежні, так і незалежні від фосфоліпази С внутрішньоклітинні шляхи.

В умовах преактивації мускаринових холінорецепторів АТФ-викликане розслаблення здійснюється незалежним від фосфоліпази С шляхом, а інозитолтрифосфатний шлях вивільнення кальцію із внутрішньоклітинних запасників залишається відповідальним за пуринергічне гальмування.

Активація швидкого компонента гальмівного синаптичного потенціалу за участі метаботропних Р2У-пуринорецепторів реалізується через інозитолтрифосфатчутливе кальцієве депо саркоплазматичного ретикулума гладеньком’язових клітин.

Вивільнення іонів кальцію із ріанодинчутливого кальцієвого депо гладеньком’язових клітин відповідає за генерацію повільного NO-ергічного компонента гальмівного синаптичного потенціалу.

Вперше виявлена здатність тирозинкінази модулювати повільний NO-ергічний компонент гальмівного синаптичного потенціалу.

Виявлено, що неадренергічне синаптичне гальмування гладеньких м’язів не обумовлено підвищенням внутрішньоклітинного рівня цАМФ у клітинах.

Показана модуляція активатором аденілатциклази форсколіном пуринергічних гальмівних синаптичних потенціалів виключно в неатропінізованих гладеньких м’язах.

Інозитолтрифосфатзалежний шлях опосередковує пуринергічне гальмування гладеньких м’язів за умов сумісної активації М2- і М3-холінорецепторів.

Вперше виявлено, що за умов селективної преактивації М2- або М3-холінорецепторів механізми внутрішньоклітинної сигналізації, опосередковуючи пуринергічне гальмування, змінюються: гальмівна дія АТФ здійснюється через незалежні від фосфоліпази С та інозитолтрифосфатний шляхи.

Список опублікованих праць за темою дисертації

Shuba M.F., Vladimirova I.A., Philyppov I.B. Mechanisms of the inhibitory action of neurotransmitters on smooth muscles // Neurophysiology. – 2003. – Vol. 35, № 3/4. – P. 252 – 261. (Здобувач приймав участь в експериментальних дослідженнях пов’язаних із з’ясуванням метаболічних механізмів генерації пуринергічного гальмування та аналізі отриманих результатів).

Филиппов И.Б., Владимирова И.А., Ганиткевич В.Я., Шуба М.Ф. Модуляция аденилатциклазой взаимодействия возбуждающих и тормозящих синаптических влияний на гладкие мышцы // Нейрофизиология. – 2004. – Т. 36, № 5/6. – С. 438 – 445. (Здобувач приймав участь у проведенні експериментальних досліджень, аналізі та узагальненні отриманих результатів)

Владимирова И.А., Филиппов И.Б., Кулиева Е.М., Дыскина Ю.Б., Ганиткевич В.Я. Отличия клеточных механизмов АТФ- и норадреналин-индуцированного торможения висцеральных гладких мышц в условиях селективной и совместной активации М2- или М3-холинорецепторов // Нейрофизиология. – 2007. – Т. 39, № 1. – С. 22 – 31. (Здобувач приймав участь в експериментальних дослідженнях пов’язаних із з’ясуванням клітинних механізмів АТФ-індукованого гальмування вісцеральних гладеньких м’язів та інтерпретації отриманих результатів)

Філіппов И.Б., Цвіловський В.В., Цицюра Я.Д., Шуба М.Ф. Оксид азоту як модулятор іонних каналів і скорочення гладеньких м’язів // Архив клинической и экспериментальной медицины. – 2001. – Т. 10, №2. – С. 229.

Владимирова І.А., Філіппов І.Б., Єрмакова Т.О. Модуляція кальмодуліном гальмівної синаптичної передачі у вісцеральних гладеньких м’язах // Матер. міжнародної конференції присвяченої пам’яті професора Шостаковської І.В. – Львів (Україна). – 2002. – С. 15.

Shuba M.F., Philyppov I.B., Povstyan O.V., Vladimirova I.A. Metabolic regulation of the purinergic inhibition in visceral smooth muscles // Second Bogomoletz-Nencki Sympozium “ Intracellular signaling in excitable cells”.– Kiev (Ukraine). – 2002. – P. 36.

Владімірова І.А., Філіппов І.Б., Єрмакова Т.О. Модулююча роль аденілатциклази на синаптичну передачу в гладеньких м’язах // Установчий з’їзд Українського товариства клітинної біології. – Львів (Україна). – 2004. – С. 166.

Shuba M.F., Philyppov I.B., Vladimirova I.A. Intracellular mechanisms involved in the purinergic synaptic inhibition in intestinal smooth muscle // Fundamental & Clinical Pharmacology. – 2004. – Vol. 18, Suppl. 1. – Poster P 07.12.

Ермакова Т.А., Филиппов И.Б., Владимирова И.А. Механизмы синаптического торможения гладких мышц кишечника // Фізіологічний журнал. – 2006. – Т.52, № 2. – С. 135 - 136.

АНОТАЦІЯ

Філіппов І.Б. Метаботропна регуляція синаптичного пуринергічного гальмування у вісцеральних гладеньких м’язах. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2007 р.

У дисертації викладені дослідження окремих ланок сигнальної системи пуринергічного гальмування вісцеральних гладеньких м’язів. За допомогою сахарозного містка та тензометричного метода було досліджено роль внутріклітинних вторинних посередників у механізмах генерації неадренергічних гальмівних синаптичних потенціалів (ГСП) та ATФ-опосередкованого гальмування. Було показано часткове пригнічення ГСП блокатором фосфоліпази С U 73122, що дало змогу виявити залежний та незалежний від фосфоліпази С шляхи, які залучені в генерацію швидкого компонента ГСП та АТФ-індукованої гіперполяризації. Локальне збільшення внутрішньоклітинної концентрації Са2+ обумовлене активацією Р2У-рецепторів, спряжених з Gq-білком, який вивільняється із інозитолтрифосфатчутливого кальцієвого депо ГМК і призводить до активації апамінчутливих кальційзалежних калієвих каналів малої провідності. Генерація NO-ергічного компонента синаптичного гальмування обумовлена вивільненням Са2+ із ріанодинчутливого внутрішньоклітинного кальцієвого депо ГМК та наступною активацією кальційзалежних калієвих каналів великої провідності.

В умовах попередньої преактивації мускаринових холінорецепторів розслаблення, викликане АТФ, продовжує здійснюватися через активацію інозитолтрифосфатчутливих рецепторів, незважаючи на незалежний від фосфоліпази С шлях гальмування. За умов селективної преактивації М2- або М3- холінорецепторів механізми внутрішньоклітинної сигналізації АТФ-викликанного гальмування здійснюються через інозитолтрифосфатнезалежний шлях.

Ключові слова: інтестинальні гладенькі м’язи, гальмівний синаптичний потенціал, фосфоліпаза С, аденілатциклаза, мускаринові холінорецептори (М2 і М3), пуринорецептори, внутрішньоклітинні сигнальні шляхи, гальмування, розслаблення.

АНОТАЦИЯ

Филиппов И.Б. Метаботропная регуляция синаптического пуринергического торможения висцеральных гладких мышц. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидат биологических наук по специальности 03.00.02 – биофизика. Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2007 г.

В диссертации изложены исследования отдельных этапов сигнальной системы пуринергического торможения висцеральных гладких мышц. С помощью сахарозного мостика и тензометрического метода была исследована роль внутриклеточных вторичных посредников в механизмах генерации неадренергических тормозных синаптических потенциалов (ТСП) и ATФ-опосредованного торможения. Было показано частичное угнетение ТСП блокатором фосфолипази С U 73122, что дало возможность выявить зависимый и независимый от фосфолипазы С пути, вовлекаемые в генерацию быстрого компонента ГСП и АТФ-индуцированой гиперполяризации. Локальное увеличение внутриклеточной концентрации Са2+, обусловленное активацией метаботропных Р2У-рецепторов, сопряженных с Gq-белком, высвобождаемого из инозитолтрифосфатчувствительного кальциевого депо ГМК, приводит к активации апаминчувствительных кальцийзависимых калиевых каналов малой проводимости. Генерация NO-эргического компонента синаптического торможение обусловлена высвобождениям Са2+ из рианодинчувствительного внутриклеточного кальциевого депо ГМК и последующей активацией кальцийзависимых калиевых каналов большой проводимости. В условиях преактивации мускариновых холинорецепторов расслабление, вызванное АТФ, продолжает осуществляться через активацию инозитолтрифосфатчувствительных рецепторов, несмотря на независимый от фосфолипазы С путь торможения. В условиях селективной преактивации М2- или М3- холинорецепторов механизм внутриклеточной сигнализации АТФ-индуцированного торможения осуществляются через инозитолтрифосфатнезависимый путь.

Ключевые слова: интестинальные гладкие мышцы, тормозные синаптические потенциалы, фосфолипаза С, аденилатциклаза, мускариновые холинорецепторы (М2 и М3), пуринорецепторы, внутриклеточные сигнальные пути, торможение, расслабление.

SUMMERY

Philyppov I.B. “Metabotropic regulation of the purinergic synaptic inhibition in visceral smooth muscles” - Manuscript.

Dissertation on obtaining of scientific degree of candidate of biological sciences under the speciality 03.00.02 - biophysics. – Taras Shevchenko Kyiv National University, Kyiv, 2007.

The present study is devoted to the investigation of the separate stages of the signalling system, which underlines purinergic inhibition of visceral smooth muscles. Using sucrose-gap and tensometric technique it was investigated the role of intracellular messenger in the mechanisms of nonadrenergic inhibitory junction potentials (IJP) generation and ATP-induced inhibition. It was shown partial suppression of IJP by the phospholipase C blocker U 73122 that provide