КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

КУРИЛЕНКО ІРИНА МИКОЛАЇВНА

УДК 577.1:633.15+58.02

ПРОЦЕСИ ПЕРОКСИДНОГО ОКИСЛЕННЯ В ПРОРОСТКАХ КУКУРУДЗИ ЗА УМОВ СОЛЬОВОГО СТРЕСУ

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі клітинної біології та анатомії рослин Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного Національної Академії Наук України.

Науковий керівник: | доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

Палладіна Тетяна Олександрівна,

Інституту ботаніки

ім. М.Г.Холодного НАН України,

провідний науковий співробітник

відділу клітинної біології та анатомії рослин.

Офіційні опоненти: | доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

Кучмеровська Тамара Муратівна,

Інститут біохімії

ім. О.В. Палладіна НАН України,

провідний науковий співробітник

відділу біохімії коферментів;

кандидат біологічних наук

Капустян Андрій Васильович,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

доцент кафедри фізіології та екології рослин.

Захист відбудеться “22” жовтня 2007 року о 16 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, пр-т академіка Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитися у науковій бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул.Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “18” вересня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Андрійчук Т.Р.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Процеси пероксидного окислення відіграють важливу роль у метаболізмі всіх живих організмів, у тому числі рослин. Розвиток цих процесів ініціюється активними формами кисню (АФК), серед яких, зокрема, пероксид водню за оптимальних умов виконує роль сигнальної молекули [Bowler C., Fluhr R., 2000, Pastori G.M. Foyer C.H., 2002, Foyer C.H., Noctor G., 2003]. Процеси пероксидного окислення знаходяться у динамічній рівновазі з функціонуванням добре розвиненої в рослинних клітинах системи антиоксидантного захисту, яка представлена антиоксидантними ферментами та неферментними сполуками [Monk L.S. et al., 1989, Larson R.A., 1988].

Посилення процесів пероксидного окислення внаслідок накопичення АФК є неспецифічною відповіддю клітин на вплив негативних факторів, в результаті чого в них виникає окисний стрес [Halliwell B., Gutteridge J.M.C., 1989]. Надлишок АФК у клітинах спричиняє руйнування ліпідів, білків та нуклеїнових кислот, призводячи до накопичення продуктів пероксидного окислення [Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972, Мерзляк М.Н., 1989]. Зростання вмісту АФК активує систему антиоксидантного захисту, що дозволяє живим організмам підтримувати окисно-антиоксидантний баланс та адаптуватися до змінених умов існування.

Одним з істотних стресових чинників для рослин є засолення ґрунту, яке перешкоджає сільському господарству в багатьох країнах світу, знижуючи його продуктивність, зокрема на південному сході України.

Сольовий стрес у рослинних клітинах виникає в результаті порушення осмотичної та іонної складових їх гомеостазу, супроводжуючись розвитком вторинного окисного стресу [Zhu J.-K., 2001]. Стресовий стан клітин посилюється через прогресуюче накопичення в них солей, особливо натрію, який є головним токсичним катіоном для метаболізму рослин [Munns R., Termaat A., 1986].

З'ясування перебігу процесів пероксидного окислення та функціонування системи антиоксидантного захисту в тканинах рослин за умов сольового стресу є фундаментальною біохімічною проблемою, актуальність якої зумовлена необхідністю встановлення механізмів адаптації рослинних організмів до впливу засолення, а також до дії інших негативних чинників.

Оскільки досягти значного посилення солестійкості сільськогосподарських культур методами класичної і клітинної селекції виявилося неможливим, вирішення цієї проблеми вбачають у створенні солестійких трансгенних форм та розробці ряду агрозаходів [Amzallag G.N. et al., 1993, Wang W. et al., 2003, Cuartero J. et al., 2006]. Перспективним також є застосування синтетичних біологічно-активних препаратів з властивостями регуляторів росту, зокрема таких як метіур та івін [Палладіна Т.О. та ін., 2001, Пономаренко С.П. и др., 1992]. Передбачається, що їх протекторна дія за умов засолення може здійснюватися через прямий або опосередкований вплив на перебіг процесів пероксидного окислення та функціонування системи антиоксидантного захисту, посилюючи адаптаційну спроможність рослинних організмів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася у відповідності з планами фундаментальних науково-дослідних робіт відділу клітинної біології та анатомії рослин Інституту ботаніки ім. М.Г.Холодного НАН України: “Дослідження механізмів дії засолення ґрунтів на рослинні організми та підвищення їх солестійкості” (№ д/р 0106U000687), “Дослідження механізмів дії засолення ґрунтів на рослинні організми та підвищення їх солестійкості” (№ д/р 0106U000688), “Посилення солестійкості сільськогосподарських рослин за допомогою синтетичних антидепресантів” (№ д/р 0107U002627).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було з’ясувати особливості перебігу пероксидного окислення і функціонування антиоксидантної системи в проростках кукурудзи (Zea mays L.) за різних умов сольового стресу, а також виявити вплив синтетичних препаратів метіур та івін на ці процеси.

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

1. Оцінити загальну окисну спроможність методом ініційованої хемілюмінесценції (ІХЛ) у коренях та листках проростків кукурудзи, які зростали за умов різного рівня засолення протягом 1 та 10 діб та/або були оброблені метіуром та івіном.

2. Визначити вміст ТБК-активних продуктів у тканинах проростків кукурудзи під впливом NaCl та при обробці синтетичними сполуками.

3. Дослідити активність супероксиддисмутази (СОД), каталази та неспецифічної пероксидази у коренях та листках проростків кукурудзи за умов сольового стресу та при обробці досліджуваними препаратами.

4. Визначити активність Н+-АТФази плазматичної мембрани (ПМ) у клітинах коренів проростків за умов засолення та при обробці метіуром і івіном, а також впливу на фермент процесів пероксидного окислення.

5. Дослідити ростові параметри проростків кукурудзи під впливом NaCl та синтетичних сполук.

Об’єкт дослідження: процеси пероксидного окислення за умов сольового стресу та під впливом препаратів метіур та івін.

Предмет дослідження: інтенсивність пероксидного окислення, активність антиоксидантних ферментів та Н+-АТФази ПМ у клітинах проростків кукурудзи за умов сольового стресу та під впливом метіуру та івіну.

Методи дослідження: хемілюмінесцентний (визначення загальної окисної спроможності), спектрофотометричний (визначення вмісту продуктів пероксидного окислення, вмісту загального білка та активності ферментів), електрофоретичний (розділення ізоформ СОД) та метод ультрацентрифугування (ізолювання фракції плазматичної мембрани).

Наукова новизна одержаних результатів. В даній роботі вперше проведено комплексне порівняльне дослідження перебігу процесів пероксидного окислення та активності антиоксидантних ферментів у коренях та листках проростків кукурудзи за умов різного рівня засолення протягом коротко- та довготривалої експозиції. Вперше досліджено вплив на ці процеси синтетичних препаратів метіур та івін. Показано, що обробка цими сполуками зернівок кукурудзи, проростки з яких експонувалися у присутності 0,1 М NaCl, приводить до зменшення інтенсивності процесів пероксидного окислення в коренях та листках; підвищення активності антиоксидантних ферментів СОД, каталази та неспецифічної пероксидази в коренях та листках; активації Н+-АТФази ПМ у клітинах коренів; зменшення гальмівного впливу умов засолення на ростові процеси у проростках.

У роботі вперше було продемонстровано in vitro інгібування на 20% активності Н+-АТФази ПМ у клітинах коренів проростків кукурудзи пероксидом водню в межах концентрацій 10-8-10-4 М та можливий регуляторний ефект окисних процесів in vivo на функціонування ферменту за умов сольового стресу.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати досліджень розширюють існуючі уявлення про механізм впливу синтетичних препаратів рістстимулюючої дії метіур та івін на рослинні організми. Одержані дані є підставою для розробки методів підвищення солестійкості рослин за допомогою використаних сполук з метою збільшення продуктивності сільськогосподарських культур на засолених ґрунтах, а також за умов посухи та техногенних забруднень.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно здійснено пошук і аналіз вітчизняної та зарубіжної літератури з даної проблеми, сформульовано завдання роботи, проведено усі експериментальні дослідження, здійснено обробку та узагальнення отриманих результатів. Спільно з науковим керівником розроблено напрямок досліджень, висунуто робочу гіпотезу, обґрунтовано методологію постановки експериментів.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи були представлені на IV Съезде общества физиологов растений России “Физиология растений – наука III тысячелетия” (Москва, 1999); VII Молодёжной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2000); 17th International Conference on Plant Growth Substances” (Brno, 2001); The 12th International Workshop on Plant Membrane Biology (Madison, 2001); International Symposium “Intracellular signaling in plant and animal systems” (ISPAS) (Kyiv, 2001); XI з’їзді Українського ботанічного товариства (Харків, 2001); International Symposium “Plant under environmental stress” (Moscow, 2001); VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002); IІ Міжнародній конференції “Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти” (Львів, 2004); The 14th FESPB Congress (Cracow, 2004); Конференції молодих учених-ботаніків “Актуальні проблеми ботаніки та екології” (Канів, 2004); Конференції молодих учених-ботаніків “Актуальні проблеми дослідження та збереження фіторізноманіття” (Умань, 2005); 6th International Conference “Eco-physiological aspects of plant responses to stress factors” (Cracow, 2005); I (IX) Международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2006); Міжнародній конференції молодих учених-ботаніків “Актуальні проблеми ботаніки, екології та біотехнології” (Київ, 2006); ІХ Українському біохімічному з’їзді (Харків, 2006).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 22 наукові роботи, у тому числі 4 статті у провідних фахових вітчизняних наукових журналах та 18 тез доповідей у збірках матеріалів вітчизняних та міжнародних конференцій та з'їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень та їх обговорення, узагальнення, висновків та списку використаних джерел, який містить 242 найменування. Робота викладена на 164 сторінках друкованого тексту, містить 11 таблиць та 23 рисунки.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

В дослідах використовували проростки кукурудзи сортолінійного гібриду Колективний 225 МВ, які вирощували у пластикових ростильнях на поживному середовищі Хогланда при 24°С за умов 16-годинного світлового дня та освітленості 50 Вт/м2. Обробку метіуром та івіном проводили шляхом намочування зернівок протягом доби в 10-7 М водних розчинах препаратів [Вакуленко В.В., Калякина Т.А., 1992]. Для індукції сольового стресу 7-добові проростки культивували 1 та 10 діб за наявності у поживному середовищі 0,05 або 0,1 М NaCl. Гомогенати тканин та препарати плазматичної мембрани одержували з коренів та листків 8- та 17-добових проростків. При дослідженні динаміки змін інтенсивності процесів пероксидного окислення та активності антиоксидантних ферментів у присутності 0,1 М NaCl визначення робили через 3, 9, 24, 48 та 240 годин сольової експозиції.

Інтенсивність процесів пероксидного окислення оцінювали двома методами – за рівнем загальної окисної спроможності методом Н2О2-ініційованої хемілюмінесценції [Попов Г.А., 1965, Барабой В.А. и др., 1991] та за вмістом ТБК-активних продуктів [Dhindsa R.S., Matowe W., 1981].

Активність СОД визначали за методом [Giannopolitis C.N., Ries S.K., 1977], що базується на здатності ферменту конкурувати з нітросинім тетразолієм за супероксидні аніон радикали, які утворюються в результаті фотохімічного відновлення води в присутності рибофлавіну. Електрофоретичний аналіз ізоформ СОД проводили за методом [Laemmli U.K., 1970], але без ДДС-Na, у 12% ПАГЕ та візуалізували за методом [Beauchamp C.O., Fridovich I., 1971]. Денситографічний аналіз здійснювали за допомогою програми “TotalLab 2.00”.

Активність каталази визначали за методом [Королюк М.А. и др., 1988], що базується на здатності пероксиду водню утворювати стійкий забарвлений комплекс із солями молібдену. Активність неспецифічної пероксидази визначали за методом [Nakano Y., Asada K., 1981], що базується на здатності ферменту окислювати пірогалол до пурпургаліну, використовуючи пероксид водню як акцептор електронів.

Фракцію ПМ одержували методом ультрацентрифугування у градієнті густини сахарози за [Leonard R.T., Van der Woude W.J., 1976]. Активність Н+-АТФази ПМ визначали за методом [Pedchenko V.K. et al., 1990], що базується на здатності залишків неорганічного фосфату, які утворюються при гідролізі АТФ, забарвлюватися хлоридом олова. Вміст білка визначали за методом [Bradford M.M., 1976].

Експериментальні дані оброблені статистично з використанням програми “Origin 6.0”. Відмінності результатів, що обговорюються в роботі вірогідні при р?0,05 за критерієм Ст'юдента.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Нашими дослідженнями було з’ясовано особливості перебігу пероксидного окислення й функціонування антиоксидантної системи в проростках кукурудзи за умов сольового стресу та впливу на ці процеси препаратів метіур та івін.

Було виявлено зростання загальної окисної спроможності у коренях та листках проростків кукурудзи, експонованих протягом 10 діб у присутності 0,1 М NaCl, тоді як за наявності 0,05 М NaCl збільшення відмічалося лише в коренях на початку експозиції (рис.1).

Рис.1. Інтенсивність ІХЛ у коренях (А) та листках (Б) проростків кукурудзи в присутності різних концентрацій NaCl: 1, 2 - відповідно 1 та 10 діб сольової експозиції.

Позначкою “*” показано вірогідні зміни, р?0,05.

Максимум інтенсивності ІХЛ у коренях припадав на 9-ту годину впливу 0,1 М NaCl, тоді як у листках на 48-му (рис.2). Отже, на початковому етапі експонування в присутності хлориду натрію відбувалося підвищення рівня ІХЛ, при цьому він залежав від сили сольового стресу.

Рис.2. Інтенсивність ІХЛ у коренях (А) та листках (Б) проростків кукурудзи в присутності 0,1 М NaCl та під впливом обробки метіуром та івіном: 1, 2, 3, 4, 5 – відповідно 3, 9, 24, 48 та 240 годин сольової експозиції.

На цьому та наступних рисунках та таблицях позначкою “*” показано вірогідні зміни в порівнянні з контролем. Позначкою “#” показано вірогідні зміни в порівнянні з впливом 0,1 М NaCl, р?0,05.

На 10 добу експерименту спостерігалося зменшення інтенсивності ІХЛ у коренях та листках проростків, експонованих за наявності 0,05 М NaCl (рис.1). Це може відбуватися внаслідок утворення вторинних та/або кінцевих продуктів пероксидного окислення, про що свідчить швидке зниження вмісту компонентів ХЛ-реакції.

Обробка зернівок кукурудзи препаратами метіур та івін сприяла зниженню рівня ІХЛ у проростках, експонованих у присутності 0,1 М NaCl (рис.2). При цьому протекторна дія метіуру більшою мірою виявлялася в коренях проростків, тоді як івіну в листках, що може бути пов’язано із різними механізмами реалізації дії цих сполук в рослинних організмах.

Логічним відображенням розвитку окисної деструкції в клітинах є наявність ТБК-активних продуктів, що з’являються на пізніших стадіях розвитку пероксидного окислення, ніж компоненти ХЛ-реакції. Це підтверджує подібність до ІХЛ змін вмісту ТБК-активних продуктів протягом перших діб експерименту у коренях та листках проростків кукурудзи, експонованих у присутності 0,05М та 0,1 М NaCl, при цьому максимуми їх накопичення виявлялися з деякою затримкою. Вплив метіуру та івіну при експозиції проростків у присутності 0,1 М NaCl практично не позначався на вмісті ТБК-активних продуктів у коренях та листках.

Активність СОД (КФ 1.15.1.1) у коренях та листках проростків кукурудзи значно зростала на початку їх експонування за наявності 0,05 М і 0,1 М NaCl та знижувалася наприкінці експерименту, причому в листках проростків у присутності 0,1 М NaCl навіть спостерігалося незначне інгібування ферменту (рис.3).

Рис.3. Активність СОД у коренях (А) та листках (Б) проростків кукурудзи в присутності різних концентрацій NaCl та під впливом обробки метіуром та івіном: 1, 2 - відповідно 1 та 10 діб сольової експозиції.

Підвищення активності СОД у коренях відбувалося переважно за рахунок збільшення вмісту Mn-СОД, Cu,Zn-СОД І і Cu,Zn-СОД ІІ ізоформ при 1- та 10-добовій сольовій експозиції проростків (рис.4). У листках збільшення активності ферменту було спричинено підвищенням вмісту усіх його ізоформ, особливо Cu,Zn-СОД ІІІ, так само як і зниження при 10-добовому експонуванні в присутності 0,1 М NaCl.

Рис.4. Електрофореграми СОД листків (А,Б) та коренів (В,Г) проростків кукурудзи в присутності різних концентрацій NaCl та під впливом обробки метіуром та івіном: 1) контроль; 2) 0,05 М NaCl; 3) 0,1 М NaCl; 4) 0,1 М NaCl та обробка метіуром; 5) 0,1 М NaCl та обробка івіном. А і В, Б і Г – відповідно 1 та 10 діб сольової експозиції.

Зростання активності СОД на початку сольової експозиції співпадало зі збільшенням рівня ІХЛ, що за умов 0,05 М NaCl стресу давало можливість підтримувати інтенсивність окисних процесів на невисокому рівні впродовж усього терміну впливу. В присутності 0,1 М NaCl зростання інтенсивності ІХЛ та активності СОД відбувалося одночасно, що вказує на значний внесок АФК, зокрема супероксидного аніон радикалу, у ХЛ-реакцію. Інгібування ферменту в листках проростків наприкінці сольового впливу може відбуватися під впливом пероксиду водню, який накопичується внаслідок функціонування СОД.

Було встановлено, що протягом перших діб сольового стресу активність каталази (КФ 1.11.1.6) гальмувалася в коренях та листках проростків кукурудзи, експонованих у присутності 0,1 М NaCl (рис.5). Це могло бути результатом інгібуючого впливу супероксидного аніон радикалу на фермент. Наприкінці експерименту відбувалося значне підвищення активності ферменту, яке, можливо, спричинялося зростанням вмісту його субстрату – пероксиду водню.

Рис.5. Активність каталази в коренях (А) та листках (Б) проростків кукурудзи в присутності 0,1 М NaCl та під впливом обробки метіуром та івіном: 1, 2, 3, 4, 5 – відповідно 3, 9, 24, 48 та 240 годин сольової експозиції.

Активність неспецифічної пероксидази (КФ 1.11.1.7) знижувалася в коренях проростків кукурудзи, що експонувалися в присутності 0,1 М NaCl, тоді як в листках вона зростала вже протягом перших діб сольового стресу (рис.6), що також пояснюється накопиченням в них пероксиду водню.

Рис.6. Активність неспецифічної пероксидази в коренях (А) та листках (Б) проростків кукурудзи в присутності 0,1 М NaCl та під впливом обробки метіуром та івіном: 1, 2, 3, 4, 5 – відповідно 3, 9, 24, 48 та 240 годин сольової експозиції.

Обробка зернівок кукурудзи препаратами метіур та івін призводила до підвищення активності досліджуваних антиоксидантних ферментів у проростках у присутності 0,1 М NaCl (рис.3,5,6). При цьому стимулююча дія метіуру більшою мірою виявлялася в коренях, тоді як івіну в листках. Однак активність пероксидази в листках проростків практично не змінювалася під впливом цих сполук (рис.6).

Отже, підвищення активності досліджуваних ферментів під впливом метіуру та івіну в проростках кукурудзи в присутності NaCl спричиняє зменшення в них рівня окисної деструкції, що сприяє біохімічній адаптації рослин до змінених умов існування.

В плазматичній мембрані рослинних клітин процеси вторинно-активного транспорту, в тому числі викиду назовні надлишку Na+, енергетично забезпечується функціонуванням Н+-насосу, механізм якого репрезентовано Н+-АТФазою (КФ 3.6.1.35). Нами було показано, що її гідролітична активність в препаратах ПМ коренів інгібувалася при експозиції проростків кукурудзи в присутності 0,05 М та 0,1 М NaCl (рис.7).

Рис.7. Активність Н+-АТФази ПМ у коренях проростків в присутності різних концентрацій NaCl та під впливом обробки метіуром та івіном: 1, 2 - відповідно 1 та 10 діб сольової експозиції.

При цьому між змінами активності ферменту та інтенсивності ІХЛ в ПМ можна прослідкувати аналогію (рис.8). Це може свідчити про регуляторний ефект окисних процесів на функціонування Н+-АТФази за умов сольового стресу. Крім того, в дослідах in vitro нами виявлено інгібування Н+-АТФази пероксидом водню на 20%, що могло бути наслідком окислення білка.

Рис.8. Інтенсивність ІХЛ в ПМ коренів проростків кукурудзи в присутності різних концентрацій NaCl та під впливом обробки метіуром та івіном: 1, 2 - відповідно 1 та 10 діб сольової експозиції.

Обробка препаратами метіур та івін посилювала активність Н+-АТФази ПМ коренів при 1-добовій сольовій експозиції проростків (рис.7). Це могло бути пов’язано зі зниженням за цих умов інтенсивності пероксидного окислення (рис.8), що зменшувало ризик конформаційних змін ферменту при окисній деструкції фосфоліпідного бішару.

Проявом біохімічних змін перебігу процесів пероксидного окислення, функціонування ферментів антиоксидантного захисту та Н+-АТФази плазматичної мембрани за умов сольового стресу було гальмування росту проростків кукурудзи. Так довжина надземної частини рослин зазнавала більшого інгібування, яке посилювалося із збільшенням концентрації NaCl та терміну його впливу (табл.1).

Таблиця 1

Ростові показники 8- та 17-добових проростків кукурудзи в присутності NaCl та під впливом обробки метіуром та івіном (М±m, n=120)

Обробка зернівок досліджуваними препаратами зменшувала гальмівний вплив сольової експозиції в присутності 0,1 М NaCl, причому антидепресантна дія метіуру виявлялася більшою мірою в коренях, тоді як івіну в листках (табл.1).

ВИСНОВКИ

1. Досліджено інтенсивність процесів пероксидного окислення та активність ферментів системи антиоксидантного захисту в коренях та листках проростків кукурудзи (Zea mays L.) впродовж 1 та 10 діб експозиції в присутності 0,05 та 0,1 М NaCl. Вперше показано протекторний ефект на ці показники синтетичних препаратів метіур і івін, застосованих шляхом обробки зернівок.

2. Знайдено, що рівень ініційованої хемілюмінесценції та вміст ТБК-активних продуктів значно підвищувалися в коренях та листках проростків кукурудзи за умов сольової експозиції, причому інтенсивність окисних процесів залежала від сили та тривалості дії стресового фактору. При цьому обробка препаратами, особливо метіуром, призводила до зменшення рівня пероксидації в тканинах проростків.

3. Показано підвищення активності супероксиддисмутази в тканинах проростків кукурудзи за умов сольового стресу, яке відбувалося в коренях переважно за рахунок збільшення вмісту Mn-СОД, Cu,Zn-СОД І і Cu,Zn-СОД ІІ ізоформ, а в листках – Cu,Zn-СОД ІІІ. Обробка метіуром та івіном ще більшою мірою посилювала активність ферменту в тканинах проростків, експонованих в присутності 0,1 М NaCl.

4. Виявлено, що активність каталази в коренях і листках проростків кукурудзи інгібувалася під впливом 0,1 М NaCl, тоді як активність неспецифічної пероксидази знижувалася в коренях та зростала в листках. При цьому обробка препаратами метіур і івін приводила до підвищення активності каталази у коренях і листках та неспецифічної пероксидази у коренях проростків, що сприяло адаптаційному процесу.

5. Встановлено, що активність Н+-АТФази в препаратах плазматичної мембрани з коренів проростків кукурудзи, експонованих в присутності 0,05 і 0,1 М NaCl, знижувалася. Обробка зернівок метіуром та івіном посилювала активність цього ферменту в коренях проростків при 1-добовому впливі 0,1М NaCl, що сприяло ефективності функціонування систем вторинно-активного транспорту.

6. Вперше продемонстровано, що пероксид водню in vitro інгібував Н+-АТФазу в препаратах плазматичної мембрани клітин коренів проростків кукурудзи, тому гальмування активності ферменту in vivo при сольовій експозиції проростків, яке супроводжується зниженням в плазматичній мембрані окисних процесів, може свідчити про опосередкований регуляторний вплив останніх на активність Н+-АТФази.

7. Показано, що умови сольового стресу викликають гальмування росту проростків кукурудзи, яке посилюється при збільшенні концентрації солі. Обробка зернівок досліджуваними препаратами зменшує гальмівний ефект 0,1 М NaCl на ростові процеси в проростках, причому дія метіуру більшою мірою виявляється в коренях, а івіну в листках.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Палладіна Т.О., Куриленко І.М., Ключко С.В., Хутова Б.М., Приказчикова Л.П., Драч Б.С. Стимулюючий ефект метіуру на ріст та солестійкість паростків кукурудзи // Доповіді НАНУ.- 2001.- №6.- С.177-180. (Особисто дисертантом проведено вирощування рослин, дослідження ростових параметрів, їх статистична обробка, аналіз та узагальнення).

2. Куриленко І.М., Палладіна Т.О. Вплив регуляторів росту на процеси пероксидного окислення в проростках кукурудзи за умов сольового стресу // Український біохімічний журнал.- 2001.- Т.73, №6.- С.56-60.

3. Куриленко І.М., Палладіна Т.О. Пероксидне окиснення ліпідів в проростках кукурудзи за умов засолення та дії синтетичних регуляторів росту // Вісник Харківського Національного Аграрного Університету. Серія Біологія.- 2005.-Вип.2(7).- С.50-54.

4. Куриленко І.М., Палладіна Т.О. Вплив засолення та синтетичних регуляторів росту на активність каталази та пероксидази в проростках кукурудзи // Український біохімічний журнал.- 2005.- Т.77, №6.- С.86-93.

5. Палладина Т.А., Куриленко И.Н. Первичные биохимические ответы растений при солевом стрессе // Физиология растений – наука III тысячелетия: IV Съезд общества физиологов растений России. Москва, 4-9 октября 1999 г.- Москва, 1999.- С.435-436.

6. Куриленко И.Н. Влияние NaCl на процессы перекисного окисления и активность антиоксидантной системы в проростках кукурузы // VII Молодежная конференция ботаников в Санкт-Петербурге. Санкт-Петербург, 15-19 мая 2000 г.- Санкт-Петербург, 2000.- С.127-128.

7. Palladina T.O., Kurylenko I.M. Effect of growth regulators on hormonal ratio in corn seedling roots under NaCl stress conditions // 17th International Conference on Plant Growth Substances. Brno, 1-6 July 2001.- Brno, 2001.- P.134.

8. Palladina T.O., Kurylenko I.M. Possible role of peroxidation processes in H+-ATPase plasma membrane alterations under salt stress conditions in corn seedling roots // 12th International Workshop on Plant Membrane Biology. Madison, 11-16 August 2001.- Madison, 2001.- P.158.

9. Kurylenko I.M., Palladina T.O. Peroxidation processes in corn seedlings under salt stress condition and at treatment by growth regulators // Intracellular Signaling in Plant and Animal Systems (ISPAS): International Symposium. Kyiv, 9-14 September 2001.- Kyiv, 2001.- P.73.

10. Куриленко І.М. Вплив сольової експозиції на процеси перекисного окислення у проростках кукурудзи // XI з’їзд Українського ботанічного товариства. Харків, 25-27 вересня 2001 р.- Харків, 2001.- С.208-209.

11. Kurylenko I.M., Palladina T.O. Antioxidative responses of corn seedlings under the salt stress condition // Plant under environmental stress: International Symposium. Moscow, 23-28 October 2001.- Moscow, 2001.- P.148.

12. Palladina T.O., Kurylenko I.M. The effect of salinity on peroxidation processes in corn seedlings // Plant under environmental stress: International Symposium. Moscow, 23-28 October 2001.- Moscow, 2001.- P.215-216.

13. Куриленко І.М. Інтенсивність пероксидного окислення ліпідів та антиоксидантного захисту за сольового стресу у проростках кукурудзи // VIII Український біохімічний з’їзд. Чернівці, 1-3 жовтня 2002 р.- Чернівці; Київ, 2002.- Український біохімічний журнал.- Т.74, Спеціальний випуск, №4б (додаток 2).- С.128-129.

14. Куриленко І.М., Палладіна Т.О. Вплив NaCl та синтетичних регуляторів росту на активність процесів пероксидного окислення та антиоксидантного захисту у проростках кукурудзи // Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти: II Міжнародна конференція. Львів, 18-21 серпня 2004 р.- Львів, 2004.- С.248.

15. Chyzhykova O., Kurylenko I., Palladina T. Adaptation lightening of salt-stressed corn seedlings by growth regulators // The 14th FESPB Congress. Cracow, 23-27 August 2004.- Cracow, 2004.- Acta Physiologiae Plantarum.- V.26, №3 Supplement.- P.204-205.

16. Куриленко І.М. Вплив різного рівня засолення на ріст та функціонування проростків кукурудзи // Актуальні проблеми ботаніки та екології: Конференція молодих учених-ботаніків. Канів, 7-10 вересня 2004 р.- Канів; Київ, 2004.- С.167-169.

17. Куриленко І.М. Активність супероксиддисмутази у проростках кукурудзи за умов засолення та обробки синтетичними регуляторами росту // Актуальні проблеми дослідження та збереження фіторізноманіття: Конференція молодих учених-ботаніків. Умань, 6-9 вересня 2005 р.- Умань; Київ, 2005.- С.156-157.

18. Kurylenko I.M., Palladina T.A. Effect of synthetic growth regulators on antioxidant enzyme activities in corn tissues under the salt stress conditions // Eco-physiological aspects of plant responses to stress factors: 6th International Conference. Cracow, 14-17 September 2005.- Cracow, 2005.- Acta Physiologiae Plantarum.- V.27, №4 (supplement).- P.62-63.

19. Palladina T.O., Kurylenko I.M., Chyzhykova O.A. Plant salt-tolerance can be increased by synthetic compounds with antioxidant and antiradical properties // Eco-physiological aspects of plant responses to stress factors: 6th International Conference. Cracow, 14-17 September 2005.- Cracow, 2005.- Acta Physiologiae Plantarum.- V.27, №4 (supplement).- P.22.

20. Чижикова Е.А., Куриленко И.Н. Участие пролина в уменьшении перекисного окисления липидов в корнях и листьях проростков кукурузы при засолении // I (IX) Международная конференция молодых ботаников в Санкт-Петербурге. Санкт-Петербург, 21-26 мая 2006 г.- Санкт-Петербург, 2006.- С.218.

21. Чижикова О.А., Куриленко І.М. Накопичення вільного проліну та процеси пероксидного окиснення ліпідів в коренях та листках проростків Zea mays L. за умов засолення // Актуальні проблеми ботаніки, екології та біотехнології: Міжнародна конференція молодих учених-ботаніків. Київ, 27-30 вересня 2006 р.- Київ, 2006.- С.175-176.

22. Куриленко І.М., Палладіна Т.О. Вплив засолення та синтетичних регуляторів росту на активність та ізоферментний склад супероксиддисмутази у проростках кукурудзи // ІХ Український біохімічний з’їзд. Харків, 24-27 жовтня 2006 р.- Харків, 2006.- Т.1.- С.140.

АНОТАЦІЯ

Куриленко І.М. Процеси пероксидного окислення в проростках кукурудзи за умов сольового стресу. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2007.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню перебігу процесів пероксидного окислення, активності антиоксидантних ферментів та Н+-АТФази плазматичної мембрани в проростках кукурудзи за умов сольового стресу, а також вивченню дії синтетичних препаратів метіур та івін на вищезазначені процеси з метою корекції сольового впливу.

Встановлено, що стрес, індукований NaCl, призводить до посилення процесів пероксидного окислення в коренях та листках проростків кукурудзи, причому їх інтенсивність залежить від сили та тривалості дії стресового фактору. Зміни рівня пероксидації за умов засолення супроводжуються одночасним підвищенням активності СОД та поступовою активацією каталази та неспецифічної пероксидази, а, до того ж, інігібуванням Н+-АТФази плазматичної мембрани, яка забезпечує енергією викид Na+ назовні. Показано, що обробка зернівок препаратами, особливо метіуром, призводить до нормалізації процесів пероксидації та підвищення активності антиоксидантних ферментів і Н+-АТФази плазматичної мембрани в проростках кукурудзи за умов сольового стресу, а також зменшення гальмівного ефекту NaCl на ростові процеси. Використання метіуру та івіну може бути запропоновано для підвищення солестійкості рослин.

Ключові слова: процеси пероксидного окислення, антиоксидантні ферменти, Н+-АТФаза плазматичної мембрани, сольовий стрес, метіур, івін.

АННОТАЦИЯ

Куриленко И.Н. Процессы перекисного окисления в проростках кукурузы в условиях солевого стресса. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2007.

Диссертационная работа посвящена исследованию процессов перекисного окисления, активности антиоксидантных ферментов и Н+-АТФазы плазматической мембраны в проростках кукурузы в условиях солевого стресса, а также изучению действия синтетических препаратов метиур и ивин на вышеуказанные процессы с целью коррекции солевого влияния.

Установлено, что стресс, индуцированный NaCl, приводит к усилению процессов перекисного окисления в корнях и листьях проростков кукурузы, причем их интенсивность зависит от силы и продолжительности стрессового влияния. Изменения уровня пероксидации в условиях засоления сопровождаются одновременным повышением активности СОД и постепенной активацией каталазы и неспецифической пероксидазы, а также ингибированием Н+-АТФазы плазматической мембраны, которая обеспечивает энергией выброс Na+ наружу. Показано, что обработка зерновок препаратами, особенно метиуром, приводит к нормализации процессов пероксидации и повышению активности антиоксидантных ферментов и Н+-АТФазы плазматической мембраны в проростках кукурузы в условиях солевого стресса, а также к уменьшению ингибирующего действия NaCl на ростовые процессы. Использование метиура и ивина может быть предложено для повышения солеустойчивости растений.

Ключевые слова: процессы перекисного окисления, антиоксидантные ферменты, Н+-АТФаза плазматической мембраны, солевой стресс, метиур, ивин.

SUMMARY

Kurylenko I.M. Peroxide oxidation processes in corn seedlings under the salt stress conditions.

Dissertation for the candidate of biological sciences degree in speciality 03.00.04 – Biochemistry. – Kyiv National Taras Shevchenko University, Kyiv, 2007.

The dissertation is devoted to investigation of intensity of peroxide oxidation, activity of antioxidant enzymes and H+-ATPase of plasma membrane in corn seedlings under the salt stress conditions and possibility to correct these processes by synthetic preparations methyure and ivine.

It was shown that 1-day exposition of corn seedlings to 0.05 M NaCl increased the level of H2O2-induced chemiluminescence (ICL) in roots whereas in leaves it was decreased. At 10-day effect of 0.05 M NaCl it was observed the decrease of ICL intensity in roots without changes in leaves. Exposition of corn seedlings to 0.1 M NaCl significantly enhanced ICL level which reached maximum at 9th and 48th hours of salt stress in roots and leaves correspondingly. Assaying of ICL intensity at 10th day of exposition to 0.1 M NaCl demonstrated its some decrease caused probably by plant adaptation to stress conditions.

At that time 1-day exposition of corn seedlings to 0.05 M NaCl increased content of TBA-active products in roots and leaves whereas 10-day one decreased it. Curve of TBA-active product accumulation in roots and leaves of corn seedlings exposed to 0.1 M NaCl repeated ICL changes one with some lateness and less amplitude of maximums. They were observed at 24th and 96th hours of salt stress in roots and leaves correspondingly. Revealed changes indicated on dependence of peroxide oxidation intensity on power and term of stress effect.

Exposition of corn seedlings to 0.05 M and 0.1 M NaCl during 1 and 10 days enhanced the SOD activity in tissues for the exception of leaves of seedlings exposed to 0.1 M NaCl during 10 days where enzyme activity was inhibited a little. Observed changes of SOD activity was caused by increase of Mn-SOD, Cu,Zn-SOD I and Cu,Zn-SOD II isoenzyme content in roots and Cu,Zn-SOD III in leaves. Corn seedling exposition to 0.1 M NaCl inhibited the catalase activity in root and leaf tissues at the beginning of salt stress whereas it was increased at 10th day of stress effect. At that time 10-day exposition of corn seedlings to 0.1 M NaCl decreased the activity of non-specific peroxidase in roots whereas increased it in leaves. These alterations of antioxidant enzyme activity indicated on major role of SOD in the defense from oxidative injury caused by salt stress.

A secondary active Na+ extrusion from plant cells is supported by H+-ATPase of plasma membrane. It was elucidated that the presence of 0.05 M NaCl in nutrient medium of corn seedling growing caused the inhibition of H+-ATPase hydrolitical activity of plasma membrane in roots as after one so after 10 days of salt stress. Exposition of corn seedlings to 0.1 M NaCl during one day revealed the same effect whereas after 10-day influence the H+-ATPase hydrolitical activity was practically unchanged. At that time 1-day exposition of corn seedlings to 0.05 M NaCl increased ICL level in plasma membrane of roots whereas 10-day salt effect decreased it. On the contrary, corn seedling exposition to 0.1 M NaCl during 1 and 10 days reduced ICL intensity in plasma membrane of roots.

In this connection the effect of hydrogen peroxide as factor that caused peroxidation processes was studied in plasma membrane of corn seedling roots in vitro. It was shown that plasma membrane incubation with a range of H2O2 concentrations (from 10-4 M to 10-9 M) caused inhibition of H+-ATPase hydrolitical activity already in presence of 10-8 M H2O2. Obtained data permit to suggest that decrease of plasma membrane H+-ATPase activity can be partly depended on enzyme oxidation by hydrogen peroxide whereas changes of oxidation processes in isolated plasma membrane under the salt stress conditions in vivo can indirectly regulate the H+-ATPase functioning.

It was revealed that treatment of corn seeds by synthetic preparations methyure and ivine decreased the high ICL level and content of TBA-active products in root and leaf tissues of seedlings exposed to 0.1 M NaCl. This effect of both compounds on ICL intensity was especially powerful in plasma membrane from roots of salt-stress corn seedlings. It was observed that treatment by methyure and ivine enhanced activity of SOD and catalase in corn tissues and non-specific peroxidase in roots of seedlings exposed to 0.1 M NaCl that furthered adaptation process. Also both preparations increased the hydrolitical activity of H+-ATPase in plasma membrane of seedling roots under the salt stress conditions that promoted effectiveness of functioning of secondary active transport systems. Treatment of seeds by methuyre and ivine reduced the inhibition of corn seedling growth caused by exposition to 0.1 M NaCl. Obtained data indicate on lightening of corn seedling adaptation to salt stress by using of methuyre and ivine that permits to recommend them for plant salt-tolerance increase.

Key words: peroxide oxidation processes, antioxidant enzymes, plasma membrane H+-ATPase, salt stress, methyure, ivine.