НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна

ПОНОМАРЕНКО ОЛЬГА ВІКТОРІВНА

УДК 577.352.4

ВПЛИВ СПЕРМІНУ НА ТРАНСПОРТ ІОНІВ Са В МІТОХОНДРІЯХ МІОМЕТРІЯ

03.00.04 - біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України.

Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор

член-кореспондент НАН України,

КОСТЕРІН Сергій Олексійович,

завідувач відділу біохімії м’язів Інституту біохімії

ім. О. В. Палладіна НАН України.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

ЛІТОШЕНКО Олександр Якович,

керівник лабораторії молекулярної генетики

Інституту геронтології АМН України;

доктор біологічних наук, професор

МАТИШЕВСЬКА Ольга Павлівна,

професор кафедри біохімії

Київського національного університету

імені Тараса Шевченка.

Провідна установа – Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,

відділ фізіології кровообігу

(м. Київ).

Захист відбудеться 2 квітня 2007 року о 14 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, Київ - 30, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат дисертації розісланий 1 березня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук КІРСЕНКО О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Іон Са (Са2+) є важливим клітинним месенджером, який здатний регулювати різноманітні біохімічні, біофізичні та фізіологічні процеси, в тому числі скорочення м’язів [Bеrridge M. et.al.,2003; Костюк П. та ін.,2005; Belkacemi L. et.al.,2005].

Са2+-залежний контроль скоротливої відповіді гладеньких м’язів (ГМ) здійснюється завдяки різноманітності внутрішньоклітинних Са2+-сигналів, які забезпечуються суперпозицією функціонування систем пасивного і активного транспорту даного катіона, що локалізовані як у плазматичній мембрані (ПМ), так і у внутрішньоклітинних мембранних структурах - саркоплазматичному ретикулумі (СР) та мітохондріях (МХ) [Poburko D. et.al.,2004; Wray S. et.al.,2005].

МХ є внутрішньоклітинними кальцієвими депо, які здатні акумулювати іони Са у великих кількостях [Maтишевська O. та ін.,2002; Duchen M.,2004]. Акумуляція Са2+ в МХ здійснюється за рахунок електрофоретичного накопичення Са2+ за градієнтом електрохімічного потенціалу, ДШ = -180 мВ, який має протонне походження [Литошенко А.,2001; Carafoli E.,2003]. Вихід Са2+ з МХ може відбуватися шляхом електронейтрального обміну Ca2+/2Н+ та Ca2+/2Na+ [Gunter T. et.al.,2004; Saris N. et.al.,2005], а також завдяки формуванню у внутрішній мембрані МХ неселективної пори - так званої мітохондріальної пори перехідної проникності (МППП) [Halestrap A.et.al.,2002; Акопова O., Сагач В.,2005]. Встановлено, що відкривання МППП відбувається при критичному накопиченні Са2+ в мітохондріальному матриксі та певному зниженні трансмембранної різниці електричних потенціалів. МППП, як вважають, належить важлива роль у процесах загибелі клітини [Gottlieb R. et.al.,2002]. Циклоспорин А (ЦсА) є одним із перших лікарських засобів, який застосували для блокування MППП [Belyaeva E. et.al.,2002; Schinzel A. et.al.,2005]. ЦсА здатен захищати клітини мозку та серця від пошкоджень, спричинених реперфузією та ішемією [Weiss J. et.al.,2003; Di Lisa F. et.al.,2006]. Проте, не дивлячись на очевидну здатність ЦсА бути антиішемічним лікарським засобом, його фармакокінетичні параметри не свідчать на користь його активного клінічного використання у перспективі [Szewczyk A. et.al.,2002]. У зв’язку з цим важливим є пошук речовин природного походження, здатних спрямовано модулювати акумуляцію Са2+ в МХ та відкривання МППП. Такими природними речовинами можуть бути поліаміни (спермін, спермідин, путресцин) та іони Mg (Mg2+), яким притаманна важлива роль у забезпеченні життєдіяльності всіх прокаріотичних та евкаріотичних клітин [Wang R. et.al.,2003; Janne J. et.al.,2004]. Тестування ЦсА-чутливої МХ пори можливо з використанням різноманітних експериментальних підходів, зокрема – із залученням ізотопної техніки (45Са2+), реєстрації набухання цих субклітинних структур та т.і. [Kosterin S.,2003; Halestrap A.,2006].

Поліаміни є важливими полікатіонами клітини, вони беруть участь у процесах росту та диференціювання клітин [Wallace H. et.al.,2003], регуляції білкового синтезу [Janne J. et.al.,2004], запрограмованій загибелі клітини [Seiler N. et.al.,2005], а також відіграють суттєву роль у регуляції транспорту Са2+ МХ [Nitta T. et.al.,2002]. Поліаміни здатні зворотньо зв’язуватись із внутрішньою мембраною МХ [Hoshino K. et.al.,2005]. Спермін відіграє важливу регуляторну роль у функціонуванні такого репродуктивного органу, як матка [Houlihan D. et.al.,2002]. Він проявляє потужний релаксуючий ефект на спонтанні та викликані агоністом скорочення ізольованих смужок міометрія людини, К+-, Са2+-, метахолін- та ванадат-індуковані скорочення міометрія щурів [Revuelta M. et.al.,1998], але механізм релаксуючої дії цього поліаміну на міоцити поки що не з’ясовано.

Дані щодо ефектів поліамінів на трансмембранний обмін Са2+ в МХ, зокрема на Са2+-уніпортер та Са2+-залежну МППП, є досить суперечливими [Igarashi K. et.al.,2000].

Беручи до уваги, що іони Mg необхідні для забезпечення АТР-залежної акумуляції іонів Са в МХ клітин міометрія, важливим також є питання щодо з’ясування закономірностей трансмембранного обміну Са2+ в МХ ГМ за умов сумісного використання Mg2+ та сперміну.

Таким чином, можна стверджувати, що подальші дослідження щодо з’ясування закономірностей регуляції активності Са2+-транспортуючих систем МХ поліаміном сперміном є особливо важливими для розробки ефективних методів спрямованої корекції трансмембранного обміну іонів Са у зазначених субклітинних структурах зворотними ефекторами у випадку його порушень [Kristian T. et.al.,1996].

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертація виконана відповідно до плану науково - дослідних робіт відділу біохімії м’язів Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАНУ за темами: “Вивчення біохімічних механізмів електро- та фармакомеханічного спряження у гладеньких м’язах та ролі систем енергозалежного транспорту Са2+ у забезпеченні цього процесу” (держ. реєстр. № 0199И000270) і “Вивчення властивостей та регуляції АТP-залежних кальцієвих помп мембранних структур гладеньких м’язів” (держ. реєстр. № 0104И003281).

Мета та задачі дослідження. Метою роботи було дослідити закономірності впливу поліаміну сперміну на Mg2+,АТР – залежну акумуляцію іонів Са та пору перехідної проникності в МХ міометрія.

Для досягнення зазначеної мети було сформульовано такі основні задачі:

1. Вивчити кінетику та Mg2+-чутливість АТР-залежної акумуляції Са2+ в МХ.

2. Дослідити закономірності впливу сперміну на Mg2+,АТР-залежну акумуляцію іонів Са в МХ.

3. Вивчити дію сперміну на Са2+-залежну ЦсА-чутливу мітохондріальну пору перехідної проникності.

Об’єкт дослідження: системи транспорту іонів Са в МХ ГМ матки.

Предмет дослідження: вплив сперміну на транспорт Са2+ в МХ міометрія та на Са2+- залежне набухання цих субклітинних структур.

Методи дослідження: препаративна біохімія, біохімічна мембранологія, ізотопна техніка (45Са2+), спектрофотометрія, лазерно-кореляційна спектроскопія (ЛКС), проточна цитофлуориметрія, кінетичний аналіз, математичне моделювання.

Наукова новизна одержаних результатів. Із використанням методів радіоактивної мітки (45Са2+), ЛКС, проточної цитофлуориметрії та математичного моделювання одержані нові дані щодо властивостей Са2+-акумулюючої системи та ЦсА-чутливої, Са2+-залежної пори перехідної проникності МХ ГМ матки, впливу поліаміну сперміну на транспорт Са2+ в них.

Вперше продемонстровано, що дія сперміну на швидкість Mg2+,АТР-залежної акумуляції Са2+ в МХ міометрія є двофазною: за малих (фізіологічних) концентрацій сперміну (?1 мМ) спостерігається активація транспортного процесу, а за великих (1-10 мМ) – його інгібування. У той же час, спермін (до 10 мМ) практично не впливає на Mg2+,АТР-залежну акумуляцію Са2+ в СР міометрія. Розроблено та апробовано у дослідах кінетичну модель біфазного впливу сперміну на швидкість Mg2+,АТР-залежної акумуляції іонів Са в МХ. Встановлено, що спрямованість дії ЦсА на акумуляцію іонів Са в МХ міометрія (стимуляція чи інгібування) залежить від концентрації іонів Mg.

Доведено, що у разі збільшення неспецифічної проникності мембрани МХ, але за присутності сперміну (1 мМ) та іонів Mg у насичувальних (щодо функціонування Са2+-уніпортера) концентраціях (7 мМ), спостерігається повне відновлення рівня Mg2+,АТР-залежної акумуляції Са2+ у цих субклітинних структурах. Показано наявність Са2+-чутливої пори перехідної проникності у МХ міометрія, яка інгібується ЦсА та регулюється сперміном.

Практичне значення одержаних результатів. Із використанням методів ЛКС та проточної цитофлуориметрії розроблено методичні підходи до ідентифікації та вивчення властивостей ЦсА-чутливої Са2+- залежної пори перехідної проникності в МХ міометрія. Ці підходи можуть бути застосовані в інших лабораторіях при дослідженні трансмембранного обміну іонів Са в МХ.

Експериментальні дані, що були одержані при вивченні впливу сперміну на транспорт Са2+ в МХ, є перспективними для подальшого з’ясування біохімічних та фізико-хімічних аспектів дії поліамінів на Са2+-уніпортер та МППП. Кінетична модель впливу сперміну на акумуляцію іонів Са в МХ ГМ матки може бути корисною для розуміння молекулярних та мембранних механізмів електро- та фармакомеханічного спряження у гладеньком’язових клітинах (ГМК).

Особистий внесок здобувача. Головна ідея та задачі досліджень були сформульовані науковим керівником – д.б.н., проф., чл.-кор. НАНУ С.О. Костеріним. Дисертанткою самостійно здійснено аналіз відповідних літературних даних, одержано фракцію МХ та суспензію ГМК матки щурів, проведено досліди по вивченню акумуляції іонів Са в МХ клітин міометрія (деякі із таких експериментів виконано разом з к.б.н. Л.Г. Бабіч та к.б.н. С.Г. Шликовим), проведено кінетичний та статистичний аналіз результатів та експериментальну апробацію кінетичної моделі дії сперміну на акумуляцію Са2+ в МХ. Особисто були проведені дослідження методом проточної цитофлуориметрії і разом із к.б.н. Л.Г. Бабіч було розроблено робочий протокол для реєстрації набухання МХ. Досліди з використанням лазерного кореляційного спектрометру виконані разом із к.ф.-м.н. В.Ф. Горчевим. Аналіз експериментальних результатів та формулювання висновків роботи проведено спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації було представлено на науково-практичній конференції студентів та молодих вчених Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця з міжнародною участю "Актуальні проблеми сучасної медицини" МОЗ України (отримала диплом за найкращу наукову роботу) (Київ, Україна, 2003 р.); Міждународному симпозіумі "Smooth muscle physiology and biophysics" (Київ, Україна, 2003 р.); Міжнародній Парнасівській конференції "Molecular mechanisms of cellular signalling" (Київ, Україна, 2005 р.); ІХ Міжнародній конференції "Cеll biology", (Лодзь, Польща, 2005 р.). Результати експериментів також доповідались на наукових семінарах відділу біохімії м’язів та засіданнях Вченої Ради Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України. Матеріали досліджень було представлено на конкурсах молодих вчених Інституту біохімії ім.О.В. Палладіна НАНУ: у 2003 р. (премія за активну участь) та у 2005 р. (посіла ІІ місце) та на здобуття стипендії імені видатних вчених-біохіміків, де роботу відзначено премією ім. член-кор. АН СРСР та АН УРСР Д.Л. Фердмана (2004 р.).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 5 статей у фахових наукових журналах та 11 тез доповідей у матеріалах міжнародних та всеукраїнських наукових конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 155 сторінках машинописного тексту і складається з таких розділів: “Вступ”, “Огляд літератури”, “Експериментальна частина” (4 підрозділи), “Заключний розділ”, “Висновки”, “Додаток” та “Список використаних джерел”, який містить 275 посилань. Робота ілюстрована 25 рисунками та 4 таблицями.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури висвітлено сучасні уявлення про мембранні механізми регуляції концентрації Са2+ в цитоплазмі, шляхи та механізми транспорту Са2+ в МХ, структуру та функціональну роль неспецифічної пори перехідної проникності в них. Охарактеризовано вплив Mg2+ на структурно-функціональні властивості біологічних мембран та обмін Са2+ у тканинах. Наведено дані щодо впливу поліамінів на транспорт Са2+ у субклітинних мембранних структурах, закономірності впливу поліамінів на скоротливу активність скелетних м’язів, міокарду та ГМ, а також безпосередньо на скоротливу функцію матки.

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідження АТР-залежної акумуляції Са2+ у МХ та СР, що були проведені за допомогою радіоізотопної техніки (45Са2+) на суспензії ГМК матки, оброблених розчином дигітоніну.

Суспензію ГМК матки невагітних щурів, естрогенізованих за 16 год до забору тканини [Rao et al.,1986], отримували за допомогою методу [Mollard et al.,1986] з деякими модифікаціями.

Транспортну активність електрофоретичного енергозалежного Са2+-уніпортера МХ та Mg2+,АТР-залежної Са2+-помпи СР тестували в експериментах, які було здійснено на суспензії клітин міометрія, оброблених розчином дигітоніну, що мали порушену бар’єрну функцію ПМ. Середовище інкубації (об’єм - 0,5 мл) містило (мМ): 20 Hереs-NaOH буфер (рН 7,4; 37єC), 3 MgCl2, 3 АТР, 3 сукцинат Na, 125 KCl, 25 NaCl, 2 фосфат K та 10 мкМ (45СаCl2+ 40CaCl2) (0,5 мкКі/мл); вміст дигітоніну - 0,1 мг/мл (0,01%). У попередніх дослідах було визначено оптимальну вищезазначену концентрацію дигітоніну. Доведено, що дигітонін у цій концентрації порушує цілісність ПМ, але не впливає на структурно-функціональні властивості внутрішньоклітинних кальцієвих депо [Fiskum et al.,1985; Шлыков и др.,1997]. Середня кількість міоцитів у пробі - 2·105. Енергозалежну акумуляцію Са2+ у СР пригнічували селективним інгібітором Са2+-помпи СР тапсигаргіном (100 нМ). Для селективного пригнічення накопичення Са2+ у МХ використовували протонофор СССР (1 мкМ) чи рутенієвий червоний (10 мкМ). Енергозалежний транспорт Са2+ в МХ та СР міоцитів, оброблених розчином дигітоніну, досліджували за допомогою ізотопної методики з використанням 45Са2+. Акумуляцію Са2+ ініціювали внесенням у середовище інкубації суспензії клітин. Кількість Са2+ (пмоль Са2+/106 клітин), що надійшла до МХ та СР в енергозалежному процесі, обчислювали за різницею між загальним його накопиченням із середовища інкубації та адсорбцією із середовища інкубації, що не містило АТР (або Mg2+). Транспортний процес зупиняли шляхом швидкого фільтрування інкубаційної суміші крізь мембранні фільтри ("Millipore", США, діаметр пор 0,45 мкм) під вакуумом з наступною разовою промивкою їх охолодженим ізотонічним розчином (об’єм - 5 мл), що містив (мМ): 20 Hереs-NaOH буфер (рН 7,4; 8?C), 150 KCl, 5 CoCl2. Радіоактивність мембранних фільтрів вимірювали за допомогою рідинного сцинтиляційного спектрометра Intertechnique SL-4000 (Франція).

МХ міометрія у разі використання такої експериментальної моделі, як суспензія міоцитів, оброблених розчином дигітоніну, були функціонально активні: вони забезпечували Mg2+,ATP-залежну акумуляцію іонів Са (початкова швидкість V0 акумуляції Са2+ у МХ дорівнювала 1324 174 пмоль Са2+/106 клітин за 1 хв., n=5), яка пригнічувалась протонофором СССР (1 мкМ) та рутенієвим червоним (10 мкМ), але не була чутливою до дії селективного інгібітора Са2+-помпи СР тапсигаргіну (100 нМ). Mg2+,ATP-залежна акумуляція іонів Са у СР міометрія характеризувалася значенням початкової швидкості V0=18847 пмоль Са2+/106 клітин за 1 хв (n=5). У цьому випадку транспорт Са2+ пригнічувався тапсигаргіном (100 нМ), але не був чутливим до дії СССР (1 мкМ) та рутенієвого червоного (10 мкМ).

При вивченні концентраційних залежностей впливу сперміну та ЦсА на енергозалежний транспорт Са2+ у МХ ці речовини безпосередньо вносили до середовища інкубації у відповідних концентраціях.

Дію іонів Mg та сперміну на Mg2+,АТР - залежну Са2+- транспортуючу систему МХ та СР клітин міометрія досліджували таким чином. Суспензія ГМК матки щурів була проінкубована з Mg2+ чи сперміном за різних концентрацій у середовищі інкубації (склад наведено вище) протягом 5 хв., у цих дослідах контролем були клітини, які “проходили” усі етапи інкубації, що наведені вище, але без внесення Mg2+ чи сперміну (вносили аліквоту Н2О).

У дослідженнях, які були проведені за умов комплексного використання сперміну, іонів Mg та ЦсА на Mg2+,АТР-залежне накопичення Са2+ у МХ, використовували 6 груп дослідів – А, Б, В, Г, Д та Є. Кожні дві групи мають свої умови дослідження.

Для групи дослідів А, В та Д концентрація Mg2+ у середовищі інкубації складала 3 мМ, а для групи дослідів Б, Г та Є – 7 мМ. Для групи дослідів В та Г середовище передінкубації містило 10 мкМ Са2+, 2 мМ фосфат К, 1 мМ спермін або 5 мкМ ЦсА, а також 3 мМ (група дослідів В) або 7 мМ (група дослідів Г) Mg2+ відповідно, однак це середовище не містило АТР (моделювали відкривання неспецифічної пори перехідної проникності мітохондріальної мембрани, що призводить до падіння величини електрохімічного протонного потенціалу на внутрішній мембрані МХ і, як наслідок, до інгібування акумуляції Са2+ у цих структурах [Crompton,1999]). Через 5 хв. вносили аліквоту розчину АТР (об’єм - 50 мкл, кінцева концентрація – 5 мМ). Для групи дослідів Д та Є середовище передінкубації містило: 10 мкМ Са2+, 2 мМ фосфат К, 1 мМ спермін або 5 мкМ ЦсА, але у відсутності не тільки АТР, але і іонів Mg. Через 5 хв. в це середовище вносили аліквоту розчину, який містив АТР та Mg2+. У всіх дослідах час інкубації становив 5 хв. Контролем були клітини, які “проходили” усі етапи інкубації, але без внесення розчину сперміну та ЦсА (вносили аліквоту Н2О).

При розробці моделі біфазної дії сперміну на акумуляцію іонів Са в МХ були використані методи хімічної та біохімічної кінетики, які ґрунтувались на використанні закону діючих мас, принципу збереження загальної концентрації речовин у реакції, принципу незалежного протікання реакцій. До аналізу моделі був також застосований закон збереження енергії (незалежність зміни вільної енергії Гіббса Д G від шляху переходу) між окремими станами Са2+-уніпортера.

Дослідження, що були проведені за допомогою ЛКС та проточної цитофлуориметрії на фракції ізольованих МХ міометрія.

Фракцію ізольованих МХ одержували із міометрія щурів, як описано раніше [Костерин и др.,1985] з деякими модифікаціями складу середовища інкубації. Кількість білка визначали за методом Бредфорда [Bradford M.,1976].

Функцію розподілу МХ за розмірами вивчали за допомогою лазерного кореляційного спектрометра “ZetaSizer –3” Malvern Instrument, який був обладнаний корелятором multi computing correlator, type 7032 ce. Досліджувану суспензію МХ (об’єм 1 мл) розташовували в циліндричній оптичній кюветі із скла діаметром 10 мм, яку вводили в термостатовану лунку лазерного кореляційного спектрометра. Реєстрацію та статистичну обробку розсіяного від суспензії під кутом 90? лазерного випромінювання (гелій-неоновий лазер ЛГ-111, потужність 25 мВт, довжина хвилі 633 нм) проводили протягом 60 – 180 сек. Потім отриману автокореляційну функцію (АКФ) аналізували за допомогою стандартної комп’ютерної програми PCS - Size mode v 1.61 та розраховували функцію розподілу фракції МХ за гідродинамічним діаметром.

Згідно отриманого розподілу середній гідродинамічний діаметр МХ складає 680±20 нм (n=6) (рис.1).

Рис. 1. Функція розподілу гідродинамічного діаметру для фракції МХ міометрія (одержано із використанням методу ЛКС).

Са2+-залежне набухання МХ досліджували із використанням методу проточної цитофлуориметрії. Аналіз зразків на проточному цитометрі COULTER EPICS XL™ (Beckman Coulter) з аргоновим лазером (вихідна довжина хвилі, л=488 нм) проводили на основі використання таких параметрів: пряме (мале кутове) світлорозсіювання (forward scatter - FS) та бічне (під кутом 90єС) світлорозсіювання (side scatter - SS), а також одного з показників флуоресценції: FL-1, л=525 нм. Дослідження процесу набухання МХ було розпочато зі створення робочого протоколу [Mattiasson G.-2004]. У протокол уводилось логічне обмеження для реєстрації зразків за прямим та бічним світлорозсіюванням. Аналіз проб припинявся за умов реєстрації 10000 подій в межах логічного обмеження. Вимірювання проводили на середній швидкості потоку.

МХ „фарбували” акридин оранжем 10-N-ноніл бромідом (NAO), 100 нМ, лзбуд.- 488 нм, лфл.- 525 нм. Як відомо, NAO селективно зв’язується з кардіоліпіном МХ незалежно від величини їхнього потенціалу, що дає можливість реєструвати зміни параметру бічного світлорозсіювання саме в МХ [Mileykovkaya E.et.al.,2000; Fernandez G.et.al,2004]. Експерименти проводили при кімнатній температурі та розпочинали внесенням аліквоти фіксованої кількості препарату фракції МХ (25 мкг білка) до середовища інкубації, яке містило: 10 мМ HEPES (рН 7,4), 250 мМ сахарозу. Набухання МХ реєстрували після введення в середовище інкубації 100 мкМ Са2+ у присутності 1 мкМ кальцієвого іонофору А23187. Для тестування максимального набухання використовували аламетицин у концентрації 7,5 мкг/мл. Зразки аналізували за зміною положення піка бічного світлорозсіювання у NAO-“позитивних” частинках. Набухання МХ розраховували за формулою [Mattiasson G. et.al.,2003]: набухання у відсотках = [(a-b)/(a-c)]·100 %, де a – положення піка бічного світлорозсіювання до додавання Са2+, b – положення піка бічного світлорозсіювання після додавання Са2+, c – положення піка бічного світлорозсіювання після додавання аламетицину.

Експериментальні дані було оброблено загальноприйнятими методами кінетичного аналізу та варіаційної статистики. Окрім того, із використанням методів ЛКС та проточної цитофлуориметрії було продемонстровано, що Са2+-залежні ефекти зміни гідродинамічного діаметру та набухання ізольованих МХ є чутливими до дії блокатора неспецифічної пори – ЦсА.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ОБГОВОРЕННЯ

І. Вивчення кінетики та Mg2+-чутливості АТР-залежної акумуляції іонів Са в МХ.

ГМК матки, які обробили розчином дигітоніну, мали здатність накопичувати 1900450 пмоль Са2+/106 клітин за 5 хв. (n=5) при 37оС (рис.2) із середовища інкубації, склад якого наведено у розділі “Методи дослідження”. При цьому накопичення іонів Са максимально пригнічувалося протонофором СССР (1 мкМ) та рутенієвим червоним (10 мкМ). Інгібуючий вплив протонофору СССР на енергозалежну акумуляцію Са2+ у ГМК, які оброблені розчином дигітоніну, був значно ефективнішим, ніж рутенієвого червоного, величини уявних констант інгібування І0,5 становили 5·10-8 М для СССР та 5·10-7 М для рутенієвого червоного (n = 5) (рис.2, криві 1 та 2 відповідно). Ці результати свідчать про наявність у клітинах міометрія чутливої до дії протонофору та рутенієвого червоного системи енергозалежної акумуляції Са2+, яка локалізована у МХ. Втім, протонофор СССР та рутенієвий червоний повністю не пригнічували енергозалежну акумуляцію Са2+ у міоцитах матки. При цьому за своєю величиною резистентна до дії протонофору та рутенієвого червоного компонента включення Са2+ в міоцити була практично однаковою і складала 300-400 пмоль Са2+/106 клітин за 5 хв., тобто 15-20% від значення накопичення Са2+ у відсутності вищевказаних ефекторів (рис.2). Наведені факти свідчать про те, що у внутрішньоклітинних структурах ГМ матки тестується ще одна система Mg2+,АТР- залежної акумуляції Са2+, яка не є чутливою до дії протонофору чи рутенієвого червоного і немає відношення до МХ. Ця система особливо наочно виявляється у присутності Са2+-преципітуючого аніону оксалату (10 мМ), який здатний дуже добре проникати крізь мембрану ретикулума [Костерин C.,1990] та гальмується специфічним інгібітором кальцієвої помпи СР тапсигаргіном (100 нМ) [Бабич Л. и др.,1994], але не є чутливою до дії СССР (1 мкМ) та рутенієвого червоного (10 мкМ) (рис.2).

Рис. 2. Концентраційні залежності впливу різних ефекторів на акумуляцію Са2+ в суспензії клітин міометрія, оброблених розчином дигітоніну (ізотопна техніка – 45Са2+).

1 – дія СССР;

2– дія рутенієвого червоного.

Надалі було проведено порівняльний аналіз динаміки Mg2+,ATP-залежної акумуляції іонів Са у СР та МХ. Слід звернути увагу на такі особливості (рис.3): по-перше, початкова швидкість V0 накопичення іонів Са у МХ у середньому у 7-8 разів перевищує таку, яка є властивою для Са2+-акумулюючої системи СР (1324±174 та 188±47 пмоль Са2+/106 клітин за 1 хв. відповідно; n=5). По-друге, кінетика акумуляції іонів Са у МХ характеризується фазою плато (починаючи з 5-ої хв. інкубації), що відзеркалює наявність стаціонарності трансмембранного кальцієвого обміну у зазначених субклітинних структурах. Втім, кінетика акумуляції іонів Са у СР задовольняє закономірностям реакції нульового порядку (лінійність між кількістю накопиченого Са і часом інкубації).

Рис. 3. Кінетика Mg2+,ATР-залежної акумуляції Са2+ у МХ (1) та СР (2) клітин міометрія (ізотопна техніка - 45Са2+) (M+m; n = 5).

1 – акумуляція Са2+ у присутності тапсигаргіну (100 нМ), але у відсутності рутенієвого червоного та оксалату;

2 – акумуляція Са2+ у відсутності тапсигаргіну, але у присутності рутенієвого червоного (10 мкМ) та оксалату (10 мМ).

Отже, отримані результати свідчать про те, що, у випадку ГМ матки МХ характеризуються значно більшою початковою швидкістю та рівнем акумуляції іонів Са, ніж СР.

Приймаючи до уваги важливу роль іонів Mg у регуляції трансмембранного обміну Са2+ у клітинах [Romani A. et al.,2000] у подальших дослідженнях було вивчено концентраційну залежність впливу цього катіона на Mg2+,ATP-залежну акумуляцію іонів Са у МХ та СР (рис. 4 А та Б). У випадку МХ концентраційна залежність стимулюючого впливу іонів Mg на акумуляцію Са2+ була практично лінійною у діапазоні концентрації Mg2+ до 5 мМ, подальше ж підвищення концентрації цього катіона до 7 мМ практично не призводило до збільшення вмісту накопиченого Са2+. Значення уявної константи активації КMg складає 2,8+0,4 мМ (n=5), насичувальна концентрація Mg2+- 5-7 мМ (рис. 4 А).

Що ж стосується СР, то концентраційна залежність стимулюючого впливу іонів Mg найбільш значно проявлялась у діапазоні концентрації до 1 мМ, подальше ж підвищення концентрації цього катіона до 5 мМ проявляло менш наочний стимулюючий ефект; значення уявної КMg складає 0,6 мМ (рис.4 Б).

Рис. 4. Концентраційна залежність впливу Mg2+ на ATP-залежну акумуляцію Са2+ в МХ (А) та СР (Б) клітин міометрія (ізотопна техніка – 45Са2+).

Як можна бачити (рис.4), зміна концентрації Mg2+ в діапазоні від 0 до 5 мМ індукувала значно більш суттєве збільшення Mg2+,ATP-залежної акумуляції іонів Са в МХ, ніж у СР: дійсно, у першому випадку середня крутизна концентраційної залежності становила 800-900 пмоль Са2+/106 клітин за 5 хв. · мМ, а у другому – лише 120-140 пмоль Са2+/106 клітин за 5 хв.· мМ. Таким чином, дві АТР-залежні Са2+-транспортуючі системи внутрішньоклітинних кальцієвих депо міометрія демонструють наочну Mg2+- залежність, проте у випадку Са2+-уніпортера МХ при підвищенні концентрації Mg2+ від (0 – 5 мМ) стимуляція акумуляції Са2+ була значно більш вираженою, ніж у випадку Са2+-помпи СР.

ІІ. Дослідження закономірностей впливу сперміну на Mg2+,АТР-залежну акумуляцію Са2+ в МХ.

Було вивчено закономірності впливу сперміну на Mg2+,ATP-залежну акумуляцію іонів Са у МХ міометрія. Важливість таких досліджень обумовлена наступним: поліамін спермін є потужним релаксантом міометрія людини, здатен підтримувати механічну напругу матки у стані спокою впродовж вагітності, але механізм його розслаблюючої дії на міоцити не з’ясований [Houlihan D.et. al.,2002].

Показано, що спермін, який був використаний у концентрації 1 мМ, стимулював Mg2+,ATP-залежну нечутливу до дії тапсигаргіну (100 нМ), але чутливу до дії СССР (1 мкМ) акумуляцію іонів Са у МХ клітин міометрія, оброблених розчином дигітоніну (рис.5).

Рис. 5. Вплив сперміну на кінетику Mg2+,АТP-залежного накопичення Са2+ в МХ клітин міометрія (ізотопна техніка – 45Са2+).

1 - контроль;

2 - контроль + 1мМ спермін;

3 - контроль + 1мкМ СССР.

При вивченні впливу сперміну, що був використаний у різних концентраціях (0-10 мМ), на Mg2+,ATP-залежне накопичення іонів Са у МХ клітин міометрія, оброблених розчином дигітоніну, було знайдено, що відповідна концентраційна залежність є складною і описується куполоподібною кривою: її максимум спостерігається при фізіологічній концентрації сперміну 1 мМ.

Рис. 6. Концентраційні залежності впливу сперміну на Mg2+,ATP-залежну акумуляцію Са2+ в МХ та СР клітин міометрія (ізотопна техніка – 45Са2+) (M+m; n = 5).

1 - акумуляція іонів Са у МХ;

2 - акумуляція іонів Са у СР.

Отже, зазначена залежність характеризується фазами активації (концентрація сперміну – до 1 мМ, константа активації Ка = 0,3-0,5 мМ) та інгібування (концентрація сперміну > 1 мМ; константа інгібування Кі = 5,2±0,6 мМ) (рис.6, крива 1). У випадку ж Mg2+,ATP-залежного накопичення Са2+ в СР тестується дуже слабко виражена фаза інгібування транспортного процесу (при концентраціях поліаміну > 1 мМ) (рис.6, крива 2). Отже, у порівняльному аспекті, при використанні одного і того ж самого діапазону концентрації сперміну його гальмуючий вплив на Mg2+,ATP-залежний транспорт Са2+ в МХ був виражений більш суттєво, ніж у СР, при цьому значення уявних констант інгібування Кі були практично однаковими – 5,2±0,6 мМ та 5,7±0,7 мМ відповідно (n=5). Таким чином, у випадку клітин міометрія, при фізіологічній концентрації сперміну (? 1мМ) об’єктом його регуляторної дії є, перш за все, активний транспорт Са2+ в МХ, а не в СР.

Приймаючи до уваги складний концентраційний ефект дії сперміну на Mg2+,ATP-залежне накопичення іонів Са у МХ міометрія (рис.6, крива 1), а також дані літератури [Salvi M.et.al.,2004], було запропоновано, проаналізовано та апробовано у дослідах кінетичну модель комплексної дії сперміну на накопичення Са2+ у цих субклітинних структурах, модель базується на уявленні про існування двох типів центрів зворотного зв’язування сперміну з мембраною МХ – S1 та S2, адсорбція поліаміну на яких зв’язана з активацією (високоафінний центр) та інгібуванням (низькоафінний центр) транспортної активності Са2+-уніпортера відповідно.

При кінетичному аналізі куполоподібної концентраційної залежності впливу сперміну на Mg2+,АТР-залежне накопичення іонів Са у МХ ГМ (рис.6, крива 1) можна ґрунтуватись на схемі (рис. 7), згідно з якою Са2+-уніпортер (F) МХ є „двохвалентним” стосовно молекули сперміну (А). Ця „двохвалентність” має причину саме у наявності двох сайтів зв’язування поліамінів – S1 та S2, які відрізняються афінітетом до нього [Salvi M. et.al.,2004]. Отже, мова йде за наступну сукупність реакцій:

Рис. 7. Кінетична модель біфазного впливу сперміну на Mg2+,АТР-залежну акумуляцію іонів Са в МХ міометрія.

Як можна бачити із схеми (рис.7), припускається, що комплекс „Са2+-уніпортер” FCa забезпечує трансмембранне накопичення іонів Са у МХ у відсутності сперміну у середовищі інкубації (константа швидкості k) (“нульова точка” у випадку рис.6, крива 1). На рівні „моновалентного” (стосовно сперміну) потрійного комплексу уніпортера FAСа (задіяний високоафінний сайт зв’язування сперміну S1) відбувається активація акумуляції Са2+ (константа швидкості k* = гk > k). У той же час „бівалентний” (стосовно сперміну) комплекс уніпортера FA2Са (задіяні як високоафінний, так і низькоафінний сайти зв’язування сперміну S1 та S2) практично не є здатним до транспорту іонів Са.

Із використанням методу кінетичної лінеаризації, застосованого у випадку двох фаз куполоподібної залежності акумуляції іонів Са в МХ міометрія від концентрації сперміну (рис.6, крива 1), вдалося продемонструвати, що вищезазначена кінетична модель (рис.7) добре описує цю залежність. Розроблена модель дії сперміну на транспортування іонів Са МХ міометрія дала можливість обчислити деякі важливі кількісні параметри, які характеризують вплив сперміну на акумуляцію іонів Са в МХ матки. Запропонована модель може бути корисною для подальшого дослідження ролі поліамінів у забезпеченні електро- та фармакомеханічного спряження в ГМ. В цілому ж вищенаведені дані (рис. 5 - 7) вказують на те, що сперміну належить суттєве значення у контролі активності Са2+-уніпортера МХ міометрія.

Згідно літературних даних спермін може модулювати не лише активність Са2+ уніпортера МХ, але й впливати на неспецифічну проникність мітохондріальної мембрани, яка, як вважають, опосередковується чутливою до дії ЦсА порою перехідної проникності МХ [Halestrap A. et al.,2002]. Одна з головних проблем при вивченні МППП - пошук коректного експериментального методу, який дозволяє її тестувати.

Було створено умови для тестування ЦсА-чутливої неспецифічної проникності внутрішньої МХ мембрани (із використанням ізотопної техніки 45Са2+). Важливим також було вивчення закономірностей дії сперміну та ЦсА на Mg2+,ATP-залежну акумуляцію Са2+ у МХ ГМ матки в умовах зміни концентрації іонів Mg у середовищі інкубації. З літератури відомо, що передінкубація МХ у середовищі, яке містить 10 мкМ Са2+, 1-2 мМ фосфат калію, але не містить АТР, призводить до збільшення неспецифічної проникності внутрішньої мітохондріальної мембрани та відкривання МППП [Crompton M.,1999].

Встановлено, що спермін (1 мМ) стимулює Mg2+,ATР-залежну акумуляцію іонів Са у МХ незалежно від того, у якій концентрації Mg2+ був присутній у середовищі інкубації (3 мМ = КMg чи 7 мМ – насичувальна концентрація, де КMg – константа активації за іонами Mg) (рис.8, групи стовпчиків А та Б). У той же час спрямованість дії блокатора МППП ЦсА (5 мкМ) на Mg2+,ATР-залежну акумуляцію Са2+ у МХ залежала від концентрації іонів Mg у середовищі інкубації: за концентрації Mg2+ 3 мМ спостерігався стимулюючий ефект, а за концентрації Mg2+ 7 мМ – інгібуючий (рис.8, групи стовпчиків А та Б).

За умов, які призводять до збільшення неспецифічної проникності МХ мембрани (5-ти хвилинна передінкубація клітин міометрія у середовищі, що не містить АТР [Crompton M.,1999]), спостерігалось значне пригнічення Mg2+,ATР-залежної акумуляції іонів Са у МХ, яка індукувалась наступним додаванням аліквоти розчину нуклеозидтрифосфату (3 мМ) як за відсутності, так і у присутності сперміну (1 мМ) чи ЦсА (5 мкМ) (рис.8, групи стовпчиків В, Г). Ще у значній мірі таке пригнічення спостерігали у випадку, якщо у середовищі передінкубації одночасно були відсутні як АТР, так і Mg2+ (рис.8, групи стовпчиків Д, Є). Як у першому, так і у другому випадках, спрямованість дії сперміну (1 мМ) на акумуляцію іонів Са зберігалась: стимуляція у присутності у середовищі інкубації як 3, так і 7 мМ Mg2+. У випадку ж середовища передінкубації, що не містило АТР, але містило 3 мМ Mg2+ та 1 мМ спермін, відновлення акумуляції іонів Са, що спостерігалось за умов внесення у це середовище на 5 хв. інкубації аліквоти розчину АТР, не досягало контрольного рівня (рис.8, група стовпчиків В). Втім, якщо у такому середовищі містилось 7 мМ Mg2+ та 1 мМ сперміну, відбувалось практично повне (відносно контрольного рівня) відновлення акумуляції іонів Са (рис.8, групи стовпчиків Г та А). У той же час за інших рівних умов таке відновлення не спостерігалось у випадку одночасної відсутності у середовищі передінкубації як АТР, так і Mg2+ (рис.8, групи стовпчиків Д та Є).

Рис. 8. Вплив сперміну (1 мМ) та ЦсА (5 мкМ) на Mg2+,ATР-залежну акумуляцію Са2+ в МХ клітин міометрія, за різних концентрацій іонів Mg (3 та 7 мМ) (ізотопна техніка – 45Са2+) (M+m; n = 6).

Групи стовпчиків: А, В, Д – 3 мМ Mg2+; Б, Г, Є – 7 мМ Mg2+; В, Г – середовище передінкубації (час - 5 хв.) містило Mg2+, але не містило АТР (транспортний процес ініціювали аліквотою розчину АТР (3 мМ)); Д та Є - середовище передінкубації (час - 5 хв.) не містило як Mg2+, так і АТР одночасно (транспортний процес ініціювався внесенням аліквоти розчину, яке містило АТР та Mg2+, кінцева концентрація цих реагентів – 3 мМ). У випадку груп стовпчиків А та Б передінкубація не мала місця. У випадку стовпчиків В-Є спермін та ЦсА були присутні безпосередньо у середовищі передінкубації (час - 5 хв.) та у середовищі інкубації.

Отже, спермін у фізіологічних концентраціях (? 1 мМ) є ефективним активатором Mg2+,ATР-залежної акумуляції іонів Са в МХ (але не в СР!) міометрія. У дослідах, проведених із використанням ізотопної техніки (45Са2+), нам вдалося ідентифікувати чутливе до дії ЦсА накопичення іонів Са у МХ міометрія.

ІІІ. Вивчення дії сперміну на Са2+-залежну ЦсА-чутливу мітохондріальну пору перехідної проникності.

Протягом останніх років у багатьох роботах було показано, що, за певних умов, у мембранах МХ вікривається особлива пора – так звана мітохондріальна пора перехідної проникності (МППП), яка є чутливою до дії ЦсА, і крізь яку відбувається не тільки масивний викид Са2+, а й вивільнення інших речовин, що може призводити до загибелі клітини [Gottlieb R. et.al.,2002;Borutaite V. et.al.,2003; Halestrap А.,2004]. Відомо, що відкривання МППП супроводжується розсіюванням електричного потенціалу на мембрані МХ та високоамплітудним набуханням органел [Kanno M. et.al.,2002]. Наші дослідження були спрямовані на вивчення процесу набухання ізольованих МХ міометрія із використанням методу лазерної-кореляційної спектроскопії (ЛКС) (вимірювання гідродинамічного діаметру МХ).

Як продемонстровано на рис.9, передінкубація МХ з 100 мкМ Са2+ та Са2+-іонофором А23187 (1 мкМ) призводить до збільшення гідродинамічного діаметру МХ міометрія майже на 30 % (n=5). За умов передінкубації препарату МХ з 5 мкМ ЦсА наступне додавання Са2+ не призводило до збільшення гідродинамічного діаметру МХ міометрія (рис.9). Отже, метод ЛКС дає змогу тестувати чутливу до дії ЦсА зміну гідродинамічного діаметру ізольованих МХ міометрія.

Рис. 9. Са2+-залежна зміна середнього гідродинамічного діаметру МХ міометрія (метод ЛКС) (М ± m, n=5).

1 – контроль;

2 – передінкубація з Са2+ (100 мкМ) та Са2+ - іонофором А23187 (1 мкМ);

3 – передінкубація з ЦсА (5 мкМ) та внесення Са2+(100 мкМ) з А23187 (1 мкМ).

Рис. 10. Са2+-залежне набухання МХ міометрія (метод проточної цитофлуориметрії, флуоресцентний зонд - акридин оранж 10-N-ноніл бромід (NAO)) (М ± m, n=15).

1 – передінкубація без Са2+;

2 – передінкубація з Са2+ (100 мкМ), у присутності А23187 (1 мкМ);

3 – аламетицин (7,5 мкг/мл);

4 – ЦсА (5 мкМ) + АDP (40 мкМ) + Са2+ (100 мкМ) у присутності А23187 (1 мкМ).

Останнім часом для дослідження різних аспектів метаболізму МХ досить широко використовується метод проточної цитофлуориметрії [Lecoeur H. et.al.,2004]. Отримані експериментальні дані показали, що набухання МХ у відповідь на додавання Са2+ (100 мкМ) у присутності А23187 (1 мкМ) складало 86±4 % (n=15) у порівнянні з максимальним (за умов присутності у середовищі інкубації аламетицину у концентрації 7,5 мкг/мл). Передінкубація препарату МХ з 5 мкМ ЦсА разом з 40 мкМ АDP (максимальне інгібування Са2+- чутливої МППП) [Hansson M.et.al.,2004]), в умовах додавання