АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА “ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ”

ПАВЛОВ СЕРГІЙ ВАСИЛЬОВИЧ

УДК 615.31:547.856.1].03: 615.214.31]]: 001.891.5

ЦЕРЕБРОПРОТЕКТИВНА АКТИВНІСТЬ ПОХІДНИХ (4-ОКСО-4-Н-ХІНАЗОЛІН-3-ІЛ) - АЛКІЛ (АРИЛ) КАРБОНОВИХ КИСЛОТ В УМОВАХ ІМОБІЛІЗАЦІЙНОГО СТРЕСУ

(ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ)

14.03.05 фармакологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ- 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Запорізькому державному медичному університеті МОЗ України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Бєленічев Ігор Федорович, Запорізький державний медичний університет, завідувач кафедри фармакології та медичної рецептури.

Офіційні опоненти: заслужений діяч науки і техніки, доктор медичних наук,

професор Громов Леонід Олександрович, Державна установа “Інститут

фармакології та токсикології АМН України”, завідувач

відділу нейрофармакології;

доктор медичних наук, професор Степанюк Георгій

Іванович, Вінницький Національний медичний університет

ім. М.І. Пирогова МОЗ України, завідувач кафедри

фармакології з курсом клінічної фармакології.

Провідна установа: Харківський державний медичний університет МОЗ України, кафедра фармакології.

Захист відбудеться “19” грудня 2007 року о 1300годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Державній установі “Інституті фармакології та токсикології АМН України” за адресою: 03057, м. Київ, вул. Є. Потґє 14.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Державної установи “Інституту фармакології та токсикології АМН України” за адресою: 03057, м. Київ, вул. Є. Потґє, 14.

Автореферат розісланий “17” грудня 2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради, Д 26.550.01

кандидат біологічних наук І.В. Данова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Зменшення тривалості, а також якості життя людини безпосередньо пов'язане із збільшенням числа нейродеструктивних захворювань, у патогенезі яких полягає стрес. У зв'язку з цим одніим з найважливіших завдань експериментальної та клінічної медицини є вивчення механізмів розвитку емоційного стресу та можливостей його фармакологічної корекції [Ф.З. Меерсон, 1981; В.Г. Передерій та ін., 2003].

Відомо, що однією з ланок патогенезу емоційного стресу є гіперпродукція активних форм кисню (АФК) біоенергетичними та нейрохімічними системами головного мозку [Ф.З. Меерсон, 1981; P.H Evans, 1997; К.В. Судаков, 1997]. Надлишок АФК в умовах антиоксидантної недостатності призводить до окисної модифікації ліпідів, білків та нуклеїнових кислот. Окисна модифікація білкових фрагментів рецепторів, іонних каналів, синаптичних структур нейрона призводить до порушення генерації, утворення, провідності нервового імпульсу, порушує синаптичну передачу і, як наслідок, призводить до погіршення когнітивно-мнестичних функцій головного мозку [А.А. Болдырев и др., 1996;
J. Noraberg et al.,1999; І.Ф. Бєленічев та ін., 2002; Ю.І. Губський та ін., 2004; Л.А. Громов, 2006; А.К. Ярош, 2006].

Вищенаведене є обґрунтуванням застосування як антиоксидантів, так і церебропротекторів з вираженою антиоксидантною активністю для профілактики та терапії негативних наслідків емоційного стресу.

У теперішній час в лікуванні захворювань ЦНС знайшли застосування такі антиоксидантні препарати, як тіотриазолін, тіоцетам, емоксипін, мексидол, неоселен, троллокс, мелаксен та інші [Л.О. Громов, 2000; Т.А. Воронина, 2001; І.Ф. Бєленічев, 2002; І.А. Мазур, 2007; І.С. Чекман, 2007]. Однак дані препарати не завжди відповідають сучасним вимогам (необхідність великих доз, недостатня церебропротективна активність). Крім того, сучасні антиоксиданти - церебропротектори мають ряд побічних ефектів при тривалому застосуванні (нудота, помірне підвищення артеріального тиску, шкірний висип) [Н.А. Горчакова, 2002; Р.У. Островская и др., 2003; А.В. Косалапов и др., 2003]. В зв’язку з цим необхідний подальший пошук нових церебропротекторів з антиоксидантним механізмом дії для корекції стресорних пошкоджень головного мозку.

Останнім часом посилено ведеться пошук нових, високоефективних церебропротекторів з антиоксидантним механізмом дії серед похідних хіназоліну [І.Ф Бєленічев., 2002; В.В. Дунаєв та ін., 2004; І.А. Мазур та ін., 2006]. Крім цього, для лікування нейродеструктивних захворювань знайшли своє застосування нейропептиди та їх фрагменти (семакс), а також дипептиди, які імітують структуру пептидних церебропротекторів або специфічних сайтів нейрональних рецепторів (ноопент, дилепт) [А.К. Ярош, 2002; Т.А. Воронина, 2002; Е.И. Гусев, 2003; О.В. Долотов и др., 2003; Э.Р. Сафронова и др., 2003].

У зв'язку з цим, одним з перспективних напрямків створення церебропротекторів є дизайн молекули хіназоліна шляхом введення в його структуру діпептидних фрагментів та одержання нових, раніше невідомих біологічно активних речовин із заздалегідь прогнозованими церебропротекторними та антиоксидантними властивостями (за програмою PASS), з подальшою оцінкою їх активності у дослідах in vitro і в умовах моделювання імобілізаційного стресу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами: Представлена дисертаційна робота виконана як фрагмент планової науково-дослідної роботи кафедр фармакології та фармацевтичної хімії Запорізького державного медичного університету "Цілеспрямований пошук біологічно активних речовин у ряді п'яти- та шестичленних азагетероциклів та створення на їх основі лікарських препаратів" № держ. реєстрації 0102 U 002863; шифр IH 15.00.02.01.

Мета роботи: На основі дослідження церебропротективної і антиоксидантної активності похідних (4-оксо-4Н-хиназолін-3-іл)-алкіл (арил) карбонових кислот встановити їх ефективність в умовах моделювання імобілізаційного стресу.

Для досягнення вказаної мети були поставлені наступні завдання:

1. Провести дослідження антиоксидантної, антирадикальної та анти-
амнестичної активності 36 похідних (4-оксо-4Н-хиназолін-3-іл)-алкіл (арил) карбонових кислот, відібраних по програмі PASS, у дослідах in vitro, in vivo. Виявити закономірність “структура - дія”.

2. Речовини, що мають високу антиоксидантну і церебропротективну активність в дослідах in vitro, in vivo і переважають за силою дії фармакологічні стандарти (тіотриазолін, емоксипін, ноофен, семакс), дослідити за умов імобілізаційного стресу.

3. Вивчити патобіохімічні зміни (рівень активності СОД, каталази, окисна модифікація білка (альдегідфенілгідразони, кетонфенілгідразони), ступінь фрагментації білкової молекули, концентрацію стабільних метаболітів NO, а також активність NO- синтази) у тканинах головного мозку, що розвиваються при моделюванні гострого імобілізаційного стресу (ГІС), а також вплив на дані зміни досліджуваних сполук (відібраних у дослідах in vitro, in vivo). Провести оцінку показників когнітивного дефіциту (за орієнтовно-дослідницькою діяльністю, умовною реакцією пасивного уникнення -УРПУ).

4. Дослідити ймовірний механізм церебропротективної дії найбільш активних сполук на моделі хронічного імобілізаційного стресу (ХІС). Вивчити дію даних сполук на показники антиоксидантної системи (рівень активності СОД, каталази, окисна модифікація білків, нуклеїнових кислот, концентрація стабільних метаболітів NO, рівень активності NO- синтази), вуглеводно - енергетичний обмін (АТФ, АДФ, АМФ); активність ГАМК-ергичної системи та рівень сполучених з нею гальмівних амінокислот (ГАМК, глутамата, глутаматдекарбоксилази, ГАМК-трансамінази).

5. Вивчити вплив досліджуваних сполук в умовах ХІС на морфофунк-
ціональний стан нейронів CA1- зони гіпокампа, а також на експресію в даній зоні генів раннього реагування c-fos та антиапоптичного білку bcl-2.

Об'єкт дослідження – похідні (4-оксо-4Н-хіназолін-3-іл)-алкіл (арил) карбонових кислот, головний мозок, плазма крові щурів лінії Вістар, підданих гострому та хронічному імобілізаційному стресу.

Предмет дослідження – Профілактична та лікувальна ефективність і механізм дії похідних (4-оксо-4Н-хіназолін-3-іл) -алкіл (арил) карбонових кислот в умовах імобілізаційного стресу.

Методи дослідження. У роботі використані фармакологічні, біохімічні, токсикологічні, цитологічні, гістоімунохімічні та математичні методи дослідження.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше запропонована стратегія створення церебропротекторів, яка заснована на дизайні молекули хіназоліна шляхом введення в його структуру дипептидних фрагментів і пептидергічних структур. Отримані дані про антиоксидантну та антирадикальну активність 36 сполук похідних (4-оксо-4Н-хіназолін-3-іл)-алкіл (арил) карбонових кислот. Дослідами in vitro встановлено, що 5 сполук на моделях ферментативного та неферментативного ініціювання СРО за здатністю інгібіювати утворення супероксидрадикалу, монооксида азоту й гальмування процесів окисної модифікації білків (ОМБ) перевищують референс-препарати (тіотриазолін, емоксипін, семакс, N-АЦЦ).

Розширені уявлення та розкриті основні механізми розвитку когнітивного дефіциту в умовах імобілізаційного стресу. Вказана роль окисного пошкодження білків, нуклеїнових кислот, зміни активності ГАМК-ергичної системи, експресії генів раннього реагування в розвитку даних порушень.

Вперше на моделі імобілізаційного стресу вивчена антиоксидантна та церебропротективна активність похідних (4-оксо-4Н-хіназолін-3-іл)-алкіл (арил) карбонових кислот. Встановлено, що в механізмі церебропротективної дії похідних (4-оксо-4Н-хіназолін-3-ил)-алкіл (арил) карбонових кислот основне місце займає їх здатність позитивно впливати на компоненти антиоксидантного захисту (каталаза, супероксиддисмутаза), знижувати ступінь окисної модифікації білків у тканинах головного мозку, гальмувати утворення стабільних метаболітів NO. Вказані похідні здатні знижувати явища енергодефіциту за рахунок інтенсифікації енергетично більш вигідного окислювання в циклі Кребса, а також зменшувати витрати інтермедіатів ГАМК - шунта в енергообміні нейрональної клітини. Вперше показано, що церебропротективний ефект найбільш активної сполуки (4-[4-оксо-3(4Н)-хіназолін] бензойної кислоти) (ПК66) пов'язаний з її здатністю знижувати гіперекспресію генів раннього реагування-c-fos та підвищувати концентрацію антиапоптичного білку - bcl-2- в зоні CA1-гіпокампа, тим самим впливаючи на такі відстрочені механізми загибелі нейронів, як апоптоз.

Практичне значення одержаних результатів. У результаті проведених експериментальних досліджень виділена сполука 4-[оксо-3(4Н)-хіназолін] бензойної кислоти (ПК 66), що проявляє виражену антиоксидантну та церебропротективну активність в умовах імобілізаційного стресу і перевищує за силою дії відомі референc – препарати (тіотриазолін, емоксипін, ноофен, семакс).

Отримано 3 деклараційних патенти України на винаходи:
Патент № 17279 (Україна); МПК GO1 № 33/52. – (UA) № 2006035001 Спосіб визначення вмісту 8 – гідроксигуаніну в сечі як маркеру пошкодження нуклеїнових кислот. Патент № 13132 (Україна); МПК GO1 № 33/48. – (UA) № 200509119 Спосіб визначення активності ферменту NO- синтази в гомогенатах тканин. Патент № 13165 (Україна) МПК GO1 № 33/48. – (UA) № 200509264 Спосіб визначення вмісту L-аргініну у біологічному матеріалі.

Результати дисертаційної роботи впроваджені у наукові дослідження та учбовий процес кафедр фармакології Запорізького державного медичного університету, Дніпропетровської державної медичної академії, Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького, Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгіївського.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно проведено патентно-інформаційний пошук, аналіз наукової літератури за даною темою, визначені мета та завдання дослідження. Самостійно проведено пошук речовин з антиоксидантною активністю серед 36 сполук похідних (4-оксо-4Н-хіназолін-3-іл)-алкіл (арил) карбонових кислот, синтезованих під керівництвом професора Коваленко С.І. на кафедрі фармацевтичної хімії Запорізького державного медичного університету, у дослідах in vitro. Автором особисто проведені всі експериментальні дослідження, статистична обробка, аналіз та узагальнення результатів досліджень, сформульовані основні положення та висновки дисертації.

Гістоімунохімічні та морфологічні дослідження нейронів CA1 зони гіпокампу були виконані за консультативною допомогою завідувача ЦНДЛ, професора Абрамова А.В.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи доповідалися й обговорювалися на 66-й науковій конференції студентів і молодих учених з міжнародною участю “Досягнення сучасної медицини”
(м. Львів, 2005); VI Національному з'їзді фармацевтів України (м. Харків, 2005); V Міжнародній науково-практичній конференції “Актуальні проблеми токсикології. Безпека життєдіяльності людини” (м. Київ, 2005); II конференції молодих учених “Актуальні проблеми фармакології та токсикології” (м. Київ, 2005); 78-й науково-практичній конференції студентів і молодих учених “Теоретичні
й практичні аспекти сучасної медицини” (м. Сімферополь, 2006); XVII з'їзді Українського фізіологічного товариства з міжнародною участю (м. Чернівці, 2006); міжнародній науково-практичній конференції “Біологічне окислювання в нормі та у патології” (м. Тернопіль, 2006); на III Національному з'їзді фармакологів України “Фармакологія 2006- крок у майбутнє” (м. Одеса, 2006), на III з’їзді фармакологів Росії “Фармакология – практическому здравоохранению” (С. – Петербург, 2007)

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 23 роботи, з них 11 статей, 3 деклараційних патенти та 9 тез у матеріалах з'їздів, конгресів, науково-практичних конференцій різних рівнів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 223 сторінках машинопису і складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, двох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків та списку літератури, який містить 227 літературних джерел; з них 53 – вітчизняних та 174 – зарубіжних авторів. Робота проілюстрована 33 таблицями та 11 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Наукова стратегія пошуку біологічно активних сполук, у тому числі і церебропротекторів, на сьогодні базується на ряді пріоритетних напрямків, серед яких комп’ютерні технології, генна інженерія, медична і комбінаторна хімія, молекулярне моделювання, високоефективний тотальний скринінг та інші [В.В. Поройков, 1999; М.Я. Головенко, 2001; Суйков та ін., 2001].

Враховуючи це, нами спільно з групою синтетиків (керівник-професор кафедри фармхімії ЗДМУ, д. фарм. н. С.І. Коваленко) була сформована віртуальна бібліотека, систематизована за допомогою пакета ISIS 2.4. Для обробки бібліотеки та відбору структур - лідерів використовувалася комп'ютерна програма PASS C&T (Prediction of Activity for Substanses: Complex and Training). Біологічну активність по програмі PASS C&T оцінювали якісним образом (так/немає). У результаті прогнозу, крім виявленої активності, проводилася ймовірність кожного виду дії (розмірність від 0 до 1). Крім того, враховувалися фармакологічні види активності, імовірність яких перевищувала 50% (Pa › 0,500).

З огляду на ту обставину, що в патогенезі стресу лежить гіперпродукція АФК, які здатні викликати незворотні порушення у нейроімуноендокринних взаємодіях, що в остаточному підсумку приводить до розвитку когнітивного дефіциту, нами проведені дослідження похідних (4-оксо-4Н-хиназолин-3-ил)-алкіл (арил) карбонових кислот, відібраних по програмі PASS у дослідах in vitro (антиоксидантна та антирадикальна активності) та in vivo (антиамнестична активність).

В основі різноманітних методів in vitro закладений механізм ініціювання СРО. Дані методи дозволяють провести відсівання значної кількості речовин і відібрати сполуки - кандидати з високою антиоксидантною (АОА) і антирадикальною (АРА) активністю [Ю.І Губський та ін., 2001]. Досліди in vivo дозволять нам виділити сполуки - кандидати, які володіють одночасно високою антиоксидантною і ноотропною активністю.

Відібрані нами сполуки - кандидати, в подальшому оцінювалися в умовах моделювання гострого імобілізаційного стресу (ГІС) за впливом на процеси ВРО, стан АО- системи в тканинах головного мозку, здатності тварин до запам'ятовування та навчання. Речовини на моделі ГІС порівнювалися з такими фармакологічними стандартами, як емоксипін, тіотриазолін, ноофен, семакс.

Найбільш активна речовина (сполука - лідер) досліджувалася на моделі хронічного імобілізаційного стресу. Враховувалася її здатність впливати на інтенсивність процесів ВРО, активацію антиоксидантної системи, нормалізацію показників вуглеводно - енергетичного обміну, стан ГАМК- ергічної системи, експресію генів раннього реагування, вплив на морфофункціональний стан нейронів CA1 зони гіпокампа в порівнянні з найбільш активним фармакологічним стандартом.

Оцінку антиоксидантної та антирадикальної активності нових синтезованих сполук проводили в дослідах in vitro методами ферментативного та неферментативного ініціювання ВРО, за здатністю сполук інгібіювати утворення активних форм кисню - супероксидрадикалу та монооксиду азоту, а також за їх впливом на гальмування окисної модифікації білків (ОМБ).

Ферментативне ініціювання проводили шляхом додавання надлишку НАДФ Н2 до гомогенату тканин мозку білих щурів. АОА оцінювали за рівнем зниження кінцевого продукту ВРО - МДА в гомогенатах [Ю.І. Губський та ін., 2001]. Неферментативне ініціювання моделювали шляхом додавання солей двовалентного заліза до суспензії ліпопротеїдів курячого яйця [И.Ф. Беленичев, 1995; Ю.І. Губський та ін., 2001]. Антирадикальну активність сполук за інгібіюванням супероксидрадикалу виявляли в реакції аутоокислення адреналіну в аденохром у лужному середовищі [Ю.І. Губський та ін., 2001]. Індукцію монооксиду азоту здійснювали опроміненням водних розчинів нітропрусиду натрію (10мм) та аскорбінової кислоти (40 мм) світлом від джерела потужністю 300 ВТ з довжиною хвилі 425 нм. Антирадикальну активність сполук по інгібіюванню монооксиду азота тестували за ступенем гальмування окислення аскорбінової кислоти, вимірюючи оптичну щільність при 265 нм, та виражали у відсотках інгібіювання окислення аскорбату [Ю.І. Губський та ін., 2001].

Вплив досліджуваних сполук на процеси ОМБ здійснювали за методом, що ґрунтується на реакції взаємодії окислених амінокислотних залишків з 2,4- дінитрофенілгідразіном з утворенням альдегідних та карбоксильних груп
[B. Halliwell, 1999].

Антиамнестичну активність синтезованих сполук оцінювали за збереженням у щурів аверсивного стимулу в тесті умовної реакції пасивного уникнення (УРПУ) [Я. Буреш и др., 1991; М.Я. Головенко, 2002].

Експерементальні досліди виконано на 600 статевозрілих білих щурах - самцях масою 200-250 гр. Щури отримані з розплідника ІФТ АМН України. Тварини утримувалися на стандартному раціоні харчування віварію при природній зміні дня та ночі. Всі експериментальні процедури здійснювали відповідно до “Положення про використання тварин у біомедичних дослідженнях”
[Ю.М. Кожемякін та ін., 2002].

Найбільш придатними для вивчення стреспротективної дії фармакологічних засобів є класична модель відтворення гострого імобілізаційного стресу (ГІС), що характеризується помірною інтенсивністю стресогенного впливу, а також відповідає умовам гуманного відношення до лабораторних тварин та їхнього використання в експерименті [О.В. Стефанов, 2002]. Модель хронічного імобілізаційного стресу нами була використана на завершальному етапі розширеного дослідження сполуки - лідера.

Перед моделюванням стресу застосовували харчову депривацію, не обмежуючи тварин у воді. Експерименти проводили з урахуванням циркадних біоритмів. При відтворенні хронічного стресу, щоденний вплив подразника припадав на певний час доби.

ГІС викликали атравматичною фіксацією на спині. Тривалість імобілізації – 3 години. Дослідження поведінкових реакцій у стресованих тварин (орієнтовно-дослідницька діяльність, УРПУ) проводили через 3 години після завершення дії стресорного фактора. Після дослідження поведінкових реакцій, щурів виводили з експерименту декапітацією під тіопенталовим наркозом (40 мг/кг). У тварин виділяли головний мозок для біохімічних, гістоімунохімічних і морфометричних досліджень.

ХІС відтворювали протягом 18 діб. Щоденна тривалість впливу подразника (фіксація на спині) – 3 години. Стадія тривоги при ХІС має місце в перші 4 доби, з 5 по 14-ту добу реєструються стадія резистентності, після 15 доби – стадія виснаження. На 18 добу стресування проводили дослідження стреспротективної дії препаратів [О.В. Стефанов, 2002].

Для біохімічних досліджень тканини гомогенізувалися в сольовому ізотонічному розчині (0,15М KCL) при охолодженні (до +40С) за допомогою скляного гомогенізатора в співвідношенні 1:40. Після виділення ядер і незруйнованих клітин (1000g) методом диференційного центрифугування (15000g) виділялася цитозольна фракція [М.И. Прохорова, 1982].

Для оцінки інтенсивності вільнорадикального окиснення в тканинах головного мозку визначали ступінь ОМБ за вмістом альдегідфенілгідразонів (АФГ), кетонфенілгідразонів (КФГ), окисну модифікацію ДНК за накопиченням 8-OHG у сечі [B. Halliwell, 1999; Ю.М. Колесник и др., 2006). Стан антиоксидантної системи оцінювали за активністю супероксиддисмутази (СОД), каталази (КАТ) та рівнем б - токоферолу в тканинах головного мозку [А.Р. Гаврилова, 1986; М.А. Королюк и др., 1987; I.M. Rapola, 1988]. Цикл оксиду азоту вивчали за вмістом стабільних метаболітів оксиду азоту по Грісу, за рівнем активності NO-синтази та за концентрацією L-аргініну в тканинах головного мозку
[Н.В. Горбунов, 1995; Ю.М. Колесник та ін., 2006]. Стан вуглеводно-енергетичного обміну та окислення в циклі Кребса визначали за рівнем аденилових нуклеотидів, лактату, малату, ізоцітрату, активності сукцінатдегідрогенази та цитохромоксидази [В.В. Зинчук, 1999; М.И. Прохорова, 1982]. ГАМК-ергічну систему вивчали за концентрацією гліціну, ГАМК, глутамату. Крім того досліджували рівень активності глутаматдекорбоксилази (ГДК), ГАМК-трансамінази (ГАМК-Т) [В.В. Зинчук, 1999; М.И. Прохорова, 1982].

На моделі імобілізаційного стресу досліджувалися такі препарати: тіотриазолін (АТ “Галичфарм”, Україна) - 50 мг/кг [И.А. Мазур и др., 2005], емоксипін (АТ “Таллінський фармацевтичний завод”, Естонська Республіка) - 100 мг/кг [Т.А. Воронина и др., 2000; Р.В. Луценко, 2001], ноофен (Олайнський хіміко-фармацевтичний завод, Латвія) - 250 мг/кг [Р.У. Островская и др., 2003], семакс (Інститут молекулярної генетики, Росія) - 300 мг/кг [Е.И. Гусев, 2001, 2003; В.С. Кудрин и др.,2003], досліджувані сполуки (ПК 37, ПК 32, ПК 53, ПК 51, ПК 66) - похідні (4-оксо-4-н-хіназолін-3-іл)-алкіл (арил) карбонових кислот – 10 мг/кг , синтезованих на кафедрі фармацевтичної хімії Запорізького державного медичного університету (д. фарм. н., професор С.І. Коваленко). Препарати та досліджувані сполуки вводили щурам per os одноразово за 3 години до стресу або через 3 годин. У дослідах in vitro синтезовані сполуки вводили в систему в кількості, кратній їх молекулярним масам.

Когнітивно - мнестичний дефіцит у стресованих щурів визначали за здатністю тварин до навчання та запам'ятовування аверсивного стимулу в тесті УРПУ та за орієнтовно-дослідницькою поведінкою в тесті “відкрите поле” [Ю.В. Буров, 1987; Я. Буреш и др., 1987; М.Я. Головенко, 2002].

Морфологічні та гістохімічні дослідження проводилися на кафедрі патофізіології Запорізького державного медичного університету (завідувач, д. мед. н., професор Ю.М. Колесник) при консультативній допомозі д. мед. н., професора А.В. Абрамова. Тканини головного мозку експериментальних тварин поміщали на 1 добу у фіксатор Буена та після стандартної гістологічної проводки тканину парафінували [Э. Пирс, 1962]. Для вивчення морфології нейронів на ротаційному мікротомі виготовляли 5 - мікронні зрізи нейронів зони CA1 гіпокампу, які депарафінували та фарбували для визначення вмісту нуклеїнових кислот галоціанін - хромовим галуном по Ейнарсону [Э. Пирс, 1962]. Гени раннього реагування c-fos та антиапоптичний білок bcl-2 визначали гістоімунохімічно в CA1-зоні гіпокампу. Для цього виготовляли 15 - мікронні зрізи, які депарафінували за стандартної методикою. На зрізи наносили первинну антисиворотку до білка c-fos та bcl-2, після чого наносили вторинні антитіла (флюоресцент коньюгований Ig G). Морфометричні та гістоімунохімічні дослідження проводили на мікроскопі Axioskop (Ziess, Німеччина). Зображення нейронів в області CA1 гіпокампа, а також флюоресценцію fos- та bcl-2- позитивних нейронів, одержаних на мікроскопі, за допомогою високочутливої відеокамери COHU-4992 (COHU Inc., США) вводили в комп'ютерну програмно-апаратну систему цифрового зображення DIAS [Y.M. Kolesnik et al., 2002].

Отримані результати піддавали статистичній обробці згідно з методом варіаційної статистики з використанням t-критерію Ст'юдента та за допомогою програми "Biostat"і MS Excell. Вірогідність від’ємностей відносних величин оцінювали із застосуванням критерію ч2. [С.Н. Лапач и др., 2002].

Результати досліджень та їх обговорення.

Дослідження антиоксидантної та антирадикальної активності проводили серед 36 похідних (4-оксо-4Н-хіназолін-3-іл)-алкіл (арил) карбонових кислот, що включають анеліди (6-R-4-оксо-4Н-хіназолін-3-іл) оцтової кислоти (20 сполук); аміди (6-R-4-оксо-4Н-хіназолін-3-іл) оцтової кислоти (13 сполук); 3-карбоксифеніл-4(3Н)- хіназолін (3 сполуки) (рис. 1).

Фармакологічним скринінгом антиоксидантної та антирадикальної активності в дослідах in vitro серед 36 похідних (4-оксо-4Н-хіназолін-3-іл)-алкіл (арил) карбонових кислот були виділені 5 сполук, що проявляють найбільш високу АОА та АРА: ПК 53 (м-хлоранілід 2-[4-оксо-3(4Н)-хіназолін] оцтової кислоти); ПК 51 (м-трифторметиланилід 2-[4-оксо-3(4Н)-хиназолін]оцтової кислоти); ПК 37 (сульфаніламід 2-[4-оксо-3(4Н)-хіназолін] оцтової кислоти); ПК 32 (n-етоксикарбоанілід 2-[6-нітро-4-оксо-3(4Н)-хіназолін] оцтової кислоти); ПК 66 (4-[оксо-3(4Н)-хіназолін] бензойні кислоти) і перевищують за силою дії (p ? 0,05) референс – препарати (табл. 1). Крім того, вивчення антиамнестичної активності досліджуваних похідних у дослідах in vivo показали, що сполуки ПК53, ПК51, ПК37, ПК32, ПК66 у дозі 10 мг/кг проявляють високу антиамнестичну активність (табл. 2). П'ять сполук - лідерів були відібрані для подальшого дослідження на моделі ГІС.

Вивчення гострої токсичності показало, що досліджувані сполуки – ПК53, ПК51, ПК37, ПК32, ПК 66 – відносяться згідно з класифікацією К.К. Сидорова, до малотоксичних сполук, так як їх ЛД50 при пероральному введенні перебуває в межах 501-5000 мг/кг.

Рис. 1 Хімічна структура похідних (4-оксо-4Н-хіназолін-3-іл)-алкіл (арил)
карбонових кислот.

R-H2, -NO2; R1-F, -Cl, -Br, -NO2, -OCH2, -COOH.

Результати аналізу взаємозв'язку структури досліджуваних сполук та біологічної активності дозволяють стверджувати, що АОА та АРА визначається природою замісника, а також його положенням в арильній субституенті, а також залежать від їх гідрофільності.

Таблиця 1

Антиоксидантна та антирадикальна активність похідних (4-оксо-4Н-хіназолін-3-іл)-алкіл (арил) карбонових кислот в дослідах in vitro

Шифр

сполук | Антиоксидантна активність | Антирадикальна активність

Неферментативне ініціювання ВРО

МДА, мкмоль/л | Ферментативне ініціювання ВРО

МДА, мкмоль/л | Інгібіювання супер-
оксидрадикалу

Оптична щільність

Інтакт | 0,03±0,002 | 0,07±0,003 | -

Контроль | 0,65±0,003 | 0,61±0,002 | 0,52±0,006

ПК 53 | 0,12±0,002* є?* | 0,18±0,002* є? * | 0,2±0,001* є?*

ПК 51 | 0,11±0,004* є?* | 0,19±0,003* є?* | 0,24±0,002* є?*

ПК 37 | 0,1±0,003*є?* | 0,07±0,001* є?* | 0,15±0,003* є?*

ПК 32 | 0,18±0,004* є?* | 0,11±0,002* є?* | 0,1±0,02* є?*

продовж. табл. 1

ПК 66 | 0,03±0,001* є?* | 0,08±0,02* є?* | 0,1±0,003* є?*

Тіотриазолін | 0,21±0,004* | 0,3±0,004* | 0,3±0,001*

Емоксипін | 0,20±0,002* | 0,25±0,001* | 0,27±0,002*

Тіосечовина | 0,22±0,003* | 0,21±0,002* | 0,26±0,001*

Примітки: 1. *- р 0,05 відносно контролю;

2. є - р 0,05 відносно тіотриазоліна;

3. ? - p 0,05 відносно емоксипіна;

4. * - p 0,05 відносно тіосечовини.

Таблиця 2

Антиамнестична активність похідних (4-оксо-4Н-хіназолін-3-іл)-алкіл (арил) карбонових кислот

Шифр сполук | Латентний період рефлексу при відтворенні УРПП, сек

Контроль без амнезії | 195,6±12,6

Контроль з амнезією (атропін 40 мг/кг) | 3,4±0,63

ПК 53 (10 мг/кг) | 177,8±5,6* є ?

ПК 51 (10 мг/кг) | 170±5,4* є ?

ПК 37 (10 мг/кг) | 187,6±6,4* є ?

ПК 32 (10 мг/кг) | 197,3±3,4* є ?

ПК 66 (10 мг/кг) | 286±3,3* є ? #

Ноофен (250 мг/кг) | 100±7,9*

Тіотриазолін (100 мг/кг) | 81±3,8*

Семакс (300 мг/кг) | 234±4,6* є

Примітки: 1. *- р 0,05 відносно контролю з амнезією;

2. є - р 0,05 відносно, тіотриазоліну;

3. ? - р 0,05 відносно ноофена;

4. # - p ? 0,05 відносно семакса.

Для визначення ефективної дози нами було досліджено вплив доз кратних LD50 (1/10; 1/20; 1/200; 1/2000) на відтворення умовного рефлексу пасивного побігання у тесті УРПУ (інтегративний показник церебропротективної активності досліджуваних сполук в умовах стресу) через 1 добу після моделювання імобілізаційного стресу. Дослідження показали, що найбільш ефективною дозою є 1/200 LD50 (10 мг/кг).

Курсове призначення досліджуваних сполук і референс - препаратів тваринам з ГІС призводило до зниження гіперпродукції стабільних метаболітів NO, на тлі зниження активності NO-синтази; підвищення рівня активності ключових ферментів антиоксидантного захисту каталази та СОД в тканинах головного мозку.

Одним із ключових моментів в антиоксидантній активності похідних (4-оксо-4Н-хіназолін-3-іл)-алкіл (арил) карбонових кислот є інгібіювання процесів окисної модифікації білків (ОМБ), що підсилюються в умовах ГІС. Так, сполука ПК 37 зменшувала кількість АФГ і КФГ при спонтанній ОМБ у середньому на 44% і на 50% відповідно, а при стимульованій - на 36% та 37% стосовно контролю (р 0,05). ПК 53 при спонтанній ОМБ знижувала концентрацію маркерів ОМБ на 36,5% та 41,4%; при стимульованій – на 20% й 18 %. Найбільш активною сполукою виявилася ПК 66, що знижувала кількість АФГ і КФГ при спонтанній ОМБ на 53% й 55% і при стимульованій – на 44% й 56% стосовно контролю. За своїм впливом на процеси ОМБ сполука ПК 66 статистично вірогідно (p?0,05) перевищувала показники найбільш активного препарату порівняння семакса, який при спонтанній ОМБ знижував кількість АФГ у середньому на 42%; КФГ - на 50%; а при стимульованій – відповідно на 40% й 41% відносно контрольної групи тварин (р 0,05).

Подібний вплив похідних (4-оксо-4Н-хіназолін-3-іл)-алкіл (арил) карбонових кислот на процеси окисної модифікації білків пояснює не тільки їх антиоксидантну та церебропротективну дію, але й позитивний вплив на когнітивний дефіцит, що розвивається у тварин після відтворення ГІС, оскільки відома роль ОМБ у розвитку порушень інтегративних функцій ЦНС, таких як пам'ять, здатність до навчання. Призначення похідних (4-оксо-4Н-хіназолін-3-іл)-алкіл (арил) карбонових кислот призводило до відновлення когнитивно- мнестичних функцій експериментальних тварин. Сполуки ПК 32, ПК 37, ПК 66, ПК 51, ПК 52 збільшували час заходу тварин у темний відсік у середньому на 125%; 108%; 209%; 108%.

Слід зазначити, що всі досліджувані сполуки та референс - препарати проявляли однакову активність як при профілактичному, так і при терапевтичному введенні експериментальним тваринам.

Проведені нами дослідження показали, що найбільш активною сполукою серед похідних (4-оксо-4Н-хіназолін-3-ил) - алкіл (арил) карбонових кислот за своїм впливом на стан антиоксидантної системи, на процеси навчання та пам'яті тварин з ГІС виявилося ПК 66 (4-[4-оксо-3(4Н)-хіназолін] бензойна кислота), з референс – препаратів - семакс. В зв'язку з цим, нами були проведені додаткові, уточнюючі дослідження сполуки ПК 66 і семакса на моделі хронічного імобілізаційного стресу.

Моделювання ХІС супроводжувалося значним зниженням активності СОД, КАТ, а також виснаженням запасів б- токоферолу, причому дані зміни стану антиоксидантної системи при ХІС були більше виражені, ніж у тварин з моделюванням ГІС. В умовах ХІС нами було спостерігалося суттєве збільшення концентрації стабільних метаболітів NO (більш ніж на 240%) відносно інтактної групи. Виснаження антиоксидантної системи, гіперпродукція стабільного метаболіту оксиду азоту- нітрит- іона призводило до окисної модифікації білків. Важливо відзначити, що при ХІС значно збільшувалися АФГ і КФГ при стимульованій ОМБ, що, на нашу думку, свідчить про виснаження резервно - адаптаційних можливостей організму в умовах ХІС.

Профілактичне та терапевтичне призначення ПК 66 (10 мг/кг), семакса (300 мг/кг) тваринам, які зазнали ХІС призводить до підвищення активності КАТ і СОД. ПК 66 за своїм впливом на дані показники перевищував активність семакса більш ніж на 30%. Крім того, курсове призначення ПК 66 і семакса призводило до зниження концентрації стабільних метаболітів NO на 66% та 58% відповідно (табл. 3).

Захисний ефект ПК 66 в умовах ХІС проявлявся позитивним впливом на процеси окисної деструкції білків. Встановлено, що курсове призначення ПК 66 знижувало концентрацію АФГ і КФГ у тканинах головного мозку. При спонтанній ОМБ зміст АФГ і КФГ знижувався на 1,7 і 1,5 рази; при стимульованій - на 2,2 та 2,1 рази, статистично достовірно (р ? 0,05) перевищуючи показники семакса.

Крім окисного пошкодження білків, окисній модифікації піддавалися нуклеїнові кислоти , зокрема гуанін, перетворюючись у 8- гідроксигуанін (8-OHG). Окисна модифікація нуклеїнових кислот призводить до порушення експресуючого геномного синтезу функціональних, структурних, регуляторних та інших продуктів, збільшенню проапоптичних генів CCD95, p53, p35, а також зниженню експресії антиапоптичного білка bcl-2 [А.А. Болдырев, 2002].

Важливим компонентом у механізмі антиоксидантної дії ПК 66 і семакса є їх вплив на процеси окисної модифікації нуклеїнових кислот. Введення ПК 66 і семакса знижувало концентрацію 8-OHG у сечі в середньому на 33% та 20%, при цьому сполука ПК 66 статистично достовірно (p?0,05) перевищувала показник семакса.

Активація процесів ВРО на тлі виснаження антиоксидантної системи тварин з моделюванням ХІС супроводжувалася розвитком енергодефіциту в мозковій тканині. Курсове призначення тваринам із хронічним стресом семакса та ПК 66 зменшувало ступінь вираженості энергодефіциту за рахунок інтенсифікації окисної продукції АТФ, підсилюючи активність дикарбонової ланки циклу Кребса (малат – на 100%); знижувало “витрату” інтермедіатів ГМАК- шунта в енергообміні, підвищувало концентрацію гальмівних амінокислот (ГАМК – на 61%), зменшувало активність анаеробного гліколізу та розвиток лактат - ацидозу в головному мозку стрессованих тварин (лактат – на 114%; цитохром –С-оксидаза – на 131%), тим самим, підсилюючи вплив стрес – лімітуючих систем (табл. 3).

Слід зазначити, що сполука ПК 66 та семакс виявляли виражену церебропротективну дію як при профілактичному, так и при лікувальному призначенні тваринам з імобілізаційним стресом.

Таблиця 3

Вплив досліджуваних препаратів на активність АО-ферментів, інтермедіатів циклу Кребса та ГАМК-шунту, маркерів оксидативного стресу в головному мозку щурів при ХІС

Група тварин

Показники | Інтактні | Тварини з ХІС

(контроль) | Семакс 300мг/кг +ХІС | ПК 66 10 мг/кг + ХІС | ХІС + семакс 300 мг/кг | ХІС + ПК 66 10 мг/кг

СОД, у.о./мг/білка/

хв.312,2±7,8 | 67,4±2,34 | 178±6,5* | 223,5±4,3** | 182,5±7,5* | 208±6,3** | Каталаза, мкат/мг/
білка/хв.8,7±0,67 | 2,3±0,43 | 5,7±0,54* | 7,3±0,32** | 6,2±0,76* | 7,7±0,32** | NO, мкм/г/тка-

нини1,2±0,054 | 4,090,55 | 1,640,12* | 1,410,07* | 1,740,13* | 1,370,07** | NO-синтза, нмоль/мг/

білка/хв.8,54±2,33 | 32,217,68 | 17,874,51* | 11,175,02* | 16,335,22* | 9,902,3** | 8-OHG, нг/л | 198,5±3,5 | 789,2±5,8 | 697,3±4,3* | 478,4±2,1** | 685,4±4,8* | 498,2±5,4 | АТФ, мкм/г/тка-

нини | 2,86±0,06 | 1,80±0,04 | 2,76±0,01* | 2,48±0,02* | 2,69±0,02* | 2,72±0,01* | ГАМК, мкм/г/тканини | 2,87±0,12 | 1,0±0,09 | 2,4±0,11 | 2,6±0,1* | 2,2±0,2* | 2,8±0,12* | Лактат мкм/г/тка-

нини | 2,6±0,10 | 4,7±0,11 | 2,72±0,11 | 2,68±0,1* | 2,74±0,11* | 2,63±0,09* | Малат мкм/г/тка-

нини | 0,38±0,02 | 0,2±0,01 | 0,27±0,01* | 0,4±0,02** | 0,28±0,01* | 0,38±0,01** | ЦХО

мкм/г/тка-

нини | 11,8±0,11 | 8,7±0,08 | 10,8±0,07* | 10,0±0,09* | 10,3±0,1* | 10,5±0,04* |

Примітки: 1. *- р 0,05 відносно контролю,

2. **- р 0,05 відносно семаксу.

В умовах окисного стресу однією з перших реакцій геному є індукція генів раннього реагування – c-fos. Білок c-fos як прямо, так і опосередковано, бере участь у процесі фрагментації ДНК та ініціюванні процесів апоптичної загибелі клітини. Призначення тваринам, які піддавалися ХІС, ПК 66 призводило до достовірного зниження (р 0,01) кількості Fos-позитивних нейронів у зоні CA1 гіпокампа більш ніж на 61%. Менш активним виявився семакс, знижуючи кількість Fos-позитивних нейронів на 25% стосовно контрольної групи тварин. За рахунок пригнічення експресії генів раннього реагування c-fos сполуки ПК 66 і семакс здатні деякою мірою впливати на процеси апоптичної загибелі нейрональної клітини, здійснюючи, тим самим, свою церебропротективну дію в умовах стресу (рис. 2). Так, введення ПК 66 збільшувало кількість антиапоптичного білка bcl-2 у зоні CA1 зони гіппокампа в порівнянні з контрольною групою тварин (р ? 0,01) і статистично достовірно (р ? 0,01) перевищуючи показники семакса (рис. 2).

Рис. 2. Експресія гена c-fos та bcl-2- білку у нейронах CA1 зони гіпокампа

тварин з ХІС.

Примітки: 1. *- р 0,01 відносно контролю;

2. **- р 0,01 відносно семаксу.

Церебропротективна дія ПК 66 і семакса підтвердилася при морфологічних дослідженнях нейронів CA1 зони гіпокампа тварин, що зазнали ХІС. Семакс та ПК 66 демонстрували церебропротективний ефект збільшенням щільності нейроцитів на 15% і 26% відносно контрольної групи тварин. Крім цього, призначення ПК 66 призводило не тільки до відновлення площі тіл нейронів, але й до перевищення даного показника на 8% у порівнянні з показниками інтактної групи. Позитивна дія ПК 66 проявлялася в підвищенні вмісту РНК у клітинах, повністю відновлюючи її концентрацію. Семакс за своїм впливом на досліджувані показники виявився менш ефективним. Подібна дія препаратів відбиває характер їх протективної дії, що виражається в значному збільшенні структурних і пластичних компонентів клітин за умов ХІС (табл. 4).

Таблиця 4

Вплив семакса та ПК 66 на морфофункціональні показники нейронів
в зоні CA1 зони гіпокампа щурів з ХІС

Досліджувані показники | Інтактні тварини | Контроль (ХІС) | ХІС + семакс | ХІС + ПК 66 | Щільність нейронів

(клітин/мм2) | 1211 | 800±20 | 920±10* | 1010** | Площа нейронів (мкм2) | 143,2±4,1 | 111,2±0,7 | 155,8±0,83* | 167,4±0,6* | Вміст РНК (Еоп) | 14,8±0,78 | 10,5±0,12 | 12,9±0,2* | 14,0±0,23** | Щільність апоптичних та деструктивно змінених нейронів (1мм2)110±5,6 | 160±6,5 | 126±4,2* | 68±3,7**

Індекс кількості загиблих та виживших нейронів (1мм2) | 14,5±1,2 | 6±1,2 | 10±1,4* | 13,6±2**

Примітки: 1. *- р 0,01 відносно контролю;

2. **- р 0,01 відносно семаксу.

Важливим показником ефективності досліджуваних препаратів є індекс відношення кількості нейронів, що вижили, до числа апоптичних і деструктивно змінених. Призначення семакса підвищувало індекс нейронів, що вижили, на 66,6%, ПК 66 - на 126,6% (табл. 4). Слід зазначити, що даний показник корелює зі вмістом в CA1 зоні гіпокампа антиапоптичного bcl-2 білка.

Церебропротективна дія семакса та ПК 66 в умовах ХІС проявлялась у відновленні когнітивних показників вищої нервової діяльності. ПК 66, перевершуючи за ефективністю семакс, більш виражено впливав на функції пам'яті, збільшуючи латентний період заходу у темний відсік на 270% відносно контрольної групи тварин (рис. 3).

Рис. 3 Вплив семакса та ПК 66 на відтворення УРПУ у щурів, що зазнали ХІС.

Примітки: 1. *- р 0,01 відносно контролю;

2. **- р 0,01 відносно семаксу.

ПК 66 за своїм впливом на стан антиоксидантної системи, на показники окисного метаболізму, експресію генів раннього реагування c-fos, на вміст антиапоптичного білка bcl-2 в CA1 зоні гипокампа, а також на морфофункціональний стан нейронів тварин, які піддавалися ХІС, статистично достовірно (p ? 0,05) перевищував відповідні показники референс - препарата - семакса.

Таким чином, проведені експериментальні дослідження виявили серед 36 похідних (4-оксо-4Н-хіназолін-3-іл)-алкіл (арил) карбонових кислот найбільш активну сполуку - 4-[оксо-3(4Н)-хіназолін] бензойну кислоту (ПК66). Дана сполука в умовах моделювання імобілізаційного стресу впливає практично на всі деструктивні процеси в нейроні: інгібує утворення АФК, зменшує інтенсивність процесів вільно-радикального окиснення й сполученого з ним енергодефіциту, збільшує активність ряду антиоксидантних ферментів, а також, безпосередньо впливаючи на метаболичні процеси в нейроні, забезпечує, тим самим, свою церебропротективну дію.

ВИСНОВКИ

В роботі, присвяченій актуальній проблемі фармакології – пошуку стреспротекторів з церебропротективною дією у ряді 36 похідних (4-оксо-4Н-хіназолін-3-іл)-алкіл (арил) карбонових кислот, виявлена сполука 4-[4-оксо-3(4Н)-хіназолін] бензойної кислоти, що проявляє виражені церебропротективні властивості в умовах моделювання імобілізаційного стресу.

1. У скринінгових дослідженнях in vitro та in vivo серед 36 похідних 6-4-R –оксо-4-Н-хіназолін-3-іл карбонових кислот виділені 5 сполук (ПК 37, ПК 32, ПК 53, ПК 51, ПК 66), що переважають референтні препарати за силою антиоксидантної (тіотриазолін, емоксипін, сечовина) та антиамнестичної (ноофен, семакс) дії.

2. Антиоксидантна та антиамнестична активність похідних 6-4-R-оксо-4-Н-хіназолін-3-іл карбонових кислот залежить від природи замісника, його розташування в арильній субституенті, а також від їх гідрофільності.

3. В умовах моделювання гострого імобілізаційного стресу сполуки ПК 37, ПК 32, ПК 53, ПК 51 та особливо ПК 66 при одноразовому профілактичному та лікувальному введенні