АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГІЇ ТА ТРАНСФУЗІОЛОГІЇ

Шалай Ольга Олексіївна

УДК: 547.963+576.314+616.155.392+616-006.441

лектинофільні вуглеводні компоненти

мембрани злоякісних клітин

при мієлоїдних і лімфоїдних пухлинах

14.01.31 – гематологія та трансфузіологія

А в т о р е ф е р а т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті патології крові та трансфузійної медицини АМН України, м. Львів

Науковий керівник - доктор медичних наук, професор

Логінський Володимир Євстахович,

Інститут патології крові та трансфузійної медицини АМН України,

заступник директора з наукової роботи,

завідувач лабораторії імуноцитології та генетики пухлин крові

Офіційні опоненти: - доктор медичних наук

Бруслова Катерина Михайлівна,

Інститут клінічної радіології Наукового центру

радіаційної медицини АМН України,

завідувач відділення радіаційної гематології дитячого віку

- доктор медичних наук, професор

Глузман Данило Фішелевич,

Інститут експериментальної патології, онкології і

радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України,

завідувач відділу імуноцитохімії

Провідна установа - Національна медична академія післядипломної освіти

імені П.Л. Шупика МОЗ України, кафедра гематології та

трансфузіології, м. Київ

Захист дисертації відбудеться “ 15 ” травня 2007 р. о …14.......годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.612.01 Інституту гематології та трансфузіології АМН України (04060, м. Київ, вул. М. Берлинського, 12).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту гематології та трансфузіології АМН України (04060, м. Київ, вул. М. Берлинського, 12).

Автореферат розісланий “..6..”…квітня..........2007 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради Г.П. Гащук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вуглеводні компоненти у складі глікопротеїнів і гліколіпідів мембрани відіграють важливу роль у життєдіяльності клітини [Дж. Фаллер и соавт., 2004]. Запропоновано концепцію глікокоду клітини, як сукупності вуглеводних структур мембрани і органел [Gabius, 2001], інформаційні можливості якого перевищують генокод [Sharon et al., 2004]. Одним із методів дослідження глікокоду, тобто вуглеводного спектру клітинної мембрани, є застосування його дешифраторів – лектинів [В.О. Антонюк, 2005], білків, що специфічно розпізнають і зв’язують глікозидні залишки без каталітичної і модифікаційної дії [Varki, 2004]. Вуглеводні структури (антигени), які виявляються лектинами, беруть участь у процесах роcту, диференціації, апоптозу чи пухлинної трансформації клітин, міжклітинній взаємодії, передачі сигналів [Weis et al., 1996; Kieda, 1998; Hakomori, 1999]. Подібне значення вони мають у процесах гемопоезу та імуногенезу, зокрема, забезпечують здатність лімфоцитів до рециркуляції, контроль за виробленням цитокінів, взаємодію лімфоцитів з клітинами-мішенями [Wang et al., 2000; Yamaji et al., 2002].

Сучасна діагностика і класифікація гематоонкологічних хвороб ґрунтується на визначенні походження, фенотипових і генотипових ознак субстратних клітин. В багатьох роботах показано важливе значення для об’єктивної діагностики та моніторингу ефективності лікування гематологічних хвороб імунофенотипової характеристики злоякісних клітин за допомогою моноклональних антитіл до CD антигенів [Д.Ф. Глузман, 2003; И.В. Абраменко и соавт., 2003; В.Є. Логінський і співавт., 2006]. Значно менше відомо про особливості вуглеводовмісних біополімерів мембрани пухлинних клітин різного походження, їх зміни при поширенні та під час лікування пухлини. Перспективними діагностичними маркерами для вивчення вуглеводних структур, можливість використання яких в гематології недооцінюється, є лектини.

Лектини використовуються у світлооптичній і електронній цито- і гістохімії для вивчення процесів онтогенезу і як селективні маркери окремих типів нормальних, реактивних і неопластичних клітин [О.А. Хомутовский и соавт., 1986; А.Д. Луцик и соавт., 1989; Д.Ф Глузман и соавт., 2003].

Аналіз даних літератури показав важливість вивчення глікозидних структур злоякісних клітин при неоплазіях гемопоетичної та лімфоїдної тканини для розуміння їх гістогенезу та діагностики [В.А Надгорная и соавт., 1990; Л.М. Скляренко, 1997; В.Є. логінський і співавт., 2004]. Однак внаслідок відсутності системного підходу у цих дослідженнях залишається мало вивченим діагностичне і диференційно-діагностичне значення змін лектинового фенотипу неопластичного субстрату при лейкеміях і лімфомах; тому він мало використовується у клінічній практиці як діагностичний і прогностичний критерій. Крім того, широка вуглеводна специфічність деяких лектинів (одночасна взаємодія з декількома вуглеводними залишками) інколи створює труднощі в інтерпретації отриманих результатів.

Таким чином, вивчення та оцінка змін, які відбуваються у глікокоді клітини при неопластичній трансформації і пухлинній прогресії залежно від її походження і ступеня диференціювання, є актуальною науковою задачею з практичним значенням для діагностики, прогнозування і визначення тактики лікування гематоонкологічних хворих.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану наукових досліджень Інституту патології крові та трансфузійної медицини АМН України і безпосередньо пов’язана з НДР “Імунофенотипічна характеристика клітин гематосарком з використанням панелі моноклональних антитіл і лектинів для диференційної діагностики і прогнозу захворювання” (№ Державної реєстрації 01.90.0006626); “Вивчити диференційно-діагностичне та прогностичне значення цитохімічного та імунологічного фенотипу лейкозних клітин у хворих недиференційованим та гострим мієлоїдним лейкозом, виділити імуноморфологічні варіанти захворювання з метою визначення найбільш ефективних схем цитостатичної терапії” (№ Державної реєстрації UA 01000 145P); “Дослідити фенотипові особливості та цитокіновий профіль пухлинних лімфоцитів у хворих на хронічну лімфоїдну лейкемію і визначити їх прогностичне значення” (№ Державної реєстрації 01.04 U 003055), співвиконавцем і відповідальним виконавцем яких була здобувач.

Мета роботи. З’ясувати діагностичне і прогностичне значення лектинового фенотипу на основі визначення особливостей вуглеводних компонентів глікопротеїнів та гліколіпідів мембрани злоякісних клітин при мієлоїдних і лімфоїдних неоплазіях залежно від їх походження, напряму і ступеня диференціювання.

Основні задачі дослідження.

1. Дослідити вуглеводні структури мембрани бластних клітин за допомогою лектинів у хворих на окремі варіанти ГМЛ і ГЛЛ, визначити їх зв’язок з експресією диференційних CD антигенів;

2. Дати характеристику лектинофільних вуглеводних залишків на мембрані малігнізованих лімфоїдних клітин при лімфоїдних неоплазіях із зрілих клітин (ХЛЛ, ВКЛ, НГЛ) залежно від їх походження, варіанту хвороби, здатності до лейкемізації, морфологічного ступеня злоякісності, експресії деяких прогностично важливих CD антигенів.

3. Провести порівняльну оцінку вуглеводних детермінант циркулюючих злоякісних лімфоцитів та клітин із уражених органів (кістковий мозок, селезінка, лімфатичні вузли) при лімфоїдних неоплазіях.

4. Визначити діагностичне і прогностичне значення лектинового фенотипу пухлинних клітин при мієлоїдних і лімфоїдних неоплазіях, розробити відповідні рекомендації.

Об’єкт дослідження – хворі на гостру мієлоїдну лейкемію (ГМЛ), гостру лімфобластну лейкемію (ГЛЛ), В-клітинну хронічну лімфоїдну лейкемію (ХЛЛ), волосистоклітинну лейкемію (ВКЛ), негоджкінські лімфоми (НГЛ).

Предмет дослідження – експресія вуглеводних детермінант, що взаємодіють з лектинами різної олігосахаридної специфічності, на мембрані малігнізованих гемопоетичних і лімфоїдних клітин крові, кісткового мозку, селезінки, лімфатичних вузлів.

Методи дослідження. Клінічні, інструментальні, гематологічні, цитологічні, цитохімічні, гістологічні та імунофенотипові методи, необхідні для встановлення діагнозу і варіанту гематоонкологічної хвороби; визначення рівня і частоти експресії глікокон’югатів мембрани пухлинних клітин за допомогою панелі лектинів різної вуглеводної специфічності; статистичні методи аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше визначено і систематизовано зміни лектинозв’язувальних вуглеводних структур глікопротеїнів і гліколіпідів мембрани злоякісних клітин при ГМЛ та лімфоїдних неоплазіях з клітин-попередників і зрілих лімфоцитів, встановлено діагностичне і прогностичне значення лектинового фенотипу при цих хворобах. Доведено, що склад глікокон’югатів мембрани відображає походження, напрямок і ступінь диференціації малігнізованих гемопоетичних і лімфоїдних клітин, корелює з експресією окремих диференційних (при ГМЛ) та прогностичних (при ХЛЛ) CD антигенів.

Вперше охарактеризовано особливості лектинового фенотипу, притаманні мієлоїдним бластам, показано зміни експресії вуглеводних залишків О- і N-глікозидів при їх диференціації у гранулоцитарному (М1-М2), моноцитарному (М4-М5) і еритроцитарному (М6) напрямку. Встановлено, що експресія CD34 на мієлоїдних бластах пов’язана з наявністю олігосахариду Fucб1>Galв1>3(4)GlсNАcв, CD15 – з фукозильованими розгалуженими N-глікозидами поліацетилглюкозамінного типу.

З’ясовано характер вуглеводних детермінант мембрани малігнізованих лімфоцитів при лімфоїдних неоплазіях із зрілих лімфоцитів (ХЛЛ, ВКЛ, НГЛ) залежно від їх Т- чи В-клітинного походження, морфологічного ступеня злоякісності, цитологічного і імунофенотипового варіанту процесу, лейкемізації. Запропоновано спосіб діагностики лімфоїдних неоплазій із зрілих В-клітин за допомогою лектинів (заявка на винахід № u 2007 00189).

Встановлено, що В-клітини при ХЛЛ відзначаються низьким рівнем експресії О- і N-глікозидних залишків, причому прогресування процесу супроводжується змінами взаємодії з лектинами LCL і WGA. Прогностично несприятливі випадки ХЛЛ з CD38+ лімфоцитами характеризуються вищим рівнем О-глікозидних залишків та зниженням експресії рецепторів лектину WGA.

Доведено, що поверхневі глікозидні залишки волосистих клітин при ВКЛ відрізняються високим рівнем експресії антигену Томсена-Фріденрайха (лектин PNA) при низькому вмісті інших О-глікозидів. Вперше продемонстровано відмінності лектинового фенотипу малігнізованих лімфоцитів при окремих варіантах (за класифікацією ВООЗ) НГЛ з лейкемізацією, який відображає походження цих клітин. При НГЛ без ознак лейкемізації виявлено зміни вуглеводних детермінант лімфоцитів периферичної крові, які свідчать про наявність у кровообігу клітин злоякісного клону.

Визначено, що злоякісні лімфоцити із уражених лімфоїдних органів назагал мають лектиновий фенотип, подібний до неопластичних лімфоцитів периферичної крові, тільки при НГЛ вони більшою мірою сіалізовані.

Встановлено, що типові особливості лектинового фенотипу злоякісних клітин при окремих варіантах гематоонкологічних хвороб можна використати для їх діагностики і диференційної діагностики.

Практичне значення одержаних результатів. Результати роботи обґрунтовують доцільність впровадження у практичну гематологію дослідження лектинового фенотипу неопластичних клітин периферичної крові, кісткового мозку та лімфоїдних органів для діагностики та диференційної діагностики мієло- та лімфопроліферативних процесів. Запропоновано використання панелі лектинів різної вуглеводної специфічності і розроблено критерії діагностики за змінами вуглеводних детермінант мембрани субстратних клітин окремих варіантів гострих лейкемій, лімфоїдних неоплазій із зрілих лімфоцитів (ХЛЛ, ВКЛ, категорії НГЛ). Показана можливість прогнозування перебігу ХЛЛ на основі взаємодії злоякісних лімфоцитів з лектинами LCL та WGA. Видано інформаційний лист “Застосування лектинів для діагностики лімфоїдних неоплазій із зрілих В-клітин” (Київ, 2006, №185).

Основні положення та результати дисертаційної роботи впроваджено в практику консультативної поліклініки Інституту патології крові та трансфузійної медицини, гематологічного відділення і денного стаціонару 5-ї міської клінічної лікарні м. Львова, дитячого гематологічного відділення Львівської обласної дитячої спеціалізованої лікарні, гематологічного відділення Харківської міської дитячої лікарні № 16, у навчальний процес кафедри гематології та трансфузіології Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького.

Особистий внесок здобувача. Автор особисто відібрала і проаналізувала літературні джерела на тему дослідження, обґрунтувала його актуальність, сформулювала мету і задачі, розробила план вирішення поставлених задач, опрацювала методики досліджень. При виконанні лабораторної частини роботи самостійно провела дослідження лектинового фенотипу клітин крові, кісткового мозку та лімфоїдних органів хворих з використанням панелі лектинів різної вуглеводної специфічності. Автор статистично опрацювала матеріал, проаналізувала, узагальнила та інтерпретувала отримані результати, підготувала до публікацій основні матеріали, написала всі розділи дисертації, сформулювала висновки і практичні рекомендації дисертаційної роботи.

Клінічне обстеження, клініко-лабораторні дослідження і діагностика хвороби проводились на базі відділення гематології (зав. – д.мед.н., с.н.с. З.В. Масляк; д.мед.н., проф. Я.І. Виговська) та консультативної поліклініки (зав. - к.мед.н. Ю.В. Войціцький) ІПКТМ АМН України, базового гематологічного відділення 5-ї клінічної лікарні м. Львова (зав. - І.Л. Гумен). Цитологічні і цитохімічні дослідження виконано у відділенні гематології ІПКТМ, визначення імунофенотипу субстратних клітин – в лабораторії імуноцитології та генетики пухлин крові спільно з к.б.н., с.н.с. Г.Б. Лебедь.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались і обговорювались на: ІІІ Українському з’їзді гематологів і трансфузіологів (Суми, 1995); IV з’їзді гематологів та трансфузіологів України (Київ, 2001); науково - практичній конференції, присвяченій 70-річчю Російського НДІ гематології і трансфузіології (Санкт-Петербург, Росія, 2002); Х Конгресі СФУЛТ (Чернівці, 2004); Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); науково - практичній конференції “Новое в гематологии” (Москва, Росія, 2004); Ювілейному VIII з’їзді ВУЛТ (Івано-Франківськ, 2005); VII науково - практичній конференції Польського товариства гематологів і трансфузіологів (Люблін, Польща, 2005); науково - практичній конференції “Гематологія і трансфузіологія: фундаментальні та прикладні питання” (Київ, 2005); науково - практичній конференції, присвяченій 65-річчю заснування Інституту патології крові та трансфузійної медицини АМН України “Актуальні проблеми гематології та трансфузійної медицини” (Львів, 2005); ХІ з’їзді онкологів України (Судак, АР Крим, 2006); ХІ Конгресі СФУЛТ (Полтава, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 18 наукових праць, з них 6 статей у провідних фахових виданнях та 12 матеріалів і тез доповідей в матеріалах конгресів, з’їздів і науково-практичних конференцій.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 197 сторінках машинопису; складається зі вступу, огляду літератури, загальної методики і основних методів досліджень, шести розділів власних досліджень, висновків, списку використаної літератури, який включає 216 джерел вітчизняних та зарубіжних авторів (24 сторінки тексту). Робота ілюстрована 32 таблицями та 9 рисунками (31 сторінка тексту).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури з’ясовує сучасні погляди на біологічну роль лектинофільних вуглеводних компонентів мембрани клітин в нормі та патології. Проведено аналіз основних відомостей про лектини, їх класифікацію, методи визначення лектинових рецепторів, їх структуру і фізіологічні функції, зміни глікопротеїнових структур, що взаємодіють з лектинами, при пухлинній трансформації клітин, зокрема при гематоонкологічній патології. Обґрунтовано актуальність наукової задачі дисертації, спрямованої на вдосконалення діагностики, диференціальної діагностики, прогнозування перебігу та тактики лікування гематоонкологічних хвороб.

Загальна методика і методи досліджень. Дослідження лектинозв’язувальних вуглеводних детермінант гемопоетичних та лімфоїдних клітин периферичної крові і/або кісткового мозку, лімфатичних вузлів та суспензії клітин селезінки проведено у 202 гематологічних хворих. У 48 випадках діагностовано гостру мієлоїдну лейкемію (Гмл), а серед 154 обстежених хворих з лімфоїдними пухлинами (ЛП) визначено наступні діагнози: гостра лімфобластна лейкемія (ГЛЛ) – 12 пацієнтів, В-клітинна хронічна лімфоїдна лейкемія (В-ХЛЛ) – 65 хворих, волосистоклітинна лейкемія (ВКЛ) – 13, В-клітинні негоджкiнські лiмфоми (В-НГЛ)– 52 хворих, Т-клітинні лімфоми (Т-НГЛ) - 12.

У всіх хворих проводились загальні клініко-лабораторні дослідження, які включали клінічне та інструментальне обстеження, гематологічні, цитологічні, цитохімічні, гістологічні, імунофенотипові, біохімічні аналізи, необхідні для встановлення діагнозу, показів для видалення селезінки та моніторингу результатів лікування, частину з яких виконували і ми.

Показники лектинового профілю лімфоїдних клітин периферичної крові контрольної групи встановлено при дослідженні поверхневих вуглеводних компонентів мононуклеарів крові у 15 здорових осіб середнього віку (7 чоловіків та 8 жінок).

Визначення лектинового фенотипу мембранних глікококон’югатів на субстратних клітинах проводили прямим пероксидазним методом на препаратах типу “висушеної краплі” [В.Г. Пінчук і співавт., 1990] за допомогою панелі з 12 лектинів всіх основних груп вуглеводної специфічності виробництва НВК „Лектинотест” (Львів, Україна) з перевіреною вуглеводною специфічністю (табл. 1). Активність ендогенної пероксидази пригнічували за допомогою розчину, що містить Н2О2 та натрію азид; десіалізацію мембрани клітин проводили розчином нейрамінідази 0,02 МО/мл. Результати реакції відчитували на світловому мікроскопі, використовуючи імерсійну систему. Оцінку результатів типування лектинових рецепторів здійснювали шляхом підрахунку відсотку позитивного маркування на 200 клітин за наявністю кінцевих продуктів реакції коричневого кольору на мембрані мононуклеарних клітин. Реакцію з лектином ми вважали позитивною, якщо з ним взаємодіяло >20% клітин.

Статистичне порівняння сукупностей проводили методами варіаційної статистики з обчисленням коефіцієнта Стюдента (t); вірогідність різниці між середніми величинами двох сукупностей приймалася за р<0,05. Вірогідність частотного розподілу обчислювали методом ч2, а при малому об’ємі сукупностей (<30 випадків) за формулою Фішера для частотних показників (pF). Взаємозалежність між показниками парних досліджень встановлювали за коефіцієнтом кореляції (r).

Таблиця 1

Специфічність використаних лектинів

Назва лектинів | Вуглеводна

специфічність | Глікозидна специфічність

повна | міжнародна скорочена

Аглютинін арахісу | PNA | D-Gal в | Galв1>3GalNАcб1>

(Т-антиген Томсена-Фріденрайха; тип III ланцюгів у О-глікозидах)

Аглютинін

кліщовини | RCA | D-Galв | Galв1>3(4)GlсNАcв1>

(тип I, II ланцюгів у О- і N-глікозидах)

Лектин омели

білої | ML-1 | D-Galб | Galб1>4Gal

(Е-рецептор токсинів)

Лектин виноградного слимака | HPL | D-GalNАcб | GalNАcб1>3GalNАcв1>

(F-антиген Форссмана)

Лектин сої | SBA | D-GalNАcб | GalNАcб1>3Galв1>

(антиген А груп крові)

Лектин сочевиці | LCL | D-Manб

L-Fucб | Rв1>2Manб1¬

36Manв1-R-R-N

Rв1>2Manб1- LFucб

(кoрова частина N-глікозидів)

Лектин гороху | PSL | D-Manб | Manб1>2(3)R

(кьрова частина N-глікозидів)

Аглютинін зародків пшениці | WGA | D-GlсNАcв | NАNА-R-GlсNАcв1>4GlсNАc>

(кьрова частина та розгалужені ланцюги поліацетилглюкозамінного типу N-глікозидів)

лектин бульб картоплі | STL | D-GlсNАcв | NАNА-R-GlсNАcв1>4GlсNАc>

лектин кори бобівника анагіролистного | LAL | термінальна

L-Fucб | Fucб1>2Galв1>4GlсNАc>

(антиген Н груп крові)

лектин кори бузини чорної | SNL | NАNА | NАNАб2>6Gal

(тип I, II, III ланцюгів у О- і N-глікозидах)

лектин квасолі звичайної | PHA-L | Поліспеци-фічний | Galв1>4GlсNАcв1>2Man>R

(тип II ланцюгів, 4-антенні N-глікозиди)

Результати досліджень, їх аналіз та узагальнення

Характеристика лектинових рецепторів мембрани злоякісних клітин при мієлоїдних неоплазіях з клітин-попередників. Для виявлення можливих змін вуглеводних компонентів мембрани гемопоетичних (мієлоїдних) клітин-попередників злоякісного клону різного ступеня і напрямку дозрівання, ми проаналізували результати дослідження лектинового фенотипу 48 хворих з окремими варіантами ГМЛ за FAB-класифікацією (табл. 2).

Найбільш незрілі мієлобласти (М0) характеризуються доволі високою експресією на їх мембрані глікокон’югатів, особливо залишків О-глікозидів (лектини PNA, HPL, SBA), Galб (ML-

Таблиця 2

Рецептори лектинів на бластних клітинах при FAB варіантах ГМЛ (Мm)

Лектини | Специ-фічність | М0

n=3 | М1

n=19 | М2

n=17 | М4

n=6 | М5

n=5 | М6

n=2

PNA | Galв | 3/3

42,37,9 | 5/19*

16,91,1* | 0/17*

7,80,7* | 0/6

9,31,9 | 2/5

20,04,6* | 0/2

9,5

RCA | Galв | 3/3

36,73,9 | 11/18

21,51,2* | 0/17*

13,20,6* | 0/6

9,80,5* | 3/5

24,02,7* | 1/2

34,0

ML-I | Galб | 3/3

46,34,5 | 7/18

20,01,4* | 0/17*

14,80,7* | 1/6

18,80,5* | 3/5

27,66,5 | 1/2

18,5

HPL | GalNАcб | 3/3

59,711,3 | 11/19

22,11,4* | 3/17*

17,80,6* | 0/6

16,70,8 | 5/5*

37,47,7* | 1/2

18,0

SBA | GalNАcб | 3/3

43,76,3 | 18/19

41,52,7 | 16/17

28,21,1* | 6/6

26,71,7 | 5/5

45,25,4* | 2/2

37,5

LCL | Manб,

Fucб | 2/3

39,714,9 | 14/19

21,70,9 | 10/17

20,80,6 | 6/6

38.81,5* | 4/5

27,42,0* | 1/2

29,5

PSL | Manб | 1/3

21,78,4 | 4/19

17,60,9 | 8/17

20,31,0* | 0/6*

15,71,1* | 0/5

11,82,4 | 1/2

22,5

WGA | GlсNАcв | 3/3

70,015,3 | 17/19

44,03,2 | 16/17

34,61,4* | 5/6

45,79,0 | 5/5

47,23,4 | 2/2

58,5

STL | GlсNАcв | 3/3

70,010,0 | 9/18

21,21,3* | 4/17

19,51,1 | 1/6

19,30,6 | 5/5*

37,04,3* | 1/2

20,5

LAL | Fucб | 1/3

27,39,9 | 10/19

20,81,3 | 0/17*

9,71,3* | 2/6

20,20,7* | 0/5

14,01,9* | 1/2

19,0

SNL | NАNАб | 1/3

22,72,7 | 17/19

26,41,3 | 11/17

22,31,2* | 5/6

22,50,7 | 5/5

29,00,4* | 2/2

26,0

PHA-L | Поліспе-цифічний | 2/3

42,314,7 | 9/18

19,91,1 | 0/17*

16,20,6* | 6/6*

24,70,5* | 3/5

23,83,6 | 2/2

33,5

Примітка: * відзначено показники, що вірогідно (р<0,05) відрізняються від аналогічного показника попередньої групи.

1), біантенних та розгалужених N-глікозидів, фукозильованих у кoровій і термінальній частині (лектини LCL, WGA, STL, LAL). Диференціювання злоякісних клітин-попередників (мієлобласти М1-М2) супроводжується зменшенням вуглеводних детермінант усіх специфічностей при однаковому рівні сіалізації. При дозріванні мієлобластів на мембрані у першу чергу знижується рівень О-глікозидів, а також поліантенних і розгалужених N-глікозидів комплексного гібридного типу. Диференціювання злоякісних клітин-попередників мієло-моноцитарної лінії (М4-М5) призводить до зростання на їх мембрані глікозидних залишків Galв/GalNАcб і GlсNАcв, що вказує на збагачення цих клітин на вуглеводні компоненти О- і особливо розгалужених N-глікозидів, очевидно, необхідних для забезпечення виконання специфічних функцій клітинами цієї лінії. Еритробласти (М6) відзначаються високим рівнем взаємодії з RCA (Galв), який виявляє вуглеводні ланцюги I і II типу О- і N-глікозидів, SBA (GalNacб) і, особливо, з WGA (GlсNАcв), спорідненого до N-глікозидів поліацетилглюкозамінного і гібридного типу. У досліджених випадках рівень взаємодії з PNA був доволі низьким.

Спільною ознакою, притаманною для бластів при всіх варіантах ГМЛ, є висока спорідненість до лектинів SBA і WGA.

В літературі відносно мало відомо про біологічне значення для клітин конкретних глікополімерів, які розпізнаються окремими лектинами, та їх зв’язок із специфічними антигенами. Для визначення можливої структури глікозидних залишків цих антигенів нами проведено аналіз кореляційного зв’язку між експресією деяких мієлоїдних CD антигенів (CD34, CD15, CD11b, CD14) та взаємодією злоякісних клітин при ГМЛ з лектинами. Встановлено, що відсоток CD34+ клітин позитивно корелює з кількістю клітин, які мають глікопротеїнові структури, що реагують з лектинами RCA і LAL, тобто містять олігосахарид Fucб1>Galв1>3(4)GlсNАcв1>. Для іншого класичного фукозовмісного глікопротеїну CD15, який з’являється на дозріваючих клітинах гранулоцитарно-моноцитарної лінії, ліганду Е і Р селектинів, таку позитивну залежність констатовано для LCL, WGA (r=+0,712), LAL і PHA-L, що свідчить про його вуглеводні детермінанти як N-глікозиди комплексного і гібридного типу з високим вмістом Fucб у кoровому і термінальному положенні. Антиген CD15 характеризується як фукозил-N-ацетиллактозамін [Д.Ф. Глузман и соавт., 2003], що пояснює його взаємодію з лектинами LCL і LAL (Fucб), WGA (GlсNАc) і PHA-L (Galв1>4GlсNАcв у багатоантенних небісектованих N-глікозидах). Експресія більш пізнього мієлоїдного антигену моноцитарного напряму диференціації CD11b негативно корелює з кількістю RCA+ клітин, що може залежати від відсутності у цьому глікопротеїні термінальної D-Galв, переважно характерної для О-глікозидів. Моноцитарний антиген, глікокон’югат CD14 за результатами кореляційного аналізу містить поліантенні розділені N-глікозиди з бічними ланцюгами комплексного типу (лектини STL, PHA-L), фукозильовані у кoровій частині (LCL) із зниженою кількістю PSL+ клітин (негативна кореляція). Його спорідненість до ендотоксинів [Д.Ф. Глузман и соавт., 2003] підтверджується доволі високим зв’язком з експресією детермінант Galб1>4Gal (r=+0,450), яка є рецептором токсинів, у тому числі лектину ML-1.

Таким чином, зміни глікокоду субстратних клітин при ГМЛ відображають ступінь і напрямок диференціювання цих клітин. Виявлене зниження рівня глікозилювання мембрани бластних клітин хворих на ГМЛ у процесі диференціації, в першу чергу, за рахунок О-глікозидних послідовностей, можуть мати діагностичне і диференціально-діагностичне значення.

Лектинофільні вуглеводні детермінанти злоякісних клітин при гострій та хронічних лімфоїдних лейкеміях. Проведено дослідження вуглеводних детермінант, властивих для лейкемічних лімфоїдних В- і Т-клітин-попередників при ГЛЛ (12 хворих), порівняно з вуглеводними структурами мембрани нормальних лімфоцитів (контрольна група). Лектиновий фенотип лімфоцитів периферичної крові у контрольній групі здорових осіб був подібний, як у повідомленнях інших авторів [Д.Ф. Глузман и соавт., 1990; Л.М. Скляренко,1997], хоча деякі лектини (STL, SNL) для таких досліджень не використовувалися.

Спільними ознаками лейкемічних В- і Т-клітин-попередників є вищий рівень, порівняно з нормальними лімфоцитами, взаємодії з лектинами, специфічними до глікозидних залишків О-глікозидів (лектини PNA, HPL), та зниження експресії N-глікозидів з бічними ланцюгами комплексного і гібридного типу (лектини PSL, RCA і PHA-L) при зростанні фукозилювання цих ланцюгів (LAL). На мембрані В-лімфобластів, порівняно з Т-лімфобластами, міститься значно менше О-глікозидів, що проявляється низьким рівнем експресії послідовностей антигенів Т, F і А (лектини PNA, HPL, SBA). Зменшується кількість розгалужених N-глікозидів поліацетилглюкозамінного типу (лектин WGA) при зростанні термінальної Fucб (лектин LAL), притаманної бічним ланцюгам комплексного типу N-глікозидів (рис.1).

Проведено дослідження рівня експресії глікополімерів лейкемічних В-клітин мембрани у 65 хворих на ХЛЛ. Як виявлено, моноклональні В-лімфоцити при ХЛЛ порівняно з нормальними лімфоцитами характеризуються низькою експресією більшості вивчених глікокон’югатів, особливо N-глікозидного типу. У частини (27%) хворих на лімфоцитах з’являється пухлиноасоційований Т-антиген (PNA+), відсутній на нормальних лімфоцитах, що свідчить про наявність у їхній мембрані О-глікозидів, властивих клітинам з порушеною диференціацією або активованим [Adhikari et al. 2001; Sharma et al., 1996]. Інші GalNАcб-вмісні дисахариди, притаманні О-глікозидам (лектини HPL, SBA), практично відсутні на лімфоцитах при ХЛЛ. Частина випадків ХЛЛ характеризується появою на лімфоцитах термінальної Fucб (антиген Н, лектин LAL), яка не спостерігається на нормальних лімфоцитах, що в літературі не описано. Сіалізація лейкемічних В-клітин низька (лектин SNL), що свідчить про відсутність їх активації [Razi et al., 1998] та відмінність від нормальних лімфоцитів [Д.Ф. Глузман и соавт., 2003] (табл. 3).

Прогресування ХЛЛ супроводжується змінами вуглеводних структур мембрани лейкемічних лімфоцитів на пізніх стадіях (III-IV за Rai, C за Binet) за рахунок частішої появи Galб (лектин ML-1), збільшення експресії N-глікозидів з Fucб у кoровій частині (лектини LCL, PSL) та зниження N-глікозидів з розгалуженими та поліантенними бічними ланцюгами (лектини WGA, PHA-L). Подібні зміни констатовано і в літературі, проте трактування їх прогностичного значення неоднозначне [Boldt et al., 1983; Mann et al., 1994; Л.М. Скляренко, 1997]. При прогресуванні ХЛЛ (рис.2) збільшується кількість клітин та частота випадків з позитивною експресією рецепторів LCL (ч2=4,09; р<0,05) та низькою WGA (ч2=6,82; р<0,01).

Проведений аналіз вказує на наявність зв’язку між рівнем експресії прогностично важливих CD антигенів (CD38, CD22, CD95) та лектинових рецепторів на мембрані лейкемічних В-клітин при ХЛЛ. Примітно, що підвищений рівень експресії CD22 і CD38 супроводжується зниженням взаємодії клітин з Galв-специфічним лектином RCA, а CD22 корелятивно зв’язаний з експресією

Рис. 2 Частота експресії лектинів LCL та WGA на різних стадіях ХЛЛ

залишків NАNА. На В-лімфоцитах низька експресія CD22 корелює з вмістом сіалізованих поліантенних N-глікозидів комплексного типу (лектини SNL і PHA-L). В літературі описано, що активність CD22 як глікопротеїну (siglec-2) регулюється сіаловою кислотою (NANA) [Razi et al., 1998]. Очевидно, що подібний вплив на CD22 має сіалізація мембрани лейкемічних В-клітин при ХЛЛ. Підвищення експресії CD38 супроводжується збільшенням числа клітин, на поверхні яких містяться антиген Т (лектин PNA) та глікозидні залишки антигену А (лектин SBA), властиві для О-глікозидів, термінальна Fucб (лектин LAL) та знижується рівень сіалізованих поліантенних N-глікозидів з ланцюгами комплексного (І і ІІ) і гібридного типу (RCA, PHA-L, WGA, STL). Таким чином, CD38+ В-лімфоцити можна охарактеризувати як PNA+WGA- з ознаками активації вуглеводних структур мембрани. Наявність CD95 рецептора (>5% позитивних клітин) на лімфоцитах при ХЛЛ корелює насамперед з низькою кількістю LCL+ клітин (N-глікозидів комплексного типу з фукозильованою кьровою частиною). Можна думати, що Cd антигени містять глікозиди, що взаємодіють з лектинами певної специфічності, а зміни конфігурації глікозидної частини цих рецепторів впливають на їх функціональну і лектинову специфічність.

Для з’ясування впливу мікрооточення проведено порівняння лектинового фенотипу циркулюючих лейкемічних клітин і цих же клітин у лімфоїдних органах. Лейкемічні клітини селезінки (7 хворих) порівняно з мононуклеарами периферичної крові хворих на ХЛЛ відрізняються за збільшеною експресією на їх поверхні вуглеводних детермінант О-глікозидів (лектини PNA, HPL), а також кьрової Manб N-глікозидів (лектин LCL). Виявлені розбіжності можуть бути зумовлені або наявністю у селезінці менш диференційованих В-лімфоцитів лейкемічного клону або зміною їх адгезивних властивостей.

Особливою структурою глікозидів мембрани серед інших В-клітинних лімфоїдних проліферацій відрізняється ВКЛ (13 хворих). Глікопротеїнові детермінанти мембрани волосистих клітин представлені високим рівнем антигену Т серед інших залишків О-глікозидів, Galб, термінальної Fucб та зниженням N-глікозидів комплексного типу (лектини PSL, RCA, PHA-L). Треба відзначити, що рівень експресії антигену Томсена-Фріденрайха на клітинах при ВКЛ [(70,23,3)% PNA+ клітин], який виявлено у всіх хворих, є найвищим серед інших В-клітинних ЛП, що може мати діагностичне і диференційно-діагностичне значення (табл. 3). Клітини селезінки при ВКЛ мають аналогічний лектиновий фенотип, однак із зменшенням зв’язування лектину RCA.

Особливості глікокон’югатів мембрани лімфоїдних клітин при злоякісних лімфомах. Проведено дослідження глікозидного фенотипу клітин крові та уражених лімфоїдних органів у 52 хворих на НГЛ із зрілих В-клітин та 12 хворих на зрілі Т-клітинні лімфоми. Результати дослідження проаналізовано залежно від походження субстратних клітин (В- чи Т-клітиного), морфологічного ступеня злоякісності (низького - LG чи високого - HG) та варіанту лімфоми за класифікацією ВООЗ [Harris et al., 2000], окремо для випадків у стадії лейкемізації (абсолютна кількість лімфоцитів периферичної крові 5109/л) і без ознак лейкемізації.

Для В-НГЛ LG з лейкемізацією характерним є вірогідне зростання експресії вуглеводних детермінант О-глікозидів (антигени Т, F та А) у переважної більшості хворих (р<0,001; pF=0,002), при зниженні послідовностей N-глікозидів, підвищенні фукозилювання (LAL, LCL) і низькій сіалізації (SNL) (табл. 3).

Для пухлинних лімфоцитів у хворих на лімфому з малих лімфоцитів (SLL) порівняно з нормальними лімфоцитами та лімфоцитами при ХЛЛ, характерним є збільшення експресії на мембрані О-глікозидів (лектини PNA, HPL, SBA) при одночасному зменшенні вуглеводних послідовностей, властивих для кoрової частини і бічних ланцюгів гібридного типу N-глікозидів з нижчою їх сіалізацією. При лімфомі маргінальної зони (MZL) для злоякісних лімфоцитів властива підвищена експресія вуглеводних залишків, що містять Galв і GalNАcб, які типові для О-глікозидів. Натомість знижується відсоток клітин, на яких наявні глікозидні структури, що містяться у кoровій частині і бічних ланцюгах N-глікозидів. Зростає рівень залишків Fucб у серцевинному та термінальному положенні. Субстратні лімфоцити при лімфомі з клітин мантії (MCL) характеризуються підвищеним вмістом на мембрані вуглеводних послідовностей Galв і GalNАcб, властивих О-глікозидам (антиген Т, лектин PNA; антиген F, лектин HPL; антиген А, лектин SBA). Посилюється фукозилювання вуглеводних ланцюгів (лектини LCL та LAL). На цих клітинах менше представлені бічні ланцюги глікопротеїнів комплексного, гібридного типу і поліантенні. Вміст сіалової кислоти знижений. При фолікулярній лімфомі (FL) злоякісні лімфоїдні клітини відзначаються високою експресією вуглеводних структур глікопротеїнів на мембрані. Насамперед, зростає рівень О-глікозидів (лектини PNA, HPL, SBA), особливо антигену Т. Вміст N-глікозидів на цих клітинах такий же, як на нормальних лімфоцитах. Зменшується експресія бічних поліантенних ланцюгів комплексного типу та їх сіалізація. Одночасно зростає фукозилювання вуглеводних ланцюгів.

Серед окремих варіантів НГЛ LG дуже високим рівнем мембранних О-глікозидів вирізняється FL, нормальними клітинами-аналогами якої вважають клітини зародкових центрів лімфоїдних фолікулів. MZL і MCL за вмістом О-глікозидів займають проміжне становище. Найнижчим рівнем мембранних О-глікозидів характеризується SLL, однак він вищий, ніж на В-лімфоцитах при ХЛЛ. (табл. 3). Отримані дані підтверджують припущення про зміну рівня експресії вуглеводних залишків О-глікозидів залежно від місця походження і ступеня зрілості клітини-аналога (зародковий центр > зона мантії > маргінальна зона > периферичні клітини), що може демонструвати динаміку змін О-глікозидів мембрани у процесі диференціації В-клітин у лімфоїдних органах.

На малігнізованих клітинах хворих на окремі варіанти НГЛ LG виявлено зміни вуглеводних детермінант у складі N-глікозидів. Найвищий вміст маннозних та повторних залишків GlсNАcв (лектини WGA і STL) спостерігається при FL і MCL. Рівень експресії бічних поліантенних вуглеводних ланцюгів комплексного типу (послідовності Galв1>3(4)GlсNАcв1; лектини RCA і PHA-L) особливо низький у хворих на SLL, найвищий при MCL і FL. Таким чином, найвищі показники експресії вуглеводних залишків N-глікозидів ми спостерігаємо на злоякісних клітинах, аналогами яких є лімфоцити з центрів фолікулів та зони мантії, з поступовим зниженням її рівня у міру диференціювання.

Мембрани субстратних клітин крові при НГЛ високого ступеня (HG), які представлені дифузною великоклітинною В-лімфомою (DLCL), відзначаються низьким рівнем експресії вуглеводних залишків. Лейкемізація DLCL супроводжується помірним зростанням відсотка лімфоцитів, які взаємодіють з PNA та HPL порівняно з нормальними лімфоцитами (р<0,05). На пухлинних лімфоцитах знижується рівень експресії (р<0,05) залишків N-глікозидів (лектини RCA, WGA, STL, PHA-L), серед яких зростає частка Fucб-вмісних, як у серцевинній (лектин LCL), так і у термінальній (лектин LAL) частині. Вірогідно знижується (р<0,01) порівняно із контрольною групою рівень сіалізації глікозидних залишків (лектин SNL).

Таблиця 3

Рівень експресії рецепторів лектинів на лімфоцитах здорових осіб і субстратних клітинах при В-клітинних лейкеміях і лімфомах з лейкемізацією

Лек-тини | Здорові люди

n=15 | В-ГЛЛ

n=10 | ХЛЛ | ВКЛ

n=13 | В-НГЛ LG | В-НГЛ HG

Загальна група

n=67 | І-ІІ

Rai

n=21 | ІІІ-IV

Rai

n=46 | Загальна група

n=19 | SLL

n=6 | MZL

n=3 | MCL

n=4 | FL

n=6 | DLCL

n=3

PNA | vv | v | v | v | v | ^^^ | ^ | ^ | ^ | ^ | ^^ | v

RCA | ^^^ | ^^ | ^ | ^ | ^ | ^^ | ^ | ^ | ^ | ^^ | ^^ | ^

ML-I | v | v | v | v | v | ^ | ^ | ^ | v | v | ^ | v

HPL | vv | ^ | vv | vv | vv | v | ^ | ^ | ^ | ^ | ^ | v

SBA | v | v | vv | vv | v | v | ^ | v | ^ | ^ | ^ | v

LCL | v | v | v | vv | v | v | ^ | ^ | ^ | ^ | ^ | v

PSL | ^^ | ^ | ^ | v | ^ | ^ | ^ | ^ | ^ | ^ | ^ | v

WGA | ^^^ | ^^ | ^ | ^^ | ^ | ^^ | ^^ | ^ | ^ | ^^ | ^^ | ^

STL | ^ | ^ | ^ | ^ | ^ | ^ | ^ | ^ | ^ | ^ | ^ | v

LAL | vv | v | v | v | v | ^ | ^ | ^ | ^ | ^ | ^ | v

SNL | ^ | ^ | v | v | ^ | ^ | v | v | v | v | v | v

PHA-L | ^^^ | ^ | ^ | ^^ | ^ | ^^ | ^ | ^ | ^ | ^^ | ^ | v

Примітка. Стрілками відзначено рівень клітин, що взаємодіють з лектином:

vv - ?10%; v - 10,1-20,0%; ^ - 20,1-40,0%; ^^ - 40,1-60,0%; ^^^ - >60,0%.

Пухлинні лімфоцити периферичної крові при В-НГЛ LG та НГЛ HG значно відрізняються за складом мембранних глікопротеїнових структур (табл. 3). Виявлені розбіжності полягають в тому, що клітини при НГЛ LG містять на поверхні значно більше як О-глікозидів (лектини PNA, HPL, SBA), так і N-глікозидів порівняно з НГЛ HG. На мембрані останніх виявлено нижчий рівень полісахаридів, характерних для кoрової частини N-глікозидів (Manб-структур, лектини LCL, PSL; детермінанти GlсNАc1>1(4)GlсNАc, лектини STL, WGA) і для бічних ланцюгів N-глікозидів (лектини RCA, PHA-L, LAL).

Для порівняння особливостей субстратних клітин при НГЛ у циркуляції і локалізованих у лімфоїдних органах проведено визначення лектинового профілю клітин селезінки (8 хворих) та лімфовузлів (9 хворих), отриманих у суспензії. Встановлено, що лімфоїдні клітини з уражених лімфоїдних органів за змінами експресії вуглеводних ланцюгів О- і N-глікозидів у складі глікопротеїнів відповідають характеристиці злоякісних лімфоцитів периферичної крові, однак відзначаються вищим рівнем сіалізації при НГЛ LG. Лімфоїдні клітини уражених лімфовузлів містять на мембрані більше термінальної Fucб, ніж малігнізовані лімфоцити крові та селезінки.

При Т-клітинних лімфомах шкіри з лейкемізацією (ТКЛШ, синдром Сезарі; 4 хворих) вміст О-глікозидів (антигени Т, F, А) на мембрані пухлинних клітин є підвищеним (р<0,01). На мембрані злоякісно трансформованих CD4+ Т-клітин при ТКЛШ виявляється істотно менша кількість (р<0,001) вуглеводних компонентів N-глікозидів комплексного типу (лектин RCA) і небісектованих поліантенних (лектин PHA-L), та нормальний вміст залишків GlсNАcв (лектини WGA і STL). Рівень фукозилювання глікозидів зростає, а їх сіалізація відповідає нормальним величинам.

Лімфоцити периферичної крові хворих на В- (10 хворих) і Т-клітинні (8 хворих) лімфоми без ознак лейкемізації (кількість лімфоцитів крові <5109/л) за вуглеводною специфічністю глікопротеїнів мембрани відрізняються від нормальних лімфоцитів, і за характером глікозидних залишків подібні до субстратних клітин при лейкемізації процесу, що може вказувати на наявність у крові в цих випадках мінорної популяції малігнізованих лімфоцитів.

При аналізі та узагальненні результатів власних досліджень особливу увагу було зосереджено на можливості використання лектинового фенотипу субстратних клітин при окремих гематоонкологічних хворобах для вияснення їх онтогенезу та на його діагностичному значенні, особливо у випадках, які становлять труднощі в діагностиці.

При гострих лейкеміях констатовано суттєві розбіжності глікопротеїнових структур мембрани найменш диференційованих М0-мієлобластів, В- і Т-лімфобластів (рис.1).

Серед лімфоїдних неоплазій із зрілих В-клітин за низьким рівнем експресії глікозидних структур виділяється ХЛЛ, чим вона відрізняється від ВКЛ, усіх В-НГЛ з лейкемізацією і, зокрема, від SLL (табл. 3). Для ВКЛ характерний високий рівень експресії Т-антигену при відсутності взаємодії з іншими О-глікозидоспецифічними лектинами. Лімфоцити при SLL значно багатші на О- і деякі N-глікопротеїнові структури (антигени Т, F, А, Н, Е-рецептор, комплексні бічні ланцюги) і меншою мірою сіалізовані порівняно з ХЛЛ. Можна припустити, що субстратні клітини при ХЛЛ і SLL, незважаючи на однаковий імунофенотиповий профіль і належність обох хвороб до однієї категорії за класифікацією ВООЗ, мають різний ступінь зрілості.

З’ясовано відмінності вуглеводних компонентів мембрани субстратних клітин при ЛП із зрілих лімфоцитів, зокрема, при В- і Т-клітинних НГЛ, В-клітинних НГЛ з лейкемізацією і лімфоїдних лейкеміях, В-НГЛ LG і HG, окремих варіантах В-НГЛ LG (табл. 3), що може служити додатковим діагностичним і диференційно-діагностичним критерієм окремих варіантів ЛП.

Таким чином, встановлено, що дослідження лектинового фенотипу малігнізованих клітин периферичної крові і/або клітин уражених кісткового мозку чи лімфоїдних органів при гострих лейкеміях та лімфоїдних неоплазіях із зрілих лімфоцитів є важливим методом пізнання біології пухлинної проліферації. Визначення вуглеводних детермінант злоякісних клітин, поряд з клінічною картиною хвороби, морфологічними, імунофенотиповими та генетичними ознаками, є швидким та об’єктивним додатковим діагностичним критерієм