УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ННЦ “ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ”

ШУТЧЕНКО ПАВЛО ОЛЕКСАНДРОВИЧ

УДК 619:579.842.14:611.018:635.5:616–076

ІМУНОГІСТОХІМІЧНА ДІАГНОСТИКА ТА ОЦІНКА КЛІТИННОГО ІМУНІТЕТУ ПРИ САЛЬМОНЕЛЬОЗІ КУРЕЙ

16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Харків – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному науковому центрі “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини”.

Науковий керівник доктор ветеринарних наук, професор,

академік УААН Красніков Г. А.,

ННЦ “ІЕКВМ” завідувач лабораторії

патоморфології

Офіційні опоненти:

доктор ветеринарних наук, професор Апатенко Володимир Максимович, Харківська державна зооветеринарна академія, професор кафедри мікробіології та біотехнології;

доктор ветеринарних наук, професор Фотіна Тетяна Іванівна, Сумський національний аграрний університет, перший проректор, завідувач кафедри ветсанекспертизи, мікробіології та зоогігієни.

Захист відбудеться “4” грудня 2007 р. о 9 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д .359.01 в ННЦ “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини”за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ННЦ “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини” за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий “26” жовтня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор ветеринарних наук, професор А.Ф. Бабкін

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сальмонельоз розглядається як одне з небезпечних захворювань у птахівництві всіх країн світу. Він викликає загибель птиці і є причиною виникнення токсикоінфекцій у людей. Сальмонельози мають велике епізоотичне та епідеміологічне значення. Спостерігається різке збільшення випадків виявлення хазяїноспецифічних сероваріантів сальмонел, виділених від людей і тварин. Одним з основних джерел збудника є хвора птиця, яйця та інші продукти птахівництва. Причинами посилення небезпеки захворювання та можливості зараження людей можуть бути безсимптомне перехворювання на сальмонельоз і хронічне носійство збудників [Ахмедов А. М., 1983; Бессарабов Б. Ф., 1970; Wray C. та ін., 2000; Van Immerseel F. та ін., 2001].

Усе це підкреслює необхідність розробки та впровадження ефективних заходів специфічної профілактики сальмонельозу птиці, які передбачають використання високочутливих і специфічних методів діагностики, застосування активних імунізуючих препаратів, вивчення особливостей стану імунітету за цієї хвороби. Методологічно такі роботи все більше ґрунтуються на використанні імуноферментних методів у мікробіологічних, імунологічних та імуногістохімічних дослідженнях із застосуванням поліклональних та моноклональних антитіл [Berndt A., 2001; Briggs D.., Skeeles J.., 1983; Carlsson H.., Lindberg A.., 1972; Chart H., Rowe B., 1990; Curiale та ін., 1997; Fierens H., Huygebaert A., 1996; GieseJ., 1995; Krussel L., Skovgaard N., 1993; McIlroy S., CohenN.., 1996].

Засоби діагностики сальмонельозів, що застосовуються в Україні, ще трудомісткі і є недостатньо чутливими та специфічними, у той час як за кордоном ведуться активні пошуки сучасних методів і вже починають застосовувати навіть у масштабах державних програм такі високочутливі тести, як ПЛР та ІФА. У ряді країн, зокрема в Німеччині, розпочалися роботи з визначення можливості застосування з цією метою імуногістохімічних досліджень [Berndt A. та ін., 2001]. Отримані дані свідчать про перспективність розвитку таких досліджень, особливо при вивченні динаміки формування імунної відповіді на введення вакцин та після зараження птиці збудниками захворювання. Вони поєднують у собі можливості сучасної гістології та імуногістохімічного аналізу на клітинному або тканинному рівнях і дають можливість диференціювати клітини імунітету у фіксованому матеріалі навіть після тривалого його зберігання [Berndt A., Methner U., 2001; Methner U., Barrow P.., 1997].

Завдяки застосуванню методів імуногістохімії з’явилася можливість дослідити формування імунітету в птиці на рівні субпопуляцій Т- і В-лімфоцитів та макрофагів. Особливо інформативним виявилося використання в імуногістохімії методу, що передбачає застосування міченого стрептавідин-біотину при зараженні птиці Salmonella typhimurium [Berndt A., Methner U., 2001; Odilia L.., Wijburg N. van, 2002].

За своїм принципом методи імуногістохімії ґрунтуються на імуноферментному виявленні антигенів за допомогою специфічних або антивидових сироваток, мічених пероксидазою, у зрізах тканин, мазках, моношарі клітин та ін. [Hsu S-M., .Raine L., 1981; Hsu S-M., Raine L., Fanger H., 1981].

В Україні такі дослідження не здійснювалися. За даними літератури, ці методи в нас ще не знайшли достатнього визнання та застосування, хоча мають значну перспективу у ветеринарній медицині, і на відміну від існуючих методів ІФА, їх можна здійснювати, використовуючи фіксований патологічний матеріал.

Звґязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертаційної роботи є частиною досліджень, передбачених тематичним планом ІЕКВМ УААН: “Дослідити механізми формування клітинного і гуморального імунітету з метою удосконалення методів діагностики, профілактики і лікування заразних хвороб тварин”, 2001–2005 рр, № державної реєстрації 010101U001615 та “Вивчити фундаментальні та прикладні основи формування імунітету і регуляції метаболізму з метою створення нових методів діагностики, лікування та профілактики хвороб тварин, 2006–2010 рр”, № державної реєстрації 0106U000339.

Мета роботи. Метою роботи було визначити за допомогою сучасних імуногістохімічних методів зміни кількості основних кластерів імунокомпетентних клітин селезінки та бурси Фабриціуса в динаміці формування імунітету в курчат після зараження сальмонелами або щеплення їх атенуйованою вакциною проти цього захворювання, розробити методику імуногістохімічного виявлення сальмонельозних антигенів, місць їхньої локалізації в органах курчат, заражених сальмонельозом.

Задачі досліджень.

Для досягнення зазначеної мети були визначені такі завдання:–

вивчити зміни вмісту найбільш показових кластерів клітин імунітету CD3, CD4, CD8, TcR1, TcR2, IgM, IgG, IgA та CVI у бурсі Фабриціуса та селезінці SPF курчат у період між 1-ю та 51-ю добами життя;–

здійснити порівняльні імуногістохімічні дослідження вмісту клітин показових кластерів при формуванні імунітету в курчат різного віку після зараження епізоотичним штамом Salmonella enteritidis;–

визначити динаміку вмісту показових кластерів імунітету в курчат різного віку після щеплення атенуйованою вакциною проти сальмонельозу Salmovac SE;–

вивчити динаміку зміни мас тимуса, бурси Фабриціуса, селезінки, печінки та залозистого шлунка після орального та внутрішньом’язового зараження курчат Salmonella enteritidis;–

опрацювати методику двохетапного імуногістохімічного визначення сальмонельозного антигена в зрізах органів і тканин;–

здійснити імуногістохімічне визначення місць розподілу та кількості сальмонельозного антигена в тканинах та органах імунітету курчат після орального та внутрішньом’язового зараження курчат сальмонелами.

Об’єкт дослідження: сальмонельоз курей та імуногістохімічні методи діагностики цього захворювання.

Предмет дослідження: Динаміка формування імунітету, імуногістохімічна індикація кластерів клітин у здорової (SPF), щепленої та хворої на сальмонельоз птиці, а також динаміка накопичення та місця розташування сальмонельозного антигена у внутрішніх органах і тканинах курчат.

Методи досліджень. Робота виконувалася з використанням серологічних, бактеріологічних, біохімічних, патогістологічних, імуногістохімічних та статистичних методів.

Наукова новизна отриманих результатів. Застосування принципово нового підходу до вивчення особливостей динаміки формування імунітету шляхом імуногістохімічного вивчення відповідальних кластерів клітин дозволяє розпочати новий напрямок його досліджень у ветеринарних наукових закладах України. На підставі здійснених досліджень отримано нові дані про склад кластерів імунітету в курчат різного віку та зміни його при захворюванні і імунізації проти сальмонельозу, встановлені показники кількості та особливості характеру маркованих клітин у нормі, визначені потенціальні можливості імуногістохімії як чутливого і точного методу оцінки стану клітинного (тканинних лімфоцитів, нормальних кілерів, хелперів та макрофагів) і гуморального (клітини, що продукують гама- та секреторні імуноглобуліни) імунітетів. Отримані нові дані про особливості післяінфекційного та післявакцинального імунітетів при сальмонельозі і показана провідна роль фабрицієвої бурси при формуванні імунітету при сальмонельозі.

Ознаки нового має запропонований метод виявлення сальмонельозного антигена в тканинах та органах хворих та інфікованих тварин, що відкриває подальші можливості експресного виявлення продуктів, контамінованих сальмонелами. Певне значення отримані дані мають і для нормальної гістології, бо склад кластерів клітин імунітету здорової птиці потребує ґрунтовного вивчення.

Практичне значення одержаних результатів. У лабораторних умовах розроблено та випробувано спосіб діагностики сальмонельозу курей шляхом імуногістохімічного дослідження продуктів забою птиці на контамінацію сальмонелами та впроваджено рекомендації щодо визначення стану імунітету за вмістом кластерів клітин імунітету при сальмонельозі.

На підставі результатів експериментальних досліджень розроблено “Методичні рекомендації з імуногістохімічної діагностики та оцінки імунітету при сальмонельозі птиці”. Науково-практичну новизну підтверджено патентами: “Спосіб імуногістохімічної діагностики сальмонельозу курей” (27.08.2007, № 25815, G01N33/00) та “Імуногістохімічний спосіб експертизи м’яса і продуктів забою птиці на контамінацію сальмонелами” (03.09.2007, № 26855).

Особистий внесок здобувача.

Автор особисто здійснив аналіз літературних даних за темою роботи, обґрунтував методи наукових досліджень; виконав наукові програми, які покладені в основу дисертації, розробив схеми та методи проведення експериментів; виконав експериментальні та аналітичні дослідження, виконав аналіз та узагальнення одержаних результатів; сформулював висновки і практичні рекомендації, провів роботу з підготовки та затвердження патентних документів.

Бактеріологічні дослідження виконувалися також у лабораторії з вивчення бактеріальних хвороб птиці ННЦ “ІЕКВМ” спільно з к. вет. н. Кіпричем В. В. Серологічні дослідження здійснювалися в лабораторії вивчення хвороб молодняка ННЦ “ІЕКВМ” спільно з к. вет. н. Кольчик О. В. Біохімічні дослідження відбувалися за участю співробітника лабораторії біохімії ННЦ “ІЕКВМ”, к. біол. н. Михайлової С. А.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були повідомлені та обговорені на звітних сесіях вченої ради ННЦ “ІЕКВМ” УААН (м. Харків) у 2002–2006 рр. та науково-практичних конференціях: “Актуальні проблеми ветеринарної медицини в умовах сучасного ведення тваринництва” (АР Крим, м. Феодосія, 2003 р.), ІІІ конференції Всеукраїнського товариства ветеринарних патологів (21 – 23 квітня 2004 р., Харків), Міжнародній науковій конференції “Тварини. Здоров’я. Якість кормів” (15 жовтня 2004 р., Єлгава, Латвія), “Сучасні аспекти розробки маркетингу і виробництва ветеринарних препаратів” (АР Крим, м. Феодосія, 2004 р.), Міжнародній науково_практичній конференції “Современное состояние и актуальные проблемы обеспечения ветеринарного благополучия животноводства” (АР Крим, м. Ялта, 2005 р.), Міжнародній науковій конференції “Актуальные вопросы борьбы с инфекционными заболеваниями в гуманной и ветеринарной медицине” (27 – 30 листопада 2005 р., Харків), Міжнародній науково-виробничій конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження професора Авророва А. А. (22 – 23 червня 2006 року, м. Вороніж, РФ), науково-практичній конференції з міжнародною участю: “Актуальні проблеми молекулярної діагностики у ветеринарній медицині та біології” (22–25 травня 2007 р., АР Крим, м. Феодосія).

Публікації. Основний зміст дисертаційної роботи викладено у 13 наукових працях, із них 12 опубліковані у фахових виданнях, перелік яких затверджено ВАК України. Отримано 2 патенти.

Структура дисертації. Основний зміст дисертації викладено на 125 сторінках друкованого тексту і складається з таких розділів: вступ, огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати власних досліджень, аналіз та узагальнення одержаних результатів, практичні пропозиції, висновки, список використаної літератури, додатки. Роботу ілюстровано 45 рисунками та 6 таблицями. Список використаних літературних джерел містить 223 найменування, серед них 207 праць зарубіжних авторів.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Наукові дослідження виконувалися протягом 2002–2006 років на базі лабораторії патоморфології, лабораторії з вивчення бактеріальних хвороб птиці, лабораторії біохімії та лабораторії вивчення хвороб молодняку Національного наукового центру “Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини”, м. Харків, Україна. При цьому застосовували методи гістологічних, імуногістохімічних, бактеріологічних, серологічних, імунологічних, біохімічних та статистичних досліджень.

Виготовлення гістологічних зрізів із зразків внутрішніх, зокрема імунокомпетентних органів і тканин, здійснювали за загальноприйнятими в гістології методами, зокрема – із застосуванням кріостату та низькотемпературного заморожування.

Динаміку імунітету курчат після зараження та щеплення проти сальмонельозу вивчали за допомогою імуногістохімічного методу міченого стрептавідин-біотину за Giorno. Згідно з цим методом, отримані кріостатні зрізи інкубували з первинними моноклональними антитілами CD3, CD4, CD8, TcR1, TcR2, IgM, IgG, IgA, CVI і в подальшому обробляли біотинованими антимишиними та антикролячими антитілами кози. Антитіла, зв’язані з ферментом після інкубації в стрептавідині, кон’югованому з пероксидазою хрону, візуалізували шляхом додавання 3,3’-діамінобензидину тетрагідрохлориду. Далі зрізи фарбували гематоксиліном.

Імуногістохімічне визначення кількості клітинних субпопуляцій Т-лімфоцитів, В-лімфоцитів та макрофагів у органах (селезінка і бурса Фабриціуса) здійснювали за допомогою комп’ютерної програми “AnalySIS”.

Визначення антигенів сальмонел проводили за допомогою двохетапного методу. Для отримання компонентів дослідження виконували гіперімунізацію кролів за оригінальною методикою лабораторії з вивчення бактеріальних хвороб птиці.

Виділення IgG із сироватки крові на першому етапі здійснювали спиртово-хлороформним методом, а в подальшому із сумарної гама-глобулінової фракції вилучали чистий IgG за допомогою іонообмінної хроматографії на ДЕАЕ-сефадексі А-50 (згідно з методиками, розробленими в лабораторії біохімії ННЦ “ІЕКВМ”.

Розчин отриманого IgG використовувався як поліклональний специфічий імуноглобулін.

Динаміку накопичення сальмонельозного антигена у внутрішніх, зокрема імунокомпетентних, органах і тканинах вивчали за допомогою імуногістохімічного методу, розробленого співробітниками лабораторії патоморфології з використанням специфічних імуноглобулінів та антивидових козячих глобулінів, мічених пероксидазою водню.

Імуногістохімічне визначення сальмонельозного антигена в зрізах із внутрішніх та імунокомпетентних органів здійснювали за допомогою комп’ютерної програми “Adobe Photoshop 5,0”. У зрізах підраховували відсоткове співвідношення позитивно фарбованих ділянок або окремих скупчень коричневого кольору до всієї незабарвленої площі зрізу.

Статистичну обробку одержаних даних проводили за допомогою комп’ютерної програми EXCEL.

Усього в дослідах було використано 219 курчат добового віку та 5 кролів живою вагою до 2-х кілограмів.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Вивчення динаміки кластерів імунітету в інтактних SPF курчат різного віку. При проведенні власних досліджень використовувалися SPF курчата. Було досліджено селезінку та бурсу Фабриціуса 33 курчат, у яких визначали кількість 9 кластерів клітин імунітету на 1-у, 2-у, 3-ю, 6-у, 8-у, 10-у, 13-у, 15-у, 17-у, 21-у та 51-у доби життя.

Дослідженнями встановлено, що кількість клітин досліджуваних кластерів з віком змінювалася, причому характер та динаміка змін у цих головних органах імунітету істотно відрізнялися. Отримані дані свідчили про те, що в селезінці (порівняно з 1-ю добою досліджень) на 8-у– 13-у доби відбувалося різке збільшення (у 2–5 разів) кількості клітин кластерів CD3, CD4, CD8, CVI та IgG. На 15-у добу спостерігалося зниження кількості клітин кластерів CD3, CVI, IgG та IgА за деякого зростання вмісту клітин з маркерами CD4 та CD8 порівняно з 13-ю добою досліджень. На 17-у добу відзначалася певна стабілізація вмісту кластерів на рівні, близькому до їхнього значення на 15-у добу. На 51-у добу відбувалося збільшення вмісту клітин з кластерами CD3, IgG та IgA порівняно із 17-ю добою за незначного зменшення кількості клітин кластерів CVI та CD4. Вміст клітин з маркером IgA помітно скорочувався між 1-ю та 15-ю добами і в подальшому підвищувався, досягаючи максимуму на 51-у добу.

Характер кількісних показників кластерів у бурсі Фабриціуса був істотно іншим. У ній відзначалося значне і безперервне, з 15-ї по 51-у доби, зниження кількості клітин з маркерами CD3 та CD4. З 15-ї доби починалося зменшення кількості клітин з маркером CD8. Кількість клітин кластера CVI утримувалася майже весь час на рівні показників першої доби. Вміст кластера IgG починав стабільно зростати з 13-ї по 51-у доби. Кількість клітин кластера IgА різко підвищувалась майже вдвічі, на 8-у добу і в 6–9 разів на 13-у–15-у та 17-у–51-у доби. Інформативними були дані, отримані при визначенні строків нагромадження максимальної кількості досліджених кластерів (табл. 1).

Таблиця 1

Час максимального накопичення кластерів у селезінці та бурсі Фабриціуса SPF курчат (M+n; n=3)

Назва кластера | Селезінка | Бурса Фабриціуса | Доба виявлення максимального вмісту кластера | Максимальний вміст кластера, % | Доба виявлення максимального вмісту кластера | Максимальний вміст кластера, % | CD3 | 13 | 28,252±4,595 | 1 | 2,574±0,162 | CD4 | 17 | 8,604±0,355 | 1 | 0,267±0,055 | CD8 | 15 | 15,515±1,534 | 1 | 0,654±0,074

CVI | 8 | 70,805±2,519 | 8 | 20,817±0,024

IgG | 13 | 1,780±2,380 | 10 | 1,012±0,158

IgA | 51 | 0,263±0,063 | 10 | 0,237±0,059 |

Отримані дані свідчили про те, що в SPF курчат показники всіх кластерів імунітету були вищими в селезінці. Особливо привертав увагу дуже високий максимальний вміст тканинних лімфоцитів CD3 (до 28,2та макрофагів (70,8що засвідчувало їхнє провідне значення у визначенні стану імунітету в SPF курчат.

Вивчення динаміки кластерів імунітету курчат після щеплення вакциною Salmovac SE. Динаміка імунітету вивчалася на субпопуляційному рівні шляхом визначення кількості 9 згаданих вище кластерів імунокомпетентних клітин Т-лімфоцитів, В-лімфоцитів і макрофагів у селезінці та фабрицієвій бурсі.

Дослідження засвідчили, що в селезінці після введення вакцинного штаму сальмонел чітке зниження кількості клітин з маркером CD3 виявлялось уже на 2-гу добу. Супресивний вплив вакцини спостерігався і на 3-ю добу, але на 6-у добу відбувалося помітне збільшення відсотка CD3, причому кількісні показники в групі імунізованих курчат приблизно вчетверо перевищували їхню величину в попередні строки досліджень. На 17-у–21-у доби відзначалася деяка стабілізація кількості кластера CD3, проте на 51-у добу знову відзначалося зниження відсотка цих клітин.

Відсоток кількості CD4 (хелперів), як і в попередній групі лімфоцитів, змінювався в процесі розвитку реакції на щеплення. Так, після введення вакцини на 1-у–2-у доби спостерігалося зменшення їхньої кількості до 1,9440,467проти 5,5281,173у контролі. Кількість хелперів після введення вакцинного штаму на 21-у добу знову починала дещо зменшуватися.

Характер кривої змін кількості CD8 (цитотоксичних клітин-кілерів) був майже таким, як і в субпопуляції CD3 (табл. 2).

Таблиця 2

Час максимального накопичення кластерів у селезінці та бурсі Фабриціуса вакцинованих проти сальмонельозу курчат (M+n; n=3)

Назва кластера | Селезінка | Бурса Фабриціуса | Доба виявлення максимального вмісту кластера | Максимальний вміст кластера, % | Доба виявлення максимального вмісту кластера | Максимальний вміст кластера, % | CD3 | 8 | 41,953±1,959* | 8 | 8,479±1,178 | CD4 | 8 | 8,119±0,838 | 8 | 0,983±0,338 | CD8 | 8 | 36,924±1,115* | 8 | 5,901±1,203

CVI | 667,343±1,773* | 8 | 30,464±2,365

IgG | 51 | 0,494±0,052** | 51 | 2,856±0,018

IgA | 510,606±0,013* | 17 | 7,205±0,051 | IgМ8 | 2,026±0,502** | 10 | 21,767±2,947 | Примітка: * – р<0,001;

** р<0,05

У субпопуляціях В-лімфоцитів з поверхневими імуноглобулінами G, M та A зміни мали інший характер. Кількість лімфоцитів з маркером IgG у цілому на першу добу мала тенденцію до зниження. На третю добу розміри скупчень цих клітин були близькими до контролю, таким чином, відбувалася певна стабілізація їхньої кількості. Далі спостерігався процес активації, що тривав до кінця строку спостережень на 51-у добу, коли відсоток цих клітин досягав 0,4940,052проти 0,194±0,033на 15-у добу.

Істотних змін кількості лімфоцитів з маркерним імуноглобуліном IgА впродовж перших 10-и діб досліду не спостерігалося. Безперервне збільшення клітин кластера IgА починалось із 13-ї та тривало до 51-ї доби.

Своєрідний тип змін спостерігався при вивченні динаміки розвитку імунної реакції лімфоцитів з маркером IgМ. Було встановлено, що різке зниження їхньої кількості на першу добу в групі вакцинованої птиці змінювалося періодом підвищення їхньої активності на 6-у–8-у доби, причому максимального рівня IgМ досягав на 8-у добу (2,0260,502проти 0,229±0,080на 6-у добу).

На макрофаги з поверхневим маркером CVI вакцина в першу добу діяла супресивно. У подальшому спостерігалося збільшення їх відсотка.

Динаміка змін субпопуляцій клітин бурси Фабриціуса мала певні особливості (табл. 2).

Вивчення субпопуляцій клітин бурси Фабриціуса з маркером CD3 дозволило встановити супресивну дію вакцини на ці клітини в перші три доби після імунізації. Із 6-ї доби спостерігалося чітке збільшення субпопуляції цих клітин. Максимального значення з високим рівнем вірогідності вона досягала на 8-у добу (8,479±1,178

Досить схожим із CD3 був характер змін кількості CD4 (Т-хелперів). Звертало на себе увагу те, що реакція хелперів на вакцинний штам була слабкішою і на 51-у добу практично згасала та була помітно нижчою, ніж після інфікування сальмонелами. Таким чином, хелпери більш активно реагували на інфікування патогенними сальмонелами.

Різке підвищення відсотка TcR2 було зареєстровано ще на першу добу після вакцинації, коли значення цього маркера було максимальним (0,7180,158проти 0,2890,068у групі контролю). Очевидно, воно було обумовлене сильною неспецифічною реакцією (на введення антигена) головного комплексу гістосумісності, до якого належать TcR1 і TcR2.

Своєрідною була реакція макрофагів (маркер CVI) бурси Фабриціуса. Кількість цих клітин у піддослідній і контрольній групах була протягом усього досліду практично однаковою навіть на 51-у добу.

При вивченні кількості клітин з маркером IgM збільшення їхньої кількості відзначено вже з 1-ї доби та становило в імунізованих курчат 3,6390,540(при 1,7370,472у контролі). Максимального значення рівень вмісту IgM досягав на 10-у добу. На 13-у добу величина IgM знижувалася до 5,7671,171(при 21,767±2,947на 10-у добу). Очевидно, це було пов’язано з інтенсивним переходом IgM в IgG на цій стадії розвитку імунного процесу.

Кількість клітин з маркером IgG у бурсі Фабриціуса вакцинованих курчат не відрізнялась постійністю й до 10-ї доби була в більшості випадків нижчою, ніж у контрольної групи птиці. Лише на 13-у добу було зареєстроване чітке зростання вмісту IgG в імунізованих курчат (2,7790,121проти 0,814±0,185на 10-у добу). Приблизно на цьому рівні утримувалося кількісне значення цього кластера від початку до кінця досліду, що засвідчувало становлення гуморального імунітету в курчат при сальмонельозі вже у віці 13-и–15-и діб. Отримані дані суттєво відрізнялися від тих, які були отримані при вивченні цих кластерів у селезінці. Вони свідчили про те, що у формуванні імуноглобулінів при сальмонельозі курчат раннього віку вирішальне значення має кластер IgG В-клітин бурси Фабриціуса.

Вміст маркеру IgА, починаючи з перших діб проведених досліджень, постійно зростав у бурсі Фабриціуса імунізованих курчат. Процес збільшення тривав з 8-ї до 21-ї доби включно, коли рівень IgА досягав максимальних значень (7,263±0,045при 0,176±0,007% у контролі). Лише на 51-у добу відзначене зниження вмісту лімфоцитів з поверхневим маркером IgА (рис. 1).

Динаміка кластерів клітин імунітету курчат, мічених стрептавідин-біотином, після застосування епізоотичного штаму S. enteritidis SE 147. У селезінці інфікованих курчат у найбільш ранній період відзначалася своєрідна фаза супресії популяції клітин з поверхневим маркером CD3, особливо чітко виражена в перші три доби. Максимальних значень рівень CD3 досягав на 6-у, 8-у та 10-у доби після зараження (табл. 3).

При вивченні субпопуляції Т-лімфоцитів з поверхневим маркером CD4 (Т-хелпери) було встановлено 2 етапи збільшення вмісту цих клітин. Перший етап спостерігався з першої по 10-у доби. Після різкого спаду активності на 13-у добу спостерігалася друга хвиля зростання відсоткового вмісту CD4 з піком на 15-у добу (табл. 3).

При вивченні динаміки змін імунокомпетентних клітин селезінки з поверхневим маркером CD8 було встановлено зменшення кількості цих цитотоксичних лімфоцитів у перші дві доби спостережень. Максимальний рівень CD8 було зареєстровано на 8-у добу. Друга хвиля постсупресивного зростання кількості клітин з маркером CD8 спостерігалася на 15-у добу (табл. 3). Високий рівень CD8 у період з 8-ї по 10-у доби значною мірою та досить демонстративно відображав загальний характер розвитку імунного процесу при сальмонельозі.

Таблиця 3

Час максимального накопичення кластерів у селезінці та бурсі Фабриціуса в курчат, заражених сальмонелами (M+n; n=3)

Назва кластера | Селезінка | Бурса Фабриціуса | Доба виявлення максимального вмісту кластера | Максимальний вміст кластера, % | Доба виявлення максимального вмісту кластера | Максимальний вміст кластера, % | CD3 | 8 | 28,898±1,299 | 8 | 19,311±1,278* | CD4 | 15 | 9,851±1,708 | 15–17 | 3,721±0,187* | CD8 | 15 | 18,697±1,056 | 8–13 | 14,769±1,196*

CVI | 8 | 66,352±1,242 | 13 | 19,138±2,057

IgG | 8 | 0,655±0,158 | 51 | 2,029±0,044*

IgA | 510,761±0,094* | 13–17 | 8,914±3,385 | Примітка: * – різниця значень показників дослідних тварин (1-а група) вірогідна за р<0,001 відносно рівня значень відповідних показників у групі контролю.

Динаміка змін субпопуляції TcR2 була дуже схожою із CD8.

Характер динаміки змін субпопуляції В-лімфоцитів з поверхневим маркером IgM був таким, як і в групі імунізованих курчат, тобто спостерігався період підвищення активності з першої по 8-у добу включно. Але, на відміну від групи імунізованих курчат, у групі інфікованої птиці це збільшення було значно сильнішим. У період з 15-ї і по 51-у доби відбувалося стабільне зниження величини відсоткового вмісту цієї субпопуляції, що вірогідно можна пояснювати переходом IgM в IgG.

При вивченні субпопуляції В-лімфоцитів з поверхневим маркером IgG у перші два тижні після інокуляції збудника не було встановлено стійкої тенденції до збільшення або зменшення кількості IgG. Це могло вказувати на те, що кінцеве формування IgG з його попередника IgМ відбувається на 14-у добу життя.

Як і в імунізованих курчат, так і в групі інфікованих курчат при вивченні В-лімфоцитів з поверхневим маркером IgА не було встановлено чіткої тенденції до збільшення або зменшення відсоткового вмісту IgА в селезінці протягом перших 13-ти діб досліджень. На 21-у й на 51-у доби встановлено різке збільшення кількості клітин кластера IgА, особливо на 51-у добу, коли його відсоток становив 0,7610,094при 0,2630,063у групі контролю.

У цілому дослідження групи лімфоцитів з маркерами імуноглобулінів у селезінці свідчили про відсутність чітких проявів збільшення кількості глобулінекспресуючих субпопуляцій клітин, зокрема лімфоцитів з маркерами IgG та IgА та про супресію субпопуляції IgМ, яка розвивалася наприкінці періоду досліджень.

Зростання субпопуляції мононуклеарів з поверхневим маркером CVI (макрофагів) відзначалося в більш ранні строки, ніж у інших субпопуляцій, тобто вже на 3-ю добу, і зберігалося до 6-ї доби, що пояснюється, можливо, їхньою найбільш ранньою взаємодією з антигеном як ланки, що забезпечує подання переробленої антигенної субстанції виконавчим клітинам.

Дослідженнями кластерів імунних клітин у бурсі Фабриціуса в курчат установлено, що в субпопуляції лімфоцитів з поверхневим маркером CD3, який характеризує загальну кількість тканинних Т-лімфоцитів у лімфоїдному органі, у інфікованої птиці на 1-у та 2-у доби спостерігалася тенденція до зниження, і лише з 3-ї доби спостерігалися незначні позитивні зрушення із збільшенням відсотка CD3–4,5500,592проти 2,781±0,562у курчат на 1-у добу. Максимальне зростання кількості CD3 клітин установлено на 8-у добу, коли в цій групі піддослідних курчат відсоток CD3 становив 19,3111,278проти 8,513±2,428на 6-у добу.

Величина маркера CD4 виявляла слабку тенденцію до збільшення в перші дві доби. На 3-ю добу збільшення відсотка Т-хелперів досягало в групі інфікованих курчат високого значення (1,1130,458проти 0,474±0,178на 2-у добу). Як свідчать дані, подані на рис. 2, вірогідне збільшення площі клітин з маркером CD4 тривало до 21-ї доби.

При вивченні динаміки змін субпопуляції Т-лімфоцитів з поверхневим маркером CD8 у бурсі Фабриціуса в групі заражених курчат була встановлена деяка супресія. Але з 8-ї доби після інфікування спостерігався процес збільшення вмісту маркера з максимальним рівнем на 13-у добу–14,7691,196

Кількісні зміни кластера TcR1 також указували на його активну участь у захисті курчат проти сальмонельозу. Так, на 2-у добу спостерігали супресію TcR1. Але, на відміну від CD8, процес різкого підвищення починався раніше – вже на 6-у добу та тривав до 10-ї доби (3,9200,507проти 3,623±0,594на 8-у добу). Від групи імунізованих курчат рівень TcR1 відрізнявся більш тривалим і сильним постсупресивним його зростанням.

Суттєве зниження кількості лімфоцитів з маркером TcR2, більш виражене, ніж TcR1, спостерігалось уже на 3-ю добу. Значне підвищення кількості TcR2 відзначали на 8-у добу, і особливо на 10-у (1,4150,190при 0,864±0,143на 8-у добу).

При вивченні клітин з маркером IgM збільшення їхнього вмісту виявили на 6-у добу після інфікування (8,9432,045проти 5,3950,590у групі контролю). Потім відбувалося збільшення кількості клітин з цим поверхневим маркером на 10-у добу та різке зменшення на 13-у добу до 6,7470,743що можна було пояснити перетворенням клітин з маркером IgM на клітини з маркером IgG після 10-ї доби досліду.

Це положення підтверджувалося даними детекції лімфоцитів з поверхневим маркером IgG. Як засвідчили здійснені дослідження, кількість клітин з маркером IgG у бурсі Фабриціуса піддослідних і контрольних курчат зростала та утримувалась майже на однаковому рівні між 1-ю та 10-ю добами. Потім спостерігалося різке підвищення їхньої кількості на 13-у добу (до 1,848±0,801проти 0,624±0,121на 6-у добу).

При вивченні лімфоцитів з поверхневим маркером IgА в бурсі Фабриціуса встановлена винятково висока їхня активність, яка досить сильно виражена вже на 8-у добу (5,9071,572проти 0,052±0,008на 1-у добу). На 51-у добу відзначено часткове зниження їхньої кількості, яка, однак, залишалася набагато вищою, ніж у контролі. На 13-у добу рівень вмісту IgА досягав максимуму та становив 8,914±3,385

Отже, звертала на себе увагу активна участь у формуванні імунітету при сальмонельозі клітин бурси Фабриціуса, що продукують імуноглобуліни. У бурсі Фабриціуса лімфоцитів з маркером IgА було більше, ніж у селезінці, також багато було в ній і клітин з маркером IgG, у той час, як у селезінці вміст останніх був незначним, що підкреслювало вирішальне значення фабрицієвої бурси у формуванні гуморальної імунної відповіді птиці.

Проте, в бурсі Фабриціуса інфікованих курчат набагато сильніше зростав вміст клітин з маркерами CD3, CD4, CD8, TcR1, TcR2, IgM, IgA, а рівень вмісту клітин з маркером IgG був вищим у вакцинованої птиці. У інфікованих курчат у бурсі Фабриціуса, на відміну від імунізованих, набагато сильніше збільшується вміст лімфоцитів з поверхневими маркерами CD3, CD4, CD8, TcR1, TcR2, а в селезінці також і клітин з маркерами IgM, IgA. Збільшення кількості кластерів імунітету за винятком макрофагів (CVI) після імунізації було у фабрицієвій бурсі набагато сильніше виражено, ніж у селезінці. Наведені дані підтверджують висловлену раніше тезу про більшу роль бурси Фабриціуса, хоча свідчать про те, що обидва органи різною мірою беруть участь у формуванні імунного захисту як при інфікуванні сальмонельозом, так і при щепленні атенуйованою вакциною. Заслуговував на увагу той факт, що рівні вмісту клітин з маркерами IgG та IgA у фабрицієвій бурсі досягали максимуму на 13-ту – 15-ту доби, причому кількість IgG була більшою в імунізованої птиці, а рівень вмісту IgA був вищим у птиці, зараженої патогенним збудником. Отже, за даними імуногістохімічних досліджень формування імунітету в організмі щепленої та інфікованої птиці настає на 13-у–15-у доби за участі обох основних кластерів продуцентів імуноглобулінів.

Імунітет, що формувався після зараження сальмонельозом та щеплення курчат проти нього, мав певні відмінності. Як свідчать дані проведених досліджень, існують також інші відмінності в характері динаміки змін інших кластерів у групах щеплених та заражених курчат. Так, зокрема встановлено, що кількість клітин кластера CD8 у селезінці зростає значно сильніше в групах імунізованих курчат, у той час як кількість клітин з маркерами CD3, CD8, TcR1 та TcR2 стабільніше зростала в інфікованих курчат. Виходячи з цього, можна припускати, що при зараженні курчат більш активно спрацьовує функція первинного клітинного захисту, а при вакцинації сильніше виражені прояви антитільного, гуморального імунітету. Звертало на себе увагу й те, що при зараженні курчат у бурсі Фабриціуса сильніше визначалося збільшення кількості (а отже, й посилення активності) лімфоцитів з поверхневими маркерами CD3, CD4, CD8, TcR1, TсR2, IgA, IgM, а в селезінці – кластера IgM.

Заслуговувало на увагу те, що в бурсі Фабриціуса дуже чітко, на протилежність групі інфікованих курчат, визначалося домінування на 8-у – 51-у доби клітин кластера IgG. Причому високий і стабільний рівень їхнього вмісту утримувався з 13-ї по 51-у доби включно. Отже, імуногістохімічне визначення кількості кластера IgG може бути критерієм визначення активності протисальмонельозних вакцин. Привертає увагу те, що в зараженої птиці превалюють клітини кластера IgA, у той час як у щеплених курчат превалюють клітини кластера IgG, що може бути використано для диференціації післявакцинального та післяінфекційного імунітетів за цього захворювання.

Вивчення динаміки накопичення сальмонельозного антигена у внутрішніх та імунокомпетентних органах і тканинах курчат після орального зараження Salmonella enteritidis. Дослідження здійснювали на 90 головах курчат добового віку породи Білий Легорн, з яких було сформовано 2 групи: інфіковані та контрольні. Забій курчат проводили на 5-у, 8-у, 10-у, 13-у, 15-у, 17-у, 21-у та 51-у доби після інфікування.

Метою цих досліджень було розробити імуногістохімічний метод визначення специфічних антигенів сальмонел у тканинах хворої на сальмонельоз птиці для індикації уражених збудником органів і тканин.

Сальмонельозний антиген у гістологічних препаратах тканин і органів тварин дослідної групи після імуногістохімічного фарбування мав вигляд локальних або дифузних скупчень округлої та глибчастої форми коричневого кольору на загальному синьому фоні. На гістологічних зрізах тканин та органів тварин контрольної групи таких скупчень не спостерігалося.

При дослідженні змін у залозистому шлунку на 5-у добу було встановлено, що сальмонельозний антиген у вигляді дрібних глибок накопичувався лише в стінках головних залоз. Відсоткова кількість антигена становила 1,58±0,007При вивченні імуногістохімічних змін у залозистому шлунку на 10-у добу спостережень було встановлено, що антиген сальмонели накопичувався в просвіті кровоносних судин. Поодинокі його глибки спостерігались у стінках головних залоз. Відсоткова кількість антигена складала 3,23±0,035відносно всієї площі гістологічного зрізу. Максимальних показників кількість сальмонельозного антигена набувала на 15-у добу досліджень і становила 5,09±0,055

Досить слабко на зараження сальмонельозом реагували тканини бурси Фабриціуса в перші два тижні спостережень. Антиген виявляли лише в міжфолікулярній сполучній тканині у вигляді окремих дрібних глибок. Маса бурси Фабриціуса на 5-у добу дорівнювала 0,057±0,010 г у інфікованих курчат проти 0,085±0,011 г у групі здорових контрольних курчат. Звертав на себе увагу той факт, що з 17-ї доби спостерігалося різке збільшення відсоткової кількості антигена в бурсі Фабриціуса, коли його вміст досягав максимального значення та дорівнював 14,42±0,12

При аналізі імуногістохімічних змін у селезінці встановлено дві хвилі помітного підвищення відсоткової кількості сальмонельозного антигена – на 8-у та 15-у доби досліджень. Кількість антигена на 5-у добу була в цілому невеликою – 2,23±0,031Але вже на 8-у добу спостерігалася перша хвиля підйому вмісту сальмонельозного антигена, коли його відсоткова кількість становила 13,58±0,046У цей період антиген накопичувався навколо ретикуло-ендотеліальних муфт, де він фіксувався періеліпсоїдами–клітинами, розташованими по периферії муфт. Друга хвиля різкого підвищення вмісту сальмонельозного антигена була зареєстрована на 15-у добу спостережень. Площа, яку займав антиген у селезінці на 15-у добу, становила 34,75±0,038У наступний період, між 17-ю та 51-ю добами, спостерігався спад активності накопичення антигена сальмонели, особливо виражений на 21-у і 51-у доби досліджень.

Що стосується сліпої кишки, то динаміка накопичення антигена сальмонели в цьому органі була дуже схожою з такою в бурсі Фабриціуса. На 17-у добу досліджень спостерігали різке збільшення вмісту антигена, коли його рівень досягав 19,36±0,084і він накопичувався в підслизовому шарі та просвіті кровоносних судин. Максимальна кількість сальмонельозного антигена відзначена на 21-у добу (19,82±0,049

Вивчення динаміки накопичення сальмонельозного антигена в м’язовій тканині дозволило встановити дуже низький його рівень. З 5-ї до 13-ї доби антиген виявляли лише між окремими м’язовими волокнами у вигляді поодиноких гранул. Площа, яку займав антиген на 5-у добу, становила 1,02±0,014Максимальний рівень накопичення антигена спостерігався на 17-у добу, коли його вміст досягав 2,85±0,053

Тенденція до поступового збільшення вмісту сальмонельозного антигена відзначена і в тимусі.

Як свідчать дані рисунка 3, при аналізі імуногістохімічних змін у печінці встановлено різке (майже вдвічі) підвищення рівня накопичення антигена сальмонели (з 4,67±0,028на 5-у добу до 8,61±0,032на 8-у добу). Основним місцем накопичення антигена на цей час був просвіт кровоносних судин. У наступний період, з 10-ї до 13-ї доби, кількість антигена в органі повільно зростала на 13-у добу досліджень. Максимального рівня процес накопичення антигена досягав на 15-у добу після інфікування, коли відсоткова його кількість досягла 14,80±0,028Антигенні скупчення набували дифузного характеру.

Отже, одержані результати свідчать, що більшу кількість антигена сальмонели було виявлено в гістологічних зрізах селезінки та печінки. З цього можна зробити висновок, що за орального зараження курчат збудник сальмонельозу в основному розмножується і накопичується в селезінці та печінці, і менше в інших органах, що досліджувалися. Частіше імунофарбований антиген спостерігався в структурах, багатих на ретикуло-ендотеліальні клітини.

Вивчення динаміки накопичення сальмонельозного антигена у внутрішніх та імунокомпетентних органах і тканинах курчат після внутрішньом’язового зараження Salmonella enteritidis. Дослідження проводили на 30 головах курчат породи Білий Легорн 14-добового віку, з яких було сформовано 2 групи: 1-а група–інфіковані, 2-а група–контрольна. Забій курчат проводили на 15-у, 30-у та 45-у доби після інфікування.

У залозистому шлунку інфікованих курчат відзначали накопичення сальмонельозного антигена в основному протягом першого місяця досліджень. Так, якщо на 15-у добу кількість антигена становила 9,79±0,042то вже на 30-у добу вона досягла 8,77±0,043Залозисті шлунки від контрольних, інтактних курчат переважали за масою інфікованих майже вдвічі.

При дослідженні імуногістохімічних змін у бурсі Фабриціуса було встановлено різке підвищення кількості сальмонельозного антигена на 15-у добу, коли максимальний його вміст становив 6,20±0,014Слід зазначити, що в цей період досліджень зареєстровано велику різницю (майже у 8 разів) між масою цього органу в інфікованих та контрольних курчат. На 30-у