НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

Шебеко Сергій костянтинович

УДК: 547.455.623`233.1:615.276:616.611-002

Експериментальне обґрунтування застосування глюкозаміну гідрохлориду та його комбінації з диклофенаком натрію в терапії гломерулонефритів

14.03.05 – фармакологія

Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата фармацевтичних наук

Харків – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі клінічної фармакології з фармацевтичною
опікою Національного фармацевтичного університету, Міністерство охорони здоров’я України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор
Зупанець Ігор Альбертович,
Національний фармацевтичний університет МОЗ України, завідувач кафедри клінічної фармакології
з фармацевтичною опікою

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
МАСЛОВА Наталія Федорівна,
ДП “Державний науковий центр лікарських
засобів” МОЗ України,
завідувачка лабораторії біохімічної фармакології

доктор медичних наук, професор
КОСУБА Раїса Борисівна,
Буковинський державний медичний
університет МОЗ України,
завідувачка кафедри фармації

Захист відбудеться 14 грудня 2007 р. о 1000 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д.64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного

фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий 12 листопада 2007 р.

Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
доктор біологічних наук, професор

Л.М. Малоштан |

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Однією з важливих проблем медичної та фармацевтичної практики сьогодення є вдосконалення методів лікування хворих на гломерулонефрити, що пов’язано з великим медико-соціальним значенням даної патології (Л.А. Пиріг, 2001). Передусім, гломерулонефрит є найпоширенішим захворюванням нирок і характеризується високим рівнем летальності пацієнтів. Крім того, дане захворювання уражує переважно молодих чоловіків працездатного віку і часто супроводжується розвитком ниркової недостатності, інвалідизацією хворих, що знижує якість їх життя та соціальну значущість (Н.Н. Петрова c соавт., 2003; Л.А. Пиріг зі співавт., 2004). При цьому, незважаючи на багатогранність патогенезу гломерулонефритів, арсенал ефективних засобів їх патогенетичної терапії дуже обмежений і основні зусилля клініцистів спрямовані насамперед на гальмування темпів прогресування захворювання та віддалення розвитку ниркової недостатності
(Ж.Д. Семидоцька, 2001; А.В. Смирнов c соавт., 2004; І. Дудар, М. Величко, 2004). Тому створення нових препаратів для лікування пацієнтів даного профілю є актуальним завданням сучасної експериментальної та клінічної фармакології.

Все більше уваги вчених у терапії хворих даної групи приділяється неімунним механізмам прогресування патології: стану гломерулярної базальної мембрани та відновленню її структурно-функціональної цілісності. Детальний аналіз наукових досліджень свідчить, що це можливо під впливом аміноцукру глюкозаміну, який міститься у великій кількості у нирковій тканині (І.А. Зупанець зі співавт., 2002), входить у складі глікозаміногліканів до структури базальних мембран та виконує ряд важливих фізіологічних функцій у нирках (I.C. Raats et al., 2000; W.M. Deen et al., 2001; P. Mundel, S. Shankland, 2002).

У Національному фармацевтичному університеті (м. Харків) ведеться активна науково-дослідна робота по фармакологічному вивченню аміноцукру
2-D-(+)-глюкозаміну та його похідних. В ході досліджень було визначено, що глюкозаміну гідрохлорид проявляє широкий спектр фармакологічної активності, а саме, мембранопротекторний, антиоксидантний, протизапальний, репаративний, гепато-, кардіо- та хондропротекторний ефекти (С.В. Мисюрева, 2001; А.Н. Семенов, 2001; Н.В. Бездетко, 2003; І.А. Зупанець зі співавт., 2002, 2004). Крім того, експериментально було доведено, що глюкозаміну гідрохлорид потенціює протизапальний ефект диклофенаку натрію та знижує його токсичність (І.А. Зупанець зі співавт., 2002, 2004; І.А. Отрішко, 2005). Це може значно розширити можливості застосування нестероїдних протизапальних препаратів (НПЗП) в нефрології, які обмежені наявністю у них нефротоксичної дії (И.Е. Тареева, 2000; Е. Шилов, С. Андросова, 2002). Враховуючи особливості фармакодинаміки глюкозаміну, можна припустити, що при умові нівелювання нефротоксичних ефектів НПЗП під його впливом, можливо отримати перспективний препарат нефропротекторної дії, що, з одного боку, буде поєднувати властивості високоефективного мембранопротектора, а з іншого – антифлогістика, і таким чином повністю буде відповідати патогенетично обґрунтованим напрямкам терапії гломерулонефритів.

У зв'язку з вищевикладеним актуальним представляється вивчення нефропротекторних властивостей глюкозаміну гідрохлориду, його похідних та комбінації з диклофенаком натрію, а також можливостей застосування даних засобів в терапії запально-деструктивних захворювань нирок.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана відповідно до планів НДР Національного фармацевтичного університету у складі комплексних тем: „Хімічний синтез, виділення та аналіз нових фармакологічно активних речовин, встановлення зв'язку „структура-активність”, створення нових лікарських препаратів” (№ держ. реєстр. 0198U007011); „Фармакологічні дослідження біологічно-активних речовин і лікарських засобів синтетичного і природного походження, їх застосування в медичній практиці” (№ держ. реєстр. 0103U000478); „Вивчення ролі глюкозаміну в молекулярних механізмах запалення і розробка критеріїв створення нових антифлогістиків” (№ держ. реєстр. UAO 1002852).

Мета і задачі дослідження. Метою досліджень є експериментальне обґрунтування застосування глюкозаміну гідрохлориду, його похідних та комбінації з диклофенаком натрію для підвищення ефективності лікування хворих на гломерулонефрити.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі:

1. Визначити роль та патофізіологічне значення ендогенного N-ацетилглю-козаміну при запально-деструктивних захворюваннях нирок різної етіології.

2. Провести фармакологічний скринінг нефропротекторних властивостей глюкозаміну гідрохлориду, деяких його похідних та комбінації з диклофенаком натрію в умовах мембранозної нефропатії у лабораторних тварин.

3. Дослідити фармакологічні властивості відібраних на етапі скринінгу субстанцій та препаратів на моделі експериментального аутоімунного гломерулонефриту.

4. Вивчити вплив найперспективніших засобів на перебіг хронічного гломерулонефриту у тварин у пізні терміни розвитку.

5. Провести гістоморфологічне дослідження морфо- та ультраструктури ниркової тканини при експериментальному гломерулонефриті під впливом субстанцій та препаратів, відібраних на етапі скринінгу.

6. Вивчити вплив дослідних засобів на перебіг гострої ниркової недостатності у лабораторних тварин.

7. Провести вивчення фармакологічних властивостей дослідних субстанцій та препаратів при експериментальній хронічній нирковій недостатності.

Об'єкти дослідження. Похідні аміноцукру глюкозаміну гідрохлориду,
2-карбоксисукцинанілових кислот, композиція диклофенаку натрію з глюкозаміну гідрохлоридом.

Предмет дослідження. Нефропротекторні властивості глюкозаміну гідрохлориду, його похідних та композиції глюкозаміну гідрохлориду з диклофенаком натрію; вплив даних засобів на перебіг у щурів різних експериментально модельованих уражень нирок.

Методи дослідження. При виконанні роботи були використані фармакологічні, біологічні, клінічні, біохімічні, гістологічні методи дослідження та методи математичної статистики.

Наукова новизна отриманих результатів. У роботі вперше визначена роль ендогенного N-ацетилглюкозаміну у розвитку ниркової патології, вивчено обмін даного аміноцукру в організмі тварин на різних моделях запально-деструктивних захворювань нирок і встановлено зниження його вмісту у нирковій тканині та відповідне підвищення у сироватці крові при цих патологічних станах.

Вперше встановлено наявність нефропротекторної активності серед похідних глюкозаміну, яка знаходиться в кореляції із питомим вмістом аміноцукру як вільної основи у складі дослідних засобів; виявлені засоби перспективні для застосування в терапії запальних захворювань нирок.

Серед похідних глюкозаміну та 2-карбокси-сукцин-анілової кислоти виявлені сполуки з вираженою діуретичною активністю (патент України №77354 від 15.11.2006р. „D-(+)-глюкозамонієва сіль 4’-броманіліду 4,6-дихлор-2-карбокси-сукцин-анілової кислоти, яка проявляє нейролептичну, антигіпоксичну, протизапальну, анальгетичну, діуретичну, фунгістатичну активність”).

Вперше в експерименті на тваринах визначено позитивний вплив глюкозаміну гідрохлориду та його комбінації з диклофенаком натрію на перебіг аутоімунного гломерулонефриту, а також гострої та хронічної ниркової недостатності, що проявлявся в нормалізації показників функціонального стану нирок, клінічних та біохімічних аналізів крові, а також збереженні морфо- та ультраструктури ниркової тканини.

Практичне значення одержаних результатів. Для спеціалістів з експериментальної фармакології визначені напрямки пошуку та критерії створення нових високоефективних засобів нефропротекторної дії та розроблено нову модифікацію експериментальної моделі ниркової патології для проведення скринінгових досліджень засобів з нефропротекторною активністю. У якості показника ступеня ураження нирок та ефективності їх фармакотерапії запропоновано використовувати вміст ендогенного N-ацетил-глюкозаміну, а також удосконалений метод визначення його вмісту у сироватці крові та гомогенаті нирок.

На підставі доклінічного вивчення глюкозаміну гідрохлориду та його комбінації з диклофенаком натрію на різних моделях ниркової патології доведена доцільність застосування цих засобів в терапії запальних захворювань нирок.

Основні результати досліджень впроваджені у практичну діяльність фахівців з експериментальної та клінічної фармакології у вигляді інформаційного листа „Оптимізація пошуку ефективних лікарських засобів нефропротекторної та гіпоазотемічної дії” (2007 р.). За результатами проведених досліджень розроблено методичні рекомендації для провізорів та лікарів „Модифікація фармакологічних властивостей нестероїдних протизапальних препаратів аміноцукром глюкозаміну гідрохлоридом” (2007 р.), що впроваджено в практику Національного наукового центру „Інститут кардіології ім. М.Д. Стражеска” АМН України (м. Київ), Інституту патології хребта та суглобів ім. проф. М.І. Ситенка АМН України (м. Харків).

Результати роботи впроваджені у навчальний процес на кафедрі фармакології Національного фармацевтичного університету (м. Харків), кафедрі пропедевтики внутрішньої медицини №2 Харківського державного медичного університету (м. Харків), кафедрі фармакології з курсом клінічної фармакології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця (м. Київ), кафедрі фармакології з клінічними фармакологією та фармакотерапією Тернопільського медичного університету ім. І.Я. Горбачевського (м. Тернопіль), кафедрі нефрології Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика (м. Київ).

Особистий внесок здобувача. Разом з науковим керівником визначені мета і завдання дослідження, розроблені методичні підходи, згідно з якими відібрані моделі та методи для виконання експериментальної частини дисертації. Особисто проведені патентно-інформаційний пошук, експериментальні дослідження, статистична обробка, аналіз та систематизація отриманих результатів, сформульовані висновки. У наукових працях, опублікованих у співавторстві, дисертантом наведені результати власних експериментальних досліджень, прийнята участь в аналізі та узагальненні отриманих даних, у написанні статей.

Електронно-мікроскопічні дослідження проведені на базі лабораторії патоморфології з групою електронної мікроскопії Інституту медичної радіології
ім. С.П. Григор’єва АМН України, морфологічні дослідження – на базі кафедри патологічної анатомії Харківського державного медичного університету.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи викладені і обговорені на Всеукраїнській науково-практичній конференції „Фармація ХХІ століття” (м. Харків, 2002); VII з’їзді Всеукраїнського лікарського товариства (м. Тернопіль, 2003); Міжнародній науково-практичній конференції „Україна наукова 2003” (м. Дніпропетровськ, 2003); Міжнародній науково-практичній конференції „Клінічна фармація: 10 років в Україні”
(м. Харків, 2003); V та VІ Всеукраїнських науково-практичних конференціях „Клінічна фармація в Україні” (м. Харків, 2004, 2007); IV Українській науково-практичній конференції з клінічної фармакології „Актуальні питання фармакології” (м. Вінниця, 2004); Всеукраїнському науково-практичному семінарі
„Перспективи створення в Україні лікарських препаратів різної спрямованості дії” (м. Харків, 2004); VI Національному з’їзді фармацевтів України „Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України” (м. Харків, 2005); Міжнародному медико-фармацев-тичному конгресі „Ліки та життя” (м. Київ, 2007).

Публікації. За матеріалами даної дисертації опубліковано 22 наукові роботи. З них – 9 статей у наукових фахових журналах, 10 тез доповідей на науково-практичних конференціях, патент України, інформаційний лист, методичні рекомендації.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, 4-х розділів експериментальних досліджень, аналізу й узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел. Загальний об’єм дисертації складає 166 сторінок друкованого тексту. Робота ілюстрована 19 таблицями та 54 рисунками. Перелік використаних джерел містить 250 найменувань, з яких 123 – іноземні.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Об’єктами досліджень були обрані глюкозаміну гідрохлорид (ГА г/х), глюкозаміну сульфат, глюкозаміну пентаацетат, D-(+)-глюкозамонієва сіль 4’-броманіліду 4,6-дихлор-2-карбоксисукцин-анілової кислоти (субстанція І), 4’-броманілід 4,6-дихлор-2-карбоксисукцин-анілової кислоти (субстанція ІІ), 2’-хлоранілід 4,6-дихлор-2-карбоксисукцин-анілової кислоти (субстанція ІІІ) та композиція на основі глюкозаміну гідрохлориду та диклофенаку натрію (ДН). Похідні 2-карбокси-сукцина-нілових кислот (субстанції І, ІІ, ІІІ) були синтезовані на кафедрі фармацевтичної хімії НФаУ під керівництвом доцента С.Г. Ісаєва. Технологія таблетованої лікарської форми на основі композиції диклофенаку натрію з глюкозаміну гідрохлоридом розроблена на ЗАТ НВЦ „Борщагівський ХФЗ” під керівництвом канд. хім. наук А.С. Шаламая.

Фармакологічні дослідження проведені на 660 білих нелінійних щурах, що були вирощені у розпліднику ЦНДЛ НФаУ та утримувались на стандартному харчовому раціоні у відповідності з санітарно-гігієнічними нормами.

Основні етапи досліджень представлені на схемі. На першому етапі було проведено вивчення динаміки вмісту ендогенного N-ацетилглюкозаміну
(N-ацГА) у тварин з мембранозною нефропатією, яку відтворювали у власній модифікації шляхом внутрішньочеревинного введення розчину доксорубіцину в дозі 10 мг/кг (І.А. Зупанець, С.К. Шебеко, 2004). Вміст аміноцукру визначали у сироватці крові та гомогенаті ниркової тканини щурів на 14 та 21 добу розвитку патології у порівнянні з інтактними тваринами.

На наступному етапі було проведено фармакологічний скринінг нефропротекторних властивостей досліджуваних засобів в умовах розвитку у тварин мембранозної нефропатії, яку моделювали за допомогою вищеописаної методики (І.А. Зупанець, С.К. Шебеко, 2004). Дослідження проводили у порівнянні з диклофенаком натрію, преднізолоном та фраксипарином з визначенням показників на 14 та 21 дні досліду.

Дослідження фармакологічних властивостей ГА г/х та його комбінації з диклофенаком натрію на тлі аутоімунного гломерулонефриту у щурів на початкових етапах розвитку було проведено на моделі нефриту Хеймана у модифікації (А.М. Вихерт с соавт., 1973) у порівнянні з диклофенаком натрію, преднізолоном та фраксипарином з визначенням дослідних показників станом на 60-у та 90-у добу. Імунізацію тварин проводили за допомогою підшкірного введення 20% емульсії коркового шару нирок в сполученні з повним ад’ювантом Фрейнда („Sigma”, США) у співвідношенні 1:1 і загальній дозі 7,4 мл/кг. У разі вивчення впливу досліджуваних засобів на перебіг гломерулонефриту в пізні терміни розвитку у тварин відтворювали нефрит Хеймана з дворазовою імунізацією у тій самій дозі з інтервалом в 4 тижні для потенціювання аутоімунного процесу. Дослідження проводили з визначенням показників на 90 та 120 добу досліду у порівнянні з диклофенаком натрію та преднізолоном.

Етапи фармакологічних досліджень

Вплив дослідних об‘єктів на перебіг гострої ниркової недостатності (ГНН) було вивчено на моделі гострого гліцеринового нефрозу, який викликали внутрішньом’язовим введенням 80 % розчину гліцерину в дозі 9 мл/кг (В.Г. Гуляев, 1989). Дослідження проводили у порівнянні з леспенефрилом станом на 4 та 7 добу експерименту. Вплив засобів на перебіг хронічної ниркової недостатності (ХНН) вивчали у порівнянні з леспенефрилом на 14 та 21 добу досліду, на моделі сулемової нефропатії, яку відтворювали підшкірним введенням 0,1 % розчину сулеми в дозі 4 мг/кг тричі протягом трьох днів (М.Ю. Аношина, 1984).

Протягом експериментальних досліджень використовували наступні методи визначення клінічних, біохімічних та функціональних показників нирок щурів. Спонтанний та відносний діурез визначали за допомогою індивідуальних метаболітних кліток (Э.Ф. Баринов с соавт., 1987); клінічні показники сечі та крові – загальноприйнятими методами (І.А. Зупанець, В.Ф. Москаленко, 2001); за допомогою біохімічних наборів „Lachema” (Чехія) визначали сечовину крові та сечі диацетилмонооксимним методом, креатинін крові та сечі – за реакцією Яффе, загальний білок крові – біуретовим методом, альбумін крові – по реакції з бромкрезоловим зеленим (В.С. Камышников, 2003). Вміст ТБК-чутливих речовин у крові та тканині нирок визначали по реакції з тіобарбітуровою кислотою (И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили, 1977). Вміст ендогенного N-ацГА у крові та тканині нирок визначали по реакції взаємодії з реактивом Ерліха у спиртовому середовищі відповідно до нашої модифікації (І.А. Зупанець, С.К. Шебеко, 2005). Кліренс ендогенного креатиніну, кліренс сечовини та канальцеву реабсорбцію, розраховували загальноприйнятими методами (В. Дж. Маршалл, 2000). Дослідження морфоструктури нирок проводили за допомогою стандартних методів світлової та імунофлуоресцентної мікроскопії, парафінові зрізи фарбували гематоксиліном та еозином, пікрофуксином по Ван Гізон, також ставили ШИК-реакцію (Д.С. Саркисов, Ю.Л. Перов, 1996). Імуногістохімічне дослідження проводили на парафінових зрізах, непрямим методом Кунса (M. Brosman, 1979) з моноклональними антитілами миші проти HLA-Dr-антигену щурів. У якості люмінесцентної мітки використовували F(ab)-2-фрагменти антитіл кролів проти імуноглобулінів мишей, мічених флюоресцеїнізотіоцианатом. Дослідження ультраструктури нирок проводили за допомогою стандартних методів електронної мікроскопії (Д.С. Саркисов, Ю.Л. Перов, 1996).

Статистичну обробку одержаних результатів проводили за допомогою комп’ютерних програм методами варіаційної статистики з використанням критеріїв Фішера-Ст’юдента та непараметричних методів аналізу (О.Ю. Реброва, 2006).

Результати досліджень та їх обговорення. При дослідженні обміну ендогенного N-ацГА на тлі мембранозної нефропатії було визначено, що при розвитку патології у щурів на 21 добу експерименту відбувається зниження вмісту
N-ацГА в нирковій тканині в 2,5 рази у порівнянні з інтактними тваринами та відповідне підвищення його вмісту у сироватці крові в 1,6 рази, за рахунок зв’язаної фракції (рис. 1). Це пояснюється руйнуванням під впливом запальних процесів мембранних структур нирок, що містять велику кількість N-ацГА у складі глікозаміногліканів, та масовим виходом цих речовин у судинне русло.

Рис. 1. Вміст ендогенного N-ацетилглюкозаміну у гомогенаті ниркової тканини та сироватці крові тварин з нефропатією

Примітка. * – p ? 0,05 відносно інтактного контролю.

Таким чином, ендогенний N-ацГА має велике патофізіологічне значення при розвитку нефропатій і може використовуватись у якості інформативного показника ступеня ураження нирок та ефективності застосованої фармакотерапії.

Скринінг нефропротекторної активності похідних глюкозаміну, 2-кар-боксисукцинанілових кислот та комбінації глюкозаміну гідрохлориду з диклофенаком натрію. Результати досліджень показали зниження проявів нефротичного синдрому у щурів, що отримували похідні глюкозаміну у порівнянні з контрольною патологією, де була відмічена значна протеїнурія (майже 60 мг/доба), лейкоцитурія, циліндрурія та поліурія. При використанні у тварин ГА г/х та його комбінації з ДН рівень протеїнурії був приблизно в 3,5 рази менше ніж у тварин з нефропатією та в 2 рази – ніж у щурів, що отримували препарати порівняння.

При використанні субстанцій І, ІІ та ІІІ було зафіксовано збільшення діурезу, що свідчить про виражену діуретичну активність речовин даного класу, причому найвищі значення спостерігались при використанні субстанції І, у хімічній структурі якої міститься глюкозамін. При аналізі змін швидкості клубочкової фільтрації (ШКФ) у групі контрольної патології спостерігалось зниження ШКФ в 2,6 рази , що свідчить про порушення фільтраційної функції нирок. При використанні ГА г/х, його композиції з ДН, глюкозаміну пентаацетату, субстанції І показник ШКФ був на рівні інтакту протягом всього експерименту та набував вірогідно вищих значень ніж у щурів, що отримували референс-препарати преднізолон та ДН. У кореляції з цими показниками знаходились показники азотистого та білкового обмінів.

Таким чином, було визначено, що похідні глюкозаміну мають виражену антипротеїнурічну активність, покращують функціональні показники нирок, знижують прояви нефротичного та набрякового синдромів, позитивно впливають на показники білкового та азотистого обміну, що загалом можна охарактеризувати як нефропротекторну активність, яка найбільше була виражена, у сполук з вищим питомим вмістом аміноцукру. Це дозволило для подальших досліджень відібрати глюкозаміну гідрохлорид та його комбінацію з диклофенаком натрію.

Вивчення фармакологічних властивостей глюкозаміну гідрохлориду та його комбінації з диклофенаком натрію в умовах розвитку аутоімунного гломерулонефриту у щурів. Результати досліджень свідчать про те, що наприкінці третього тижня після імунізації у більшості тварин з контрольною патологією виникали перші клінічні ознаки захворювання і далі набували розгорнутого характеру через 7-8 тижнів. У всіх групах відбувається вірогідне збільшення спонтанного діурезу та зменшення відносного діурезу, окрім тварин, що отримували ГА г/х та його комбінацію з ДН, де спостерігалась нормалізація цих показників (табл. 1).

Таблиця1

Показники функціонального стану нирок щурів з гломерулонефритом
під впливом експериментальної терапії (90 доба)

Умови
досліду | Діурез,
мл/доба | Відносний
діурез, % | Протеїнурія, мг/доба | ШКФ,
мл/доба

Інтактні щури | 8,280,23 | 50,860,63 | 1,60,3 | 415,513,3 | Патологія | 9,650,25* | 47,251,01* | 45,65,2* | 208,015,0* | ГА г/х | 9,180,22 | 50,350,89**/? | 15,61,9**/? | 279,77,9** | ГА г/х+ДН | 9,030,30 | 50,141,04**/? | 17,41,5**/? | 273,413,0** | ДН | 8,120,28** | 45,420,17* | 40,32,7* | 180,210,7* | Преднізолон | 9,040,35 | 44,830,65* | 27,22,3** | 247,115,2* | Фраксипарин | 10,720,37* | 45,400,78* | 32,31,8** | 267,210,9** | Примітки (тут та на рис. 2):

1) * – p ? 0,05 відносно інтактних тварин;
2) ** – p ? 0,05 відносно тварин з патологією;
3) ? – p ? 0,05 відносно референс-препарату преднізолону.

У сечі контрольних тварин було визначено наявність високого вмісту лейкоцитів та переважно гіалінових циліндрів (до 15-20 в полі зору) і значну протеїнурію (до 55 мг/доба). При застосуванні ГА г/х та дослідної композиції вміст лейкоцитів та циліндрів у сечі склав 5-10 в полі зору, рівень протеїнурії було знижено в 3 рази відносно контрольної патології, і на 90 добу він був вірогідно нижчим ніж при використанні референс-препаратів (табл. 1).

У групі контрольної патології показник ШКФ був майже вдвічі менший, ніж у інтактних тварин, і значно збільшувався при використанні ГА г/х та дослідної комбінації. Слід відмітити, що серед референс-препаратів показник ШКФ був вірогідно вищим за інтактних тварин тільки у фраксипарину, що є характерною властивістю низькомолекулярних гепаринів.

У якості показника інтенсивності перебігу деструктивних процесів у нирках використовували вміст ендогенного N-ацГА у гомогенаті нирок, а також його загальної, вільної, та зв’язаної фракцій у сироватці крові (рис. 2). Протягом дослідження у щурів з гломерулонефритом було значне підвищення (приблизно в 2 рази) рівня загального та зв’язаного N-ацГА у сироватці крові та зниження вільної фракції, а також його вмісту у паренхімі нирок. На відміну від цього, у тварин, що отримували досліджувані препарати розглянуті показники мали вірогідні відмінності й наближались до рівня інтакту, а на 90 добу досліду були вірогідно кращими ніж у тварин, у яких застосовували преднізолон.

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7

1 - інтактний контроль | 3 - ГА г/х | 5 - ДН | 7 - фраксипарин | 2 - контрольна патологія | 4 - ГА г/х+ДН | 6 - преднізолон | Рис. 2. Вміст ендогенного N-ацетилглюкозаміну у сироватці крові та паренхімі нирок щурів з гломерулонефритом (90 доба)

Таким чином, ГА г/х та його комбінація з ДН при використанні у лабораторних тварин з гломерулонефритом на початкових етапах розвитку чинять позитивний вплив на перебіг захворювання, покращують функціональний стан нирок та біохімічні показники крові.

При дослідженні впливу ГА г/х та його комбінації з диклофенаком натрію на перебіг гломерулонефриту у пізні терміни розвитку у щурів контрольної групи відмічалось вірогідне зменшення відносного діурезу. При застосуванні ГА г/х та його комбінації з ДН цей показник збільшувався і на 120 день експерименту навіть перевищував рівень тварин, що отримували референс-препарати (табл. 2).

У щурів з контрольною патологією рівень протеїнурії зростав майже в 65 разів (до 136 мг/доба). При використанні ГА г/х та дослідної композиції даний показник знижувався в 3,0-3,4 рази і у тварин, що отримували композицію, досягав найменших значень, вірогідно менше, ніж при використанні преднізолону та ДН. Постійна втрата білків із сечею в групі контрольної патології призводила до вірогідного зниження рівня загального білка: в 2,4 рази у порівнянні з інтактом
(табл. 2). Причому рівень альбумінів крові був вірогідно нижчим за інтакт тільки на 90 добу експерименту і потім ця різниця нівелювалась, що частково вказує на неселективний характер протеїнурії. При використанні ГА г/х та його комбінації з ДН ці показники вірогідно перевищували рівень тварин контрольної групи, а також щурів, що отримували препарати порівняння.

Таблиця 2

Показники функціонального стану нирок та білкового обміну щурів
з гломерулонефритом у пізні терміни розвитку (120 доба)

Умови
досліду | Відносний
діурез, % | Протеїнурія, мг/доба | Загальний
білок, г/л | ШКФ,
мл/доба

Інтактні щури | 51,080,30 | 2,10,6 | 72,61,6 | 432,112,8 | Патологія | 37,180,83* | 136,211,6* | 30,02,1* | 132,49,4* | ГА г/х | 45,270,54**/? | 44,43,9**/? | 58,52,0**/? | 241,55,3**/?? | ГА г/х+ДН | 45,291,06**/?39,15,2**/?61,52,7**/? | 246,311,6**/??ДН | 40,420,77** | 67,85,4** | 37,12,3* | 196,68,3** | Преднізолон | 38,241,09* | 78,55,0** | 39,22,6** | 215,910,7** | Примітки: 1) * – p ? 0,05 відносно інтактних тварин;
2) ** – p ? 0,05 відносно тварин з патологією;
3) ? – p ? 0,05 відносно препаратів порівняння;

4) ?? – p ? 0,05 відносно референс-препарату диклофенаку натрію.

Рівень ШКФ у тварин з гломерулонефритом протягом всього досліду був значно знижений у порівнянні з інтактними щурами (майже в 3,5 рази на 120 добу експерименту). У всіх тварин, що отримували ГА г/х та дослідну композицію, показник ШКФ був значно вищим за інших дослідних щурів і вірогідно перевищував показники тварин, яких лікували референс-препаратом ДН.

Протягом всього експерименту у крові тварин з гломерулонефритом спостерігалось зниження вмісту гемоглобіну, що на 120 добу досягло 1,5 разів (табл. 3). При застосуванні ГА г/х цей показник був вірогідно більшим, ніж у контролі та ніж у тварин, яких лікували референс-препаратами.

Таблиця 3

Клінічні показники крові щурів з гломерулонефритом у пізні терміни
розвитку під впливом експериментальної терапії (120 доба)

Умови
досліду | Гемоглобін,
г/лЕритроцити,
1012/л | Лейкоцити,
109/л | ШОЕ,
мм/год

Інтактні щури | 153,20,9 | 5,380,11 | 9,80,6 | 3,30,4 | Патологія | 104,82,9* | 3,700,09* | 21,61,8* | 22,31,5* | ГА г/х | 146,81,4**/? | 5,100,10**/? | 13,11,0**/? | 14,90,8** | ГА г/х+ДН | 141,52,2** | 4,870,09** | 11,30,6**/? | 10,30,6**/? | ДН | 125,61,7** | 4,450,07** | 14,90,9** | 15,30,8** | Преднізолон | 137,22,2** | 4,780,08** | 17,81,3** | 17,30,6** | Примітки (тут та на рис. 3):

1) * – p ? 0,05 відносно інтактних тварин;
2) ** – p ? 0,05 відносно щурів з патологією;
3) ? – p ? 0,05 відносно тварин, що отримували референс-препарати.

Така ж саме ситуація була відмічена і при дослідженні вмісту еритроцитів, тобто між цими показниками була відмічена чітка кореляція. Кольоровий показник протягом досліду не мав вірогідних змін, що вказує на нормохромний характер анемії. Також у групі з контрольною патологією відмічався ріст вмісту лейкоцитів більш ніж в 2 рази, що є неспецифічним маркером запалення. При застосуванні дослідних засобів на 120 день перебігу патології було відмічено, що рівень лейкоцитів був вірогідно меншим ніж у контрольній групі, і у щурів, що отримували препарати порівняння преднізолон та ДН. Така ж саме картина спостерігалась і в динаміці показнику ШОЕ (табл. 3).

Розвиток процесів вільнорадикального окислення є важливою ланкою патогенезу гломерулонефритів, тому протягом експерименту у щурів було визначено динаміку вмісту ТБК-чутливих речовин. Так, у групі з контрольною патологією було відмічено вірогідне підвищення вмісту ТБК-чутливих речовин у сироватці крові та гомогенаті нирок протягом всього експерименту (рис. 3). При введенні тваринам об’єктів дослідження розглянуті показники були не тільки вірогідно меншим за тварин з гломерулонефритом, але й щурів, що отримували препарати порівняння.

інтактний

преднізолон

Рис. 3. Вміст ТБК-чутливих речовин у сироватці крові та тканині нирок щурів з гломерулонефритом у пізні терміни розвитку (120 доба)

Таким чином, при використанні для лікування лабораторних тварин з гломерулонефритом на пізніх етапах розвитку ГА г/х та його комбінація з ДН знижують прояви нефротичного та набрякового синдромів, покращують функціональний стан нирок, нормалізують біохімічні та клінічні показники крові.

Дослідження впливу глюкозаміну гідрохлориду та його комбінації з диклофенаком натрію на структуру ниркової тканини щурів з аутоімунним гломерулонефритом. Аналіз морфоструктури нирок щурів з гломерулонефритом показав, що у тварин виникає нефропатія, яка згідно загальноприйнятим уявленням відповідає мезангіопроліферативному гломерулонефриту людини (Б.И. Шулутко, 1983). Під впливом ГА г/х та його комбінації з ДН спостерігалась нормалізація цитоархітектоніки ниркової тканини, зниження проліферативних процесів у мезангіумі клубочків та зменшення лімфоцитарної інфільтрації. Особливої уваги заслуговує зниження вмісту у базальних мембранах клубочків сироваткових білків, що було виявлено за допомогою ШИК-реакції. Слід відмітити, що кількісні показники інтенсивності ШИК-реакції були значно нижче при використанні ГА г/х. При дослідженні гістологічних препаратів іммунофлуоресцентним методом спостерігалось значне зниження вмісту клітин, що експресують рецептори до HLA-Dr-антигену у нирковій тканині. Це вказує на зниження інтенсивності аутоімунних процесів у нирках, що найбільше було виражено під впливом ГА г/х.

При дослідженні ультраструктури нирок методами електронної мікроскопії у контрольний групі було визначено високий ступінь порушення структур ниркового фільтру, що проявлялось у відшаровуваннях ендотелію від базальних мембран, наявністю на них ділянок нерівномірної щільності, утворень субендотеліальних і субепітеліальних депозитів імуноглобулінів, відкладанням фібриноподібних мас та ін. При лікуванні тварин ГА г/х спостерігалась нормалізація ультраструктурної картини нирок та наближення її до інтактних тварин. Причому найбільший позитивний вплив чинився на структури ниркового фільтру. У разі використання композиції ГА г/х з ДН в ультраструктурі нирок спостерігались деякі патологічні зміни, але при мінімальному ступені проявів. За впливом на ультраструктуру нирок щурів з нефропатією ГА г/х та його комбінація з ДН значно перевершували референс-препарати диклофенак натрію, преднізолон та фраксипарин.

Експериментальне вивчення глюкозаміну гідрохлориду та його комбінації з диклофенаком натрію при нирковій недостатності. Перші ознаки ГНН проявлялись вже на 2 добу досліду. Тварини були в’ялими, малорухливими, з вираженими набряками на мордочках та проявами асциту. На 4 добу досліду загальна летальність у контрольній групі склала 50 %, при використанні ДН – 63 %, 38% – при використанні досліджуваної композиції та по 25 % у решті груп.

При розвитку ГНН у тварин була відмічена стійка олігурія, спостерігалась висока протеїнурія (до 50 мг/доба), макрогематурія та зниження канальцевої реабсорбції. У показниках азотистого обміну щурів відбувалось зниження кліренсів креатиніну та сечовини в 5 разів, та відповідне підвищення сечовини крові приблизно в 4 рази (рис. 4). При використанні ГА г/х та його комбінації з ДН відбувалась нормалізація сечовидільної функції, достовірно знижувався рівень протеїнурії (в 2,1-2,4 рази), підвищувався показник ШКФ (в 2,9 рази при застосуванні ГА г/х і в 1,7 рази – дослідної композиції) та нормалізувався показник канальцевої реабсорбції. Також під впливом ГА г/х відбувалось зниження в 1,5 рази рівня сечовини крові та збільшення її кліренсу в 3 рази. Вплив комбінації ГА г/х з ДН на дані показники був виражений трохи слабше – сечовина крові знижувалась в 1,3 рази, а її кліренс збільшувався в 2,3 рази. Слід відзначити, що за впливом на рівень сечовини крові ГА г/х, на відміну від його комбінації з ДН, проявляв активність на рівні референс-препарату леспенефрилу, що є одним з найвідоміших гіпоазотемічних засобів.

Гостра ниркова недостатність (7 доба)

інтактний
контроль

контрольна
патологія

ГА г/х

ГА г/х + ДН

ДН

леспенефрил

Хронічна ниркова недостатність (21 доба)

Рис. 4. Показники азотистого обміну у щурів з гострою та хронічною нирковою недостатністю під впливом експериментальної терапії

Примітки: 1) * – p ? 0,05 відносно інтактних тварин;
2) ** – p ? 0,05 відносно тварин з контрольною патологією.

Схожа картина спостерігалась при розвитку ХНН. На другий тиждень патологія набувала розгорнутого характеру. Відмічався значний рівень летальності, що у контрольній групі склав 50 %, при застосуванні ДН – 38 %, та по 13 % у решті груп. У тварин з нефропатією відмічалась олігурія, високий вміст білку у сечі (до 30 мг/доба), зниження канальцевої реабсорбції, зниження кліренсу креатиніну в 6,5 разів та ріст рівня сечовини крові в 5 разів, що корелювало зі значним зниженням її кліренсу (рис. 4). При застосуванні дослідних препаратів спостерігалась нормалізація показників відносного діурезу, зниження рівня протеїнурії в 1,7 рази під впливом ГА г/х та в 2,4 рази – дослідної композиції. Також відбувався вірогідний ріст показника ШКФ та зниження канальцевої реабсорбції. Вміст сечовини у крові також знижувався, при чому у разі використання ГА г/х не було виявлено вірогідних розбіжностей з леспенефрилом, що також корелює з посилюючим впливом аміноцукру на кліренс сечовини та обумовлює позитивний вплив на перебіг патології.

ВИСНОВКИ

1. Динаміка вмісту ендогенного N-ацетилглюкозаміну у тканині нирок та сироватці крові, а також співвідношення його вільної та зв’язаної фракцій є інформативним показником ступеня ураження та інтенсивності деструктивних процесів у нирках.

2. В умовах розвитку у лабораторних тварин мембранозної нефропатії похідні глюкозаміну чинять виражену нефропротекторну дію, що збільшується при підвищенні вмісту аміноцукру у складі дослідного препарату. Найбільшу нефропротекторну активність проявили глюкозаміну гідрохлорид та його композиція з диклофенаком натрію.

3. Глюкозаміну гідрохлорид та його комбінація з диклофенаком натрію чинять позитивний вплив на перебіг експериментальних гломерулонефритів як на початкових, так і на пізніх етапах розвитку, переважаючи за клінічними, біохімічними та функціональними показниками активність референс-препа-ратів преднізолону, фраксипарину та диклофенаку натрію.

4. За даними гістоморфологічних досліджень глюкозаміну гідрохлорид та дослідна композиція сприяють збереженню морфо- та ультраструктури нирок тварин на тлі експериментального гломерулонефриту та зниженню інтенсивності перебігу аутоімунних процесів у нирковій тканині.

5. В умовах розвитку експериментальної гострої та хронічної ниркової недостатності глюкозаміну гідрохлорид та його комбінація з диклофенаком натрію чинять помірну гіпоазотемічну дію, підвищуючи виведення продуктів азотистого обміну шляхом посилення клубочкової фільтрації, не поступаючись при цьому препарату порівняння леспенефрилу.

6. Глюкозаміну гідрохлорид проявляє більшу гіпоазотемічну дію, а його комбінація з диклофенаком натрію – більшу антипротеїнурічну, в зв’язку з чим даний аміноцукор доцільніше застосовувати у разі латентних форм гломерулонефритів та при нирковій недостатності, а дослідну композицію – при виражених нефротичних та набрякових синдромах без ниркової недостатності.

7. Глюкозаміну гідрохлорид та його комбінація з диклофенаком натрію можуть бути рекомендовані для клінічних досліджень у якості засобів для лікування хворих на гломерулонефрити.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ:

1. Зупанець І.А. Шебеко С.К. Моделювання мембранозної нефропатії у ла-бораторних тварин для скринінгових досліджень лікарських препаратів мембранопротекторної дії // Клінічна фармація. – 2004. – Т.8, №3. – С. 36-40. (Особистий внесок здобувача: проведення експериментальних досліджень, підготовка статті).

2. Динаміка вмісту ендогенного N-ацетилглюкозаміну при запально-деструк-тивних процесах різної етіології та під впливом експериментальної терапії /
І.А. Зупанець, С.Б. Попов, С.К. Шебеко, І.А. Отрішко, О.О. Андрєєва // Клінічна фармація. – 2004. – Т.8, №4. – С. 34-37. (Особистий внесок здобувача: проведення експериментальних досліджень, аналіз й узагальнення результатів).

3. Шебеко С.К., Зупанець І.А. Вплив аміноцукрів та їх комбінацій з диклофенаком натрію на біохімічні показники лабораторних тварин на тлі мембранозної нефропатії // Клінічна фармація. – 2005. – Т.9, №2. – С. 34-38. (Особистий внесок здобувача: проведення експериментальних досліджень, участь в аналізі й узагальненні отриманих даних, підготовка статті).

4. Зупанець І.А., Шебеко С.К. Уніфікація методів кількісного визначення ендогенного глюкозаміну у біологічному матеріалі // Фармаком. – 2005. ? №4. – С. 56-61. (Особистий внесок здобувача: проведення експериментальних досліджень, участь в аналізі й узагальненні отриманих даних, підготовка статті).

5. Зупанець І.А., Шебеко С.К. Вивчення фармакологічних властивостей аміноцукрів та їх комбінацій з диклофенаком натрію в умовах моделювання мембран-нозної нефропатії у лабораторних тварин // Фармацевтичний журнал. ? 2006.? №1. – С. 92-99. (Особистий внесок здобувача: проведення експериментальних досліджень, участь в аналізі й узагальненні отриманих даних).

6. Шебеко С.К., Зупанець І.А. Дослідження фармакологічних властивостей деяких похідних глюкозаміну в умовах розвитку експериментального аутоімунного гломерулонефриту // Клінічна фармація. – 2006. – Т.10, №2. – С. 31-35. (Особистий внесок здобувача: проведення експериментальних досліджень, участь в аналізі й узагальненні отриманих даних, підготовка статті).

7. Зупанець І.А., Шебеко С.К. Дослідження гіпоазотемічних властивостей глюкозаміну гідрохлориду на тлі ренальної гіперазотемії у лабораторних тварин // Вісник фармації. – 2006. – №4 (48). – С. 19-22. (Особистий внесок здобувача: проведення експериментальних досліджень, участь в аналізі й узагальненні отриманих даних, підготовка статті).

8. Зупанец И.А., Шебеко С.К. Динамика содержания эндогенного глюкозамина у лабораторных животных с нефропатией под воздействием экспериментальной терапии // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2006. – Т.69, №6. – С. 40-42. (Особистий внесок здобувача: проведення експериментальних досліджень, аналіз й узагальнення результатів, підготовка статті).

9. Зупанець І.А., Шебеко С.К. Вплив глюкозаміну гідрохлориду та його комбінації з диклофенаком натрію на перебіг хронічної ниркової недостатності в експерименті // Медична хімія. – 2007. – Т.9, №1. – С. 67-71. (Особистий внесок здобувача: проведення експериментальних досліджень, підготовка статті).

10. Патент на винахід 77354, Україна, МПК А61К 31/225, А61P 7/10, A61P 25/18, A 61 P 29/00, C07C 231/00. D-(+)-глюкозамонієва сіль 4’-броманіліду 4,6-дихлор-2-карбоксисукцин-анілової кислоти, яка проявляє нейролептичну, антигіпоксичну, протизапальну, анальгетичну, діуретичну, фунгістатичну активність / І.А. Зупанець, С.Г. Ісаєв, Л.В. Брунь, Н.Ю. Шевельова, А.О. Ткач, Н.Л. Березнякова, Т.В. Алексєєва, С.К. Шебеко; Національний фармацевтичний університет; Заявл. 30.05.2005; Опубл. 15.11.2006; Бюл. № 11. – 8 c.

11. Зупанець І.А., Шебеко С.К. Оптимізація пошуку ефективних лікарських засобів нефропротекторної та гіпоазотемічної дії // Інформаційний лист. – Київ, 2007. – №21. – 8 с.

12. Модифікація фармакологічних властивостей нестероїдних протизапальних препаратів аміноцукром глюкозаміну гідрохлоридом: Методичні рекомендації / С.Б.