КОММЕДБІОПРОМ
КОММЕДБІОПРОМ
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ДЕРЖАВНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ
На правах рукопису
Для службового користування
Примірник №
ШОВКОВИЙ Андрій Віталійович
УДК 615.2 : 547.466 ].07
РОЗРОБКА МЕТОДІВ АНАЛІЗУ НОВИХ БІОЛОГІЧНО
АКТИВНИХ СПОЛУК У РЯДУ ПОХІДНИХ АМІНОКИСЛОТ
ДЛЯ СТАНДАРТИЗАЦІЇ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ НА ЇХ
ОСНОВІ
15.00.03 – стандартизація та організація виробництва лікарських засобів
Автореферат
диссертації на здобуття наукового ступеня
кандидата фармацевтичних наук
Харків – 1999
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в лабораторії фізико-хімічних процесів Державного наукового центру лікарських засобів (м. Харків), Коммедбіопром, Національна академія наук України.
Науковий керівник: доктор хімічних наук
Ковальов Іван Петрович,
Державний науковий центр лікарських засобів, завідувач
лабораторії фізико-хімічних процесів.
Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, професор
Болотов Валерій Василійович,
Українська фармацевтична академія,
Завідувач кафедри аналітичної хімії
Доктор фармацевтичних наук, професор,
Петюнін Генадій Павлович,
Харківська медична академія післядипломної освіти, завідувач
кафедри клінічної біохімії та судебно-медичної токсикології
Провідна установа: Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика,
кафедра фармацевтичної хімії та фармакогнозії, Міністерство охо-
рони здоров`я України, м. Київ.
Захист відбудеться “ 29 ” жовтня 1999 р. о 12 год на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.817.01 при Державному науковому центрі лікарських засобів (310085, м. Харків-85, вул. Астрономічна, 33).
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці ДНЦЛЗ (310085, м. Харків-85, вул. Астрономічна, 33).
Автореферат розісланий “ 28 ” вересня 1999 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,
доктор фармацевтичних наук, професор М. О. Казарінов
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність дослідження. В останні роки велика увага приділяється створенню нових лікарських засобів на основі амінокислот, які поєднують у собі як пластичні, так і регуляторні функціі і можуть проявляти різноманітну лікувальну дію на людський організм, а при тривалому застосуванні бути цінними профілактичними засобами.
Аналіз стану виробництва амінокислотних препаратів у країнах із розвинутою медичною промисловістю показує, що їх випуск із року в рік неухильно зростає. Так, за прогнозами на 1999 р, обсяг світового продажу амінокислотних препаратів повинен становити 5 – 6 млрд. дол. США.
В Україні виробництво препаратів на основі амінокислот, за виключенням таблеток “Аспаркам”, було практично відсутнім. Тому, починаючи з другої половини 80-х років, в ДНЦЛЗ розроблюються препарати як на основі індивідуальних амінокислот, так і препарати, діючими речовинами яких є нові, оригінальні субстанції. Це водорозчинні солі амінокислот і біологічно активних сполук (L-лізину байкалінат, L-гістидину байкалінат, L-лізину есцинат, суміш L-лізинових солей флавонових глюкуронідів). Як показали фармакологічні і клінічні дослідження одержаних сполук, вони є не тільки водорозчинними аналогами природніх речовин (байкалін, есцин), але і мають значно ширший спектр біологічної дії, у порівнянні з вихідними продуктами.
У зв`язку з цим виникла необхідність розробки науково-технічної документації (НТД) на нові субстанції і препарати на їх основі, що неможливо зробити без доказу будови сполук, а також без застосування сучасних методів аналізу якості як субстанцій, так і готових лікарських форм.
Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відпо-відності з планом науково-дослідних робіт Державного наукового центру лікарських засобів (№ держ. реєстрації 0288.0069232; 0189.0061283; 0193U041088).
Мета і завдання дослідження. Мета роботи – доказ будови нових біологічно активних сполук в ряду похідних амінокислот, розробка методик аналізу препаратів як на основі нових сполук, так і препаратів на основі суміші індивідуальних амінокислот і комбінованих амі-нокислотних препаратів, а також вивчення метрологічних характеристик розроблених ме-тодик.
У зв`язку з цим нами були поставлені такі завдання дослідження:
Ё
вивчення фізико-хімічних характеристик та біологічної дії амінокислот, флаво-ноїдів та тритерпенового глікозиду – есцину;
Ё доказ будови нових водорозчинних солей: L-лізину байкалінату, L-гістидину байкалінату, L-лізину есцинату, суміші L-лізинових солей флавонових глюкуронідів з використанням ІЧ-,УФ-спектроскопії, спектроскопії ПМР та ВЕРХ;
Ё вибір ефективних методів аналізу препаратів, які створені на основі нових суб-станцій;
Ё розробка методик аналізу амінокислот і препаратів, діючими речовинами яких є су-міші індивідуальних амінокислот;
Ё вибір умов проведення аналізу препаратів, які є сумішшю амінокислот і інших дію-чих речовин;
Ё вивчення метрологічних характеристик розроблених методик.
Наукова новизна одержаних результатів.
Ё
Доведена будова нових біологічно активних сполук: L-лізину байкалінату, L-гістидину байкалінату, L-лізину есцинату, суміші L-лізинових солей флавонових глюкуронідів;
Ё вибрані ефективні методи аналізу препаратів на основі вищенаведених субстанцій;
Ё вперше, з використанням методу ВЕРХ, вивчена фракція флавонових глюкуронідів надземної частини шоломниці байкальської. Вивчена хроматографічна поведінка флавонових глюкуронідів надземної частини шоломниці байкальської;
Ё розроблені методики аналізу індивідуальних амінокислот і препаратів на їх основі. Вивчена хроматографічна поведінка 2,4-дінітрофенілпохідних амінокислот;
Ё науково обгрунтовані умови контролю препаратів, які містять суміші амінокислот та інших активних речовин;
Ё вивчені метрологічні характеристики розроблених методик аналізу препаратів.
Практичне значення одержаних результатів.
Одержані 4 нові сполуки: L-лізину байкалінат, L-гістидину байкалінат, L-лізину есцинат, суміш L-лізинових солей флавонових глюкуронідів, які завдяки тому, що розчиняються у воді, значно перевищують за своєю біологічною дією байкалін, есцин, суміш флавонових глюкуронідів. На основі цих сполук, а також індивідуальних амінокислот розроблено 12 препаратів та 10 методик контролю якості препаратів, які введені у нормативно-технічну документацію:
ТФС 42У-115/37-252-96. L-лізину байкалінат
Проект ТФС 42У- L-гістидину байкалінат
ТФС 42У-11/37-160-95 L-лізину есцинат
Проект ТФС 42У- Розчин L-лізину байкалінату 20 % для ін`єкцій
Проект ТФС 42У- Таблетки “Гістинат”, вкриті оболонкою
ТФС 42У-11/37-1085-99 Розчин L-лізину есцинату 0,1 % для ін`єкцій
Проект ТФС 42У- Таблетки “СпермАмін”
Проект ТФС 42У- Капсули “Октамін плюс”
Проект ТФС 42У- Поліамін – У
ТФС 42У-15/37-253-96 Таблетки “Аспалінат”, вкриті оболонкою
Проект ТФС 42У- Таблетки “Байкамін-КМП”, вкриті оболонкою
Проект ТФС 42У- Таблетки “Факовіт”
Перелічені препарати впровадженні у виробництво на АТ “Фармацевтична фабрика Здоров`я”, АТ “Київмедпрепарат”, ВАТ “Луганський ХФЗ” та АТ “Галичфарм”. Випуск препарату “Поліамін-У” планується на ЗАТ “Біолек”.
Особистий внесок здобувача полягає в отриманні наукових результатів, які викладені у дисертації, плануванні експерименту, апробації розроблених методик контролю якості лікарських засобів та участі у розробці 12 НТД на препарати, одними із основних діючих речовин яких є амінокислоти.
Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладені і обговорені на республіканській науково-практичній конференції “Наукові дослідження і проблеми вироб-ництва лікарських засобів” (Харків,1995), на Всеукраїнській конференції по аналітичній хімії (Ужгород, 1998), на Міжнародній науково-практичній конференції “Фармація ХХІ століття: іновації та традиції” (С.-Петербург, 1999).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 8 робіт. З них 5 статей у наукових фахових виданнях та 3 тези доповідей.
Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, трьох розділів власних експериментальних досліджень, загальних висновків, списку використаних джерел та додатків. Викладена на 180 сторінках машинопису (149 сторінок основного тексту), містить 38 рисунків, 51 таблицю. Список використаної літератури містить 213 джерел, у тому числі 116 зарубіжних авторів.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Доказ будови i складу нових бiологiчно активних сполук.
З метою збiльшення бiодоступностi природних сполук, таких ях байкалiн, есцин, сумiш флавонових глюкуронідiв i розширення спектру iх фармакологiчноi дii, були отриманi такi сполуки: L-лiзину байкалiнат, L- гiстидину байкалiнат i L-лiзину есцинат, сумiш лiзинових солей флавонових глюкуронідів надземної частини шоломниці байкальської.
Для доказу будови сполук нами були вивченi ІЧ-, ПМР-, УФ-спектри, хроматографiчна поведiнка цих речовин, а також вихiдних речовин – L-лiзину, L-гiстидину, байкалiну, есцину i сумiші флавонових глюкуронідів.
Характерною особливістю ІЧ-спектрів нових сполук є відсутність смуги поглинання карбоксильної групи глюкуронової кислоти, яка присутня в спектрах байкаліну, есцину та суміші флавонових глюкуронідів при ~ 1740 см-1, а також наявність двух інтенсивних смуг при 1615 та 1410 см-1, які належать асиметричним та симетричним валентним коливанням карбоксилат-іону глюкуронової кислоти. Треба відзначити, що дві останні смуги складні і включають як смуги карбоксилат-іону глюкуронової кислоти, так і карбоксилат-іону амінокислоти, яка створює внутрішню соль.
Те, що до складу речовин входять амінокислоти і біологічно активні сполуки, було доказано також методами ПМР, УФ-спектроскопії та ВЕРХ.
На основi проведених дослiджень було встановлено, що одержанi нами сполуки – солi i мають такi cтруктурні формули:
L-лізину байкалінат
4 - , - дiамiно-капронової кислоти -5,6,7- триоксифлавон-7- 0--0– глюкуронiдат
L-гістидину байкалінат
4 - - амiно - - iмiдазолiлпропiонової кислоти - 5,6,7 - триоксифлавон - 7 - 0 - - 0 – глюкуронiдат
L-лізину есцинат
4 - , - дiамiнокапронової кислоти - 28 - (3 - ацетокси - 2 - метилбутират) - есцигенiн, - 4 - 0 - - 0 - глюкопiронозин) - глюкуронiдат.
Склад i хроматографiчна поведiнка флавонових глюкуронiдiв надземної частини
шоломниці байкальської
Пiд час дослiджень фракцiї надземної частини шолом- ниці байкальської методом ВЕРХ, було встановлено, що до iї складу входять 8 флавонових глюкуронiдiв, п`ять з яких удало- ся iдентифiкувати (рис.1).
Хроматографування проводилось на колонцi, заповненiй сорбентом С 18, з використанням рухомої фази: метанол – кислота оцтова – вода iз градiєнтом метанолу від 30 до 60 % об.
Рис. 1. Хроматограма сумiшi флавонових глюкуронідів.
1–лютеолiн-7-О--D-глюкуронiд;
2–скутелярін-7-О--D-глюкуронiд;
3–апiгенiн-7-О--D-глюкуронiд;
4–байкалеїн-7-О--D-глюкуронід;
7–хрiзин-7-О--D-глюкуронiд.
При порівнянні часу утримання речовин (табл. 1) встановлено, що iз збiльшенням ступеня гiдроксилювання флавонових глюкуронідiв, їх час утримання зменшується, причому при рiвнiй кiлькостi гiдрокси-груп менший час утримання ма-ють тi флавонові глюкуроніди, у яких ОН-групи знаходяться у В - колi флавона.
Прикладом цьому можуть бути пари флавонових глюкуронідів: лютеолін-7-О--D-глюкуронід / скутелярін-7-О--D-глюкуронід и апігенін-7-О--D-глюкуронід / байкалеїн-7-О--D-глюкуронід.
Таблиця 1.
Порівняльна таблиця будови флавонових глюкуронідів, які входять до складу фракції, отриманої з надземної частини шоломниці байкальської
Назва | Будова | Час виходу, хв.
Лютеолін-7-О--D-глюкуронід |
21,4
Скутелярін-7-О--D-глюкуронід |
29,3
Апігенін-7-О--D-глюкуронід |
38,3
Байкалеїн-7-О--D-глюкуронід |
42,8
Хрізин-7-О--D-глюкуронід |
58,6
Подальші дослiдження показали, що головними компонентами суміші є скутелярін-7-О--D-глюкуронід, апігенін-7- О--D-глюкуронід та хрізин-7-О--D-глюкуронід (табл. 2).
Таблиця 2.
Кількісний склад фракції флавонових глюкуронідів, отриманої з надземної
частини шоломниці байкальської
Флавоновий глюкуронід | Склад фракції, % | Склад
L-лізинових солей фракції, %
Лютеолін-7-О--D-глюкуронід | 4,2 | 4,1
Скутелярін-7-О--D-глюкуронід | 25,8 | 25,4
Апігенін-7-О--D-глюкуронід | 17,2 | 17,4
Байкалеїн-7-О--D-глюкуронід | 7,3 | 7,2
Хрізин-7-О--D-глюкуронід | 36,9 | 37,5
Інші глюкуроніди (сума) | 8,6 | 8,4
Сума глюкуронідів: | 100,0 | 100,0
З таблиці видно, що склад окремих компонентiв у сумiшi, до i пiсля одержання солi, залишається практично незмiнним (різниця–2,5%), що не перевищує відносне cтандартне відхилення при кількістному визначенні методом ВЕРХ.
Дослідження складу суміші тритерпенових глікозидів – есцину.
Дослідження есцину 4-х серій, методом ВЕРХ, показали, що до складу речовини входять 14 тритерпенових глікозидів (рис. 2).
Рис. 2. Типова хроматограма речовини есцин
Встановлено, що на поданій хроматограмі -есцину – основному компоненту речовини есцин, належать піки 5,6,7,8. Належність -есцину чотирьох піків пояснюється тим, що речовина є сумішшю полігідроксітритерпенових глікозидів, етерифікованих різними карбоновими кислотами.
Аналогічні результати спостерігались і при дослідженні методом ВЕРХ водорозчинної солі есцину– L-лізину есцинату.
Аналіз есцину показав, що склад -есцину від серії до серії змінюється в незначній мірі: від 76,35% до 79,29% і у середньому складає 77,39%.
На основі відносного стандартного відхилення результатів () проведена більш глибока оцінка коливання складу речовини есцин (табл. 3).
Таблиця 3.
Результати статистичної обробки хроматограм есцину різних серій
Пік | Хсер | S2 | Sx(сер.) | X | Xсер. | , %
1 | 2,36 | 0,98 | 0,49 | 3,15 | 1,58 | 66,7
2 | 1,28 | 0,44 | 0,10 | 0,67 | 0,33 | 26,0
3 | 0,34 | 0,01 | 0,05 | 0,32 | 0,16 | 46,6
4 | 1,93 | 0,20 | 0,22 | 1,42 | 0,71 | 36,7
5 | 9,34 | 0,46 | 0,34 | 2,16 | 1,08 | 11,6
6 | 34,77 | 0,54 | 0,37 | 2,33 | 1,17 | 3,4
7 | 7,28 | 0,24 | 0,25 | 1,57 | 0,78 | 10,0
8 | 25,46 | 2,47 | 0,79 | 4,99 | 2,49 | 9,8
9 | 4,71 | 0,36 | 0,29 | 1,91 | 0,95 | 20,2
10 | 0,43 | 0,05 | 0,13 | 0,98 | 0,57 | 132,7
11 | 1,47 | 0,67 | 0,58 | 10,4 | 7,37 | 501,1
12 | 0,71 | 0,25 | 0,35 | 6,29 | 4,44 | 626,1
13 | 5,72 | 1,05 | 0,51 | 3,26 | 1,63 | 28,5
14 | 2,97 | 3,29 | 0,91 | 5,78 | 2,89 | 97,5
Сума піків 5,6,7,8 | 77,39 | 1,92 | 0,69 | 4,41 | 2,2 | 2,85
Результати обліку показали, що для характерних -есцину піків відносні стандартні відхилення результатів знаходяться в інтервалі 3,4–11,6 %. Для суми піків 5,6,7,8 ця величина становить 2,85 %, тоді як для інших піків ці показники коливаються в інтервалі 20,2 – 626 %.
Розробка методів аналізу препарів на основі амінокислот
Препарати на основі амінокислот, для яких нами були розроблені методи аналізу, можна розділити на 3 групи:
1.
Препарати, діючими речовинами яких є нові біологічно активні сполуки.
1.
Препарати, діючими речовинами яких є індивідуальні амінокислоти і їх суміші.
1.
Препарати, діючими речовинами яких є суміші амінокислот з іншими біологічно активними сполуками.
Аналіз препаратів, які відносяться до першої групи, проводився з використанням методів ТШХ, ВЕРХ, УФ-спектроскопії.
Розроблений метод ТШХ дозволив проконтролювати із однієї хроматограми такі показники якості препаратів на основі байкаліну, як “Ідентичність” і “Сторонні домішки“. Хроматографування проводилось на пластинках Силуфол УФ-366 із використанням хроматографічної системи спирт н-бутиловий - кислота оцтова - вода (2:1:1). Достовірність одержаних результатів була підтверджена методом ВЕРХ на колонці, заповненій сорбентом С18, з рухомою фазою метанол - оцтова кислота - вода і зміною складу метанолу від 50 до 70 % об. Як показали наступні дослідження, розроблена методика ВЕРХ може використовуватись і для контролю препаратів за показником “Кількісний склад”. Підтвердженням цьому є співвідношення результатів, одержаних під час використання метода ВЕРХ і метода УФ-спектроскопії, які свідчать про рівнозначність обох методів.
Аналіз препаратів, умовно віднесених до другої групи, проводився з використанням метода ВЕРХ. Однією з основних проблем при розділенні амінокислот цим методом є велика різниця в їх полярності і низькі коефіцієнти поглинання в УФ-області спектру. Тому на практиці їх обробляють модифіційними реагентами. Це дозволяє отримувати гідрофобні похідні амінокислот, які, по-перше, значно легше розділити методом зворотньо-фазової хроматографії і, по-друге, отримати сполуки, які мають більш вищій коефіцієнт екстинкції, що дозволяє проводити аналіз у більш довгохвильових областях спектру.
Кінетика реакції утворення 2,4-дінітрофенілпохідних амінокислот
Порівняння різних модифікаторів амінокислот показало, що для серійного аналізу амінокислотних препаратів найбільш вдало використовувати 2,4-дінітро-1-фторбензол. Однак одним із основних недоліків цього реагенту є тривалість проходження реакції дериватизації. Одержання ДНФ-похідних амінокислот займало 14 год.
Тому для оптимізації одержання ДНФ-похідних амінокислот нами були проведені дослідження з кінетики утворення похідних амінокислот. Дослідження проводились на основі L-триптофану.
Схема реакції утворення ДНФ-похідної триптофану представлена на рис.3.
Рис.3. Схема реакції утворення 2,4-дінітрофенілтриптофану.
При дослідженні кінетики реакції дериватизації, прове- деної при кімнатній температурі, були одержані результати, співставлені з приведеними в літературі. Для збільшення швидкості реакції її проводили при температурі 40 0С. Це сприяло досягненню скорочення часу реакції до 20 хвилин. Кінетичні криві представлені на рис. 4.
Рис. 4. Кінетика реакції утворення 2,4-дінітрофенілтриптофану.
На основі проведеного експерименту була запропонована загальна методика отримання 2,4-дінітрофенілпохідних амінокислот.
Ця методика була використана при розробці НТД на препарати “Октамін плюс”, який містить 8 амінокислот і “Поліамін – У”, який містить 13 амінокислот.
Метрологічні характеристики, які характеризують запропоновану методику, були роз-глянуті на прикладі найменш подільної пари амінокислот ізолейцину і лейцину (табл. 4).
Таблиця 4.
Метрологічні характеристики, розраховані для амінокислот ізолейцину та лейцину
X(ср) | F | S2 | Sx | S(x)сер | Р, % | t(p,f) | Dxсер | e,%
Ізолейцин
0,01 | 5 | 5,6х10-8 | 2,4х10-4 | 9,7х10-5 | 95 | 2,57 | 2,5х10-4 | +2,9
Лейцин
0,0135 | 5 | 1,1х10-7 | 3,3х10-4 | 1,4х10-4 | 95 | 2,57 | 3,5х10-4 | +3,0
Хроматограма, одержана при розділенні 13 амінокислот препарату “Поліамін–У”, представлена на рис. 5.
Рис. 5. Хроматограма ДНФ-похідних амінокислот препарату “Поліамін-У”:
1-метіонин, 2-гістидин, 3-гліцин, 4-пролін, 5-2,4-дінітрофенол,
6-аланін,7-аргінін, 8-треонін, 9-лізин, 10-валін, 11-ізолейцин,
12-лейцин, 13-фенілаланін, 14-триптофан.
При порівнянні часу утримання 2,4-ДНФ-похідних амінокислот, представлених у табл. 5, було помічено, що час утримання похідних амінокислот зростає із збільшенням ланцюжка амінокислот.
Таблиця 5.
Час утримання ДНФ-похідних амінокислот
Амінокислота | Час утримання, хвил. | Амінокислота | Час утримання, хвил.
Метіонин | 23,5 | Лізин | 50,9
Гістидин | 26,1 | Валін | 60,7
Гліцин | 30,0 | Ізолейцин | 68,5
Пролін | 32,6 | Лейцин | 69,1
Аланін | 36,5 | Фенілаланін | 69,8
Аргінін | 37,8 | Триптофан | 72,4
Треонін | 43,7
Треба зазначити, що з ряду дещо випадають лізин і метіонин, можливо це пов`язано з наявністю в їх ланцюжку додаткового атому азоту (лізин) і сірки (метіонин).
Дещо іншу картину представляють багатокомпонентні амінокислотні препарати, які умовно відносяться до третьої групи препаратів і, як вже говорилось, є сумішшю амінокислот і іншіх активних речовин. Якщо контроль активних речовин у препараті Таблетки Аспалінат вдалося провести з використанням методів УФ-спектроскопії (L-лізину байкалінат, по байкаліну), неводного титрування (калій аспарагінат, іони калію) і комплексометричного титрування (магній аспарагінат, іони магнію), то контроль активних речовин препаратів Байкамін і Факовіт без використання методу ВЕРХ неможливий.
Визначення складу препарату Факовіт, один різновид таблеток якого містить гліцин, глутамінову кислоту і піридоксин, а другий – цистеїн і аскорбінову кислоту, проводили при довжині хвилі 210 нм на рідинному хроматографі Міліхром. Вибір довжини хвилі 210 нм обгрунтовано тим, що амінокислоти мають значне поглинання в інтервалі 200-220 нм і це дає можливість отримувати необхідні результати без використання дериватизаційного реагента, реакція якого з іншими компонентами препаратів маловивчена і тому важкоконтрольована.
Активні речовини, які входять до складу препарату, завдяки своїм фізико-хімічним властивостям, мають достатньо різний час утримання. Це дозволило провести розділення цих речовин в ізократичному режимі з використанням колонки, заповненої сорбентом С8 (рис. 6 і 7).
Рис.6. Хроматограма препарату Факовіт, таблетки №1:
1-кислота глутамінова, 2-гліцин, 3-піридоксин г/х.
Рис.7. Хроматограма препарату Факовіт, таблетки №2:
1-аскорбінова кислота, 2-цистеїн
Розділення активних речовин препарату “Байкамін” у ізократичному режимі проводилось на рідинному хроматографі фірми Waters, на заповненій сорбентом С18 колонці, при довжині хвилі 210 нм. Результати хроматографування представлені у вигляді хроматограми на рис.8.
Рис.8. Хроматограма препарату Таблетки Байкамін.
1–гістидин, 2–аргінін, 3–L-лізину байкалінат.
ЗАГАЛЬНІ ВИСНОВКИ
1.
Вивчені фізико-хімічні властивості і встановлена будова та склад нових сполук у ряду похідних амінокислот, які мають широкий спектр біологічної дії:
Ё
4-,-дiамiнокапронової кислоти-5,6,7-триоксифлавон-7-0- -0–глюкуронiдат (L-лізину байкалінат);
Ё 4--амiно--iмiдазолiлпропiонової кислоти-5,6,7-триокси- флавон - 7 - 0 - - 0 – глюкуронiдат (L-гістидину байкалінат);
Ё 4 - , - дiамiнокапронової кислоти - 28 - (3 - ацетокси - 2 - метилбутират) - есцигенiн, - 4 - 0 - - 0 - глюкопiронозин)– глюкуронiдат (L-лізину есцинат);
Ё Суміш L-лізинових солей флавонових глюкуронідів.
1.
Вперше, з використанням методу ВЕРХ, вивчений якiсний i кiлькiсний склад флавонових глюкуронiдiв надземноi частини шоломниці байкальської та їх хроматографiчна поведiнка. Показано, що основними сполуками суміші є скутелярін–7-О--D-глюкуронід (25,8%), апігенін–7-О--D-глюкуронід (17,2%) і хрізин–7-О--D-глюкуронід (36,9%). Встановлено, що iз збiльшенням ступеня гiдроксилювання флавонових глюкуронiдiв, час утримання речовин зменшується, причому при рiвнiй кiлькостi гiдрокси-груп менший час утримання мають тi флавоновi глюкуронiди, у яких гідрокси- група знаходиться у В - колi флавону.
1.
Показано, що тритерпеновий глікозид есцин є комплексом із 14 сполук, які представляють собою поліоксітритерпенові глікозиди, етеріфіковані різноманітними карбонови- ми кислотами, до того ж так званому “-есцину” належать 4 піка. Встановлено, що місткість “-есцину” в різних серіях субстанції залишається практично постійною і становить 77,39%, тоді як місткість інших компонентів коливається в широких межах.
1.
Вивчена кiнетика реакцiї утворення 2,4-дiнiтрофенiлпохiдних амiнокислот. З метою оптимізації реакції одержання ДНФ-похідних запропоновано проводити її при температурі 400С, що дозволило скоротити час реакції в 40 раз. Вивчена також хроматографiчна поведiнка тринадцяти 2,4–дінiтро-фенiлпохiдних амiнокислот та показано, що час утримання їх зростає із збільшенням вуглеводневого ланцюжка.
1.
Вибрано оптимальні умови хроматографічного розділення та розроблені хроматографічні методики (методи ТШХ і ВЕРХ) контролю якості нових біологічно активних сполук.
1.
Розроблена методика кiлькiсного визначення 2,4-дінiтрофенiлпохiдних амiнокислот, яка придатна для аналізу лікарських препаратів, що представляють собою суміші індивідуальних амінокислот. Розроблені також методики контролю якості препаратів, що представляють собою суміш амінокислот з лікарськими препаратами різних класів ор- ганічних сполук.
1.
Проведена обробка метрологiчних характеристик запропонованих методик кiлькiсного визначення діючих речовин у препаратах.
1.
Всі розробленi методики аналiзу запроваджені в нормативно-технічну документацію на лікарські препарати:
ТФС 42У-115/37-252-96. L-лізину байкалінат; проект ТФС 42У-... . L-гістидину байкалінат; ТФС 42У-11/37-160-95. L-лізину есцинат; проект ТФС 42У-... . Розчин L-лізину байкалінату 20 % для ін`єкцій; проект ТФС 42У-... . Таблетки “Гістинат”, вкриті оболонкою; ТФС 42У-11/37-1085-99. Розчин L-лізину есцинату 0,1 % для ін`єкцій; проект ТФС 42У-... . Таблетки “Сперм-Амін”; проект ТФС 42У-... . Капсули “Октамін плюс”; проект ТФС 42У-... . Поліамін–У; ТФС 42У-15/37-253-96. Таблетки “Аспалінат”, вкриті оболонкою; проект ТФС 42У-... . Таблетки “Байкамін-КМП”, вкриті оболонкою; проект ТФС 42У-... . Таблетки “Фа-ковіт”.
Основний зміст дисертації викладено в публікаціях:
1.
Применение метода ВЭЖХ для определения аминокислотного состава препарата Октамин плюс / Шовковый А.В, Зинченко А.А., Шеин А.Т., Ковалев И.П. // ФАРМАКОМ. – 1998. - № 6. – С. 54-57.
1.
К выбору методов определения нового биологически активного соединения – L-лизина байкалината – в субстанции и некоторых лекарственных формах / Шовковый А.В., Черныш Л.Я., Шеин А.Т., Ковалев И.П. // ФАРМАКОМ. – 1999. - № 2.- С. 32-35.
1.
Использование метода ВЭЖХ для анализа флавоновых глюкуронидов в надземной части шлемника байкальского / Шовковый А.В., Шеин А.Т., Попова Т.П. и др. // Провизор. – 1999. - № 10. – С. 36-38.
1.
Шовковый А.В., Шеин А.Т. Исследование состава биологически активного природного вещества эсцин. // Провизор. – 1999. - № 12. – С. 42-43.
1.
Шовковий А.В., Лапкіна Ю.І.,Ковальов І.П. Кількісне визначення L-лізину есцинату у субстанції та ін`єкційній лікарській формі // Фармацевтичний журнал. – 1999. - № 4. – С. 74-77.
1.
Анализ препаратов на основе аминокислот и флавоноидов /Лапкина Ю.И., Черныш Л.Я., Абрамова М.М., Шеин А.Т., Шостенко Ю.В., Ковалев И.П., Шовковый А.В. // Научные достижения и проблемы производства лекарственных средств: Тез. докл. респ. научно-практич. конф. Харьков, 1995. - С.262-264.
1.
Високоефективна рідинна хроматографія амінокислот / Шовковий А.В., Зінченко О.А., Шеін А.Т., Ковальов І.П. // Всеукр. конф. з аналітичної хімії: Тез.доп. – Ужгород, 1998. -С.64.
1.
Шовковый А.В. Применение метода ВЭЖХ в анализе комбинированного препарата “Таблетки Байкамин” // Фармация ХХI века: инновации и традиции: Тез. докл. научно-практич. конф. – С.-Петербург, 1999. - С. .
Анотація
Шовковий А.В. Розробка методів аналізу нових біологічно активних сполук у ряду похідних амінокислот для стандартизації лікарських засобів на їх основі. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.03 – стандартиза- ція та організація виробництва лікарських засобів.– Державний науковий центр лікарських засобів, Харків, 1999.
Проведені дослідження будови нових біологічно активних сполук: L-лізину байкалі-нату, L-гістидину байкалінату, L-лізину есцинату, суміші L-лізинових солей флавонових глю-куронідів надземної частини шоломниці байкальської, які являють собою водорозчинні солі.
Вивчено якісний та кількісний склад фракції флавонових глюкуронідів надземної час-тини шоломниці байкальської і їх хроматографічну поведінку. Дослідження есцину методом ВЕРХ показали, що вміст -есцину, основного компоненту природньої речовини есцин, залишається практично постійним, тоді як вміст інших компонентів значно змінюється.
Вивчена кінетика реакції і запропонована методика отримання 2,4-динітрофенілпохід-них амінокислот, яка використана для аналізу амінокислотних препаратів. Методика вико-ристана при розробці НТД. Вивчена хроматографічна поведінка похідних амінокислот.
Розроблено ряд методик, які дозволяють проводити контроль основних показників якості як у препаратах, одержаних на основі нових субстанцій, так і в препаратах на основі індивідуальних амінокислот і їх сумішей з іншими діючими речовинами.
Розроблені методики аналізу препаратів увійшли в 12 НТД.
Ключові слова: стандартизація, контроль, якість, біологічно активні сполуки, будова, амінокислоти, ВЕРХ, лікарські засоби, шоломниця байкальська, склад.
Аннотация
Шовковый А.В. Разработка методов анализа новых биологически активных соединений в ряду производных аминокислот для стандартизации лекарственных средств на их основе. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.03 – стандартизация и организация производства лекарственных средств. Государственный научный центр лекарственных средств, Харьков, 1999.
Проведены исследования строения новых биологически активных соединений: 4-,-диаминокапроновой кислоты-5,6,7-триоксифлавон-7-0--0–глюкуронидат (L-лизина байка-лината), 4--амино--имидазолилпропионовой кислоты-5,6,7-триоксифлавон-7-0--0–глюку-ронидат (L-гистидина байкалината), 4-,-диаминокапроновой кислоты-28-(3-ацетокси-2- метилбутират)-эсцигенин,-4-0--0-глюкопиронозин)–глюкуронидат (L-лизина эсцината), смеси L-лизиновых солей флавоновых глюкуронидов надземной части шлемника байкальского.
Установлено, что полученные соединения представляют собой водорастворимые соли. В исследованиях использовались методы ИК-, УФ-, ПМР-спектроскопии и ВЭЖХ.
Впервые, с использованием метода ВЭЖХ, изучен качественный и количественный состав флавоновых глюкуронидов надземной части шлемника байкальского и их хроматографическое поведение. Показано, что в состав смеси входят восемь флавоновых глюкуронидов, пять из которых: лютеолин-7-О--D-глюкуронид, скутеллярин-7-О--D-глюкуронид, апигенин-7-О--D-глюкуронид, байкалеин-7-О--D-глюкуронид, хризин-7-О--D-глюкуронид удалось идентифицировать. По результатам изучения количественного состава смеси установ- лено, что основными ее компонентами являются скутеллярин-7-О--D-глюкуронид (25,8%), апигенин-7-О--D-глюкуронид (17,2%) и хризин-7-О--D-глюкуронид (36,9%).
Установлено, что с увеличением степени гидроксилирования флавоновых глюкуро-нидов, время их удерживания уменьшается, причем при равных количествах гидрокси-групп меньшим временем удерживания обладают те флавоновые глюкурониды, у которых гидрок-си-группы находятся в В-кольце флавона.
Показано, что тритерпеновый гликозид эсцин является комплексом 14 соединений, представляющих собой полиокситритерпеновые гликозиды, этерифицированные различны-ми карбоновыми кислотами, причем так называемому “-эсцину” принадлежат 4 пика. Ана-лиз эсцина показал, что состав -эсцина от серии к серии изменяется в пределах от 76,35 % до 79,29 % и в среднем составляет 77,39 %. Более глубокая оценка состава вещества эсцин проведена на основе расчета величин относительного стандартного отклонения результатов эксперимента. Результаты расчета показали, что для характерных -эсцину пиков относительное стандартное отклонение результатов находится в интервале 3,4 % – 11,6 % (отно-сительное стандартное отклонение суммы четырех пиков 2,85 %), тогда как для других пиков эти показатели колеблются в интервале 20,2 % – 626 %. Приведенные данные свидетельствуют о том, что содержание основного вещества эсцина – -эсцина от серии к серии изменяется незначительно, тогда как содержание других компонентов смеси колеблется в широких пределах.
Проведенный литературный анализ модификаторов аминокислот показал, что наиболее приемлемым реактивом для контроля препаратов на основе аминокислот является 2,4-динитро-1-фторбензол, который использовался для введения метки в -аминогруппы аминокислот. Основным недостатком этого реагента являлась продолжительность полу-чения 2,4-динитрофенилпроизводных аминокислот. Поэтому нами была изучена кинетика реакции образования 2,4-динитрофенилпроизводных аминокислот. С целью оптимизации реакции получения ДНФ-производных, предложено проводить ее при температуре 40 0С, что позволило сократить время реакции в 40 раз. Предложена методика получения 2,4-динитро-фенилпроизводных аминокислот.
С использованием предложенной методики были проанализированы два препарата, содержащие восемь и тринадцать аминокислот.
Изучено хроматографическое поведение тринадцати 2,4-динитрофенилпроизводных аминокислот и показано, что время их удерживания возрастает с увеличением цепи аминокислот.
Выбраны оптимальные условия хроматографического разделения и разработаны хроматографические методики (методы ТСХ и ВЭЖХ) контроля кочества новых биологически активных соединений. Разработанная методика, основанная на методе тонкослойной хроматографии, позволила контролировать такие показатели качества лекарственных веществ, как “Подлинность” и “Посторонние примеси” из одной хроматограммы. Правильность полученных результатов подтверждена методом ВЭЖХ.
Разработана методика количественного определения 2,4-динитрофенилпроизводных аминокислот, пригодная для анализа лекарственных препаратов, представляющих собой смеси индивидуальных аминокислот. Разработаны методики контроля качества препаратов, представляющих собой смеси аминокислот с лекарственными препаратами различных классов органических соединений.
Проведен расчет метрологических характеристик разработанных методик количественного определения действующих веществ в различных препаратах.
Разработанные методики анализа включены в нормативно-техническую документацию на 12 препаратов.
Ключевые слова: стандартизация, контроль, качество, биологически активные соединения, строение, аминокислоты, ВЭЖХ, лекарственные средства, шлемник байкальский, состав.
Resume
Shоvkoviy Development of methods of the analysis of new biologically active connections in a number of derivatives amino acids for standartization of medicinal tools on their basis.
Thesis for Candidate of pharmaceutical science degree in speciality 15.00.03 - Standardisation and Organisation of Drug Production. – State Scientific Drug Center, Kharkov, 1999.
Researches of a structure of new biologically active connections are spent: L-lisini baicalinas, L-histidini baicalinas, L- lisini aescinas, mixture L-lisinis of salts flavone glucuronides the undegraunt of a part Scutellariae baicalensis, representing water-soluble of salt. In researches such physico-chemical methods, as IR-, UV-, NMR-spectrometry and HPLC were used.
Qualitative and quantitative structure of flavone glucuronides the undegraund of a part Scutellariae baicalensis and them chromatography behaviour is investigated. Researches aescinum by a method HPLC have shown, that the content of main substance of this connection - aescinum, remains practically to the constants, whereas the content of other substances of the subserver much varies.
The kinetics of response is investigated and technique of obtaining 2,4-dinitrophenyl derivatives of amino acids is offered which can be used for the analysis amino acids of preparations. A technique approvement on 2-th preparations. Chromatography behaviour of derivatives amino acids is investigated.
Number of techniques, allowing to carry out a control of main metrics of quality of preparations as in preparations obtained on the basis of new subservers, and in preparations on the basis of individual amino acids and their mixtures with other operating substances, is developed.
The developed techniques of the analysis have come in 12 STD.
Key words: standartization, control, quality, biologically active connections, structure, amino acids, HPLC, medicinal means, Scutetellariae baicalensis, structure.
Формат 60 84 1/16. Бумага офсетная. Офсетная печать. Усл. печ.л. 1,9
Тираж 100 экз. Заказ № 6930
ООО фирма “Стас” 310002 г. Харьков, ул. Дарвина,8
тел.: 19-44-55
