Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім Р.Є.Кавецького НАН України

БУТЕНКО АНДРІЙ КОСТЯНТИНОВИЧ

УДК 616.155.32-006.04:612-017.1:614.876

ІМУНОДЕФІЦИТ-АСОЦІЙОВАНІ ЗЛОЯКІСНІ ЛІМФОМИ

(ПАТОГЕНЕЗ ТА ТАКТИКА ЛІКУВАННЯ)

14.01.07 – онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ-2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті онкології АМН України.

Науковий консультант - | доктор медичних наук, професор

Гриневич Юрій Якимович,

заступник директора, завідувач лабораторії клініч-ної імунології Інституту онкології АМН України, м. Київ.

Офіційні опоненти: -

-

-

|

доктор медичних наук, професор

Глузман Данило Фішелевич,

завідувач відділу імуноцитохімії Інституту експе-ри-мен-тальної патології, онкології і радіобіології
ім. Р.Є Кавецького НАН України, м. Київ;

доктор медичних наук, професор

Бебешко Володимир Григорович,

генеральний директор Наукового центру радіаційної медицини АМН України, м. Київ;

доктор медичних наук, професор

Логінський Володимир Євстахович,

заступник директора по науковій роботі, завідувач лабораторії імуноцитології та імуноцитогенетики пухлин крові Інституту патології крові та трансфу-зійної медицини АМН України, м.Львів.

Провідна установа - |

Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, кафедра онкології та кафедра гематології і трансфузіології, м. Київ.

Захист відбудеться " 20 " грудня 2000 р. о 13 годині 30 хвилин на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є Кавецького НАН України (03022, Київ, вул. Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці ІЕПОР
ім. Р.Є Кавецького НАН України (03022, Київ, вул. Васильківська, 45).

Автореферат розісланий " 17 " листопада 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради
кандидат медичних наук Н.В. БОРОДАЙ

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми зумовлюється перш за все значним підвищенням частоти захворюванності на злоякісні лімфоми (ЗЛ) в останнє десятиріччя в різних країнах світу та недостатнім вивченням механізмів їх розвитку. Збільшення ризику виникнення злоякісних лімфом в значній мірі пов'язано з погіршенням екологічної ситуації в різних регіонах, в тому числі в Україні, та розповсюдженням ВІЛ інфекції (В.Г.Пінчук, 1996; А.И.Воробьев и соавт., 1997; Д.Ф.Глузман і співавт., 1998; І.Shigematsu et al., 1995; G.Canellos et al., 1998; D.Mason, N.Harris, 1999).

Cмертність від злоякісних новоутворень в Україні в останні роки зросла в 2-3 рази (С.О.Шалімов, 1997, 1999; A.M.Serduk, O.A.Bobyljova, 1997). В структурі онкологічної захворюванності злоякісні лімфоми посідають 5 місце, а у дітей вони є лідируючими і розглядаються як маркери несприятливого екологічного стану. В зв’язку з цим, актуальним є поглиблене вивчення окремих пухлинних захворювань післячорнобильського періоду, зокрема ЗЛ.

Слід підкреслити, що в останні роки виявлено зв’язок підвищення частоти захворювання на лімфаденопатії та ЗЛ з ослабленням функцій імунної системи. Це особливо проявляється при СНІД, імуносупресії, пов'язаної з трансплантацією органів та тканин, спадковому та індукованому імунодефіциті. При цих станах ризик розвитку злоякісних лімфом підвищується в 100 і більше разів (Ю.А.Гриневич, 1989; С.Freter, 1989,1990; P.Trotot et al., 1997; A.Levine, 1998). Тому в теперішній час визначені імунодефіцит-асоційовані лімфоми, які одержують все більше розповсюдження і окремо розглядаються в сучасній класифікації злоякісних лімфом ВООЗ (N.Harris et al., 1999; J.Diebold, 2000). Ці спостереження свідчать про важливу роль порушень імунної системи в розвитку ЗЛ та підтверджують відому концепцію Р.Є.Кавецького про значимість взаємовідносин організму та пухлин (Р.Є.Кавецький,1962).

Як з'ясувалось, одним з найбільш поширених негативних наслідків впливу чорнобильської катастрофи на здоров'я населення є порушення в імунній системі (С.В.Комісаренко і співавт., 1994; Ю.А.Гриневич 1995, 1997; А.А.Ярілін, 1996). За даними Л.П.Кіндзельського (1995), підвищення частоти розвитку ЗЛ спостерігалось уже через 5 років після аварії на ЧАЕС і захворювання супроводжуються змінами в клінічних проявах . Це стосується і інших форм пухлин, зокрема раку шлунка у людей, які зазнали радіаційного впливу (I.Shchepotin et al., 1997), а також гострого лейкозу (В.І.Клименко і співавт., 1999).

Досвід Хіросіми та інших радіаційних катастроф свідчать про їх згубний вплив на організм людини, який може призводить до онкологічних та гематологічних наслідків (В.Г.Бебешко, 1999; J.Gofman, 1990; S.Parker et al., 1997; N.Imamura, 1999). Причинна роль іонізуючого опромінення при ЗЛ вивчена недостатньо, хоча відомо про значне підвищення частоти ЗЛ серед жителів Японії, які вижили після атомного бомбардування (I. Shigematsu et al., 1995). Про збільшення ризику розвитку лімфом і гемобластозів в післячорнобильський період та їх клінічну характеристику вказують ряд авторів (Я.І.Виговська і співавт., 1995; Л.П.Кіндзельський і співавт., 1995, 1997; С.М.Гайдукова і співавт., 1995, 1998; Е.П.Іванов, 1996; В.І.Клименко і співавт., 1997; Д.Ф.Глузман і співавт., 1998; В.Д.Дроздова і співавт., 1999). Хоча є і досить обережні заключення експертів ВООЗ (A.Gonzales, 1996).

Актуальність досліджень зумовлюється і тим, що в післячорнобильський період у постраждалих людей відмічені зміни патоморфозу ЗЛ, перебігу та клінічних проявів захворювань, збільшення їх агресивності, що може бути пов’язано з особливостями їх біологічних властивостей, які залишаються ще не з’ясованими, але можуть бути визначені при застосуванні комплексу сучасних імуногістохімічних, електронно-мікроскопічних та молекулярно-генетичних методів дослідження, які дозволяють виявити найбільш специфічні молекулярні та клітинні порушення, що мають патогенетичне значення.

Недостатньо ще вивчена роль окремих ланок імунної системи в патогенезі ЗЛ. Основна увага вчених в останні десятиріччя була зосереджена, в основному, на вивченні імунофенотипу клітин різних форм ЗЛ, що безумовно має велике діагностичне значення, в той час як з’ясуванню імунного статусу хворих на ЗЛ та порушенню клітинного імунітету присв’ячені тільки окремі роботи (В.Є.Логінський, 1986, 1989; C.Fretter, 1990; H.Stein, 1998). Дуже обмежена інформація відносно вмісту та функції циркулюючих лімфоцитів різного імунофенотипу у хворих на ЗЛ, особливо Т- та ПК-клітин, які виконують імунологічний нагляд за пухлинними клітинами, сприяють їх елімінації та беруть участь у секреції протипухлинних цитокінів (А.Ф.Возианов и соавт., 1998; Н.М.Бережная, В.Ф.Чехун, 2000).

Майже відсутні дані відносно змін показників імунного захисту одночасно в тканині лімфом і в крові хворих та їх зв’язку з клінічним перебігом захворювання, що дало б більш точне уявлення про стан протипухлинної резистентності при ЗЛ. В зв’язку з цим являється важливим поглиблене вивчення імунопатогенезу ЗЛ, зокрема радіаційно-асоційованих та з’ясування їх властивостей шляхом вивчення клініко-морфологічних та імуногістохімічних особливостей окремих форм неходжкінських лімфом (НХЛ) і лімфогранулематозу (ЛГМ), імунофенотипу їх клітин, а також ультраструктурних морфо-функціональних порушень в клітинах лімфом та змін на рівні клітинного геному – експресії онкогенів і білків лімфотропного вірусу Епштейна-Барр (ЕБВ), який часто активується в умовах порушення імунітету (Т.А.Афанасьева, В.Е.Гурцевич, 1998; G.Klein, 1994, 1998; J.Cohen, 1999). Це може внести вагомий вклад в розуміння властивостей і механізму розвитку окремих ЗЛ та їх діагностику, а також обгрунтування застосування нових засобів патогенетичної терапії ЗЛ з використанням препаратів цитокінів, які одержують все більше поширення (А.Ф.Возианов и соавт., 1998; А.Л.Воронцова, Ю.Й.Кудрявець, 2000; J.Armitage, 1997, 2000). Проведення таких досліджень за допомогою використання комплексу найбільш сучасних методів дослідження клітин периферійної крові (ПК) і патологічної тканини лімфатичних вузлів при різних формах злоякісних лімфом є актуальним оскільки дасть змогу більш глибоко вивчити клініко-цитологічні та біологічні особливості ЗЛ сучасного періоду, з’ясувати їх імунопатогенез та розробити тактику лікування.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами,темами. Дане дослідження проведене в ході виконання НДР по проблемі "Онкологія", проведенних за планом наукових досліджень Українського НДІ онкології і радіології МОЗ України. Номера державної реєстрації: 0186.0054734, 0193U013871, UA011006158P, а також по темі Національної програми "СНІД", номер державної реєстрації 0193U031007.

Мета дослідження: Визначити клініко-морфологічні, імунологічні і деякі молекулярно-біологічні особливості та патогенетичні механізми розвитку найбільш поширених форм ЗЛ та впровадити нові терапевтичні підходи для підвищення ефективності їх лікування.

Задачі дослідження:

1.

2.

3.

4.

5.

Об’єкт дослідження – хворі на різні форми злоякісних лімфом, включаючи радіаційно-асоційовані.

Предмет дослідження – клініко-морфологічні та біологічні особливості злоякісних лімфом, стан імунної системи, ефективність їх лікування.

Методи дослідження. Для оцінки стану хворих на НХЛ та на ЛГМ використані загальноклінічні та традиційні методи дослідження, а також гематологічні методи з автоматизованим підрахунком лейкоцитів крові; імунологічні, включаючи визначення лімфоцитів периферійної крові різного імунологічного фенотипу: CD3+, CD4+, CD8+, CD20+ та CD56+ - клітин за допомогою проточної цитометрії (FACStar аналіз) та цитотоксичної активності ПК-клітин; імуногістохімічні методи дослідження НХЛ та ЛГМ з визначенням CD3+,CD4+,CD5+, CD8+, CD10+, CD15+, CD20+, CD21+, CD30+, CD56+, CD57+ - клітин, а також експресії IgA, IgG, IgM, гранзима Б, білків антиапоптозного гена bcl-2 та вірусу ЕБВ- LMPI, а також вірусної іРНК – EBERI; молекулярної гібрідізації ДНК та електронної мікроскопії клітин ЗЛ і периферійної крові хворих. Статистичну обробку одержаних даних проведено за допомогою комп’ютерного аналізу, який включає програму Microsoft Excel 97 SR-1.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше охарактеризовані особливості різних форм НХЛ та ЛГМ , включаючи радіаційно-асоційовані, на основі застосованного комплексу сучасних клініко-морфологічних, імуногістохімічних, ультраструктурних та молекулярно-генетичних методів дослідження.

Встановлено зв’язок змін клінічних проявів захворювання та агресивності перебігу з біологічними властивостями злоякісних лімфом (імунофенотипом, ступенем диференціювання, ультраструктурною організацією клітин та міжклітинних зв’язків, експресією клітинного онкогену bcl-2, вірусспецифічних іРНК – EBERI та онкогенного білка LMPI) і станом Т- та ПК-клітинного імунітету.

Вперше виявлено різний ступінь дефіциту Т-клітинної (CD3+, CD4+) і ПК-клітинної (CD56+, CD57+) ланок імунітету у хворих на НХЛ і ЛГМ різних груп та в залежності від впливу радіації, встановлено критерії його оцінки та роль в патогенезі лімфом.

Вперше детально описані особливості ЛГМ, асоційованих з експресією лімфотропного вірусу ЕБВ, які дістають все більше поширення.

Одержані докази належності ЗЛ, особливо ЛГМ, що виникають у хворих, які зазнали радіаційного впливу, до імунодефіцит-асоційованих лімфом.

Розроблена сучасна концепція В-клітинного лімфомогенезу з урахуванням молекулярно-генетичних порушень та ролі взаємовідносин організму та пухлини в розвитку ЗЛ.

Представлено наукове обгрунтування адаптованих методів хіміотерапевтичного лікування агресивних ЗЛ, включаючи радіаційно-асоційовані. Доведена доцільність хіміо- та імунотерапії хворих на ЗЛ з застосуванням рекомбінантних препаратів інтерферону (рлІФН-альфа) та гемопоетичних колонієстимулюючих факторів (рлГ-КСФ та рлГМ-КСФ) для підвищення ефективності лікування НХЛ.

Практичне значення отриманих результатів.

Запропонований і використаний комплекс імунологічних, імуногістохімічних, ультраструктурних та молекулярно-генетичних методів дослідження дозволяє більш точно діагностувати різні форми та гістологічні варіанти НХЛ і ЛГМ з урахуванням ступеня їх злоякісності, експресії онкогенів та встановлення зв’язку з лімфотропним вірусом ЕБВ, що важливо для адекватного вибору тактики лікування.

Встановлені нові кількісні та якісні критерії оцінки стану Т- і ПК-клітинного імунітету на основі визначення імунофенотипу лімфоцитів крові, їх ультраструктурної характеристики та функції при різних формах ЗЛ, які можуть бути використані для визначення стану протипухлинного імунітету та враховані при призначенні та прогнозуванні ефективності патогенетичного лікування з застосуванням цитокінотерапії.

Запропоновані адаптовані методи хіміотерапії ЗЛ з застосуванням рекомбінантних препаратів інтерферону-альфа, які покращують результати лікування, особливо фолікулярних форм НХЛ. Визначені імунологічні та гематологічні критерії для призначення колонієстимулюючих цитокінів (філграстиму та молграмостиму) у дітей та оцінки повноцінності відновлення кровотворення при хіміотерапевтичній мієлосупресії. Розроблені спеціальні рекомендації по використанню схем хіміотерапевтичного лікування ЗЛ у хворих, які зазнали дії іонізуючої радіації.

Шляхом видання методичних рекомендацій та публікацій в спеціальних медичних виданнях результати роботи впроваджені в практику установ охорони здоров’я, зокрема у відділеннях системних пухлинних захворювань і дитячої онкології УНДІОР МОЗ України та НЦРМ АМН України, а також на кафедрах Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика МОЗ України та Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця.

Особистий внесок здобувача.

Розроблена програма і план досліджень, самостійно проведено відбір хворих на злоякісні лімфоми і здорових дорослих та дітей, що склали відповідні контрольні групи, проведено їх обстеження, діагностика та клінічне спостереження. Здійснено забір біологічного матеріалу у хворих ( периферійна кров, пунктати кісткового мозку, біопсія уражених лімфатичних вузлів), його первинна підготовка (фіксація, заморожування, цитоцентрифугування, фарбування) і подальший аналіз гематологічних і цитологічних препаратів, а також аналіз результатів автоматизованого дослідження субпопуляцій лімфоцитів і ПК-клітин за допомогою проточної цитометрії. Самостійно підготовлені препарати тканин ЗЛ для імуногістохімічних досліджень, аналіз яких проведений при консультаційній допомозі експерта ВООЗ по злоякісних лімфомах проф. Ж.Дібола. Електронно-мікроскопічні дослідження проведені в комплексних дослідженнях при консультативній і безпосередній участі доктора медичних наук О.І.Науменко та кандидата біологічних наук В.В.Афанасьєвої, а гібридізаційний аналіз клітинної ДНК – доктора біологічних наук І.А.Смирнової. Порівняння і обговорення одержаного матеріалу, формулювання концепції лімфомогенезу, всі положення та висновки зроблено самостійно. Приймав безпосередню участь в розробці та впровадженні нових схем хіміотерапевтичного лікування агресивних ЗЛ та застосування ІФН-альфа. Самостійно впровадив в клінічну практику метод лікування хворих на ЗЛ дітей з хіміотерапевтичною мієлосупресією за допомогою рекомбінантних КСФ і розробив критерії оцінки повноцінності відновлення клітинного складу крові.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації повідомлені на Інститутських конференціях 1988-1990рр., VI з'їзді патофізіологів (Кишинів, 1989),Республіканській науковій конференції "Механизмы канцеро- и лейкозогенеза" (Київ, 1990), VIII та IX з'їздах онкологів України (Донецьк, 1990; Вінниця, 1995), II з'їзді радіологів (Київ,1993), Національній конференції по проблемі ВІЛ/СНІДа (Київ, 1995), 1 з'їзді онкологів країн СНД (Москва, 1996), 22-му Європейському конгресі по онкології (Порто, Португалія, 1989), 7-му конгресі по пухлинним маркерам (Київ, 1990), 24-му Конгресі гематологів (Лондон, Англія, 1992), 1 Конгресі по аналітичній клітинній патології (Немеген, Голандія, 1992), 6 Конгресах по протираковій терапії (Париж, Франція, 1993, 1995, 1996, 1997, 1998, 1999), Симпозіумі по лікуванню злоякісних лімфом (Мемфіс, США, 1995), Канадській конференції по Міжнародному здоров’ю (Оттава, Канада, 1996), I Міжнародній конференції по прогресу в лікуванні пухлин (Відень, Австрія, 1997), ІІ з’їзді онкологів країн СНД (Київ, Україна, 2000).

Публікації. Результати дисертації опубліковані в 2 монографіях і 43 публікаціях, в тому числі в 20 статтях, з яких 11 самостійних, в провідних фахових журналах та в 23 тезах у матеріалах вітчизняних та міжнародних конгресів, конференцій та з’їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, дев’яти розділів, аналізу і узагальнень результатів досліджень, висновків, списку використаних літературних джерел.

Повний обсяг дисертації 270 сторінок. Обсяг, що займають 90 ілюстрацій – 45 сторінок, 12 таблиць – 11 сторінок. Список використаних літературних джерел містить 410 найменувань і займає 40 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Загальна характеристика хворих. Вивчення клініко-морфологічних, імуногістохімічних і ультраструктурних особливостей НХЛ та ЛГМ різних груп хворих

Загальна кількість хворих і здорових людей, у яких проведені клінічні обстеження та спеціальні дослідження, складє 471 чоловік. Розподіл хворих на ЗЛ та осіб контрольних груп представлено в табл. 1.

Таблиця 1

Загальна характеристика обстежених хворих на ЗЛ та осіб контрольних груп в залежності від захворювання, статі та віку

Групи обстежених | Кіль-кість обстежен. | Стать | Вік (в роках)

чол. | жін. | до 15 | 16-20 | 21-45 | 46-60 | 61-75

Хворі на ЗЛ загальної популяції | 68 | 41 | 27— | 18 | 34 | 11 | 5

Хворі з радіаційно-асоційованими ЗЛ | 67 | 42 | 25— | 5 | 51 | 11—

Хворі на ЗЛ (до 1986 року) | 52 | 27 | 25— | 15 | 31 | 6—

Хворі на ЗЛ з клінік Західної Європи | 62 | 32 | 30— | 8 | 36 | 12 | 6

Хворі на лімфаденит | 47 | 21 | 26— | 11 | 29 | 7—

Діти хворі на ЗЛ | 87 | 45 | 42 | 87————

Здорові дорослі (донори) | 68 | 40 | 28— | 17 | 30 | 21—

Здорові діти | 20 | 9 | 11 | 20————

Всього | 471 | 257 | 214 | 107 | 74 | 211 | 68 | 11

Серед хворих на ЗЛ були дорослі загальної популяції, у яких не встановлено зв’язку з впливом радіації – 68 осіб; дорослі з радіаційно-асоційованими ЗЛ: ліквідатори наслідків аварії на ЧАЕС, що одержали, відповідно документів, сумарні дози опромінення від 20 до 75 сГр та жителі контрольованих територій Чорнобильського регіону – 67 осіб; хворі на ЗЛ до 1986 року – 52 особи; пацієнти, які обстежувались в клініках Західної Європи – 62 хворих; діти на різні форми ЗЛ – 87 осіб. В контрольних групах було 47 хворих з реактивною гіперплазією лімфовузлів, 68 практично здорових людей -первинних донорів Київської станції переливання крові та 20 практично здорових дітей в віці 8-14 років, які проходили профілактичні огляди.

Як видно з табл.1, серед хворих з радіаційно-асоційованими ЗЛ переважали чоловіки, що слід віднести за рахунок ліквідаторів аварії на ЧАЕС. Середній вік їх складав 35 років, що важливо для порівняння з хворими на імунодефіцит-асоційовані ЗЛ при СНІД, середній вік яких дорівнює 37 років.

Діагноз і стадію захворювання встановлювали на основі клінічного обстеження, результатів рентгенологічних, гістологічних, імунологічних, біохімічних, цитологічних та інших лабораторних методів дослідження. Діагностику ЗЛ проводили відповідно з класифікаціями ВООЗ (1976, 1999) та переглянутою Європейсько-Американській REAL класифікацією з урахуванням ступені їх злоякісності (N.Harris et al., 1995, 1999). Стадіювання НХЛ та ЛГМ проводили відповідно Анн-Арборській класифікації (1971) та класифікації, прийнятій на Міжнародному сімпозіумі в Парижі в 1985 році. Патогістологічне заключення проводилось у відділі патоморфології (завідувач професор К.О.Галахін) ІО АМН України.

На основі вперше застосованого комплексу сучасних клініко-морфологічних, імуногістохімічних, електронно-мікроскопічних і молекулярно-біологічних методів охарактеризовані різні форми НХЛ та ЛГМ, включаючи радіаційно-асоційовані, виявлені їх особливості і встановлено зв’язок клінічних проявів захворювання з біологічними властивостями лімфом та імунологічними порушеннями в організмі.

В результаті проведених досліджень показано, що у обстежених хворих на НХЛ з групи ліквідаторів аварії на ЧАЕС і осіб, які проживають на територіях підсиленого радіоекологічного контролю через 3-10 років після аварії, частіше зустрічаються генералізовані форми ЗЛ, більш агресивні не тільки за своїми клінічними проявами, але і за цитоморфологічними ознаками. Серед НХЛ переважають лімфобластні, імунобластні та прогресуючі фолікулярні форми НХЛ. Для лімфобластних лімфом з імунофенотипом CD10+, CD19+, CD20+, IgM+, а в окремих випадках ЕБВ+, тобто вміщующих в клітинному геномі вірусний генетичний матеріал, була характерна на ультраструктурному рівні перевага патологічних лімфобластів з сильно зміненими структурою і звивистим контуром ядер, тобто присутністю аберантних форм лімфоцитів, характерних для осіб, які зазнали опромінення в результаті аварії на ЧАЕС(А.И.Воробьев и соавт., 1990; Д.Ф.Глузман і співавт., 1992, 1994; К.П.Зак і співавт., 1992, 1999).

Злоякісні клітини імунобластних лімфом характеризувались особливою структурою малодиференційованих клітин з округлим світлим ядром і центрально розташованими нуклеолами, ультраструктура яких до цього часу мало вивчена і тому детально представлена в настоящій роботі, що дозволяє більш точно ідентифікувати ці НХЛ. Слід при цьому підкреслити, що як і імунобластні лімфоми, асоційовані з набутим імунодефіцитом, вони мали дуже поліморфну морфологію (D.Knowles, 1999).

Хворі на фолікулярні лімфоми проміжного ступеня злоякісності III-IV стадії захворювання мали прояви генералізованої лімфаденопатії і швидкого прогресування захворювання. При імуногістохімічних дослідженнях в лімфатичних вузлах виявлено домінування фолікулярних структур. Неопластичні лімфоїдні клітини представлені центрофолікулярними клітинами – центроцитами з розщепленими ядрами і центробластами, які складали більше 50% клітин фолікула, що свідчить про належність таких ЗЛ до більш високого -другого ступеня злоякісності. По своєму імунофенотипу лімфоїдні клітини В-клітинних фолікулярних лімфом були IgM+, CD10+, CD20+, CD5-. Характерною була також гіперекспресія білка антиапоптозного гена bcl-2, який безпосередньо причетний до механізму лімфомогенезу, оскільки показана його онкогенність, а його виявлення має діагностичне та прогностичне значення (G.Canellos et al.,1998).В нормальних гермінальних центрах експресія гена bcl-2 відсутня або носить локальний характер (С.Zutter et al., 1991). В малігнізованих же фолікулах ЗЛ у хворих загальної популяції білок гена bcl-2 часто експресується. В описаних нами випадках радіаційно-асоційованих фолікулярних лімфом експресія гена bcl-2 була сильно вираженою і виявлялась в переважній більшості клітин, що може свідчити про більшу злоякісність таких лімфом.

По відношенню до інших форм ЗЛ, наприклад, В-клітинних лімфом маргінальної зони, відома більша участь гена bcl-6, що дозволяє уточнювати патогенез окремих видів ЗЛ і набуває значення у їх діагностиці. Різні НХЛ відрізняються не тільки цитологічно, але й молекулярно-біологічно (J.Zhang et al., 1998; T. Taniguchi et al., 1999).

Характеризуючи НХЛ, що асоційовані з радіаційним впливом, слід підкреслити, що при певній схожесті їх морфологічних і клінічних ознак з лімфомами у хворих, які не зазнали опромінення, вони мають свої особливості і за рядом проявів наближаються до характеристик відомих імунодефіцит-асоційованих лімфом – більша розповсюдженність процесу з залученням багатьох лімфовузлів, агресивність перебігу з цитологічними, імуногістохімічними та молекулярно-біологічними ознаками більш високого ступеню злоякісності клітин, вираженими порушеннями міжклітинних зв’язків, які приймають участь в регуляторних процесах, зниженням показників ПК-клітинного і Т-клітинного імунітету, як в периферійній крові, так і в тканині лімфом.

Що до ЛГМ, то при великій кількості гістологічних, цитологічних і імуноцитохімічних робіт, присвячених характеристиці клітин цього виду ЗЛ за допомогою світлової мікроскопії, значно менше число досліджень, виконаних на ультраструктурному рівні. Відсутні електронно-мікроскопічні та імуногістохімічні дослідження клітин найбільш поширених варіантів ЛГМ у осіб, які зазнали радіаційного впливу.

Власні комплексні дослідження з використанням методів імуногістохімії і електронної мікроскопії проведені у хворих на ЛГМ загальної популяції і тих, що зазнали впливу радіації в результаті аварії на ЧАЕС, при чому в одній групі хворих виявлено геном ЕБВ, а в другій - він був відсутнім.

У обстежених хворих на ЛГМ загальної популяції домінуючим був змішано-клітинний варіант з характерними для нього морфологічними особливостями, що відповідає даним літератури (Д.Ф.Глузман і співавт., 1998; G.Сanellos et al., 1998).

Аналізуючи одержані дані щодо особливостей радіаційно-асоційованого ЛГМ, було встановлено, що клінічно він має більш агресивний перебіг з поширеними патологічними змінами в тканинах як морфологічними, так і молекулярно-біологічними. Характерними особливостями ЛГМ у опромінених хворих була перевага більш злоякісних варіантів захворювання, тобто змішано-клітинного та лімфоїдного виснаження, які зустрічались у 60% хворих. В той же час у хворих ЛГМ загальної популяції такі варіанти спостерігались у 48%. Як відомо, ці два варіанти найбільш часто зустрічаються при імунодефіцитних лімфомах у ВІЛ-інфікованих людей (C.Freter, 1991; G.Canellos et al., 1998). Відмічено також збільшення частоти варіанту нодулярного склерозу, особливо у чоловіків-ліквідаторів у порівнянні з аналогічним варіантом ЛГМ у чоловіків, які не зазнали дії радіації. При цій формі ЛГМ спостерігається розвиток дифузного фіброзу, який руйнує нодулярні структури і часто "замуровує" окремі лакунарні і БШ клітини. Імуногістохімічно виявляється значна кількість CD30+ клітин та оточуючих їх CD8+ клітин, а також підвищення експресії в патологічних клітинах вірусного онкобілку LMPI (рис.1). На ультраструктурному рівні відмічається більша вираженість структурних змін в ядрах та ядерних мембранах лімфоїдних клітин, а також клітинах БШ, як у хворих ЛГМ загальної популяції. Було також виявлено підвищення вмісту клітин БШ і гігантських лакунарних клітин, що є

Рис.1. Радіаційно-асоційований ЛГМ, варіант нодулярний 

склероз. Лімфовузол: 1 – загальний вигляд; 2 – дифузний фіброз з замуруванням лакунарних клітин (пофарбовано по Гімза); 3 – гіперекспресія вірусного білка LMPI; 4 – клітини БШ, експресуючі CD30 (імуногістохімічна реакція).

однією з характерних ознак агресивних ЛГМ. До таких слід віднести і значні порушення міжклітинних зв’язків патологічних клітин із стромальними елементами, що свідчить про регуляторні порушення. Часто спостерігались деструктивні зміни судин. Вираженість описаних вище субмікроскопічних змін в клітинах патологічних лімфовузлів у ЕБВ+ хворих на ЛГМ була найбільш вираженою і в багатьох випадках корелювала зі ступенем зниження показників Т- і ПК- клітинного імунітету.

Дослідження участі В-лімфотропного вірусу Епштейна-Барр в розвитку радіаційно-асоційованих злоякісних лімфом

Дослідження включення вірусних генів в клітинний геном та їх експресії є важливим для з’ясування участі вірусу Епштейна-Барр в механізмі розвитку радіаційно-асоційованих ЗЛ. Для цього відбирали хворих з первинно діагностованими лімфомами – всього 47 чоловік. Зразки ДНК одержували з біоптатів патологічних лімфовузлів чи клітин крові і досліджували методом блот-гібрідизації клітинної ДНК з міченим вірусним ДНК зондом. Одночасно у хворих на НХЛ та ЛГМ проводилось імуногістохімічне визначення в клітинах ЗЛ вірусного білка LMPI, а у ряді випадків вірусної іРНК – EBERI.

В результаті проведених досліджень вперше показано, що в клітинному геномі, особливо у хворих на ЛГМ, що зазнали дії радіації, присутні вірусні нуклеотидні послідовності: в ДНК з клітин лімфом у 54%, а з клітин крові - у 37,5% випадків. В той же час у хворих на ЛГМ загальної популяції вірусні гени виявлялися у 12% випадків в ДНК лімфом і у 18% - в мононуклеарах крові і слід при цьому зазначити, що це стосувалось хворих на сімейний ЛГМ. Як показали імуногістохімічні дослідження, експресія вірусного білка LMPI виявляється в клітинах лімфом, у осіб, що зазнали дії радіації, у 58% випадків, а в відповідній контрольній групі хворих на ЗЛ - у 14%.

На основі одержаних даних нами вперше описані клінічні, ультраструктурні і імуногістохімічні характеристики ЕБВ- і ЕБВ+ ЛГМ. Для останніх характерні переважання класичних варіантів ЛГМ, первинна поширеність та швидка генералізація процесу, наявність симптомів інтоксикації. До морфологічних особливостей ЕБВ+ радіаційно-асоційованих захворювань слід віднести більшу вираженість ультраструктурних змін як лімфоїдних елементів, так і клітин Ходжкіна і БШ (особливо їх ядер) і клітин мікрооточення. При змішано-клітинному варіанті ЛГМ патологічний локус складається переважно з клітин Х або БШ з характерною структурою ядер і електронно-світлої цитоплазми, які оточені лімфоїдними клітинами. Міжклітинні простори в таких групах клітин розширені. Судини зі значним потовщенням базальної мембрани, яка в окремих випадках дистрофічно змінена. Відростки фолікулярних дендрітних клітин скорочені. Зони їх контактів з лімфоцитами збільшені, тобто відмічається більша відокремленість клітин патологічних локусів, що свідчить про значні регуляторні порушення.

При радіаційно-асоційованих ЕБВ+ ЛГМ виділено прогностично несприятливий підвариант нодулярного склерозу з лімфоїдним виснаженням. Проведеними нами імуногістохімічними дослідженнями показано, що більшість клітин характеризувались як CD3+, CD5+, CD8+, IgA+, IgM+, CD15+ (маркер нодулярного склероза), CD30+, GrB+, CTL (до 10%). Виявлення LMPI+ клітин свідчить про функціонування генів вірусу ЕБВ. При нодулярному склерозі майже у всіх хворих була позитивна реакція на цей вірусіндукований білок в клітинах БШ. При цьому в ряді випадків в ядрах клітин визначалась також і вірусна іРНК EBER1. Тобто виявлявся тандем експресії LMPI/EBERI, який є характерним для цього гістологічного вараінту ЛГМ, що раніше не було описано.

При радіаційно-асоційованих лімфомах геном ЕБВ виявляли не тільки в клітинах ЗЛ, але в ряді випадків і в мононуклеарах периферійної крові, що є сигналом розповсюдження інтеграції вірусного геному з клітинним і показником ризику агресивного розвиткуЗЛ. Це важливо, оскільки наприклад, виявлення ДНК цього вірусу в цереброспинальній рідині розглядається як інформативний пухлинний маркер при агресивних СНІД-асоційованих ЗЛ головного мозку (А.Congolan et al., 1998).

Як відзначає G.Klein (1998) з урахуванням існування ЕБВ+ і ЕБВ- ендемічних і спорадичних лімфом, можливість лімфоїдної трансформації вище у ЕБВ+ В-клітин, але при цьому мають значення і кофактори. На перший план при цьому виступають механізми взаємодії організму, вірусу і пухлини. В клініці особливу увагу слід звертати на ЛГМ, при яких виявляється активація вірусу, так як ЕБВ+ злоякісні клітини є резистентними до апоптозу, і такі лімфоми важко піддаються лікуванню. З цими, а також з іншими біологічними властивостями в значній мірі, можуть бути пов’язані складності в лікуванні різних імунодефіцит-асоційованих лімфом (G.Canellos et al., 1998; А.Ruf et al., 1999).

Лейкоцитарний склад і імунологічний фенотип лімфоцитів периферійної крові у хворих на злоякісні лімфоми

Дослідження проведені у 67 первинних хворих на ЗЛ у віці 25-40 років. Загальна кількість лейкоцитів і лейкоцитарний склад крові у більшості хворих на ЛГМ загальної популяції суттєво не відрізнялись від таких показників у здорових людей. Водночас у частини хворих ІІІ-ІУ стадій захворювання виявлялась помірна лімфоцитопенія. Вміст лейкоцитів в середньому складав 7,07±0,22х109/л (р>0,05), нейтрофілів – 4,66±1,4х109/л (р>0,05), еозинофілів – 0,24±0,03х109/л (р>0,05), моноцитів – 0,54±0,05х109/л (р>0,05) і лімфоцитів (включаючи ВГЛ) – 1,69±0,11х109/л (р>0,05).

В групі хворих на ЛГМ, які зазнали дії радіації, кількість лейкоцитів складала 7,45±0,26х109/л (р>0,05), нейтрофілів 5,23±0,22х109/л (р>0,05), відносна і абсолютна кількість палочкоядерних нейтрофілів перевищувала нормальні показники і складала 0,90±0,04х109/л (р<0,01) відмічалось статистично достовірне збільшення кількості еозінофілів – 0,29 ±0,03х109/л (р<0,05). Слід відзначити, що еозінофілія, як постійний феномен, описана у ліквідаторів, що наводить на думку про її радіаційне походження.

При дослідженні кількості лейкоцитів і лейкоцитарної формули крові хворих на НХЛ кількість лейкоцитів складала в середньому 6,9±0,28х109/л, палочкоядерних нейтрофілів - 0,26±0,02х109/л (р<0,05), сегментоядерних нейтрофілів – 3,73±0,23х109/л (р>0,05), еозінофілів – 0,30±0,04х109/л (р>0,05), моноцитів – 0,42±0,05х109/л (р>0,05) і лімфоцитів - 29,7±1,12х109/л (р>0,05).

В групі хворих на НХЛ, які зазнали дії радіації, загальна кількість лейкоцитів складала в середньому 6,72±0,27х109/л, палочкоядерних нейтрофілів - 0,15±0,01х109/л (р>0,05), сегментоядерних нейтрофілів – 3,90±0,10х109/л (р>0,05), еозінофілів – 0,43±0,03х109/л (р<0,05), моноцитів – 0,27±0,04х109/л (р>0,05) і лімфоцитів – 1,88±0,11х109/л (р>0,05).

Беручи до уваги майже повну відсутність інформації про зміни лімфоцитів різного імунофенотипу у пацієнтів з радіаційно-асоційованими лімфомами, що не дає змоги всебічно їх охарактеризувати, подальшим етапом у нашій роботі стало вивчення показників окремих ланок імунної системи у хворих на ЛГМ та НХЛ.

При проточно-цитометричному дослідженні лімфоцитів різного імунофенотипу в периферійній крові хворих на ЛГМ було виявлено, як видно з рис.2, значне достовірне зниження відносної та абсолютної кількості CD3+ і особливо CD4+ клітин у порівнянні з групою здорових людей. В групі хворих на ЛГМ, які зазнали дії радіації внаслідок аварії на ЧАЕС, рівень цих субпопуляцій лімфоцитів був ще нижчий як по відношенню до норми, так і до хворих, в анамнезі котрих були відсутні дані про опромінення. При електронно-мікроскопічному дослідженні лімфоцитів, які містять в цитоплазмі тільця Голла, що є морфологічним маркером CD4+ клітин, у хворих ЛГМ, особливо зазнавших опромінення, відзначалось в порівнянні з нормою зменшення їх розміру, вакуолізація та відсутність гранул-супутників, що вказує на значні порушення функцій цих клітин і є важливим показником розвитку стану імунодефіциту.

Менш значні зміни при ЛГМ спостерігались з боку рівня CD8+ клітин. Все ж, як видно з рис.2, у хворих з радіаційно-асоційованим ЛГМ виявлялось достовірне зниження абсолютної кількості CD8+ клітин в крові. Відносна та абсолютна кількість CD20+ клітин у хворих на ЛГМ не відрізнялась від таких у контрольної групи.

Привертало увагу те, що в крові більшості хворих ЛГМ, значно зменшено вміст природніх клітин-кілерів (CD56+ клітин і ВГЛ). Абсолютна кількість CD56+ клітин в крові хворих на ЛГМ в середньому на 51,7% знижена відносно здорових людей, а ВГЛ навіть на 89%. Особливо виражені зміни

Рис.2 Абсолютна кількість лімфоцитів різного імунофенотипу в

крові здорових осіб (1), хворих на ЛГМ (2), хворих на ЛГМ, які

зазнали дії радіації (3).

CD56+ клітин спостерігались у хворих з радіаційно-асоційованим ЛГМ (рис.2). У окремих хворих з цієї групи зовсім не вдалось виявити ВГЛ в мазках крові. При електронно-мікроскопічному дослідженні ПК-клітини крові хворих характеризувались зниженням в них, в порівнянні з нормою, кількості та розміру електронно-щільних (азурофільних) гранул і порушенням будови унікальних для них цитоплазматичних паралельно-трубчатих утворень, що спостерігається при ослаблені цитотоксичної функції цих клітин. Для ВГЛ крові хворих на радіаційно-асоційований ЛГМ, крім описаних змін ультраструктури була характерна також фрагментація ядер та присутність ядерних кишень, які виявляються у більшості людей, що зазнали опромінення (С.В.Комісаренко і співавт., 1994). Дані про зниження функції природних клітин-кілерів у хворих на ЛГМ підтверджуються результатами одночасно проведеного цитотоксичного тесту. Так, наприклад, при співвідношенні клітин-ефекторів до клітин-мішенів культури К-562, мічених 51Cr, 50:1, процент лізису у здорових людей складав 33-42%, в той час як у хворих з ІІ-ІІІ стадією ЛГМ – 25-27%.

Важливо відзначити, що у хворих з радіаційно-асоційованим ЛГМ, у яких була виявлена експресія гена вірусу ЕБВ, показники Т- і ПК-клітинного імунітету були значно нижчими, ніж у ЕБВ-негативних хворих на ЛГМ. Так, абсолютна кількість CD4+ клітин в групі неопромінених хворих складала в середньому 0,50±0,05х109/л, а CD56+ клітин – 0,11±0,03х109/л, в той час як у опромінених – 0,38±0,05х109/л (р<0,05) та 0,09±0,03х109/л (р<0,05) відповідно. Це вказує на те, що присутність вірусу ЕБВ пов’язана з більш вираженими порушеннями імунітету.

При визначені кількості, ультраструктури та функції лімфоцитів різного імунофенотипу у хворих на НХЛ, які зазнали дії радіації були одержані дані подібні до тих, що спостерігались при ЛГМ, але зміни були дещо менш виражені. З рис.3 видно, що для хворих з радіаційно-асоційованими НХЛ характерним було статистично достовірне зниження абсолютної кількості Т-лімфоцитів, експресуючих CD3 антиген, CD4+ та CD56+ клітин. У більшості хворих на ЗЛ зниження кількості CD56+ клітин в крові корелювало зі значним зниженням вмісту цих клітин в тканині лімфом, що виявлялось імуногістохімічно. Це свідчить, що виявлені нами зміни не є результатом перерозподілу цих клітин в організмі, а у таких хворих існує дійсне зменшення кількості CD56+.

Таким чином, одержані дані вказують, що порушення імунітету при ЗЛ, в значній мірі пов’язані з функціонуванням Т-хелперів/індукторів (CD4+ клітин) та природніх клітин кілерів (CD56+ клітин), що наводить на думку про їх важливу роль в патогенезі НХЛ, особливо ЛГМ. Виявлене нами вперше найбільш значне зниження кількості та функції цих ефекторних клітин імунітету у пацієнтів з радіаційно-асоційованими ЗЛ, особливо ЕБВ-

Рис.3 Абсолютна кількість лімфоцитів різного імунофенотипу в

крові здорових осіб (1), хворих НХЛ (2), хворих НХЛ, які

зазнали дії радіації (3).

позитивними, вказує на їх належність до імунодефіцит-асоційованих лімфом. Дані дають наукове обгрунтування більшої агресивності таких ЗЛ та стійкості до терапевтичних впливів і вказують на необхідність розробки адаптованих методів їх лікування, в тому числі з застосуванням цитокінів.

Розробка адаптованих методів лікування хворих на злоякісні лімфоми з застосуванням хіміотерапії та препаратів цитокінів

Поряд з комплексною розробкою рекомендацій щодо впровадження адаптованих схем хіміотерапевтичного лікування хворих на ЗЛ, які зазнали дії

радіації (Л.П.Кіндзельський і співавт., 1994), була запропонована окрема схема хіміотерапії агресивних Т-клітинних лімфом (А.К.Бутенко, 1996).

Особливу увагу в роботі було приділено вивченню та науковому обгрунтуванню доцільності застосування нового покоління лікарських препаратів – цитокінів при ЗЛ. До недавнього часу використання цих гормоноподібних імуномодуляторів, які продукуються клітинами імунної системи, в практичній медицині було неможливим, так як у природньому стані в організмі тварин та людини вони утворюються в надто малих кількостях. Одержання цитокінів в вигляді рекомбінантних препаратів в достатній для клінічного випробовування кількості стало дійсно революційним. Найбільш широке застосування в онкогематології серед цитокінів одержав рекомбінантний препарат – інтерферон-альфа (рлІФН-альфа). Однак його використання при ЗЛ ще мало вивчено та одержані результати в певній мірі є суперечливими. Не існує також єдиної думки і про механізм лікувальної дії рлІФН-? при ЗЛ.

Проведені нами дослідження лікувальної дії рлІФН-альфа 2А (роферона-А) як у вигляді монотерапії, так і в комплексі з хіміотерапією при різних формах НХЛ показали, що найкращі результати спостерігаються при фолікулярних лімфомах. Як видно з рис.4, при застосуванні середніх доз рлІФН-? (5 млн МО п/ш 3 рази на тиждень, протягом 28 днів – 3 цикла) разом з поліхіміотерапією (теніпозид, циклофосфамід, вінкристін, метатрексат, цитозар, преднізолон), об’єктивна (повна + часткова) ремісія згідно з критеріями ВООЗ спостерігалась у 80% хворих, в той час як при монотерапії рл ІФН-? (за тією ж схемою) вона наступала у 57%, а при хіміотерапії - у 40% хворих. При застосуванні великих доз рл ІФН-? (50 млн МО п/ш, 3 рази на тиждень) виникали значні побічні ускладнення (3-4 ступінь токсичності за шкалою ВООЗ), що змушувало припинити лікування