НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна

БОРИСОВА ЛЮДМИЛА АНАТОЛІЇВНА

УДК 577.352.45:612.396.22

КІНЕТИЧНІ ВЛАСТИВОСТІ Mg2+,АТФ - ЗАЛЕЖНОГО ТРАНСПОРТУ ІОНІВ Са У ВНУТРІШНЬОКЛІТИННИХ СТРУКТУРАХ МІОМЕТРІЯ ТА BПЛИВ ЕТАНОЛУ НА ЦЕЙ ПРОЦЕС

03.00.04 - біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України.

Науковий керівник – доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

КОСТЕРІН Сергій Олексійович,

завідувач відділу біохімії м'язів Інституту біохімії

ім. О. В. Палладіна НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

ЗИМА Валентин Леонідович,

професор кафедри біофізики Київського національного

університету імені Тараса Шевченка

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

ГІММЕЛЬРЕЙХ Ніна Германівна,

завідувач відділу нейрохімії Інституту біохімії

ім. О. В. Палладіна НАН України

Провідна установа – Інститут фізіології ім.О. О. Богомольця НАН України,

відділ фізико - хімічної біології клітинних мембран

(м. Київ)

Захист відбудеться “ 29 ” січня 2001 року о 14 год на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна

НАН України за адресою: 01601, Київ - 30, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат дисертації розісланий “ 27 ” грудня 2000 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук КІРСЕНКО О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Іонам кальцію належить важлива роль в активації скорочення гладеньких м'язів [Шуба и др.,1991; Horowitz et al.,1996; Smith et al., 1996; Somlyo et al.,1998; Taggart et al.,1998; Burdyga et al., 1999].

Гладеньком'язові клітини (ГМК) матки є складною тензоелектричною системою, скоротлива активність якої контролюється чисельними факторами, а саме: статевими гормонами, гормонами гіпофіза, зокрема окситоцином, медіато-рами, іонами, а також механічним розтягуванням [Остин и др.,1987; Wray et al.,1993; Szal et al.,1994; Sanborn et al.,1998; 2000].

Фундаментальне значення у забезпеченні внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу належить системам пасивного та активного транспорту цього катіона [Kostyuk et al., 2000]. Серед останніх у гладеньких м'язах ідентифіковані Mg2+,АТФ-залежні Са2+-транспортуючі системи, що локалізовані як у плазматичній мембрані (ПМ), так і у внутрішньоклітинних мембранних структурах – у мітохондріях (МХ) та ендоплазматичному ретикулумі (ЕР) [Garfield et al.,1994; Kosterin et al.,1994; Taggart et al.,1998; Pozzan et al.,2000; Rizzuto et al.,2000; Sanborn et al.,2000]. Ізольовані МХ міометрія здатні накопичувати іони Са із значною швидкістю, ці субклітинні структури мають велику кальцієву ємність [Костерин,1990; Gunter et al.,1994; Duchen et al.,1999; 2000; Pozzan et al.,2000]. ЕР міоцитів матки циклічно звільняє та акумулює іони Са у процесі фармакомеханічного спряження, індукованого агоністами [Missiaen et al.,1991; Berridge et al.,1993; Shmigol et al., 1999; Corbet et al.,2000; Fu et al.,2000]. Але слід зазначити, що відносний парціальний внесок систем акумуляції Са2+ у МХ та ЕР міоцитів матки у забезпечення внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу остаточно не визначений. Значною мірою це пов'язано з відсутністю одержаних у біохімічних дослідах за однакових експериментальних умов порівняльних даних щодо кінетичних властивостей електрофоретичної Са2+-акумулюючої системи МХ та Mg2+,АТФ-залежної окситоцинчутливої кальцієвої помпи ЕР міометрія.

Встановлено, що внаслідок хронічного вживання алкоголю порушується Са2+-залежна скоротлива активність міокарда, скелетних, а також гладеньких м'язів, зокрема міометрія [Urbano-Marquez et al.,1989; Capasso et al.,1992; Lieber et al.,1995; Mitidieri et al.,1995; Pagala et al.,1995; Oba et al.,1997; Сударикова и др.,1999; Vasdev et al.,1999; Cofan et al.,2000]. Останнім часом у багатьох країнах світу збільшується тенденція до алкоголізму [Lieber et al.,1995;1997; Фридман и др.,1998; Добровольский и др.,1999; Шабанов,1999]. У випадку алкоголізму у жінок частішають (у 2 – 4 рази) такі патології, як спонтанні аборти, невиношування плода, передчасні пологи, слабість пологової діяльності, а також атонія, гіпотонус та гіпертонус міометрія [Лещинский,1983; Комиссарова и др.,1986; Фридман и др.,1998; Шабанов,1999]. Слід зазначити, що етанол, якому притаманні ліпофільні та гідрофільні властивості, дуже добре проникає крізь слизові оболонки та біологічні мембрани. Вважають, що в основі дії етанолу на клітини та тканини є комплексний ефект: прямий вплив цього спирту на внутрішньоклітинні біохімічні та фізико-хімічні процеси, структурно-функціональні властивості біологічних мембран та опосередкований – через продукти метаболічного перетворення етанолу [Goldstein et al.,1981; Gandhi et al.,1989; Rottenberg et al.,1992; Lieber et al.,1995; Mitidiery et al.,1995; Ho et al.,1997; Cervino et al.,1998; Гулий,2000; Cofan et al.,2000; Oide et al.,2000].

Чисельні експериментальні дані свідчать про те, що за умов алкоголізму пору-шується регуляція концентрації Са2+ у клітинах скелетних м'язів [Cofan et al.,1995; Oba et al.,1997; Nicolas et al.,1998; Cofan et al.,2000], синаптосомах [Messing et al.,1986; Davidson et al.,1988; Gandhi et al.,1989], а також у клітинах гладеньких м'язів [Johnson et al.,1996; Zhang et al.,1997; Wakabayashi et al.,1998; Vasdev et al.,1999]. Тому не можна виключати, що вищезазначені патології скоротливої функції матки у жінок, що зловживають алкоголем, значною мірою можуть бути пов'язані саме із порушенням внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу в міометрії. Отже, при вивченні біохімічних аспектів впливу споживання алкоголю на скоротливу функцію міометрія важливим є з'ясування молекулярних та мембранних механізмів дії етанолу на трансмембранне перенесення Са2+ у субклітинних структурах гладенького м'яза матки, зокрема в МХ та ЕР.

Відповідно до вищезазначеного можна стверджувати, що порівняльне дослід-ження кінетичних властивостей Mg2+,АТФ-залежних Са2+-транспортуючих систем міоцитів – це одна із актуальних проблем сучасної біохімії гладеньких м'язів, а вивчення закономірностей впливу етанолу на трансмембранний обмін Са2+ у суб-клітинних структурах міометрія є необхідним для подальшого з'ясування біохіміч-них механізмів дії алкоголю на скоротливу функцію матки.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу біохімії м'язів Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України (проблема "Біохімія тварин та людини"): тема 5, № 0194И013509 "Вивчення біохімічних механізмів регуляції концентрації Са2+ у гладеньком'язових клітинах та ролі систем енергозалежного транспорту цього катіона у контролі скорочення-розслаблення гладеньких м'язів" (І кв. 1994 – IV кв. 1998 р.); тема 5, № 0199И000270 "Вивчення біохімічних механізмів електро- та фармакомеханічного спряження у гладеньких м'язах та ролі систем енергозалежного транспорту Са2+ у забезпеченні цього процесу" (І кв. 1999 – IV кв. 2003 р.).

Мета та задачі дослідження. Метою цієї роботи було провести порівняльне дослідження кінетичних властивостей Са2+-акумулюючої системи МХ та Mg2+,АТФ-залежної окситоцинчутливої Са2+-помпи ЕР міометрія щурів у контролі та за умов дії етанолу in vitro та in vivo (підгостре, гостре та хронічне введення етанолу тваринам).

Для досягнення зазначеної мети було сформульовано такі основні задачі:

1. Із використанням селективних інгібіторів енергозалежних Са2+-транспорту-ючих систем вивчити кінетичні властивості Са2+-акумулюючої системи МХ та Са2+-помпи ЕР міоцитів матки.

2. Дослідити in vitro вплив етанолу та інших аліфатичних спиртів на Са2+- акумулюючу систему МХ та Са2+-помпу ЕР клітин міометрія.

3. Провести порівняльне дослідження кінетичних властивостей Са2+-акумулю-ючої системи МХ та Са2+-помпи ЕР клітин міометрія in vivo – за умов підгострого та гострого введення розчину етанолу тваринам, а також у разі його хронічного споживання.

4. Провести порівняльне дослідження впливу етанолу in vitro на Са2+-акумулюючу систему МХ та Са2+-помпу ЕР клітин міометрія за умов попереднього підгострого та гострого введення розчину спирту тваринам, а також у разі його хронічного споживання.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше у дослідах, виконаних на суспензії клітин міометрія, попередньо оброблених розчином неіонного детергента дигітоніну з метою порушення бар'єрної функції ПМ, із використанням селективних інгібіторів енергозалежних Са2+-транспортуючих систем проведено порівняльне дослідження кінетичних властивостей процесу акумуляції Са2+ в МХ та Mg2+,АТФ-залежного окситоцинчутливого накопичення Са2+ в ЕР у контролі та за умов дії етанолу in vitro і in vivo (підгостре та гостре введення розчину етилового спирту тваринам, а також його хронічне споживання ними).

Під час вивчення порівняльної дії низькомолекулярних аліфатичних спиртів in vitro (0 – 10%) на акумуляцію іонів Са у МХ та ЕР встановлено, що ефективність гальмівної дії спиртів на накопичення Са2+ як у МХ, так і в ЕР відповідає такій послідовності: бутанол > пропанол > етанол > метанол. Загалом ця ефективність визначається типом транспортного процесу (електрофоретичне чи Mg2+,АТФ-залежне накопичення Са2+) та (або) субклітинною мембранною структурою (МХ чи ЕР), а також довжиною аліфатичного ланцюга.

Доведено, що як у контролі, так і за умов підгострого та гострого введення етанолу в організм, транспортна активність Са2+-акумулюючої системи МХ значно домінує над такою, що властива Са2+-помпі ЕР. Проте у разі хронічного споживання етанолу таке домінування суттєво зменшується. При цьому значно порушується Са2+-транспортуюча функція як МХ, так і ЕР.

За умов хронічного споживання етанолу втрачається чутливість Mg2+,АТФ-залежної Са2+-помпи ЕР до гальмівної дії утеротонічного пептидного гормону окситоцину.

Одержані результати розширюють сучасні уявлення щодо біохімічних механізмів кальцієвого обміну в ГМК, властивостей локалізованих в них енергозалежних Са2+-транспортуючих систем та їхньої чутливості до дії етанолу.

Практичне значення одержаних результатів. Виявлено, що суспензія міоцитів, попередньо оброблених розчином дигітоніну, є перспективною експериментальною моделлю для порівняльного дослідження кінетичних властивостей енергозалежних Са2+-транспортуючих систем МХ та ЕР міометрія, чутливості цих систем до дії ефекторів та фізико-хімічних факторів (селективні інгібітори, Са2+-преципітувальні аніони, іонофори, органічні розчинники тощо), а також фізіологічно активних речовин (окситоцин).

Одержані результати мають значення для подальшого розуміння порушення мембранних механізмів контролю внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу у міометрії та його скоротливої функції за умов зловживання алкоголем, розробки фармакологічних засобів спрямованої корекції активності Са2+-транспортуючих систем МХ та ЕР міоцитів матки у випадку алкоголізму.

Окремі положення роботи можуть бути корисними при викладанні спеціальних курсів лекцій, що читаються на біологічних факультетах вищих навчальних закладів із біохімії м'язів, мембранології, нервово-м'язової фізіології.

Особистий внесок здобувача. Дисертантка особисто брала участь у створенні етанолзалежних моделей на щурах, одержувала суспензію ГМК матки щурів, фракцію МХ міоцитів матки свиней, проводила досліди з вивчення акумуляції іонів Са в МХ та ЕР клітин міометрія (деякі з таких експериментів виконано із співавторами, разом з якими було опубліковано наукові праці – к.б.н. Л.Г.Бабіч та к.б.н. С.Г.Шликовим), безпосередньо проводила кінетичний та статистичний аналіз фактичних результатів.

Дисертанткою самостійно здійснено аналіз відповідних літературних даних. Головна ідея та задачі досліджень були сформульовані науковим керівником – д.б.н. С.О.Костеріним. Аналіз власних результатів, їхнє узагальнення, інтерпретацію та формулювання основних положень і висновків роботи проведено спільно із науковим керівником.

Всі розділи та автореферет дисертації написані дисертанткою самостійно.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що викладено в дисертації, були представлені на таких наукових конференціях: I з'їзд Українського біофізичного товариства, 1994 р., Київ, Україна; XII school on biophysics of membrane transport, 1994 р., Poland; II з'їзд Українського біофізичного товариства, 1998 р., Харків, Україна; "Membranes and Signalling", 2000 p, Київ, Україна. Результати експериментів також доповідались у 1998 – 2000 рр. на наукових семінарах відділу біохімії м'язів, розширеному засіданні відділів біохімії м'язів, регуляції обміну речовин, хімії та біохімії ферментів, біохімії ліпідів та засіданнях вченої ради Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України. Окремі експериментальні дані обговорювались у відділах біохімії та токсикологіі НДІ наркології, відділі серцево-судинної патології Російського кардіологічного науково-виробничого комплексу МОЗ РФ (Москва). Вибрані результати дисертаційної роботи апробовано на конкурсах молодих вчених Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України у 1999 р. (II місце) та 2000 р. (ІІІ місце).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 4 статті у фахових наукових журналах та 3 тези доповідей на міжнародній та вітчизняних наукових конференціях.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 155 сторінках машинописного тексту і складається з таких розділів: “Вступ”, “Огляд літератури”, “Методи досліджень”, чотири експериментальні розділи, в яких висвітлено результати досліджень та обговорення, “Заключний розділ”, “Висновки” та “Список використаних джерел”, який містить 250 посилань. Робота ілюстрована 26 рисунками та 3 таблицями.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з двох розділів. Перший розділ присвячено опису систем енергонезалежного (пасивного) та енергозалежного (активного) транспорту Са2+ в ГМК матки, функціональної ролі цих систем, мембранних механізмів регуляції концентрації іонізованого кальцію у клітинах гладеньких м'язів. У другому розділі представлено загальні уявлення щодо впливу етанолу на фізико-хімічні та метаболічні процеси в організмі, структурно-функціональні властивості біологічних мембран і обмін Са2+ у тканинах, а також безпосередньо на скоротливу функцію матки.

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Суспензію міоцитів матки невагітних щурів, естрогенізованих за 16 год до забору тканини [Rao et al.,1986], одержували за допомогою методу [Mollard et al.,1986] з деякими модифікаціями. Фракцію МХ одержували з міометрія свині, як описано раніше [Костерин и др.,1985]. Кількість білка визначали за методом Лоурі [Lowry et al.,1951].

Функціональну активність електрофоретичної енергозалежної Са2+-транспор-туючої системи МХ та Mg2+,АТФ-залежної Са2+-помпи ЕР тестували в експери-ментах, які було здійснено на суспензії міоцитів матки, оброблених розчином дигітоніну, що мали порушену бар'єрну функцію ПМ. Концентрація дигітоніну у стандартному середовищі інкубації (склад наведено у розділі ”Результати дослідження та обговорення”) становила 0,01%. Доведено, що дигітонін у цій концентрації порушує цілісність ПМ, але не впливає на структурно-функціональні властивості внутрішньоклітинних кальцієвих пулів [Fiskum et al.,1985; Шлыков и др.,1997]. Енергозалежну акумуляцію Са2+ в ЕР пригнічували селективним інгібітором Са2+-помпи ЕР тапсигаргіном (100 нМ). Для пригнічення накопичення Са2+ у МХ використовували рутенієвий червоний (10 мкМ) чи азид натрію (10 мМ).

Енергозалежний транспорт Са2+ в ізольованих МХ та в МХ і ЕР міоцитів, оброблених розчином дигітоніну, досліджували за допомогою ізотопної методики з використанням 45Са2+. Акумуляцію Са2+ ініціювали внесенням у стандартне середовище інкубації аліквоти розчину АТФ (або Mg2+) чи суспензії клітин. Кількість Са2+ (пмоль/106 клітин), що надійшов до МХ та ЕР в енергозалежному процесі, обчислювали за різницею між загальним його накопиченням із стандартного середовища інкубації та адсорбцією із середовища інкубації, що не містило АТФ (або Mg2+). Транспортний процес зупиняли шляхом швидкого фільтрування інкубаційного середовища крізь мембранні фільтри ("Millipore", США або "Хіміфіл", Естонія, діаметр пор 0,45 мкм) під вакуумом. Радіоактивність фільтрів вимірювали за допомогою сцинтиляційного лічильника.

У дослідах, які були проведені із використанням чотирьох експериментальних моделей, досліджували вплив етанолу, що надходив в організм щурів, на акумуляцію іонів Са в МХ та ЕР міоцитів матки контрольних (модель I) та експериментальних (моделі II – IV) тварин.

Модель I (контроль). Використовували статевозрілих щурів (віком 2–3 міс.), які утримувались на стандартному раціоні віварію.

Модель II (підгостре введення етанолу). У цьому разі статевозрілим тваринам протягом 8 діб внутрішньочеревно вводили 20%-й розчин етанолу в дозі 1 мл на 100 г маси тіла на добу (1,63 г абсолютного алкоголю на 1 кг маси тіла) [Стогній та ін.,1989; Гулый и др.,1990; Люк и др.,1998]. У попередніх дослідах було доведено, що введення фізіологічного розчину таким тваринам у тому самому режимі та об'ємі не впливає на активність Са2+-транспортуючих систем МХ та ЕР.

Модель III (гостре введення етанолу). Статевозрілим тваринам одноразово внутрішньочеревно вводили 40%-й розчин етанолу в дозі 1 мл на 100 г маси тіла (3,3 г абсолютного алкоголю на 1 кг маси тіла) [Гулый и др.,1990; Люк и др.,1998; Селевич и др.,1999]. Попередньо було доведено, що введення фізіологічного розчину таким тваринам у тому самому режимі і об'ємі не впливає на активність внутрішньоклітинних Са2+-транспортуючих систем ГМК.

Модель IV (хронічне споживання етанолу). Статевозрілі тварини протягом 11 місяців вживали 15%-й водний розчин етанолу в умовах примусової заміни води розчином спирту [Буров и др.,1985; Попова и др.,1986; Бардина и др.,1999]. При цьому не спостерігали водної депривації, тобто щури споживали достатню середньодобову кількість води. Доведено, що немає статистично вірогідних змін в активністі внутрішньоклітинних Са2+-транспортуючих систем міометрія щурів віком 12–13 місяців та 2–3 місяців (модель I, контроль).

Ефективність дії етанолу та інших аліфатичних спиртів на Са2+-транспортуючі системи визначали за величиною уявної константи інгібування І0,5–такої концентрації алкоголів, за якої спостерігається гальмування акумуляції Са2+ на 50% відносно контрольного значення (за відсутності спиртів у середовищі інкубації).

Експериментальні дані оброблено загальноприйнятими методами кінетичного аналізу та варіаційної статистики [Кокунин, 1975].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ОБГОВОРЕННЯ

1. Вивчення кінетичних властивостей Са2+-акумулюючої системи МХ та Са2+-помпи ЕР клітин міометрія з використанням селективних інгібіторів енергозалежних Са2+-транспортуючих систем.

Фундаментальне значення у забезпеченні внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу та Са2+-залежного контролю скорочення-розслаблення міометрія належить енергозалежним Са2+-транспортуючим системам ПМ, МХ та ЕР міоцитів [Kosterin et al.,1994; Smith,1996; Shmigol et al.,1999; Duchen,2000; Pozzan et al.,2000]. Властивості Са2+-транспортуючої системи МХ міометрія можна успішно вивчати у дослідах із використанням цих ізольованих субклітинних структур [Kosterin et al.,1994]. Однак вивчати властивості Са2+-помпи ЕР на фракції ізольованих мембранних везикул міометрія практично неможливо, оскільки Са2+-помпа ЕР міоцитів матки досить швидко інактивується під час препаративного одержання фракції мікросом [Grover et al.,1983; Kosterin et al.,1994]. Використання суспензії міоцитів, попередньо оброблених розчином дигітоніну з метою порушення бар'єр-ної функції ПМ, є адекватним для коректного сумісного тестування Са2+-транспортуючих систем МХ та ЕР міометрія саме за практично ідентичних експериментальних умов та природнього співвідношення сумарних об'ємів внутрішньоклітинних кальцієвих депо [Fiskum, 1985; Yamamoto et al., 1986; Негруцкий,1997; Шлыков и др.,1997].

ГМК матки, що оброблені розчином дигітоніну, мали здатність накопичувати 1900±450 пмоль Са2+/5 хв на 106 клітин (n = 3) із стандартного середовища інкубації, що містило (мМ): 50 тріс-НСl (рН 7,4, 370С), 125 KCl, 25 NaCl, 3 АТФ, 3 сукцинату натрію, 3 MgCl2, 2 фосфату калію та 10 мкМ (40Са2+ + 45Са2+). Інгібітори енергозалежного транспорту Са2+ у МХ – рутенієвий червоний (10 мкМ) та азид натрію NaN3 (5мМ) пригнічували акумуляцію Са2+ у суспензії ГМК (рис.1).

По-перше, інгібувальний вплив рутенієвого червоного на енергозалежну акумуляцію Са2+ в ГМК, оброблених розчином дигітоніну, був значно ефективнішим, ніж азиду натрію: значення уявної константи інгібування І0,5 становило 0,7 ± 0,3 мкМ та 1,1 ± 0,4 мМ відповідно. Тому у подальших експериментах для пригнічення акумуляції Са2+ в МХ, як правило, використовували рутенієвий червоний. Отже, ці результати свідчать про наявність у клітинах міометрія системи енергозалежної акумуляції Са2+, що локалізована в МХ. По-друге, інгібітори транспорту Са2+ у МХ– рутенієвий червоний та азид натрію – при використанні їх у насичувальних концентраціях (10–100 мкМ та 10 мМ відповідно), остаточно не пригнічували енергозалежну акумуляцію Са2+ у міоцитах матки.

Резистентна до дії рутенієвого червоного та азиду натрію компонента вклю-чення Са2+ у міоцити стимулювалась оксалатом калію (10 мМ) – фактором збіль-шення кальцієвої ємності ЕР як із зростанням часу інкубації, так і концентрації Са2+-преципітуючого агента у середовищі інкубації. За умов наявності у середовищі інкубації азиду натрію (з метою пригнічення енергозалежної акумуляції Са2+ у МХ) рутенієвий червоний у широкому діапазоні концентрацій (10-8–10-4 М) майже не впливав на стимульоване оксалатом накопичення Са2+ у міоцитах (рис. 2,графік 1). Селективний інгібітор Са2+-помпи ЕР тапсигаргін [Bian et al.,1991; Sagara et al.,1991; Wictome et al.,1992] у концентрації 100 нМ повністю пригнічував резистентну до дії рутенієвого червоного та азиду натрію оксалатстимульовану компоненту енергозалежної акумуляції Са2+ у суспензії ГМК (Рис.2, графік 2).

Таким чином, використання суспензії ГМК, оброблених розчином дигітоніну, за наявності селективних інгібіторів енергозалежного транспорту Са2+ дає можливість на одній моделі майже за однакових експериментальних умов тестувати

та вивчати властивості двох внутрішньоклітинних Са2+-транспортуючих систем міоцитів матки. Перша – локалізована в МХ, пригнічується рутенієвим червоним і азидом натрію, нечутлива до дії тапсигаргіну; друга – локалізована в ЕР, нечутлива до дії рутенієвого червоного та азиду натрію, потенціюється оксалатом і пригнічується тапсигаргіном.

2. Вивчення in vitro впливу етанолу та інших аліфатичних спиртів на енергозалежну акумуляцію іонів Са у внутрішньоклітинних структурах міометрія.

Аліфатичні спирти, зокрема етанол, часто використовують як фактор модифі-кації структурно-функціональних властивостей біомембран та мембранозв'язаних ферментів [Суковатая,2000; Слинченко и др.,1997; Cervino et al.,1998]. Загалом, необхідність вивчення впливу аліфатичних спиртів, зокрема етанолу, на біологічні мембрани обумовлена трьома причинами. По-перше, такі дослідження сприяють з'ясуванню молекулярного механізму дії загальних анестетиків на структурну організацію та функціонування клітинних органел. По-друге, результати таких досліджень поширюють уявлення щодо загальних закономірностей модифікації функціональної активності мембранних білків хімічними та фізико-хімічними факторами. По-третє, етанол, як і інші органичні розчинники, використовуються для створення так званого "дизайну середовища" з метою вивчення структури та властивостей білкових молекул [Костерін,2000; Суковатая,2000]. Оскільки аліфатичні спирти добре проникають у клітини [Rottenberg et al.,1992; Lieber et al.,1995], то цілком ймовірно, що об'єктом їхньої неспецифічної дії на міоцити можуть безпосередньо бути і Са2+-транспортуючі системи, які локалізовані у субклітинних мембранних структурах.

З метою дослідження загальних закономірностей впливу аліфатичних спиртів

на енергозалежний транспорт Са2+ у внутрішньоклітинних мембранних структурах міометрія було проведено порівняльне вивчення дії низькомолекулярних алкоголей in vitro на електрофоретичну Са2+-акумулюючу систему МХ та Mg2+,АТФ-залежну Са2+-помпу ЕР міоцитів.

Вплив аліфатичних спиртів in vitro на систему акумуляції Са2+ у МХ (рис.3) та на Са2+-помпу ЕР міометрія (рис.4) характеризується неоднаковими концентрацій-

ними залежностями. Дійсно, у першому випадку для дії пропанолу, етанолу та метанолу, на відміну від дії бутанолу, властивий невеликий активаційний ефект на транспорт Са2+ з наступним його пригніченням. У другому випадку для дії всіх аліфатичних спиртів типовими є монотонні концентраційні залежності гальмівного впливу на акумуляцію Са2+. При використанні метанолу, етанолу, пропанолу та бутанолу значення уявної константи гальмування транспортного процесу I0,5 для

системи акумуляції Са2+ у МХ відповідно становили: 2400 ± 250, 1560 ± 60, 230 ± 40 та 79 ± 30 мМ (n = 4). Значеня уявної константи гальмування I0,5 транспортного процесу для системи акумуляції Са2+ в ЕР у разі використання метанолу, етанолу, пропанолу та бутанолу дорівнювали 1980 ± 70, 650 ± 30, 180 ± 50 та 58 ± 10 мМ, відповідно (n = 4).

Отже, здатність аліфатичних спиртів in vitro гальмувати акумуляцію Са2+ в МХ та ЕР міоцитів матки задовольняє однаковій послідовності: бутанол > пропанол > етанол > метанол (рис.3, 4), та зростає із збільшенням кількості атомів вуглецю в молекулі аліфатичного спирту.

Проте система акумуляції Са2+ у МХ (I0,5 = 1560 ± 60 мМ) вірогідно менш чутлива до гальмівної дії етанолу, ніж Mg2+,АТФ-залежна Са2+-помпа ЕР (I0,5 = 650±30 мМ).

Таким чином, загалом вищенаведені дані свідчать про те, що модифікувальний ефект низькомолекулярних аліфатичних спиртів in vitro на енергозалежну акуму-ляцію Са2+ у внутрішньоклітинних мембранних структурах гладенького м'яза матки визначається типом транспортного процесу (електрофоретичне накопичення Са2+ у МХ чи Mg2+,АТФ-залежний первинний активний транспорт Са2+ в ЕР) та (чи) субклітинною мембранною структурою (МХ чи ЕР), а також залежить від довжини аліфатичного ланцюга в молекулі спирту.

3. Порівняльне дослідження кінетичних властивостей Са2+-акумулюючої системи МХ та Са2+-помпи ЕР міометрія in vivo – за умов підгострого та гострого введення розчину спирту тваринам, а також у разі його хронічного споживання.

З літератури відомо, що за умов хронічного надходження етанолу в організм збільшується вхід Са2+ у клітини серцевого, скелетного та гладенького м'язів. При цьому порушуються структурно-функціональні властивості МХ [Rottenberg et al.,1992; Сударикова и др.,1997; Marcinkeviciute et al.,2000], спостерігаються морфо-логічні зміни на рівні ретикулума [Baruah et al.,1988]. Порушення внутрішньо-клітинного кальцієвого гомеостазу, а також морфологічні, фізико-хімічні та біохі-мічні зміни у мембранах МХ та ЕР можуть бути важливим етапом у розвитку патологічних процесів у разі хронічного алкоголізму [Montgomery et al.,1987; Nicolas et al.,1998; Сударикова и др.,1999; Nagy, 2000].

Було вивчено вплив підгострого, гострого та хронічного вживання етанолу щурами (моделі II, III та IV відповідно) на накопичення Са2+ у МХ та ЕР міоцитів матки (рис. 5 та 6).

У випадку всіх експериментальних моделей МХ міометрія акумулювали іони Са зі стандартного середовища інкубації. Стаціонарний рівень акумуляції Са2+ у МХ міоцитів матки встановлювався з п'ятої хвилини інкубації в усіх модельних експериментах (рис. 5).

ЕР клітин міометрія також накопичував іони Са зі стандартного середовища інкубації. Але кінетика Mg2+,АТФ-залежної акумуляції Са2+ в ЕР, на відміну від МХ, характеризувалась лінійністю у часі протягом 10 хв інкубації, що можна пояснити наявністю у середовищі інкубації Са2+-преципітувального аніона оксалату, який добре проникає крізь ретикулярну мембрану та збільшує кальцієву ємність ретику-

лума внаслідок утворення кристалів оксалату кальцію (рис. 6).

За контрольних умов (модель I) значення початкової швидкості акумуляції Са2+ у МХ V0, яка кількісно характеризує транспортну активність Са2+-акумулюючої системи, становить 1324 ± 174 пмоль Са2+/хв на 106 клітин (n = 4). Ця величина у середньому в 1,1; 1,3 та 6,0 разів перевищує таку, що була встановлена для моделей підгострого, гострого та хронічного введення етанолу (моделі II, III та IV відповід-но). Тобто, початкова швидкість акумуляції Са2+ у МХ вірогідно відрізнялась від контролю (р < 0,05) лише за умов хронічного вживання етанолу (рис. 7).

Значення початкової швидкості акумуляції Са2+ в ЕР (V0) за контрольних умов (модель I) дорівнювало 181 ± 47 пмоль Са2+/хв на 106 клітин (n = 6). Ця величина в середньому в 1,7; 1,2 та 2,9 раза більша, ніж така, що встановлена для моделей підгострого, гострого та хронічного введення етанолу (моделі II, III та IV відповідно). У статистичному відношенні величина V0 акумуляції Са2+ в ЕР була вірогідно нижчою порівняно з контрольним значенням цього параметра лише за умов хронічного вживання алкоголю (модель IV) (рис. 7).

Стаціонарний рівень акумуляції Са2+ у МХ для контролю (модель I) становив 3091 ± 227 пмоль Са2+/5 хв на 106 клітин (n = 4), що в 1,2; 2,0 та 9,8 раза перевищував такий, який встановлено в експериментах для моделей II, III та IV відповідно. Тобто, стаціонарний рівень акумуляції Са2+ у МХ вірогідно відрізнявся від контролю (р < 0,05) в умовах гострого та хронічного введення алкоголю (моделі ІІІ та IV відповідно).

Mg2+,АТФ-залежна акумуляція Са2+ в ЕР контрольних тварин на п'ятій хвилині інкубації становила 960 ± 148 пмоль Са2+/106 клітин (n = 6), що перевищувало таку, яку встановлено у разі використання моделей II, ІІІ та IV у 1,3; 1,0 і 2,3 раза відповідно. Статистичний аналіз показав, що рівень акумуляції Са2+ у ретикулумі на п'ятій хвилині інкубації лише в умовах хронічного вживання алкоголю (модель IV) виявився вірогідно нижчим за контроль (модель І).

Таким чином, лише у випадку хронічного споживання етанолу (модель IV) спостерігаються статистично вірогідні зміни в акумуляції Са2+ у МХ та ЕР порівняно з контролем (модель I) як за початковою швидкістю транспорту цього катіона (яка зменшувалась у 6,0 і 2,9 раза відповідно), так і за рівнем його накопичення протягом 5 хв (який зменшувався у 9,8 і 2,3 раза відповідно).

У порівняльному аспекті аналіз модельних даних, що отримані при вивченні впливу етанолу на акумуляцію Са2+ у внутрішньоклітинних структурах гладенького м'яза матки (наведено вище), дозволяє дійти такого висновку. У випадку контролю, підгострого та гострого введення етанолу в організм початкова швидкість V0, а також величина акумуляції Са2+ у МХ міометрія (на п'ятій хвилині інкубації) перевищують значення цих параметрів, що властиві для Mg2+,АТФ-залежного транспорту Са2+ в ЕР, у середньому в 7,3; 11,4 і 7,9 раза (для V0) та 3,2; 3,5 і 1,8 раза (для накопичення Са2+ за 5 хв) відповідно. Таким чином, для моделей I – III спостерігається суттєве домінування Са2+-транспортуючої функції МХ порівняно з ЕР як за активністю Са2+-акумулюючої системи, так і за кількістю накопичених іонів Са. Однак за умов хронічного споживання алкоголю домінувальна роль Са2+-транспортуючої системи МХ стосовно Mg2+,АТФ-залежної Са2+-помпи ЕР у забезпеченні транспорту іонів Са у міоцитах практично зникає. Так, значення початкових швидкостей акумуляції Са2+ у МХ і ЕР (рис.7) (V0), як і рівень акумуляції Са2+ у МХ і ЕР (на п'ятій хвилині інкубації), вірогідно не відрізняються одне від одного.

Як відомо, утеротонічна дія пептидного гормону окситоцину пов'язана з активацією рецепторкерованих Са2+-каналів ПМ та ЕР [Sanborn et al., 1998] на фоні часткового інгібування (на 30 – 50%) Mg2+,АТФ-залежної Са2+-помпи ПМ та ЕР [Шлыков и др., 1993; 1997], що зумовлює збільшення концентрації Са2+ у міоцитах матки. У наших дослідах попередня обробка суспензії клітин міометрія розчином окситоцину (100 нМ) до внесення в середовище інкубації фактора порушення бар'єрної функції ПМ – дигітоніну (0,01%) як у випадку контролю (модель I), так і у

випадку підгострого та гострого введення етанолу в організм (моделі II та III відповідно), приводила до зниження початкової швидкості V0 Mg2+,АТФ-залежної акумуляції Са2+ у ЕР у середньому в 1,7; 1,9 та 1,9 раза відповідно. За хронічного споживання етанолу (модель IV) гальмівний ефект окситоцину на параметр V0 майже не спостерігався (рис. 8).

Отже, за умов хронічного споживання етанолу щурами окситоцин не впливає на активність Са2+-помпи ретикулума міоцитів матки. Можливо, що втрата чутли-вості Са2+-помпи ЕР міометрія до гальмівної дії окситоцину в умовах хронічного споживання етанолу (рис. 8) є своєрідною компенсаторною реакцією, що запобігає збільшенню концентрації Са2+ у міоцитах матки на фоні суттєвого зниження Са2+-акумулюючої функції МХ та ЕР.

4. Порівняльне дослідження впливу етанолу in vitro на Са2+-акумулюючу систему МХ та Са2+-помпу ЕР міометрія за умов попереднього підгострого та гострого введення розчину спирту тваринам, а також у разі його хронічного споживання.

Деякі гладеньком'язові органи (насамперед, шлунково–кишкового тракту) в умовах споживання етанолу безпосередньо контактують із розчином спирту у досить високій концентрації, що перевищує таку у плазмі крові При вживанні алкоголю вагітною жінкою він накопичується у навколоплідній рідині [Clarke et al.,1986; Hayashi et al.,1991; Фридман и др.,1998; Шабанов,1999]. Тому з огляду на високий рівень ліпофільності та водорозчинності етанолу, не можна виключати можливість його безпосереднього впливу на гладенькі м'язи матки. З метою вивчення закономірностей безпосереднього впливу етанолу на трансмембранний обмін Са2+ у внутрішньоклітинних мембранних структурах міометрія (у разі попереднього створення на тваринах етанолзалежних моделей) досліджували концентраційні залежності дії цього спирту in vitro на акумуляцію Са2+ у МХ та ЕР у випадку попереднього введення алкоголю в організм щурів. Дію етанолу оцінювали за параметром І0,5 (%).

Гальмівна дія етанолу на акумуляцію Са2+ у МХ міометрія за своєю ефектив-ністю була практично однаковою для моделей I – III. Значення уявної константи гальмування I0,5 становило: 9,1 ± 0,4%, 8,4 ± 0,3% та 8,3 ± 0,7% відповідно (рис. 9). Але для моделі IV цей показник був суттєво нижчим (4,0±0,6%), що вірогідно відрізнялось від контролю та свідчило про збільшення чутливості цієї транспортної системи (майже у 2 рази) до гальмівного впливу етанолу in vitro за умов попереднього хронічного споживання етанолу тваринами. Значення уявної константи гальмування I0,5 у випадку ЕР для моделей І, ІІ, ІІІ та IV дорівнювало: 3,8± 0,2 %, 2,8 ± 0,2 %, 2,5 ± 0,2 % та 2,3 ± 0,3 % відповідно. Тобто, чутливість Са2+-помпи ретикулума до пригнічуючої дії етанолу in vitro практично однакова для всіх етанолзалежних моделей (ІІ – IV), але вона більша, ніж у контролі (модель І).

Таким чином, у випадку хронічного споживання етанолу (модель IV) чутливість Са2+-акумулюючих систем МХ та ЕР до дії етанолу in vitro вірогідно збільшується відносно контролю (модель І). Проте для всіх моделей ця чутливість Са2+-помпи ЕР завжди більша, ніж Са2+-акумулюючої системи МХ (рис. 9).

ВИСНОВКИ

1. У комплексних модельних дослідженнях, що були виконані на суспензії міоцитів, оброблених розчином дигітоніну, проведено порівняльне вивчення кінетичних властивостей Са2+-транспортуючих систем мітохондрій та ендоплазма-тичного ретикулума міометрія. Вперше досліджено вплив етанолу за умов in vitro та in vivo на Mg2+,АТФ-залежне накопичення іонів Са у внутрішньоклітинних структурах гладенького м'яза матки. Доведено, що хронічне споживання етанолу призводить до суттєвого гальмування акумуляції іонів Са у мітохондріях та ендоплазматичному ретикулумі міометрія.

2. Із використанням селективних інгібіторів активного транспорту іонів Са, Са2+-преципітуючого аніона оксалату та Са2+-іонофору у міоцитах матки ідентифіковані дві внутрішньоклітинні Mg2+,АТФ-залежні Са2+-транспортуючі системи: нечутлива до дії тапсигаргіну, яка пригнічується рутенієвим червоним та азидом натрію і локалізована у мітохондріях; і нечутлива до дії рутенієвого червоного та азиду натрію, яка пригнічується тапсигаргіном, потенціюється оксалатом, частково інгібується окситоцином та локалізована в ендоплазматичному ретикулумі.

3. Ефективність гальмівної дії низькомолекулярних аліфатичних спиртів in vitro на Mg2+,АТФ-залежну акумуляцію іонів Са як у мітохондріях, так і в ендоплазма-тичному ретикулумі клітин міометрія, задовольняє послідовності: бутанол > пропанол > етанол > метанол. Ступінь гальмування акумуляції Са2+ аліфатичними спиртами визначається типом транспортного процесу (електрофоретичне накопи-чення чи Mg2+,АТФ-залежний первинний активний транспорт Са2+) та (або) субклітинною мембранною структурою (мітохондрії чи ретикулум) і залежить від кількості атомів вуглецю у спиртовій молекулі.

4. Транспорт іонів Са у мітохондріях менш чутливий до гальмівної дії етанолу in vitro, ніж акумуляція цих іонів в ендоплазматичному ретикулумі: значення I0,5 становить 1560 ± 60 та 650 ± 30 мМ відповідно.

5. За умов контролю, підгострого та гострого введення етанолу в організм щурів початкова швидкість Mg2+,АТФ-залежної акумуляції іонів Са у мітохондріях клітин міометрія суттєво перевищує значення цього параметра, встановленого для ендоплазматичного ретикулума (в середньому в 7, 11 та 8 разів відповідно). У випадку хронічного вживання етанолу (15%) це домінування у накопиченні Са2+ значно зменшується, при цьому суттєво порушується Са2+-транспортуюча функція як мітохондрій, так і ендоплазматичного ретикулума.

6. За умов попереднього хронічного вживання 15% розчину етанолу щурами, на відміну від попереднього підгострого та гострого введення його в організм, значно зростає чутливість Са2+-акумулюючої системи мітохондрій міоцитів матки до галь-мівної дії етанолу in vitro відносно контролю (в середньому в 2 рази). У випадку ендоплазматичного ретикулума клітин міометрія чутливість Са2+-помпи до пригні-чуючої дії етанолу in vitro практично однакова для всіх етанолзалежних моделей та більша, ніж у контролі.

7. У випадку хронічного вживання 15% розчину етанолу щурами, на відміну від контролю, підгострого та гострого введення етанолу в організм, втрачається чутли-вість Mg2+,АТФ-залежної кальцієвої помпи ендоплазматичного ретикулума клітин міометрія до інгібуючої дії окситоцину.

СПИСОК РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Бабич Л.Г., Шлыков С.Г., Борисова Л.А., Костерин С.А. Энергозависимый транспорт Са2+ во внутриклеточных структурах гладкой мышцы//Биохимия. – 1994.– 59, № 8. – С. 1218 – 1229.

2. Бабич Л.Г., Шлыков С.Г., Борисова Л.А., Слинченко Н.Н., Браткова Н.Ф., Костерин С.А. Влияние этанола на активность энергозависимых Са2+ – транспортирующих систем клеток миометрия//Укр.биохим.журн. – 2000. – 72, № 1. – С. 32 – 41.

3. Борисова Л.А., Бабич Л.Г., Шлыков С.Г., Костерин С.А. Сравнительное исследование влияния алифатических спиртов на энергозависимую аккумуляцию ионов Са во внутриклеточных мембранных структурах гладкой мышцы//Укр.биохим.журн. – 2000. – 72, № 2. – С. 28 – 35.

4. Борисова Л.А., Бабич Л.Г., Шлыков С.Г., Костерин С.А. Аккумуляция ионов Са во внутриклеточных структурах миометрия крыс при подостром, остром и хроническом введении этанола//Укр.биохим.журн. – 2000. – 72, № 3. – С. 44 – 55.

5. Бабіч Л.Г., Шликов С.Г., Борисова Л.А., Костерін С.О. Енергозалежна акумуляція Са2+ у внутрішньоклітинних пулах пермеабілізованих міоцитів матки. Збірник тез І з'їзду Українського біофізичного товариства, Київ, 1994 р., С. 31.

6. Babich L.G., Shlykov S.G., Borisova L.A., Kosterin S.A. Energy – dependent transport of Ca2+ in the intracellular structures of the smooth muscle. Proc. XII school on biophysics of membrane transport, Poland, 1994, P. 195.

7. Шликов С.Г., Бабіч Л.Г., Борисова Л.А. Регуляція енергозалежного накопичення Са2+ у ендоплазматичному ретикулумі міометрія фізіологічно– активними речовинами. Збірник тез ІІ з'їзду Українського біофізичного товариства, Харків, 1998, С. 121.

АНОТАЦІЯ

Борисова Л.А. Кінетичні властивості Mg2+,АТФ-залежного транспорту іонів Са у внутрішньоклітинних структурах міометрія та вплив етанолу на цей процес. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ, 2000.

Дисертація присвячена порівняльному дослідженню кінетичних властивостей Са2+-транспортуючих систем мітохондрій та ендоплазматичного ретикулума гладеньком'язових клітин матки.

На суспензії міоцитів, попередньо оброблених