НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

ЦИЦЮРА ЯРОСЛАВ ДМИТРОВИЧ

УДК 577.352:612.73

ФАРМАКО-БІОФІЗИЧНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ НЕСЕЛЕКТИВНОГО КАТІОННОГО СТРУМУ АКТИВОВАНОГО МУСКАРИНОВИМ РЕЦЕПТОРОМ В ГКМ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ - 2000

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі нервово-м’язової фізіології

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: академік НАН України, доктор медичних наук

Шуба Михайло Федорович

зав. відділом нервово-м’язової фізіології

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Веселовський Микола Сергійович

заст. директора Міжнародного центру молекулярної фізіології при НАН України

кандидат біологічних наук

Лозова Наталія Олексіївна

старший науковий співробітник відділу фізико-хімічної

біології клітинних мембран Інституту фізіології

ім. О.О. Богомольця НАН України

Провідна установа: відділ біохімії м`язів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна

НАН України, м. Київ

Захист відбудеться “_14_” листопада 2000 р. о “ 14 ” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “_7_” _жовтня_ 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Питання, що стосуються механізмів нервової регуляції тонусу та скоро-чення гладеньких м’язів, були і залишаються центральними питаннями фізіології, фармако-логії та біофізики цих м’язів. Ацетилхолін (АХ), що є головним медіатором парасимпатичної нервової системи, викликає збудження і скорочення вісцеральних гладеньких м’язів, а також деяких судинних м’язів. Без детального дослідження механізмів дії АХ на гладеньком’язові клітини (ГМК) неможливе розуміння гуморальної регуляції функціонування різних органів, а також порушень їх моторики при різних захворюваннях і пошук нових терапевтичних під-ходів при лікуванні порушень дихальних шляхів, шлунково-кишкового та сечовивідного трактів. АХ, що вивільнюється з парасимпатичних нервових закінчень, так само як і аплі-кація холіноміметиків (наприклад, карбахоліну (КХ)) в експериментальних умовах, викликає скорочення гладеньких м’язів різних органів шляхом активації мускаринових рецепторів. Останні належать до великої родини рецепторів, які діють на різноманітні ефектори - іонні канали і клітинні білки - шляхом активації G-білків.

Центральною ланкою низки подій від активації мускаринових рецепторів до м’язово-го скорочення є підвищення концентрації іонізованого внутрішньоклітинного кальцію ([Са2+]і), джерелами якого є внутрішньоклітинні депо та вхід Са2+ через потенціалкеровані Са2+ канали при деполяризації мембрани ГМК, яка відбувається внаслідок відкривання неселективних катіонних каналів. Враховуючи гетерогенність мускаринових рецепторів та специфічність кожного з підтипів щодо активації G-білків, на сучасному етапі стає все більш очевидним, що холінергічний контроль гладеньких м’язів неможливо уявити як просту суму окремих подій. Навіть така проста подія, як активація катіонних каналів, що відбувається за участю М2 мускаринових рецепторів, є багатофакторним процесом, який залежить від багатьох чинників. Актуальним є подальше дослідження різних взаємодій у цій складній системі: ролі [Са2+]і, а також деяких внутрішньоклітинних процесів, що можуть відбуватися під час М_холінергічного збудження і приймати участь в регуляції неселективного мускаринового катіонного струму (Ікат) ГМК тонкої кишки. Крім того, до сьогодні ще не існує специфічних блокаторів катіонних каналів, що активуються мускариновими рецепорами.

Дослідження проводились відповідно до планів наукової роботи відділу нервово-м’язової фізіології Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за темами “Механізми метаболічної регуляції іонних каналів та скорочення гладеньком’язових клітин” та “З’ясування молекулярних механізмів специфічних змін провідності клітинних мембран при виникненні основних нервових процесів”.

Мета і завдання досліджень. Зважаючи на вищевикладене, метою даної роботи було досліди-ти мембранні та внутрішньоклітинні механізми модуляції Ікат. Для досягнення цієї мети було поставлено наступні задачі:

1.

2. Дослідити дію хімічної сполуки імідазольного походження SK&F 96365 на неселективні катіонні канали мембрани ГМК ileum морської свинки.

3. Використовуючи високоселективний блокатор протеїнкінази G (ПКG), встановити внесок ПКG в регуляцію Ікат та скорочення ГМК ileum морської свинки.

Наукова новизна отриманих результатів. Встановлено, що десенситизація Ікат ГМК ileum морської свинки є також кальційзалежною. Вперше показано, що потенціалзалежні характеристики Ікат змінюються при зміні [Са2+]і. Встановлено, що [Са2+]і впливає на потенціалзалежні активаційні характеристики Ікат.

Виявлено потенціалзалежну блокуючу дію SK&F 96365 на неселективні катіонні канали в мембрані ГМК ileum морської свинки.

Встановлено, що блокування ПКG призводить до зростання максимальної амплітуди тонічної компоненти КХ-індукованого скорочення та сповільнення кінетики розвитку і збільшення амплітуди Ікат ГМК ileum морської свинки.

Теоретичне та практичне значення роботи. Дана робота має в основному експериментальний характер, і її результати значно поглиблюють існуючі теоретичні уявлення про механізми активації неселективних катіонних каналів, що лежить в основі деполяризуючої дії АХ на ГМК. Виявлено, що SK&F 96365, завдяки своїй унікальній потенціалзалежній дії може бути використана як фармакологічний тест для експресованих катіонних каналів в дослідженнях з молекулярної біології.

Особистий внесок. Всі експерименти, описані в роботі, обробка експериментального матеріалу, аналіз та узагальнення результатів досліджень, були виконані особито автором.

Дослідження пригнічуючої дії SK&F 96365 на КХ-активований Ікат проводились разом з д.б.н. Жолосом О.В.

Тензометричні дослідження проводилися спільно з м.н.с. Філіпповим І.Б.

В розробці концепції роботи також брали участь інші співавтори публікацій.

Апробація роботи. Основні положення роботи були представлені та обговорені на наукових семінарах Інституту фізіології ім. О.О.Богмольця НАН України (1996-1999), на 44-му щорічному конгресі біофізичного товариства США (Новий Орлеан, США, 2000); на з’їзді фізіологічного товариства Великобританії (Імперський Коледж, Лоднон, Великобританія, 12-14 квітня, 2000) та на розширеній науково-практичній конференції для молодих фізіологів “Мебрани та процеси передачі сигналу” спільно з Фізіологічним товариством Великобританії (Київ, Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, 4-8 вересня 2000).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковано в п’яти статтях наукових журналів та двох тезах міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису методики та результатів досліджень, обговорення, висновків та списку літератури з 200 найменувань. Робота викладена на 108 сторінках (без списку літератури), ілюстрована 24 рисунками та 2 таблицями.

МЕТОДИКА Досліджень

Дослідження були проведені на поодиноких свіжоізольованих ГМК поздовжнього шару ileum морської свинки, які отримували за допомогою методу ферментативномеханічної ізоляції. Фрагменти м’язової тканини поміщали в 2 мл номінально безкальцієвого розчину Кребса, який містив колагеназу тип IА (1 мг/мл), соєвий інгібітор трипсину (1 мг/мл) і бичачий сироватковий альбумін (1 мг/мл) на 25-30 хв при 36С. Після цього тканину відмивали від ферменту в номінально безкальцієвому розчині і багаторазово пропускали через кінчик скляної піпетки до сильного помутніння розчину. Суспензію клітин розводили нормальним розчином Кребса і зберігали при 4С. Ізольовані клітини використовували на протязі 6-8 годин після їх виділення.

Для дослідження Ікат використовували стандартний метод фіксації потенціалу і внутрішньоклітинної перфузії за допомогою скляної мікропіпетки в конфігурації “ціла клітина”. Піпетки витягували із м’якого молібденового скла; після заповнення відповідним розчином вони мали опір 2-3 МОм. Внутрішньопіпетковий розчин був такого складу (мМ/л): CsCl 80, MgSO4 1, Na2ATФ 1, креатин 5, ВАРТА 10, D-глюкоза 20, HEPES 10, СаCl2 3, 4.6 або 8.1 ([Ca2+]і, розрахована з використанням програми “Eqcal”, становила 30, 100 та 500 нМ, відповідно) рН=7.4 (CsOH, загальна концентрація іонів Cs+ 124 мМ). Розчин Кребса був такого складу (мМ/л): NaCl 120, KCl 6, CaCl2 2.5, MgCl2 1.2, D-глюкоза 12, HEPES 10, pH=7.4 (NaOH). Зовнішньоклітинний розчин для реєстрації Ікат містив (мМ/л): CsCl 120, MgCl2 1, D-глюкоза 12, HEPES 10, рН=7.4 (CsOH, загальна концентрація іонів Cs+ 124 мМ).

Ікат реєстрували за допомогою підсилювача Patch-Clamp L/M-EPC 5 та фільтрували за допомогою фільтру Бесселя 2-го порядку з частотою зрізу 1 кГц. Для генерації імпульсів напруги, а також для реєстрації Ікат використовували аналого-цифровий перетворювач Digidata 1200B і програму pClamp 6.0. Дані аналізували з допомогою програм pClamp 6.0 та MicroCal Origin 5.0. Вольт-амперні характеристики Ікат отримували після цифрового вирахування струмів, що виникали при подачі ідентичних пилкоподібних імпульсів напруги від 80 до -120 мВ тривалістю 6 с, до і після аплікації КХ або одразу ж після прориву мембрани клітини у випадку використання ГТФS для активації катіонного струму.

Результати статистичної обробки експериментальних даних представлені як середнє арифметичне ± стандартна похибка середнього арифметичного (n - кількість вимірювань). Дані апроксимувались різними функціями із використанням програмного забезпечення Origin. Активаційні криві описувались рівнянням Больцмана (1): G=Gmax/(1+e(V-V1/2)/k); де G - провідність при потенціалі V, Gmax - максимальна величина G, V1/2 - потенціал, при якому G=0,5Gmax, k - фактор крутизни. Криві “доза-ефект” при дії SK&F 96365 описували за наступним рівнянням (2): ІSK&F/Іконтр=1/{1+([SK&F]/IC50)P}; де Іконтр - амлітуда Ікат в контролі, ІSK&F - амплітуда Ікат в присутності SK&F 96365 в різних концентраціях [SK&F], ІС50 - концентрація SK&F 96365 при якій струм пригнічувався на 50%, Р - фактор крутизни.

Тензометричні дослідження проводили на гладеньком’язових смужках поздовжнього шару ileum морської свинки в умовах ізометричного скорочення з використанням ємнісного датчика сили. Реєстрацію скоротливої активності проводили на паперовому самописці Н3021-4. Результати обраховували вручну.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

1. Залежність Ікат від [Ca2+]і. В цій серії експериментів ми досліджували залежність Ікат, активо-ваного КХ 50 М або внутрішньоклітинною аплікацією ГТФS 200 М при підтримуваному потенціалі -40 мВ, від [Ca2+]і. З рис.1А, де зображені типові реєстрації від окремих клітин, видно, що амплітуда КХ-активованого Ікат значно збільшується при підвищенні [Ca2+]і від 30 до 100 нМ, але майже не змінюється при [Ca2+]і=500 нМ, коли КХ аплікували через короткий час (20-25 с) після прориву мембрани клітини. Більш того, якщо КХ аплікували після більш тривалої перфузії клітини розчином з [Ca2+]і=500 нМ (3 хв), виникав Ікат дуже незначної амплітуди. Таким чином, десенситизація Ікат прискорювалась із зростанням [Ca2+]і. У випадку ГТФS-активованого Ікат зміна [Ca2+]і викликала подібний ефект. Збільшення [Ca2+]і з 30 до 100 нМ значно збільшувало ампітуду Ікат та скорочувало час досягнення максимума (7-8 хв при 30 та 4-5 хв при 100 нМ) (див. рис.1Б). Підвищення [Ca2+]і до 500 нМ призводило до подальшого скорочення часу активації (близько 1.5 хв до максимуму), але також викликало швидку десенситизацію Ікат.

Також значних змін зазнала і форма стаціонарної вольт-амперної характеристики Ікат (рис.2). При [Ca2+]і=30 нМ КХ-індукований Ікат був малої амплітуди та деактивувався при |

Рис.1. Залежність активації та швидкості розвитку десенсити-зації Ікат від [Ca2+]і. Ікат активували карбахоліном 50 М через 3 хв перфузії клітин внутрішньопіпет-ковим розчином, крім випадку кривої (А) або внутрішньоклі-тинною аплікацією ГТФS 200 М в момент часу “0” (Б) при підтримуваному потенціалі -40 мВ.

гіперполяризації. Збільшення [Ca2+]і до 100 нМ призводило до зростання амплітуди Ікат, пік вольт-амперної характеристики зміщувався в область більш негативних потенціалів та подовжувалася лінійна частина вольт-амперної характеристики. Підвищення [Ca2+]і до 500 нМ призвело до зменшення амплітуди Ікат; а крім того, деактивація Ікат при гіперполяризації значно зменшувалася. Така зміна форми кривої вольт-амперної характеристики не залежала від часу пер-фузії клітини розчином із 500 нМ [Ca2+]і. Подібні зміни відбувалися і для ГТФS-активованого Ікат. Порівняно із [Ca2+]і=30 нМ при 100 нМ амплітуда Ікат значно збільшувалась, пік вольт-амперної характеристики зсувався в бік більш негативних потенціалів. Підвищення [Ca2+]і до 500 нМ призводило до подовження лінійної частини вольт-амперної характеристики, а крім того Ікат майже не проявляв ознак деактивації при гіперполяризації.

Зміна форми вольт-амперної характеристики Ікат вказує також на зміну залежності катіонної провідності від потенціалу. Активаційні криві Ікат отримували, поділивши амплітуду Ікат при кожному потенціалі на електрорушійну силу. Таким чином, U-подібні криві вольт-амперної характеристики були перетворені на сигмоїдні активаційні криві (див. рис.3). Ефектом підвищення рівня [Ca2+]і від 30 нМ до 100 нМ був негативний зсув активаційних кривих (на 48 мВ для КХ та 41 мВ для ГТФS-активованого Ікат). Подальше підвищення [Ca2+]і до 500 нМ не вплинуло на положення активаційної кривої відносно осі абсцис, проте викликало появу потенціалнезалежної компоненти катіонної провідності. При аплікації КХ через 3 хв перфузії

клітин розчином з [Ca2+]і=500 нМ, також було виявлено виражений позитивний зсув активаційних кривих катіонної провідності (рис.3А).

З метою перевірки можливості впливу зміни [Ca2+]і на чутливість Ікат ГМК ileum до КХ, було виконано такі експерименти. Клітини перфузували розчинами із [Ca2+]і=30 та 100 нМ на протязі 3 хв при підтримуваному потенціалі -40 мВ, після чого до зовнішнього розчину додавали КХ в ступінчато зростаючих концентраціях (1, 3, 10, 30, 100 та 300 М). З отриманих даних були побудовані криві “доза-ефект” (дані не представлені). Виявилось, що

Рис.2. Залежність стаціонарних вольт-амперних характеристик Ікат від [Ca2+]і. А - карбахолін-, та Б - ГТФS-активований Ікат. |

Рис.3. Вплив зміни [Ca2+]і на активаційні ха-рактеристики Ікат. А - карбахолін-, та Б - ГТФS-активований Ікат. Активаційні криві Ікат отримували, поділивши амплітуду Ікат в кожній точці на електрорушійну силу для носіїв струму при кожному потенціалі, та описували їх за рівнянням Больцмана.

[Ca2+]і істотно не впливає на чутливість Ікат ГМК ileum до КХ (ЕС50=3.480.78 М для [Ca2+]і=30 нМ (n=13), та ЕС50=5.81.35 М для [Ca2+]і=100 нМ (n=6)).

2. Дія SK&F 96365 на Ікат. SK&F 96365 є відносно новим блокатором рецепторстмульованого входу кальцію до клітини а також іонних каналів, що кодуються генами Trp6 та Trp3. Транскрипти цих генів нещодавно були виявлені і в ГМК шлунково-кишкового тракту, тому й було вирішено дослідити дію SK&F 96365 на Ікат в ГМК ileum морської свинки.

В дослідженнях, проведених нами на багатоклітинних гладеньком’язових препаратах, було виявлено, що SK&F 96365 в концентрації 30 М зменшував більш ніж на 50% амплітуду скорочення, викликаного 50 М карбахоліну (дані не представлені).

В експериментах на ізольованих ГМК Ікат активували додаванням 50 М карбахоліну до зовнішнього розчину при підтримуваному потенціалі -40 мВ через 3 хв після прориву мембрани клітини. До внутрішньопіпеткового розчину додавали 1 мМ ГТФ, що зводило десенситизацію Ікат до мінімума. Ступінчаті зміщення мембранного потенціалу (МП) від -40 до +80 мВ тривалістю 600 мс подавали кожні 5 с (рис. 4); SK&F 96365 додавали до зовнішнього розчину в зростаючих концентраціях (1, 3, 10, 30 М). При 1 М SK&F 96365 блокування Ікат спостерігалося тільки при +80 мВ, але не при -40 мВ; при більш високих концентраціях SK&F 96365 струм при +80 мВ блокувався більш швидко та на більшу величину, ніж при -40 мВ (рис. 4). Майже повне відновлення амплітуди Ікат спостерігалося на протязі однієї хвилини після відмивання SK&F 96365. Також було помічено кумулятивність блокування струму при позитивних потенціалах та деяке відновлення Ікат при поверненні до -40 мВ, що проявлялося у вигляді релаксацій вхідного струму. Для дослідження цього явища було використано тривалі ступінчаті зміщення МП (рис. 5). Аплікація SK&F 96365 10 М викликала незначне і повільне пригнічення Ікат при підтримуваному потенціалі -40 мВ. Однак,

Рис.4. Потенціалзалежність блокування КХ-активований Ікат SK&F 96365. Ступінча-ті зміщення МП від -40 до +80 мВ подавали кожні 5 с. Пунктирна лінія вказує на рівні струму при відповідних потенціалах, виміряні перед аплікацією КХ. | Рис.5. Пригічення Ікат дією SK&F 96365 при деполяризації. Знизу показано протокол експерименту.

зміщення МП до +80 мВ в присутності блокатора викликало швидке додаткове блокування Ікат, яке розвивалося з постійною часу =0.6 с. Наступне зміщення МП до -40 мВ спричиняло

вхідний “хвостовий струм” із постійною часу =5.6 с, який міг би бути пояснений як потенціалзалежний вихід катіонних каналів із блокованого стану, так само як і перехід каналів з відкритого стану до заблокованого на початку зміщення МП до +80 мВ.

З початкової та остаточної стаціонарних амплітуд під час релаксацій Ікат при -40 мВ можна було оцінити ступінь блокування Ікат під час ступінчатих зміщень МП до різних значень, в тому числі і до потенціалів, близьких до потенціалу реверсії Ікат, де струм не можна було виміряти прямо (наприклад, за даних умов потенціал реверсії Ікат становив 0 мВ). В експериментах, що показані на рис.6А, подавали серію довгих (тривалістю 20 с, зображені

тільки останні 5 с кожного епізоду) ступінчатих зміщень МП до різних рівнів в присутності 10 М SK&F 96365. На рис.6Б показано відношення процентної частки викликаного деполяризацією блокування, обрахованої, як показано на четвертій реєстрації (а/b*100%), до відповідного потенціалу. При постійній концентрації SK&F 96365 пригнічення Ікат було сигмоїдною функцією мембранного потенціалу із потенціалом половинного блокування 18 мВ та фактором крутизни -18 мВ.

Оскільки блокування та вихід з блокованого стану КХ-активованого Ікат сполукою SK&F 96365 розвивалося набагато повільніше, ніж активація та деактивація струму під час аплікації та відмивання КХ (рис.4), не можна було виключити те, що SK&F 96365 впливає на взаємодію агоніста з мускариновим рецептором. Для перевірки цієї можливості в наступних експериментах Ікат активували внутрішньоклітинною аплікацією ГТФS 200 М. Цей ГТФS-індукований Ікат блокувався SK&F 96365 в подібній потенціалзалежній манері як і КХ-індукований Ікат, вказуючи на те, що саме катіонний канал, а не мускариновий рецептор, є місцем зв’язування для SK&F 96365.

Так як ГТФS-індукований Ікат досить стабільний в часі, потенціалзалежність та кіне-тику блокуючої дії SK&F 96365 було досліджено більш детально. Використовуючи прото- |

Рис.6. Потенціалзалежність пригнічен-ня Ікат SK&F 96365. А- потенціал-залежні релаксації КХ-активованого Ікат в присутності SK&F 96365 10 М після тривалих (20 с; зображено тільки останні 5 с) зміщень МП. Б- залежність процентної частки при-гнічення Ікат від МП, вказаних на А. Ступінь пригнічення обраховували як а/б*100% (де а і б вимірювались, як показано на А). Точки описані за рівнянням (2). В- залежність сступеня () та швидкості блокування () ГТФS-активованого Ікат від МП в присутності 30 М SK&F 96365. Протокол експерименту був подібним до А.

кол, зображений на рис.6А, досліджували відновлення Ікат при підтримуваному потенціалі -40 мВ, яке відбувалося після тестуючих імпульсів до різних потенціалів (від -80 до +120 мВ з інкрементом 10 мВ). На представленому на рис.6В прикладі, 30 М SK&F 96365 викликало потенціалзалежне пригнічення Ікат із потенціалом половинного ефекту 38 мВ та фактором крутизни -13 мВ (суцільна лінія що сполучає позначки на рис.6В); середня величина для V1/2 блокуючого ефекту становила 50.78.6 мВ та -17.31.5 мВ для фактора крутизни k (n=6). В деяких клітинах не спостерігалося ніякого пригнічення Ікат при потенціалах більш негативних ніж -20 мВ (див. рис.6В). Швидкість пригнічення Ікат зростала з подібною потенціалзалежністю як і ступінь блокування при тих же зміщеннях МП (див. рис.6В суцільна лінія через позначки , зменшення часової константи в е разів за 11.9 мВ).

Оскільки деполяризація мембрани ГМК прискорює та посилює блокуючу дію SK&F 96365 на катіонні канали, можна було припустити, що гіперполяризація мембрани прискорить кінетику процесу виходу каналів із блокованого стану. Для цього було використано наступний протокол експерименту: після ступінчатого МП до +80 мВ на протязі 5 с відбувалась ступінчата гіперполяризація мембрани тривалістю 6,4 с від -10 до -120 мВ з інкрементом -10 мВ. За нормальних умов було зареєстровано деактивацію катіонного Ікат із часовою константою в кілька десятків мілісекунд при потенціалах нижчих за -50 мВ. В присутності блокатора SK&F 96365 було зареєстровано відновлення струму в протилежному напрямку. На рис.7А показано, що обидва процеси - блокування та вихід Ікат із блокованого стану - можна задовільно описати одноекспоненційною функцією. Швидкість виходу каналу з блокованого стану зростала із збільшенням рівня гіперполяризації, таким чином змен-шувалася з ~4 с при -10 мВ до 1.4 с при -120 мВ (рис.8Б). Подібно до рис.6А блокуючий ефект SK&F 96365 не був виражений при підтримуваному потенціал -40 мВ і розвивався тільки при деполяризації до 80 мВ, починаючися з того ж самого рівня, що і струм в контро-лі. Також, використовуючи ступінчаті зміщення МП різної тривалості, було отримано дані щодо кількісного порівняння фракцій Ікат, блокованого при деполяризації, та Ікат, що вихо-дить із блокованого стану при гіперполяризації. В експерименті, протокол якого зображено на рис.8А, Ікат активували внутрішньоклітинною аплікацією ГТФS 200 М і в присутності блокатора SK&F 96365 в концентрації 30 М поступово збільшували тривалість (з 0.5 до 12 с) зміщень МП від підтримуваного потенціалу -80 мВ до +80 мВ, для того щоб викликати поступове наростання блокуючого ефекту. При подальшій реполяризації мембрани ГМК до -80 мВ спостерігався вихід Ікат з блокованого стану (див. рис.8А). На рис.8Б порівнюється процентне співвідношення блокованого Ікат при обох потенціалах для цієї (кружки) та іншої (квадрати) клітини, дослідженої із використанням такого ж протоколу. Майже ідентичні величини були отримані для блокуючої дії, виміряної на кінці зміщення МП до +80 мВ та негайно після реполяризації мембрани при -80 мВ, що вказує на те, що фармакологічно ідентичні канали приймали участь у генерації Ікат при обох потенціалах.

Рис.7. Потенціалзалежність виходу ГТФS-активованого Ікат із блокованого стану. А- суперпозиція Ікат до та після аплікації SK&F 96365 30 М. Блокування Ікат при +80 мВ та вихід з блокованого стану при -70 мВ розвивалися із константами швидкості, вказаними біля кожного рівня. Горизонтальна пунктирна лінія вказує на нульовий рівень Ікат. Б- крива потенціалзалежності швидкості виходу Ікат із блокованого стану. | Рис.8. Кореляція між частинами струму, блокованого SK&F 96365 при потенціалах +80 та -80 мВ. А - суперпозиція струмів та протокол експерименту; пунктирні лінії показують початкову амплітуду струму при 80 та -80 мВ одразу ж піс-ля прориву мембрани. Б - процент блокування струму при 80 мВ (зафарбовані позначки) та -80 мВ (незафарбовані позначки), обрахований з А для двох клітин.

3. Залежність КХ-активованого Ікат від активності ПКG. Для дослідження залежності Ікат ГМК ileum морської свинки від активності ПКG використовували внутрішньопіпетковий розчин із [Ca2+]і=100 нМ. Після прориву мембрани клітину перфузували внутрішньопіпетковим розчином на протязі 3 хв, після чого аплікували КТ5823 1 М - високоспецифічний блокатор ПКG, на протязі двох хвилин. Це призводило до незначного зростання вихідного струму при потенціалах вищих від +40 мВ (дані не представлені). Потім, не усуваючи блокатор із зовнішнього розчину, додавали 50 М КХ. У відповідь на аплікацію КХ в присутності блокатора ПКG при підтримуваному потенціалі -40 мВ розвивався вхідний струм. В ~25% випадків блокування ПКG перед аплікацією КХ призводило до істотного сповільнення як процесу активації (рис.9, час досягнення максимума активації становив 10-14 хв (n=2) порівняно до 20-30 с в контролі (n=7)), так і розвитку десенситизаціїї Ікат (час напівмаксимального спаду більше 40 хв) та зростання амплітуди Ікат.

Також були проведені дослідження участі ПКG в регуляції скоротливої активності гладеньком’язових смужок ileum морської свинки. Аплікація 5 М КТ 5823 до омиваючо-го розчину Кребса не впливала на базальний тонус багатоклітинного препарату, але викликала, порівняно з нормальними умовами (рис.10А), зміну тонічної компоненти активованого КХ 50 М скорочення, а саме: збільшувалась амплітуда і тривалість (рис.10Б). Максимальне значення амплітуди тонічного скорочення становило 4.40.2 мН в контролі та 5.40.3 мН в присутності КТ 5823 5 М (n=5); приріст амплітуди становив 27.06.0 %. Вплив цього блокатора на КХ-індуковане скорочення характеризувався стабільною повторюваністю. Під час тривалої (30 хв) реєстрації КХ-індукованого скорочення в присутності КТ 5823 5 М було виявлено, що спад тонічної компоненти скорочення значно сповільнювався, тоді як за нормальнох умов вона знижувалась майже до рівня базального тонусу (дані не представлені).

Рис.9. Вплив блокування ПКG на кінетику розвитку КХ-активованого Ікат при підтриму-ваному потенціалі -40 мВ. | Рис.10. Участь ПКG в регуляції М-холіно-цептивної скоротливої активності гладень-ком’язової смужки поздовжнього шару ile-um морської свинки. Скорочення, викли-кане КХ (50 М) в контрольних умовах (А) та через 10 хв після аплікації блока-тора ПКG КТ 5823 5 М (Б). Пунктирна лінія вказує на початковий рівень тонусу.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

1. Кальційзалежність Ікат ГМК ileum морської свинки. Відкривання катіонних каналів лежить в основі деполяризації мембрани під час мускаринового холінергічного збудження у вісцеральних гладеньких м’язах. Було показано (Inoue & Isenberg, 1990), що неселективні катіонні канали власне не активуються внутрішньоклітинними іонами Ca2+, однак, будучи активованими при взаємодії з G-білками, вони стають дуже чутливими до зміни [Ca2+]і (Pacaud & Bolton, 1991). З іншого боку, коли ж [Ca2+]i досить низька, (наприклад, в присутності високої концентрації EGТА або BAPTA всередині клітини), катіонні канали не відкриваються навіть при максимальній стимуляції мускаринових рецепторів. Таким чином, внутрішньоклітинні іони Ca2+ відіграють як “дозволяючу”, так і “підсилюючу” ролі.

В даній роботі досліджувалося, як [Ca2+]i впливає на біофізичні характеристики Ікат. Відомо (Kuriyama & Kitamura, 1999), що в ГМК шлунково-кишкового тракту рівень [Ca2+]i коливається в межах 100-150 нМ, саме тому було вирішено дослідити властивості катіонних каналів при відносно низькій (30 нМ) та високій (500 нМ) [Ca2+]i та порівняти їх із “контрольними” даними при [Ca2+]і=100 нМ. Як видно із отриманих результатів, навіть [Ca2+]і=30 нМ цілком достатньо для активації Ікат, проте кінетичні та потеціалзалежні характеристики цього Ікат істотно відрізняються від таких при [Ca2+]і=100 нМ. Маючи на увазі те, що чутливість Ікат ГМК до КХ, які перфузували розчином із [Ca2+]і=30 нМ не відрізнялася істотно від того випадку, коли [Ca2+]і=100 нМ, можна зробити висновок, що виявлені відмінності мають суто кальційзалежну природу і, очевидно, пов’язані з Са2+-залежністю активації G-білків або існуванням в молекулі каналу “сенсора Са2+”, який може відкривати канали синергічно з місцем зв’язування G-білка. Результати, отримані при використанні ГТФS для активації Ікат, можуть бути ще одним підтвердженням цього припущення. Проте точне визначення механізму впливу [Ca2+]і на Ікат вимагає подальших досліджень.

Виходячи із порівняння властивостей Ікат при 30 та 100 нМ [Ca2+]i та припускаючи кальційзалежніссть активації каналу/G-білків, можна було б зробити висновок, що подальше збільшення [Ca2+]i до 500 нМ до зростання амплітуди Ікат, прискорення процесу десенситизації, зміни форми кривої вольт-амперної характеристики та негативного зсуву активаційних кривих. Але отримані результати, особливо у випадку КХ-активованого струму, дещо відрізняються від очікуваних. Основна відмінність полягає в зменшенні амплітуди КХ-активованого Ікат та позитивному зсуві активаційних кривих, особливо у випадку, коли клітини перфузували розчином з 500 нМ Са2+ на протязі 3 хв перед аплікацією КХ. Для пояснення такого феномену можна припустити, що в цьому випадку відбувається швидка Са2+-залежна, агоністнезалежна десенситизація мускаринового рецептора, який активує катіонний канал. Підтвердженням для такого припущення можуть бути наведені вище результати, а саме той випадок, коли Ікат активували КХ через короткий час після прориву мембрани клітини (~25 с), тобто коли внутрішньоклітинна рівновага для іонів Са2+ іще не встановилася. В цьому випадку потенціалзалежні характеристики Ікат мало чим відрізнялися від таких, коли [Ca2+]і=100 нМ, тим не менше були деякі характерні відмінності. Очевидно, при 100 нМ вільного Са2+ відбувається повна “активація” усіх чи майже усіх каналів/G-білків, що зв’язані з катіонним каналом, тому подальше підвищення [Ca2+]і не призводить до значного зростання амплітуди Ікат, зсуву активаційних кривих. Проте було зареєстровано прискорення десенситизації та зміну форми кривої вольт-амперної характеристики Ікат, які передбачалися. Ще одним доказом на користь припущення про Са2+-залежну і агоністнезалежну інактивацію мускаринових рецепторів при [Ca2+]і=500 нМ можуть бути експерименти, в яких Ікат активували прямо, без участі мускаринових рецепторів, шляхом внутрішньоклітинної аплікації ГТФS 200 М. В цьому випадку Ікат поводився як і передбачалося - час активації струму скорочувався, розвивалася швидка десенситизація Ікат (характерно, що майже ніякої десенситизації не було помітно за такий же проміжок часу, коли [Ca2+]і=100 нМ), відбувалося незначне зростання амплітуди Ікат. Струм деактивувався при гіперполяризації на рівнях, значно більших від рівня Ікат при підтримуваному потенціалі, тому форма вольт-амперної характеристики також зазнавала змін.

Особливої уваги заслуговують активаційні криві Ікат при [Ca2+]і=500 нМ, оскільки їх вже не можна було описати за рівнянням Больцмана з використанням тільки однієї, потенціалзалежної, компоненти, і потрібно було вводити іще одну, потенціалнезалежну, компоненту. Наявність потенціалнезалежного, стаціонарного рівня особливо добре видно (за рахунок значного позитивного зсуву активаційних кривих) у випадку КХ-активованого Ікат при [Ca2+]і=500 нМ, коли струм активували через 3 хв після прориву мембрани. Природа такого ефекту підвищення вільного Са2+ на активаційні характеристики Ікат поки-що не з’ясована, проте можна висунути припущенна про те, що в порі самого каналу є специфічна ділянка, з якою можуть зв’язуватися іони Са2+ і таким чином модулювати воротні характеристики каналу. Підставою для такого роду припущень може бути робота (Zholos & Bolton, 1995), в якій досліджували вплив позаклітинних іонів Mg2+ та Са2+ на Ікат в ГМК ileum морської свинки. Підвищення позаклітинної концентрації іонів Mg2+ призводило до пригнічення Ікат та позитивного зсуву активаційних кривих. Такий ефект Mg2+ на Ікат пояснюється за теорією Гуі-Чапмена (Hille, 1992), яка передбачає зсув активаційних кривих за рахунок екранування поверхневих зарядів мембрани клітини двовалентними катіонами. Проте у впливові позаклітинного Са2+ на Ікат було виявленно деякі відмінності - іони Са2+ не тільки екранували (а отже пригнічували амплітуду Ікат та зсували активаційні криві в область менш негативних потенціалів) поверхневі заряди, але й, очевидно, зв’язувалися в певних ділянках біля катіонного каналу чи на самому каналі, змінюючи його воротні характеристики, що проявлялося у зміні нахилу аквтиваційних кривих - в присутності Са2+ криві ставали більш пологими (~38%) ніж в контролі. Приймаючи до уваги, що за фізіологічних умов неселективний катіонний канал може бути проникним для іонів Са2+ (близько 1% від загального струму (Kim et al., 1998)), можна припустити, що іони Са2+ діяли не як зовнішній екрануючий чинник, а проникали досередини каналу чи клітини і таким чином модулювали його, діючи на внутрішнє вустя каналу. Результати, отримані в даній роботі можуть бути так само пояснені за умови, якщо активаційні криві описувати рівнянням Больцмана тільки за допомогою однієї, потенціалзалежної компоненти - в такому випадку дійсно спостерігатиметься значна зміна нахилу активаційних кривих, вони ставатимуть більш пологими, що свідчитиме про зміну воротних характеристик каналу.

В інших дослідженнях (Armstrong, 1999) було показано, що потенціалкеровані Na+ канали можуть блокуватися позаклітинними іонами Са+, крім того кальцій впливає на швидкість відкривання/закривання активаційних воріт. Збільшення позаклітинної концентрації іонів Са2+ також призводить до позитивного (на 21 мВ) зсуву активаційних кривих Na+ струму. При цьому було показано, що Са2+ проникає досередини самої пори каналу і блокує Na+ канал саме зсередини. Зважаючи на все вищезазначене, а також на те, що за фізіологічних умов неселективні катіонні канали ГМК ileum морської свинки під час М-холінергічної активації спрацьовують в першу чергу саме як натрієві канали, можна припустити, що як позаклітинний, так і внутрішньоклітинний Са2+ можуть ефективно модулювати воротні механізми катіонних каналів.

2. Фармакологічні властивості Ікат в ГМК ileum морської свинки. Нещодавно були детально досліджені деякі фармакологічні властивості катіонних каналів. Було показано (Kuriyama et al., 1998), що багато добре відомих блокаторів інших каналів ефективно блокували Ікат, в основному в межах своїх типових концентрацій. Сюди відносяться неорганічні блокатори Са2+ каналів: Zn2+, Cd2+, Ni2+, Co2+, Mn2+; в цьому випадку блокування було практично потенціалнезалежним із незначними змінами потенціалу реверсії або чутливості до антагоніста. Органічні блокатори К+ каналів блокували Ікат у потенціал-залежній манері; хінідин серед них був найбільш ефективним (ІС50=0.25 М), за ним слідує хінін (1 М), 4-амінопіридин (3.3 мМ), ТЕА+ (4.1 мМ), прокаін (1-5 мМ) (який також блокує інші потенціалкеровані іонні канали та процес вивільнення Са2+ з СР). Кофеїн, що є Са2+-вивільнюючим агентом, також блокує катіонні канали (~10 мМ). Очевидно, що серед цих блокаторів тільки хінідин можна вважати відносно селективним для мускаринової катіонної провідності.

В даних експериментах ми досліджували блокуючу дію імідазольної сполуки SK&F 96365, відомої як селективний блокатор рецепторстимульованого входу Са2+ до клітини (Merritt et al., 1990). З літературних даних відомо, що ця речовина блокує рецептор-стимульований вхід Са2+ з наступним спустошенням Са2+ депо в різних типах клітин, включа-ючи і гладенькі м’язи. Однак SK&F 96365 не є ні досить сильним (ІС50 в більшості випадків близько 10 М), ні селективним блокатором, оскільки він пригнічує потенціалкеровані Са2+ канали, К+ канали.

Багато блокаторів діють потенціалзалежним чином і було запропоновано кілька механізмів для пояснення такої дії, хоча у більшості випадків досить важко визначити критерії, щоб розрізнити цірізні механізми. Блокування Ікат TEA+, 4-AП, прокаїном, xiнiном, хінідином та кофеїном сильно залежало від деполяризації мембрани; такий ефект пояснюють тим, що ділянка для зв’язування блокатора локалізовано усередині самої пори каналу і молекула блокатора повинна пройти певну відстань у електричному полі мембрани клітини, або, як це є у випадку із позитивно зарядженою молекулою блокатора, наприклад ТЕА+, потенціалзалежність обумовлена електрорушійною силою (Hille, 1992). Альтернативною, або додатковою, є можливість того, що макромолекула іонного каналу зазнає конформаційних змін при зміщеннях мембранного потенціалу і таким чином ділянка для зв’язування змінює свою здатність чи афінність по відношенню до блокуючої молекули. Приймаючи до уваги такий механізм блокування, цікаво відмітити, що відкривання катіонного каналу відбувається при більш негативних потенціалах, які варіюють від клітини до клітини, а також залежить від кількості активованих G-білків, але, як правило, величини V1/2 для активаційних кривих, обрахованих за рівнянням Больцмана є більш негативними ніж _mV у порівнянні із величинами V1/2 для блокуючої дії SK&F 96365, які є більш позитивними, ніж 20 мВ. Таким чином можна виключити блокування відкритого каналу (наприклад, ефекти подібні до дії внутрішньоклітинної аплікації TEA+ або місцевих анестетиків на інші типи каналів). Напрямок протікання струму також здається неважливим, тому що відносний блокуючий ефект SK&F 96365 описувався гладкою сигмоїдною лінією по відношенню до мембранного потенціалу в області, де струм був тільки вихідним (див. рис.6B).

Кінетика блокування та виходу Ікат із блокованого стану під час ступінчатих зміщень мембранного потенціалу доводить, що SK&F 96365 можна віднести до категорії повільних блокаторів, які мають значний латентний період дії. Зростання швидкості блокування з зростанням деполяризації мембрани має таку ж саму потенціалзалежність, що й ступінь блокуючого ефекту (див. рис.6B, крива ) і разом із прискоренням виходу струму із блокованого стану при гіперполяризації мембрани клітини (рис.8) перебуває у повній згоді із впливом МП на уявну константу дисоціації.

У попередніх роботах було показано значні відмінності у поведінці катіонного струму мускаринових рецепторів в області позитивних та негативних потенціалів (Zholos & Bolton, 1996). Було запропоновано, що один і той же канал відкривається по-різному при різних потенціалах в залежності від кількості активованих G-білків в клітині, вказуючи на те, що кілька активованих G-білків можуть зв’язуватись з одним і тим же катіонним каналом, подовжуючи таким чином його відкривання при будь-якому потенціалі; а під час гіперполяризації для відкривання каналу потрібно більше активованих G-білків. Кількісне порівняння між фракціями заблокованого SK&F 96365 Ікат при позитивних потенціалах та Ікат, що виходить із блокованого стану при негативних потенціалах дало нам майже ідентичні величини (рис.8), підтверджуючи таким чином, що один і той же тип каналу працює на всьому проміжку потенціалів.

На завершення, блокуюча дія SK&F 96365 на мускариновий неселективний катіонний канал у гладеньком’язових клітинах клубової кишки підтверджує припущення про те, що цей канал може кодуватися геном Trp6. Також, слід відзначити, що цей блокатор завдяки своїм унікальним властивостям міг би бути придатним як фармакологічний тест експресованих неселективних каналів.

3. Регуляція Ікат струму цГМФ-залежною протеїнкіназою. Нещодавні роботи показали, що Ікат може модулюватися кальмодуліном (Kim et al, 1995) та протеїнкіназами (Ahn et al., 1997; Inoue et al., 1994). Фосфати з макроергічними зв’язками (АТФ, ГТФ,