Селекцiйно-генетичний iнститут УААН

Левчук Людмила Володимирівна

УДК 577.645: 575.167: 595.773.4

Пристосованість генотипів Drosophila melanogaster за штучного заміщення хромосом

03.00.15-генетика

Автореферат

дисертація на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Одеса – 2000

Дисертацiєю є рукопис

Робота виконана в Одеському державному унiверситеті iм. І.Й. Мечникова

Науковий керiвник: доктор бiологiчних наук, професор

(консультант) Тоцький Владлен Миколайович

Одеський державний унiверситет

iм. І.?. Мечникова, завiдувач кафедрою

генетики та мол. бiологii

Офiцiйнi опоненти: доктор біологічних наук

професор Шахбазов Валерій Гаєвич

Харківський державний університет

завідувач кафедрою генетики

кандидат біологічних наук

Моцний Іван Іванович

кандидат біологічних наук

Селекційно-генетичний інститут УААН

старший научний співробітник відділу генетики

Провідна установа: Київський національний університет

ім. Тараса Шевченка, м. Київ.

Захист відбудеться 10.11.2000 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.363.01 при Селекційно-генетичному інституті УААН (65036, м. Одеса, Овідіопольска дорога, 3).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Селекційно-генетичного інституту (65036, м. Одеса, Овідіопольска дорога, 3).

Автореферат розісланий 09.10.2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Станкевич А. О.Актуальність теми. Актуальною проблемою сучасної генетики є вивчення механізмів пристосованості особин популяцій та її залежності від особливостей генотипів. Ця проблема давно займає центральне місце в еволюційній теорії, генетиці й селекції, залишаючись одночасно найбільш дискусійною [Жученко, 1980, 1988].

Будь-які структурні зміни генотипу, включаючи генно-інженерні перетворення, заміщення хромосом з метою отримання нового вихідного матеріалу для селекції можуть призводити до істотних змін генного балансу, а, отже, і до змін пристосованості синтезованих генотипів.

Спрогнозувати ці можливі зміни при створеннi нових генотипів дуже важливо, але дуже складно, бо на сьогодні спiльний вплив окремих алельних генів власних і чужинних хромосом на пристосованість штучно ситезованих генотипів залишається мало з`ясованим. Дані про негативний вплив гібридного дисгенезу (Хесин, 1984), а також деяких маркерних мутацій (Soliman, 1987) на адаптивний потенціал організмів добре відомі, але вони не систематизовані й не вирішують проблему в цілому.

Таким чином, є підстави вважати, що вивчення пристосованості та її складових на об`єктах із штучно зміненими генотипами являє собою актуальну, теоретично й практично важливу проблему, вирішення якої сприятиме подальшому прогресу сучасної генетики, генетичної інженерії й селекції. В умовах України такі дослідження є особливо актуальними у зв`язку з упровадженням у сільськогосподарське виробництво трансгенних рослин (томати, картопля та ін.), а також генотипів, створених поєднанням хромосом різного походження (рослини з заміщеними хромосомами, штучно створена культура – тритікале тощо). Слід зазначити, що адаптивний потенціал генотипів таких рослин досліджений недостатньо.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження провадили на кафедрі генетики та молекулярної біології Одеського державного університету в межах теми “Вікові особливості життєздатності й мейотичної рекомбінації у дрозофіли в залежності від генотипу, штучного заміщення хромосом і умов утримання” № 760, реєстраційний номер 0197 V 017690, яка входила до координаційного плану № 15 за фаховим напрямком “Біологія” Міністерства освіти України.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було з`ясування впливу реципрокних міжлінійних обмінів хромосом на окремі показники пристосованості D. mеlanogaster.

Для досягнення мети вирішували наступні завдання:

1. Отримати інбредні форми мух вихідних лабораторних ліній і з`ясувати ступінь їх пристосованості за рядом показників;

2. Відібрати лінії мух з високою й низькою пристосованістю для подальших дослідів;

3. Здійснити реципрокні обміни (заміщення) хромосом першої, другої й третьої пари між мухами ліній з однаковою та різною пристосованістю;

4. З`ясувати рівень відносної пристосованості та інших показників адаптивної здатності генотипів, синтезованих шляхом заміщення хромосом;

5. Провести порівняльну оцінку ефективності впливу заміщення певних пар хромосом на показники пристосованості D. melanogaster;

6. Визначити алельний склад локуса Adh і властивості алкогольдегідрогенази (АДГ) у мух вихідних інбредних ліній і синтезованих форм;

7. З`ясувати можливість модифікацій властивостей АДГ при реципрокних обмінах хромосом;

8. Визначити вплив маркерних мутацій (cn i vg) на пристосованість генотипів із заміщеними хромосомами;

9. З`ясувати ступінь кореляції окремих показників пристосованості у вихідних лінійних мух і у генотипів, синтезованих шляхом заміщення хромосом.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше отримано лінії мух з реципрокними заміщеннями хромосом, маркованих морфологічними мутаціями (cn i vg) і алельними генами локуса Adh. На цих модельних об`єктах показано, що реципрокні заміщення хромосом 1, 2 і 3 істотно впливають на відносну пристосованість генотипів та інші показники їх адаптивної здатності (реальну плодючість, теплостійкість, тривалість життя та ін.).

Експериментально доведено, що хромосомні заміни навіть у межах споріднених і однаково добре пристосованих ліній (C-S i cn) можуть призводити до зменшення відносної пристосованості генотипів і суттєвих змін окремих складових цієї ознаки.

Показано, що основним можливим чинником зменшення адаптивного потенціалу генотипів, синтезованих шляхом заміщення хромосом, є введення в ці генотипи мутацій, які негативно впливають на пристосованість мух (наприклад, мутації vg). Мутація cn, майже нейтральна щодо життєвості вихідних лінійних мух, може істотно негативно впливати на пристосованість штучно змінених генотипів.

Іншою причиною зменшення пристосованості генотипів мух із заміщеними хромосомами є порушення у них генного балансу і, можливо, посттрансляційної модифікації продуктів генів. Доведено, що властивості S- i F-алозимів АДГ у мух із заміщеними хромосомами можуть істотно модифікуватись без зміни електрофоретичної рухливості цих алозимів. Упровадження гена Adhs у генотип, адаптований до гомозиготного стану алеля AdhF, може призводити до модифікації властивостей S-алозиму за типом F-алозиму. За протилежного напрямку заміщення хромосом можлива модифікація властивостей F-алозиму за типом S-алозиму. Таким чином, посттрансляційні модифікації алозимів АДГ у мух можна розглядати як важливий механізм їх онтогенетичної адаптації при заміщеннi хромосом, а раніше опубліковані дані (Тоцький, Хаустова, 1998; 1999) про важливу роль локуса Adh в адаптивних реакціях дрозофіли дістали подальший розвиток.

У цілому матеріали дисертаційної роботи поглиблюють існуючі уявлення про взаємодію структурних генів хромосом і сприяють подальшому розвитку теорії адаптації й адаптивного гетерозису.

Практичне значення одержаних результатів. Отримано мух з міжлінійними хромосомними заміщеннями, які можуть слугувати модельними об`єктами в генетичних дослідженнях по з`ясуванню взаємодії генів, залежності кросинговеру від збалансованості генотипу, особливостей розвитку синтезованих генотипів і т.п. Ці лінії мух використовують співробітники й студенти кафедри генетики та молекулярної біології Одеського державного університету для проведення наукових досліджень, виконання курсових і дипломних робіт. На підставі вивчення корелятивних зв`язків між окремими показниками пристосованості у генотипів із заміщеними хромосомами деякі з цих показників (плодючість, теплостійкість особин, алозимна належність АДГ) пропонуються як надійні тести за оцінки і прогнозу адаптивної здатності штучно створених генотипів дрозофіли.

З'ясований факт, що введення чужинних хромосом у каріотип може негативно впливати на показники пристосованості генотипів і змінювати властивості продуктів структурних генів, має враховуватись у селекційнiй роботi по створенню форм із заміщеними хромосомами, генотипів з доповненим каріотипом, а також для здійснення трансгенозу та інших генно-інженерних перетворень біологічних об`єктів. У зв`язку з цим, матеріали дисертації можуть цікавити наукові установи, які провадять генетично-інженерні та селекційні дослідження.

Особистий внесок здобувача. Роботу з літературою й написання огляду літератури, експерименти по заміщенню хромосом у D. melanogaster і дослідження показників пристосованості у вихідних ліній і синтезованих генотипів проведено самостійно. Електрофоретичний розподіл АДГ і визначення фізико-хімічних властивостей алозимів у лабораторних ліній дрозофіли здійснювали разом з В.М. Тоцьким, Н.Д. Хаустовою та С.В. Моргун. Аналіз та інтерпретацію результатів, одержаних на мухах з заміщеними хромосомами, провадили разом із науковим керівником. Статистичну обробку цифрового матеріалу, написання тексту дисертації та її оформлення здійснювали самостійно.

Апробація результатів дисертації. Результати й основні положення роботи доповідали на звітних конференціях аспірантів і викладачів Одеського державного університету ім. І. І. Мечникова та на міжнародних симпозиумах “Біологічні механізми старіння” (м. Харків 15-17 травня 1996 р., 19-21 травня 1998 р. та 24-27 травня 2000 р.). та на IЙ ?ацiональному конгресi геронтологiв i герiатрiв Украiни (м. Киiв, 4 жовтня 1994 р.).

Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковано 11 праць, з них 5 статей у фахових виданнях та 6 тез у збірниках конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу й розділів: огляду літератури (два підрозділи і резюме), опису загальної методики й основних методів досліджень, експериментальної частини (шість підрозділів), аналізу й узагальнення результатів, висновків, а також додаткiв і списку літератури з 311 найменувань.

Додаток А (15 таблиць) містить результати кореляційного аналізу (значення r) показників пристосованості досліджуваних генотипів при заміщеннi хромосом.

Основний зміст роботи

У вступі обгрунтована актуальність теми дисертації, вказано на її зв'язок з існуючими в Україні науковими програмами та планами, сформульовано загальну мету та завдання дослідження, підкреслено наукову новизну та практичне значення роботи, зазначено особистий внесок здобувача в її виконаннi.

У першому розділі (“Огляд літератури”) на підставі аналізу літературних джерел дано огляд сучасних уявлень про генетичні засади онтогенетичної та філогенетичної адаптації, про відносну пристосованість та її складові, про значення взаємодії генів і генного балансу у визначенні показників пристосованості.

Досліди провадили на лінійних та експериментально отриманих лініях Drosoрhila melanogaster із заміщеними хромосомами. Із вихідних лабораторних ліній (С-S, cn i vg) спершу отримували інбредні лінії шляхом довготривалого (понад 50 поколінь) близькородинного (сестра х брат) інбридингу.

Мухи лінії C-S – це мухи дикого типу, які в генетичних дослідженнях часто використовуються як контроль. Мутація cn, що обумовлює кіноварний колір очей у мух відповідної лінії, локалізована в хромосомі 2 у положенні 57.5 сМ. Фенотиповим проявом мутації vg є зачаткові крила та жужальця; мутація займає положення 67.0 сМ у хромосомі 2.

Заміщення хромосом здійснювали за дещо модифікованим методом Luckinbill et al., 1988. Для цього використовували стандартну лінію, збалансовану за рецесивними леталями, що знаходяться в хромосомах 2 і 3, а саме Cy/Pm, D/Sb.

Провадили заміщення хромосом у мух лінії C-S на хромосоми мутантів cn та vg, а також реципрокні заміщення хромосом мутантів cn і vg на хромосоми мух C-S.

Відносну пристосованість (W) вихідних та синтезованих шляхом заміщення хромосом генотипів визначали за Ф. Айала і Дж. Кайгер, 1987. Пристосованість мух з найбільш ефективним розмноженням, тобто мух дикого типу лінії C-S, приймали за 1, а пристосованість усіх інших генотипів порівнювали з цим значенням.

Окрім відносної пристосованості (W), у досліджуваних генотипів враховували також і інші показники пристосованості, а саме: реальну плодючість, теплостійкість, тривалість життя за нормальних (стандартних) умов, здатність виживати в умовах голоду, а також електрофоретичну рухливість, активність та термостабільність їх АДГ.

Теплостійкість мух оцінювали по їх виживанню після одноразової дії на них жорсткої гіпертермії (41°С, 15 хв.). В цих дослідах використовували триденних дорослих мух (імаго) кожної лінії. Враховували кількість мух, що залишились живими через 24 години після впливу високої температури, і вираховували їх процент від загальної кількості мух, які знаходились у стані теплового шоку (Шахбазов, 1966).

Реальну генеративну здатність мух визначали як кількість нащадків (імаго) однієї пари батьківських форм, що утримувались у пробірці (20 мл) протягом 3 діб.

Для визначення тривалості життя досліджуваних мух утримували в пробірках за стандартних умов. Кожна пробірка містила по 10 особин чоловічої та жіночої статі. Підрахунки живих мух провадили щоденно, зміну корму здійснювали через кожні 3 доби, результати виражали кількістю діб, що супроводжувалась загибеллю 50% особин (Lt).

Для визначення виживання мух за умов голодування їх поміщали в пробірки без корму (по 10 особин кожної статі). Підрахунок загиблих мух протягом першої доби провадили через кожні 6 годин, а в подальшому - через кожні 3 години до повної загибелі їх у пробірці. Результати виражали відсотком мух, що виживали після 48 годин голодування.

Визначення електрофоретичних спектрів множинних молекулярних форм (ММФ) АДГ провадили за допомогою електрофорезу у поліакриламідному гелі. Електрофоретичному розподілу піддавали білки екстрактів тканин однієї мухи відповідної лінії. Електрофорез здійснювали стандартним методом (Ornstain, 1966) в апараті для вертикального гель-електрофорезу АВГЕ-1. Використовували 7,5% поліакриламідний гель, каталізатор – персульфат аммонію. Розподіл АДГ вели 2,5 години при температурі 10°С /напруга 250-500 V, сила струму - 30 мА на пластину товщиною 1 мм/. Для виявлення ізоформ АДГ провадили специфічне фарбування ізоформ (Chambers, 1984).

Для визначення активності та термостабільності АДГ використовували тридобових особин. Активність АДГ в екстрактах тканин визначали спектрофотометрично за допомогою СФ-26 (McKechni, Cellr, 1984).

Активність ферменту оцінювали по збільшенню вмісту НАDH у середовищі інкубації протягом 3 хв. Субстратом виступали етанол та ізопропанол. Активність АДГ виражали в нмолях HADH / хв*мг білка. Вміст білка визначали за методом Лоурі (1951).

Термостабільність АДГ визначали по її залишковій активності після прогріву екстрактів мух у водяному термостаті при 40°С протягом 5 хв. і виражали відношенням часток денатурованого й нативного ферменту в процентах (Chambers et al., 1984).

Математичну обробку отриманих результатів провадили загальновизнаними методами варіаційної статистики (Рокицкий, 1965, Сепетлієв, 1968).

У розділі 3 (“Експериментальна частина й методика досліджень”) у вигляді окремих підрозділів (3.1–3.6) викладено основні результати виконаної роботи та деякі методичні особливості її проведення.

Підрозділ 3.1 містить результати досліджень алозимного складу АДГ і показників пристосованості (відносної пристосованості, реальної плодючості, теплостійкості, виживання в умовах голоду, тривалості життя) вихідних інбредних лінійних мух (C-S, cn, vg).

Таблиця 1

Алельний склад локуса Adh і показники пристосованості

вихідних ліній Drosophila melanogaster

Вихідні лінії Алель- ний склад локуса Аdh Віднос-на присто-сова-ність Плодючість (кількість нащадків однієї батьківської пари) Теплостій- кість (% мух, що вижили після жорсткої гіпертермії) Стійкість до голодування (% особин, що вижили за 48-годин- ного голодування) Тривалість життя за стандартних умов утримання (Lt), днів

C-S S 1 126,704,60 88,502,71 20,502,66 21,100,78

Сn S 0.93 117,304,25 87,002,33 20,002,30 19,100,74

Vg F 0.65* 81,806,00* 49,003,32* 48,004,17* 9,150,74*

Примітка: * - достовірно в порівнянні з мухами C-S (p<0.05)

Ідентифікацію АДГ як F- або S-алозиму у зазначених лінійних мух провадили за трьома критеріями – електрофоретичною рухливістю, активністю й термостабільністю ферменту (Greel et al., 1965). Mухам ліній C-S і cn властивий S-алозим, а мутантам vg – F-алозим АДГ, що узгоджується з даними інших авторів (Heinsta, 1993). Досліджувані показники пристосованості у ліній C-S і cn, гомозиготних по гену AdhS, не відрізняються (табл. 1). Мухи vg (гомозиготи по гену AdhF) за стандартних умов утримання поступаються мухам C-S показниками плодючості (74.6% від рівня мух C-S), теплостійкості (56.4%) і тривалості життя (56.7%). Статистично достовірними є також відмінності показників пристосованості мух vg в порівнянні з мухами cn. Базуючись на цих даних, ми віднесли мух C-S і cn до добре пристосованих генотипів, а мух vg – до таких, що мають низьку пристосованість.

З'ясувалось, що мутація vg, яка негативно впливає на пристосованість мух за стандартних умов їх утримання, виявилась корисною за повного голодування. Як видно з табл. 1, мухи vg у відсутність корму виживають значно краще, ніж мухи ліній C-S та cn.

Підрозділ 3.2 містить інформацію про зміни відносної пристосованості (W) генотипів за реципрокного заміщення їх хромосом (табл. 2).

Таблиця 2

Відносна пристосованість (W) вихідних та експериментально отриманих лінії Drosophila melanogaster

Генотип Cередня кількість нащадків на одну особину першого покоління Відносна пристосованість (W)

C-S 63,35 1

cn 58,65 0,93

vg 40,90 0,65

cn(1C-S) 52,53 0,83

cn(2C-S) 55,20 0,87

cn(3C-S) 54,70 0,86

C-S(1cn) 59,35 0,93

C-S(2cn) 55,30 0,87

C-S(3cn) 57,00 0,90

C-S(1vg) 48,45 0,76

C-S(2vg) 43,10 0,68

C-S(3vg) 50,60 0,80

vg(1C-S) 40,45 0,63

vg(2C-S) 50,30 0,79

vg(3C-S) 43,05 0,68

Із представлених даних видно, що відносна пристосованість (W) – мух C-S i cn майже не відрізняється, в той час як мухи лінії vg мають значно гірший показник відносної пристосованості (W=0.65). Важливо зазначити, що введення в каріотип гомологічної хромосоми мух іншої лінії (навіть за умови, що ця хромосома не містить відомих мутацій) призводить, як правило, до зниження відносної пристосованості синтезованого генотипу (див. табл. 2).

Це зменшення є особливо виразним у випадку заміщення хромосоми 2, яка у мух cn i vg містить маркерну мутацію. Отже, є підстави вважати, що мутації vg i cn можуть виявляти певний плейотропний ефект в умовах незбалансованості генотипу, і що існуюче уявлення про нейтральність мутації cn у відношенні адаптивної здатності генотипів вимагає певних уточнень.

Найбільш виразними є зміни відносної пристосованості мух C-S за введення в їх каріотип хромосом мух vg. Максимальне зменшення пристосованості спостерігається у генотипу C-S(2vg), тобто за наявності у мух C-S хромосоми 2 лінії vg. Цей факт пояснюється тем, що саме в хромосомі 2 локалізується мутація vg з відомим плейотропним ефектом. Заслуговує уваги те, що пристосованість мух C-S істотно зменшується також за наявності в їх каріотипі хромосом 1 і 3 лінії vg, хоч ці хромосоми не містять відомих мутацій. Як видно з таблиці 2, форми C-S(1vg) i C-S(3vg) мають вищу пристосованість, ніж мухи vg та C-S(2vg), але поступаються вихідним мухам C-S.

Заміщення хромосом 1 і 3 мух vg на гомологічні хромосоми мух дикого типу лінії C-S не призводить до підвищення відносної пристосованості відповідних форм vg(1C-S) i vg(3C-S) у порівнянні з вихідними лінійними мухами vg. В протилежність цьому, заміщення хромосоми 2 у мух vg з отриманням форми vg(2C-S) супроводжується достовірним підвищенням пристосованості особин у порівнянні з вихідними мутантними мухами. Цей результат – непрямий доказ того, що, можливо, основною причиною низької пристосованості мух vg є відповідна маркерна мутація. Разом з тим слід зазначити, що, незважаючи на відсутність цієї мутації у форми vg(2C-S), відносна пристосованість останньої значно менша (W=0.79), ніж мух лінії дикого типу C-S (W=1). Цей факт можна пояснити тим, що в хромосомах 1 і 3 лінії vg, можливо, мiстяться гени, які, подібно маркерній мутації хромосоми 2, негативно впливають на пристосованість особин. З другого боку, дещо менша в порівнянні з мухами C-S пристосованість форм vg(2C-S), cn(1C-S), C-S(3cn), cn(3C-S) та інших може пояснюватись слабкою коадаптованістю генів хромосом різного походження і незбалансованістю геномів.

У підрозділах 3.3 – 3.5 викладено результати досліджень по з'ясуванню впливу реципрокних заміщень окремих пар хромосом (1, 2 і 3) на інші показники пристосованості досліджуваних генотипів (плодючість, теплостійкість, виживання в умовах голоду, тривалість життя).

Цифрові дані, що аналізуються в цих трьох підрозділах дисертації, наведено у табл. 3.

Зміни відносної пристосованості (W), спровоковані внесенням чужинних хромосом у каріотипи досліджуваних мух, супроводжувались достовірними зрушеннями показників реальної плодючості, теплостійкості особин та тривалості їх життя. Інші показники (виживання за відсутності корму, активність та теплостійкість АДГ) змінювались лише в деяких варіантах досліду.

Найбільш істотне зменшення показників пристосованості у мух C-S спостерігалось за упровадження в їх карiотип хромосоми 2 мух vg, яка є носієм маркерної мутації. Дещо менший, але в більшості випадків статистично достовірний ефект викликало також заміщення хромосом 1 і 3.

Таблиця 3

Показники пристосованості вихідних і експериментально отриманих генотипів Drosophila melanogaster, n=20

Вихідні та експери-ментально отримані лінії Реальна плодючість (кількість нащадків однієї батьківської пари) Теплостійкість (% мух, що вижили після жорсткої гіпертермії) Стійкість до голодування (% особин, що вижили за 48-годин- ного голодування) Тривалість життя за стандартних умов утримання (Lt)

C-S 126,704,60 88,502,71 20,502,66 21,100,78

сn 117,304,25 87,002,33 20,002,30 19,100,74

vg 81,806,00* 49,003,32* 48,004,17* 9,150,74*

сn(1C-S) 105,062,62*^ 76,491,27*^ 21,830,35 20,003,14

vg(1C-S) 80,883,65* 42,011,68* 8,942,36* 17,002,75*^

C-S(1cn) 118,704,05 78,503,63*^ 19,701,04 19,002,87

C-S(1vg) 96,905,28*^ 76,502,39*^ 18,900,93^ 19,003,94^

сn(2C-S) 110,404,48* 78,502,00*^ 20,003,36 18,500,87

vg(2C-S) 100,603,00*^ 66,003,70*^ 30,002,80*^ 14,200,71*^

C-S(2cn) 110,604,54* 78,002,01*^ 20,003,46 18,500,83

C-S(2vg) 86,204,60* 56,003,78* 38,002,34*^ 12,300,82*^

сn(3C-S) 109,404,21* 82,001,82 19,002,70 19,750,91

vg(3C-S) 86,107,26* 58,003,03*^ 45,003,12* 12,200,76*^

C-S(3cn) 114,004,06* 82,002,91 21,004,03^ 19,500,84

C-S(3vg) 101,204,07*^ 71,502,86*^ 25,002,06^ 17,801,03*^

Примітки: 1. * -достовірно в порівнянні з мухами C-S (p<0.05)

2. ^ -достовірно в порівнянні з відповідною мутантною лінією (p<0.05)

Цілком ймовірно, що зменшення пристосованості генотипів після заміщення їх хромосом обумовлюється недостатньою коадаптацією алельних генів хромосом донора і реципієнта, що призводить до порушення генного балансу. Важлива роль останнього в адаптаційній здатності генотипів підкреслювалась неодноразово , але експериментально ця теза обгрунтована недостатньо. З урахуванням цієї обставини здійнювали реципрокний обмін хромосомами між дуже схожими за адаптивною здатністю лініями – C-S i cn. Як видно з табл. 3, реципрокні заміщення хромосом у мух C-S i cn у більшості випадків мало впливають на основні показники пристосованості синтезованих генотипів; більш виразний ефект був за заміщення хромосоми 2. Цілком можливо, що локалізована в цій хромосомі мутація cn, адаптивно нейтральна для мух вихідної лінії, виявляє плейотропний вплив у випадку генотипів з заміщеними хромосомами .

Слід, однак, зазначити, що заміщення хромосом 1 і 3 у мух C-S на гомологічні хромосоми так само добре пристосованих мух лінії cn дещо зменшує відносну пристосованість генотипів і призводить до певних змін інших показників пристосованості. Так, заміщення хромосоми 1 у мух C-S достовірно зменшує їх теплостійкість на 11%, а заміщення хромосоми 3 знижує рівень реальної плодючості мух на 10%.

Ще більш переконливими є результати заміщення хромосом мух cn на відповідні хромосоми мух C-S. Із табл. 3 видно, що за упровадження в каріотип мух cn хромосом лінії дикого типу C-S спостерігається зменшення відносної пристосованості, реальної плодючості та теплостійкості мух. Вражає і те, що заміщення хромосом у мутантних мух vg на хромосоми мух дикого типу не призводить до підвищення показників пристосованості синтезованих генотипів до рівня мух C-S. Наведені дані переконують у тому, що поєднання в каріотипі хромосом різного походження само по собі може спричиняти значні і, як правило, негативні зміни пристосованості. Винятком із цього правила є лише ті випадки, коли заміщення хромосом супроводжується вилученням із генотипу шкідливих мутацій з вираженою плейотропною дією. Так, заміщення хромосоми 2 у мух vg на гомологічну хромосому мух C-S (при цьому вилучається маркерна мутація vg) призводить до значного поліпшення пристосованості піддослідних мух за даними більшості показників (табл. 3). Однак і в цьому випадку рівень пристосованості, властивий мухам C-S, не досягається.

Таким чином, при внесеннi в генотип чужинного генетичного матеріалу слід очікувати, як правило, зменшення пристосованості синтезованих генотипів, що може пояснюватись як порушенням взаємодії генів, так, можливо, і несумісністю внесених генів з цитоплазмою донора. Ці особливості штучно створених генотипів слід враховувати в селекції та в генетичній інженерії.

Підрозділ 3.6 дисертації містить інформацію про функціональний стан ген-ензимної системи АДГ при заміщеннi хромосом у дрозофіли.

Відомо, що адаптація популяцій до тих чи інших чинників зовнішнього середовища супроводжується змінами алельного складу локуса Adh і алозимної належності відповідного ферменту. Адаптивне значення ген-ензимної системи АДГ за онтогенетичної та філогенетичної адаптації значно зростає у зв'язку з наявністю генів – модифікаторів АДГ (Белоконь і співавтори, 1986).

Слід зазначити, що заміна хромосоми 2 у мух лінії C-S на аналогічну хромосому мух cn чи навпаки не призводить до зміни алозимної форми АДГ у піддослідних мух, у той час як реципрокні заміщення хромосом у мух C-S i vg супроводжуються цими змінами. Інші хромосомні заміщення (групи зчеплення 1 і 3) не впливають на алозимну належність АДГ, але можуть вносити в генотип мухи – реципієнта не властиві йому алельні гени, зчеплені з чужинною хромосомою. Під впливом цих генів властивості АДГ можуть модифікуватись. Така модифікація особливо ймовірна, якщо муха – реципієнт отримує “чужу” хромосому 2 з невластивим реципієнту алельним складом локуса Adh. Виходячи з цих міркувань, мух із заміщеними хромосомами ми використовували як модельний об'кт для з'ясування можливості виникнення модифікаційних змін алозимів АДГ за структурних перебудов генотипів.

Як видно із табл. 4, заміщення хромосоми 2 у лінії C-S на відповідну хромосому мух cn [генотип C-S(2cn)] i реципрокне заміщення з отриманням форми cn(2C-S) не впливає на досліджувані фізико-хімічні властивості ферменту. Можна припустити, що мухи C-S i cn мають дуже подiбну генетичну програму біохімічної модифікації АДГ. Реципрокні заміщення хромосом у цьому випадку практично не змінюють цієї програми, і властивості АДГ за таких заміщень не змінюються.

Tаблиця 4

Активність, теплостійкість і електрофоретична рухливість

АДГ у вихідних і експериментально отриманих генотипів дрозофіли

Вихідні лінії та синтезовані форми Алозимна форма АДГ Активність АДГ Теплостійкість АДГ

C-S S 88,514,24 74,941,78

cn S 92,014,44 71,342,57

vg F 130,057,79* 20,013,09*

C-S(1cn) S 94,704,13 76,151,80

C-S(2cn) S 90,544,64 75,183,32

C-S(3cn) S 89,603,78 75,052,36

cn(1C-S) S 92,355,12 74,433,12

cn(2C-S) S 94,354,11 75,432,21

cn(3C-S) S 91,164,58 71,702,34

vg(1C-S) F 120,076,56* 25,014,01*

vg(2C-S) S 112,223,43*^ 37,071,57*^

vg(3C-S) F 105,812,33*^ 38,623,68*^

C-S(1vg) S 91,844,41^ 73,183,43

C-S(2vg) F 100,044,20*^ 36,842,85*^

C-S(3vg) S 97,343,56^ 61,243,04*^

Примітки: 1. * Відмінності у порівнянні з лінією C-S вірогідні(p<0,05)

2. ^ Відмінності у порівнянні з мутантною лінією вірогідні (p<0,05)

Інші результати отримано за реципрокного заміщення хромосом у особин ліній C-S i vg, які відрізняютьсяі між собою алельним контролем АДГ. Реципрокні обміни хромосомою 2 у мух C-S i vg призводять до змін електрофоретичної рухливості, активності та термостабільності АДГ. Дані табл. 4 свідчать про те, що генотип C-S модифікує властивості чужинного F-алозиму по типу S-алозиму, тобто зменшує його активність і підвищує теплостійкість. На відміну від цього, генотип мух vg сприяє підвищенню активності і зменшенню теплостійкості продукту чужого алельного гена AdhS.

На підставі цих даних можна припустити, що генотипи D. melanogaster мiстять гени, які обумовлюють модифікацію АДГ і зміну властивостей цього ферменту залежно від конкретних умов.

Розділ 4 – “Аналіз і узагальнення результатів досліджень” – є інтегральним щодо огляду літератури і основної частини дисертації. В ньому наголошується на науковій доцільності досліджень по реципрокному обміну хромосом між мухами з високою і низькою пристосованістю в світлі сучасних теорій адаптації і адаптивного гетерозису, а саме компенсаційних комплексів генів (Струнніков, 1986), адаптаційних комплексів генів (Тоцький, 1990, 2000), генетично-біофізичних уявлень про гетерозис (Шахбазов и др., 1990) і т. і.

Детально обговорюється питання про взаємовідносини і взаємозалежність інтегрального показника адаптивної здатності – відносної пристосованості (W) генотипів і iнших досліджуваних показникiв – реальної плодючості мух, їх стійкості до високої температури та повного голодування, тривалості життя тощо. Для цього за допомогою комп'ютерної програми розраховували коефіцієнти кореляції (r) між досліджуваними показниками пристосованості у вихідних і отриманих експериментально генотипiв D. melanogaster.

Спершу визначали значення r для об'єднаної вибірки мух усіх варіантів дослідів (табл. 5). В подальшому ці розрахунки здійснювали окремо для кожної вихідної лінії і кожного генотипу з заміщеними хромосомами (додаток А). Ступінь корелятивних зв'язків між окремими показниками пристосованості визначали згідно з рекомендаціями Д. Сепетлієва (1968).

Як видно з даних табл. 5 отриманих на великій (об'єднаній) вибірці, у D. melanogaster існує сильно виражений позитивний кореляційний зв'язок між показником відносної пристосованості (W), з одного боку, i тривалістю життя, реальною плодючостю і теплостійкістю особин, з другого. Помірна позитивна залежність існує між теплостійкістю особин і теплостійкістю АДГ (r=0.47), теплостійкістю АДГ і відносною пристосованістю (r=0.44). Негативна кореляція спостерігається між активністю і теплостійкістю АДГ, між відносною пристосованістю і виживанням в умовах голоду. Таким чином, зазначені показники можуть слугувати критеріями адаптивної здатності генотипів. Особливо показовими в цьому відношенні виявились реальна плодючість та теплостійкість особин, що добре узгоджується з думкою інших авторів (Айала, Кайгер, 1987; Шахбазов, 1966).

Таблиця 5

Коефіцієнти кореляції показників пристосованості у вихідних ліній та експериментально отриманих форм D. melanogaster

Показники Теплостійкість особин Виживання в умовах голоду Тривалість життя Активність ADH Теплостійкість ADH Відносна пристосованість

Реальна плодючість 0,92 -0,7 0,56 -0,71 0,56 1

Теплостійкість особин -0,85 0,81 -0,64 0,47 0,96

Виживання в умовах голоду -0,81 0,38 -0,37 -0,79

Тривалість життя -0,28 0,24 0,77

Активність ADH -0,57 -0,66

Теплостійкість ADH 0,44

Показник активності АДГ у наших дослідах теж досить добре корелював з відносною пристосованістю особин, їх реальною плодючістю та теплостійкістю, проте ця залежність була негативною (r= -0.6–0.7). Дійсно, мухи з менш активним S-алозимом АДГ мали кращі показники пристосованості за стандартних умов утримання. Отже, алозимна належність АДГ у дрозофіли разом з іншими показниками може слугувати критерієм оцінки і прогнозу адаптивної здатності генотипів.

Значна негативна кореляція спостерігалась між показником “виживання в умовах голоду” та іншими показниками (відносною пристосованістю, реальною плодючістю, теплостійкостю особин та ін.). Це повністю узгоджується з тим, що мухи vg, гірше пристосовані до стандартних умов, ніж мухи C-S, краще виживають за повного голодування.

Зазначені закономірності щодо кореляційних зв'язків між окремими показниками пристосованості зберігаються також для окремих генотипів – вихiдних iнбредних то експериментально отриманих лiнiй iз замiщеними хромосомами. Однак за заміщення хромосом дещо змінюється в окремих випадках вираженість взаємозв'язків між окремими складовими пристосованості, що може свідчити про певний дизбаланс у функціонуванні штучно створених генотипів.

Значна увага за аналізу результатів досліджень надається проблемі генетичних засад тривалості життя. Слід зазначити, що питання про вплив штучних перебудов генотипів на тривалість їх існування досі не з'ясоване.

Результати проведених нами дослідів свідчать про те, що тривалість життя досліджуваних генотипів добре корелює з їх відносною пристосованістю реальною плодючістю і теплостійкістю (див. табл. 5). Реципрокні заміщення хромосом в окремих варіантах досліду призводили до змін тривалості життя генотипів. Більш виразними були зміни тривалості життя дрозофіл за реципрокних заміщень хромосом другої пари (див. табл. 3). При цьому обміни хромосом між мухами C-S i cn не викликали істотних змін, а реципрокні заміщення другої хромосоми між мухами C-S i vg істотно впливали на тривалість життя генотипів vg(2C-S) i C-S(2vg). У останніх тривалість життя була більшою, ніж у мух vg, але значно меншою, ніж у мух C-S. Цей результат вказує на те, що строки життя мух vg залежать не тільки від плейотропної дії маркерного мутантного гена, але й від інших алельних генів хромосоми 2. До тривалості життя дрозофіли також має певне відношення алельний склад хромосоми 3. Мухи vg(3C-S) i C-S(3vg) живуть довше мух vg, але значно поступаються за цим показником мухам C-S. Таким чином, є підстави вважати, що тривалість життя дрозофіли визначається збалансованою взаємодією генів усіх хромосом, проте найважливіше значення мають хромосоми 2 і 3.

В даній роботі вперше отримано дані, що свідчать про можливість модифікації АДГ за заміщення хромосом і упровадження в генотип невластивого йому алеля Adh. Результати дослідів свідчать про те, що основну роль у модифікації властивостей АДГ грають гени хромосоми 2. Цей висновок добре узгоджується з даними літератури (Боднар, 1992). Заміщення хромосом 1 і 3 в умовах наших дослідів не призводило до істотних змін активності і теплостійкості АДГ.

Можна припустити, що тип модифікації продукту чужинного гена Adh визначається не тільки генами-модифікаторами реципієнтного геному, але й властивостями цитоплазми, в яку попадає чужинний ген.

Таким чином, модифікація продуктів структурних генів (наприклад Adh) залежно від особливостей генотипу і зовнішніх умов, може розглядатись як один із можливих механізмів сприятливого впливу постульованих в літературі компенсаційних (Струнніков, 1985) і адаптаційних (Тоцький, 1992) комплексів генів на пристосованість генотипів.

Дане дослідження є першою спробою на прикладі ген-ензимної системи АДГ з'ясувати особливості взаємодії у дрозофіли структурних генів хромосом різного походження і залежність адаптивних можливостей генотипів від подібних взаємодій. У зв'язку з широким застосуванням трансгенних рослин та інших штучно стрворених генотипів у народному господарстві подібні дослідження мають не тільки теоретичне, але й практичне значення.

Висновки

1. З'ясування адаптивноi здатностi штучно створених генотипiв набуває високоi актуальностi у зв'язку з бурхливим розвитком генетичноi iнженерii та iнших сучасних напрямкiв генетики та селекцii. Є пiдстави вважати, що штучнi втручання в структуру генотипiв, включаючи замiщення хромосом, можуть призводити до iстотних змiн генного балансу, а, отже, i пристосованостi створених генотипiв, однак переконливого експериментального пiдгрунтя ця точка зору ще не знайшла.

2. Отриманi шляхом тривалого iнбридингу вихiднi лiнii мух C-S, cn i vg iстотно вiдрiзняються показниками пристосованостi, а також алельним контролем алкогольдегiдрогенази. Мухам лiнiй C-S i cn властива висока пристосованiсть i наявнiсть у тканинах S-алозиму АДГ, а мухи лiнii vg за стандартних умов утримання виявляють низьку пристосованiсть i утримують F-алозим зазначеного ферменту.

3. Реципрокні заміщення хромосом 1, 2 і 3 у мух піддослідних ліній призводять до істотних змін відносної пристосованості та інших показників адаптивної здатності генотипів (реальної плодючостi, виживання в умовах гiпертермii та голоду, тривалостi життя за стандартних умов утримання тощо).

4. Найбільш істотні зміни показників пристосованості у мух C-S спостерігаються при упровадженнi в їх каріотип хромосом мух vg, особливо хромосоми 2, що несе маркерну мутацію. Наявність цієї хромосоми в каріотипі мух C-S значно зменшує їх відносну пристосованість, реальну плодючість, теплостійкість та тривалість життя за стандартних умов існування. У протилежність цьому, в умовах голоду мухи C-S(2vg) виживають краще, ніж мухи C-S.

5. Заміщення хромосом у мутантних мух vg на хромосоми мух C-S, навiть за умови вилучення iз генотипу vg маркерноi мутацii не призводять до зростання пристосованостi генотипiв до рiвня, властивого мухам C-S, а реципрокнi обмiни хромосом у однаково добре пристосованих мух C-S i cn призводять до зменшення пристосованостi генотипiв

6. Упровадження в каріотип чужинної хромосоми може супроводжуватись модифiкацiєю властивостей продуктiв зчеплених з нею генiв. Так, реципрокні обміни хромосомою 2 між мухами C-S і vg призводять до змін теплостійкості й активності алозимів АДГ у тканинах синтезованих мух. При цьому властивості F-алозиму у мух C-S (2vg) модифікуються за типом S-алозиму, а властивостi S-алозиму АДГ у клітинах мух vg(2C-S) – за типом F-алозиму.

7. Поява чужинних хромосом у каріотипі може призводити до зменшення адаптивної здатності організмів не тільки через внесення в генотип у складі цих хромосом мутантних алельних генів, але й у зв`язку з порушенням генного балансу при заміщеннi хромосом. Цю особливість штучно створених генотипів слід враховувати в генетиці та селекції.

8. На пiдставi вивчення корелятивних зв'язкiв мiж окремими показниками пристосованостi у генотипiв з замiщеними хромосомами деякi з цих показникiв (плодючiсть, теплостiйкiсть особин, алозимна належнiсть АДГ) можна рекомендувати як надiйнi критерii оцiнки i прогнозу адаптивноi здатностi штучно створених генотипiв дрозофiли.

Список праць, що вІдображають основнІ положеннЯ дисертацІЇ

1. Тоцкий В.Н., Хаустова Н.Д., Левчук Л.В., Моргун С.В. Генотипические основы низкой жизнеспособности мутантов vestigial Drosophila melanogaster //Генетика, ѕ 1998. ѕ Т. 34 ѕ № 9. ѕ С. 1233-1238.

2. Левчук Л.В. Заміщення хромосом та деякі показники життєздатності у Drosophila melanogaster //Вісник Одеського державного університету. ѕ 1998. ѕ № 2. ѕ С. 106-110.

3. Левчук Л.В., Тоцький В.М., Заміщення хромосом і пристосованість генотипів Drosophila melanogaster //Цитология и генетика. ѕ1998. ѕ Т. 32. ѕ № 2. ѕ С. 42-48.

4. Тоцкий В.Н., Хаустова Н.Д., Моргун С.В., Левчук Л. В. Ген-энзимная система алкогольдегидрогеназы при изменениях генотипа у Drosophila melanogaster // Украинский биохимический журнал. ѕ 1998. ѕ Т. 70. ѕ № 5. ѕ С. 42-51.

5. Левчук Л. В., Моргун С. В. Пристосованість Drosophila melanogaster за штучних змін генотипів // Вісник Одеського державного університету. ѕ 1999. ѕ Т.4. ѕ вип. 3. Біологія ѕ С. 36-40.

6. Тоцький В. М., Хаустова Н. Д., Левчук Л. В., Моргун С. В. Множинні молекулярні форми естерази - 6 і алкогольдегідрогенази у дрозофіли за старіння // ІІ Національний конгрес геронтологів і геріатрів України: 4-6 жовтня 1994 р. м. Київ. 1994 р. ѕ С. 619.

7. Левчук Л. В. Заміна хроомосоми 1 і тривалість життя у Drosophila melanogaster // Біологічні механізми старіння. Міжнародний симпозіум. 15-17 травня 1996 р. м. Харків. 1996 р. ѕ С. 89.

8. Тоцький В. М., Хаустова Н. Д., Левчук Л. В. Локус Adh за селекції дрозофіли на затримку старіння // Біологічні механізми старіння. Міжнародний симпозіум. 15-17 травня 1996 р. м. Харків. 1996 р. ѕ

С. 13.

9. Хаустова Н. Д., Тоцький В. Н., Моргун С. В., Левчук Л. В. Влияние мутации vg на продолжительность жизни Drosophila melangaster. Биологические механизмы старения. IІІ международный симпозиум. Тезисы. 19-21 мая 1998 г. Харьков. 1998 р. ѕ С. 75.

10. Левчук Л. В. Заміщення хромосом та тривалість життя Drosophila melanogaster. III международный симпозиум. Тезисы. 19-21 мая 1998 г. Харьков. 1998 р. ѕ С. 77.

11. Левчук Л. В. Тривалість життя як показник пристосованості генотипів Drosophila melanogaster за заміщення хромосом //