НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

ДЕРЕВ'ЯНКО СТАНIСЛАВ ВАСИЛЬОВИЧ

УДК: 576.8.077:576.835.11/636.4

АНТИГЕННI ВЛАСТИВОСТI ЕНТЕРОВIРУСIВ СВИНЕЙ

03.00.06 - вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії вірусології тварин Інституту сільськогосподарської мiкробiологiї Української академiї аграрних наук

Науковий керівник: доктор ветеринарних наук, академік УААН Романенко Володимир Пилипович, Інститут ветеринарної медицини УААН, завідувач лабораторії генетики та імунології

Офiцiйнi опоненти: доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України Дяченко Наталія Сергіївна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу молекулярної біології вірусів

доктор медичних наук, старший науковий співробітник Задорожна Вікторія Іванівна, Інститут епідеміології та інфекційних захворювань ім. Л.В. Громашевського АМН України, завідувач лабораторії поліомієліту та інших ентеровірусних інфекцій

Провідна установа: Національний аграрний університет Кабінету Міністрів України, м. Київ

Захист відбудеться “ 23 ” травня 2001 р. о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 в Інституті мiкробiологiї i вірусології iм. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143 м. Київ, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бiблiотецi Інституту мiкробiологiї i вірусології iм. Д.К. Заболотного НАН України: 03143 м. Київ, вул. Заболотного, 154.

Автореферат розісланий 20 квітня 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Л.М. Пурiш

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ентеровіруси свиней відносяться до родини Picornaviridae роду Enterovirus. Підвищена увага до вивчення ентеровірусів обумовлена їх особливим екологічним, соціальним та економічним значенням.

Широке розповсюдження у тваринницьких господарствах України мають ентеровіруси свиней, які є етіологічними агентами пневмоній, гастроентеритів і пневмоентеритів, а також інших інфекційних захворювань. Нерідко у їх виникненні значну роль відіграють й інші інфекційні агенти (віруси і бактерії). У більшості випадків за одними клініко-епізоотологічними та патолого-анатомічними характеристиками ентеровірусний пневмоентерит визначити не можливо. Вирішальне значення для постановки діагнозу мають лабораторні дослідження. До методів діагностики належать виділення вірусу та його ідентифікація в реакції нейтралізації, а також ретроспективний аналіз сироваток крові. Ускладнюючим фактором їх застосування є існування значної кількості серотипів ентеровірусів свиней (ЕВС), кожен із яких необхідно ідентифікувати окремо. Виділення і вивчення ентеровірусів свиней, які нейтралізуються сироватками крові до референтних штамів ЕВС декількох різних серологічних груп, відкриває перспективи розв'язання цієї проблеми. Використання ЕВС з міжтиповими антигенними властивостями для створення діагностичних наборів дозволить скоротити кількість діагностичних штамів вірусів та спростити постановку діагнозу.

Єдиної думки щодо причини міжтипових антигенних зв'язків ЕВС не існує. Відповідно, є об'єктивна потреба у виділенні ЕВС, вивченні їх антигенних властивостей та з'ясуванні причин міжтипових серологічних реакцій. Теоретико-методологічна та практична значимість цього питання визначає актуальність теми дослідження, його мету та завдання дисертаційної роботи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослiдження, поданi в дисертацiйнiй роботi, виконувались як складова частина тематичних планiв по завданнях 0198U004590 "Розробити засоби дiагностики та системи профiлактики ентеровiрусних iнфекцiй свиней" i 0198U004591 "Провести таксономiю ентеровiрусiв свиней, вивчити закономiрностi утворення рекомбiнантних штамiв ентеровiрусiв" НТП УААН N23 "Ветеринарне забезпечення", а також завдання "Створити рекомбiнантнi штами ентеровiрусiв i на їх основi розробити набори дiагностикумiв i вiрусвакцини проти ентеровiрусних хвороб свиней" НТП Державного комiтету з питань науки, технiки i промислової полiтики "Захист сiльськогосподарських тварин вiд захворювань та новi лiкувально-профiлактичнi препарати для ветеринарiї" (договiр N2/738-97 вiд 12.08.1997 р.).

Мета i завдання дослiджень. Метою дослідження є визначення міжтипових антигенних зв'язків ЕВС та розробка компактного набору діагностикумів ентеровірусних пневмоентеритів свиней.

Для досягнення цієї мети в дисертаційній роботі поставлено для вирішення такі завдання:

·

· вивчити їх біологічні, фізико-хімічні та антигенні властивості;

· дослідити вплив білкових компонентів клітин хазяїна на антигенні властивості ЕВС;

· провести міжтипові схрещування ЕВС і вивчити біологічні та антигенні властивості одержаних рекомбінантів;

· розробити компактний набір діагностикумів ентеровірусних пневмоентеритів свиней на основі штамів ЕВС з міжтиповими антигенними властивостями.

Об'єктом дослідження є ентеровіруси свиней.

Предметом дослідження є антигенні властивості ентеровірусів свиней.

Наукова новизна одержаних результатів. До основних результатів дисертаційного дослідження, що визначають його наукову новизну, належать:

виявлено 4 штами ЕВС, антигенно відмінних від вірусів відомих серотипів, та 28 штамів ентеровірусів свиней з міжтиповими антигенними властивостями;

встановлено, що міжтипові антигенні властивості обумовлені спільними вірусними антигенними детермінантами і не залежать від біологічних систем їх репродукції та методів очищення вірусів;

вперше визначено, що штами з міжтиповими антигенними властивостями не аглютинують досліджені еритроцити (людини чотирьох груп крові, свині, барана, кроля, морської свинки, миші та курки), хоч мають антигенні зв'язки з референтними штамами ЕВС, в яких цю властивість виявлено;

вперше одержано рекомбінантні штами ентеровірусів свиней з міжтиповими антигенними властивостями в результаті культивування in vitro суміші штамів ЕВС різних серотипів.

Практичне значення одержаних результатiв. Практична цінність роботи полягає в тому, що вивчення штамiв ЕВС з міжтиповими антигенними властивостями дозволило забезпечити наукове обгрунтування створення компактних наборiв дiагностикумiв хвороб свиней ентеровiрусної етiологiї. На основі штамів ЕВС з міжтиповими антигенними властивостями створено “Набір діагностикумів ентеровірусних пневмоентеритів свиней”, який має ряд переваг над існуючими аналогами. На набір розроблено науково-технічну документацію, до якої належать Технічні умови, Інструкція по виготовленню і контролю якості набору та Тимчасова настанова по його застосуванню. Набір пройшов комісійну перевірку та перебуває на стадії виробничих випробувань, що здійснюються на базі Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України (м. Київ).

Особистий внесок здобувача. Основні експериментальні дані здобувач одержав особисто. Робота виконана в лабораторiї вiрусологiї тварин Iнституту сiльськогосподарської мiкробiологiї УААН пiд керiвництвом доктора ветеринарних наук, академiка УААН В.П.Романенка. Здобувачем проведено виділення вірусів з патологічного матеріалу, вивчення їх біологічних, фізико-хімічних та антигенних властивостей, концентрування та очищення вірусів, поставлено експерименти на тваринах. Літературний пошук, аналiз i узагальнення одержаних результатiв, а також статистична обробка цифрового матеріалу виконані самостійно.

Апробацiя результатiв дисертацiї. Основнi матерiали дисертацiйної роботи доповiдалися на засiданнях Вченої ради Iнституту сiльськогосподарської мiкробiологiї УААН (1996-2000 рр.) та Iнституту експериментальної i клiнiчної ветеринарної медицини УААН (1996-1998 рр.); Мiжнароднiй науково-практичнiй конференцiї молодих вчених "Науковi досягнення в галузi ветеринарної медицини" (м. Харкiв, 1-2 квітня 1997 р.); Мiжнароднiй науково-практичнiй конференцiї "Розвиток ветеринарної науки в Українi: здобутки та проблеми" (м. Харкiв, 24-26 вересня 1997 р.); Мiжнароднiй науково-практичнiй конференцiї "Сучаснi проблеми ветеринарної медицини зооiнженерiї та технологiї продуктiв тваринництва" (м. Львiв, 9-11 жовтня 1997 р.); Мiжнароднiй науковiй конференцiї "Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных" (м. Владимир, 27-31 жовтня 1997 р.); II Мiжнароднiй конференцiї "Бiоресурси i вiруси" (м.Київ, 7-10 вересня 1998 р.); Науково-практичнiй конференцiї молодих вчених аграрiїв Чернiгiвщини "Наукове обгрунтування сталого розвитку агроекологiчних систем Чернiгiвщини в ринкових умовах i обмеженого ресурсного забезпечення (м. Чернiгiв, 5-6 квітня 1999 р.); Науково-практичнiй конференцiї молодих вчених та спецiалiстiв "Стан та перспективи розвитку ветеринарної науки" (м.Харкiв, 5-6 жовтня 1999 р.); Установчiй конференцiї паразитоценологiв СНГ (м. Вiтєбськ, 23-24 вересня 1999 р.); Мiжнароднiй науково-практичнiй конференцiї "Актуальные вопросы диагностики и профилактики наиболее распространенных болезней животных" (м. Ставрополь, 12-13 жовтня 1999р.); II науково-практичному семiнарi молодих вчених i спецiалiстiв "Вчимося господарювати" (смт.Чабани, 22-23 листопада 1999 р.); Мiжнароднiй науковiй конференцiї, присвяченiй 100-рiччю вiд дня народження С.З.Гжицького, (м. Львiв, 5-7 травня 2000 р.), II (IХ) Установчому з'їздi Українського мiкробiологiчного товариства (м. Чернiгiв, 11-13 вересня 2000 р.).

Публiкацiї. За матерiалами дослiджень опублiковано 16 наукових праць, з них 7 статей у фахових журналах та 9 - у інших виданнях.

Структура і обсяг дисертаційної роботи. Дисертаційна робота складається з вступу, чотирьох розділів, висновків, списку використаних джерел та додатків. Текст роботи викладений на 155 сторінках (з них 9 сторінок займають рисунки та таблиці). Робота містить 28 таблиць, 9 рисунків та 8 додатків. Список використаної літератури нараховує 219 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

РОЗДІЛ 1. Огляд літератури

Розділ 1 складається з шести підрозділів. У ньому надано огляд історичного розвитку та сучасного стану проблем, пов'язаних з антигенними властивостями ентеровірусів свиней. Висвітлено морфологічні, фізико-хімічні, біологічні та антигенні властивості ЕВС, проблеми серологічної класифікації ентеровірусів свиней. Наведено стислий аналіз етіологічної ролі різних серотипів ЕВС в захворюванні свиней та методів лабораторної діагностики цих хвороб. На підставі аналізу літературних джерел обгрунтовано актуальність теми, мету та завдання досліджень.

РОЗДІЛ 2. Об'єкти та методи досліджень

Штами вірусів, культури клітин та дослідні тварини. Для проведення дослідів використовували референтні штами ентеровiрусiв свиней 21-го серотипу, із яких 7 штамів (Konratice, F59, F34, F78, F12, F7 i V13, відповідно 1 - 6 та 8 серотипiв) класифіковані Dunne H.W. з спiвавт. (1971), одержані в 1970 р. Романенком В.П. від Derbyshire J.B. (Велика Британія); 14 штамів (М2323, К9, К22, Л90, М116, Ч73, Г95, Б111, Ч184, Д227, И249, П142, В151, И393, відповідно 10 - 23 серотипiв) виділені та класифіковані Романенком В.П. з спiвавт. (1993), які захищені авторськими свідоцтвами і зберігаються в Інституті сільськогосподарської мiкробiологiї УААН. Там же зберігаються гіперімунні сироватки крові до них. Крім цього використовували 7 штамів ентеровiрусiв свиней, які мають міжтипові антигенні властивості (К422, Р501, Ч756, Г681, Г705, И57, И59). В експериментах використані перещеплювані лінії культур клітин нирки ембріону свині (СНЕВ), нирки зеленої мавпи (Vero i Mark-145), а також 40 голів свиней, 48 кролів, 38 морських свинок i 42 бiлi мишi.

Методи досліджень. Виділення ізолятів вірусів здійснювали із застосуванням методу послідовних пасажів в культурі клітин СНЕВ. Одержання чистих популяцій проводили триразовим клонуванням методом крайніх розведень з послідуючим триразовим клонуванням методом бляшок.

Інфекційну активність вірусів встановлювали в культурі клітин СНЕВ методом титрування і виражали в тканьових цитопатогених дозах (ТЦД50/мл), обраховували за класичним методом Рiда i Менча, статистичну обробку здійснювали за методом Ашмарiна Н.П. (1965).

Бiологiчнi та фiзико-хiмiчнi властивості ізолятів вірусів (чутливість до iнгiбiторiв нуклеїнового обміну (актиноміцину Д та 5-бром-2-дезоксіуридину), лiпiдорозчинникiв (ефіру та хлороформу), протеолітичних ферментів (трипсину), стійкість до прогрівання при температурі 50° С протягом 1 години в присутності 1 М розчину MgCl2 та без нього, відношення до середовищ з різним значенням рН (2-11) – досліджували із застосуванням загальновизнаних методик.

Гемаглютинуючi властивості ЕВС вивчали методом прямої аглютинації еритроцитів людини чотирьох груп (0(I), A(II), B(III), AB(IV), еритроцитів барана, курей, морських свинок, мишей, свиней i кролів при різних значеннях рН від 5,3 до 7,5 i температурі 4, 18, 37° С.

Гiперiмуннi сироватки крові до ентеровiрусiв свиней одержували на кролях, морських свинках та білих мишах з застосуванням різних схем iмунiзацiї. Титр сироваток визначали в реакції нейтралізації вірусу в культурі клітин.

Типування виділених ізолятів проводили в реакції вiруснейтралiзацiї гiперiмунними сироватками крові до референтних штамів 1-6, 8, 10-23 серотипів ЕВС з використанням постійної дози вірусу (100-1000 ТЦД50/мл) i постійної дози сироватки - 20 нейтралізуючих одиниць (НО).

Антигенну спорідненість (R) виділених вірусів з референтними штамами ЕВС 21 серотипу визначали в перехресній реакції вiруснейтралiзацiї з використанням постійної дози сироватки (20 НО) та десятикратних розведень вірусу i обчислювали за формулою Arсhetti J. and Horsfalla F. (1950).

Для звільнення штамів, які вступають в міжтипові серологічні реакції, від культурального антигену застосовували різні методи: послідовні пасажі вірусів у гетерогенних культурах клітин (Vero та Mark-145); послідовні пасажі вірусів через мозок поросят 2-3-мiсячного вiку; очищення вірусів ультрацентрифугуванням у градієнті щiльностi сахарози (15-45 %) у присутності м'якого неіонного детергенту Twin-20; виснаження вiрусвмістної культуральної суспензії сироваткою крові до гомологічної культури клітин.

Для вивчення морфології вірусних ізолятів та контролю за якістю очистки проводили електронно-мiкроскопiчнi дослідження методом негативного контрастування.

Можливість одержання рекомбiнантних штамів ЕВС зі зміненими антигенними властивостями вивчали шляхом культивування протягом 20 послідовних пасажів при високій множинності зараження 10-100 ТЦД50 суміші штамів вірусів різних серотипів на 1 клітину та одноразової інокуляції суміші їх РНК в культурі клітин. У дослідах використовували референтні штами ЕВС F78 та И249, відповідно, 4-го i 20-го серотипiв. Виділення РНК проводили гарячим фенольно-детергентним методом за Бишоп Дж. i Кох Г.К. (1972). Контроль за якістю одержаних РНК та їх сумішей проводили шляхом визначення репродуктивної активності в присутності РНК-ази та без неї в моношарi культури клітин, а також методом бляшок під агаровим покриттям. В реакції нейтралізації визначали антигенну спорідненість клонованих вірусів з вихідними (батьківськими) та референтними штамами ЕВС 21 серотипу.

Подібним чином аналізували бiологiчнi властивості нуклеїнових кислот та їх парних сумішей, виділених з референтного штаму Г95 16-го серотипу ЕВС та штамів И57, К422, Р501, Ч756 з міжтиповими антигенними властивостями.

РОЗДІЛ 3. Результати досліджень

Виділення ізолятів вірусів i встановлення їх таксономічного положення. З метою оцінки розповсюдженості ентеровiрусiв на території України в 1995-1998 роках обстежено 20 свинарських господарств 7 областей України (Донецької, Київської, Одеської, Сумської, Харківської, Херсонської та Чернігівської). Від хворих, перехворілих та вимушено забитих свиней з симптомами пневмонії, гастроентериту, пневмоентериту та енцефаломієліту для вірусологічних досліджень відібрано 179 проб матеріалів (ректальні та назальні змиви, проби органів i тканин), а також 94 сироватки крові для серологічних досліджень.

У результаті дослідів виділено 47 ізолятів вірусів, що становить 26,3 % від загальної кількості відібраного матеріалу. Віруси проявили цитопатогенну дію в другому-шостому пасажах. Інфекційний титр вірусів коливався в межах 5,5 - 7,5 lg ТЦД50/мл. Цитопатогенна дія вірусів характеризувалась дегенеративними змінами культури клітин СНЕВ, появою поодиноких округлих клітин, з подальшим зростанням їх кількості у вигляді вогнищ округлих клітин до повного руйнування моношару. Для одержання чистих популяцій штамів вірусів проведено їх триразове клонування методом крайніх розведень з послідуючим триразовим клонуванням методом бляшок. Штами вірусів утворювали бляшки під агаровим покриттям у культурі клітин СНЕВ, які характерні для ентеровiрусiв свиней, а саме: круглої форми з рівними краями, прозорі, діаметр коливався в межах від 0,1 до 5,0 мм. .

Штами вірусів не знизили репродуктивної активності в культурі клітин СНЕВ у присутності iнгiбiторiв ДНК (актиноміцину Д та 5-бром-2-дезоксіуридину), що свідчить про їх належність до РНК-геномних вірусів. Інфекційна активність вірусів не знизилася після обробки лiпiдорозчинниками (ефіром, хлороформом) та протеолітичним ферментом трипсином, що вказує на відсутність лiпiдовмiстної оболонки та їх належність до кишкових вiрусiв. Віруси проявили стійкість як до кислого, так i до лужного середовища, характерну для ЕВС. Iнфекцiйнi титри вірусів знизились при прогріванні протягом 1 години на 1,0-1,5 lg ТЦД50/мл, що вказує на їх відносну термостійкість. Катіони Mg2+ сприяли стабiлiзацiї вірусів при прогріванні: їх титри в присутності 1 М розчину MgCl2 не змінювались, що характерно для ЕВС.

У результаті вивчення типової належності 47 штамів вірусів встановлено, що 9 з них нейтралізувалися сироваткою крові до референтного штаму 1-го серотипу ЕВС, 2 штами – до 4-го серотипу, 4 штами належали до 6-го серотипу. У 28 штамів вірусів серотипова належність не визначена, так як їх нейтралізували сироватки крові до декількох (двох - вісімнадцяти) серотипiв. Чотири штами (863, 878, 881 та 882) не нейтралізувалися жодною сироваткою крові до референтних штамів ЕВС 1-6, 8, 10-23 серотипів (табл.1).

Таблиця 1

Типова належність виділених штамів вірусів

Штам вірусу Типова належність вірусу Кількість серотипів

1 2 3

Р814 1 1

Р815 1 1

Р816 1 1

Р817 1 1

Б823 1 1

М828 1 1

М829 1 1

М830 1 1

М831 1 1

935 4 1

936 4 1

865 6 1

877 6 1

938 6 1

939 6 1

917 10, 23 2

928 1, 12 2

853 4, 12, 14, 17 4

833 1, 2, 5, 13, 17, 20, 22, 23 8

Продовження таблиці 1.

1 2 3

851 1, 4, 6, 10, 13, 18, 20, 23 8

822 1-3, 10-12, 14, 18, 23 9

824 1, 2, 10, 11, 13, 14, 18, 22, 23 9

835 1-3, 10, 11, 13, 14, 17, 23 9

836 1, 2, 4, 6, 10, 13, 14, 19, 20 9

К757 1, 3, 4, 6, 10, 14, 18, 20, 23 9

796 4, 6, 8, 10-12, 14, 16, 17, 20 10

826 1-3, 6, 11, 13, 14, 18, 20, 22 10

831 1, 2, 6, 11, 13, 14, 17, 20, 22, 23 10

823 1, 2, 4-6, 11, 13, 14, 18, 22, 23 11

834 1-4, 6, 10-14, 23 11

859 3, 4, 10-14, 17, 18, 22, 23 11

915 3, 4, 6, 10, 11, 13, 14, 16-18, 23 11

Х803 1-4, 13, 14, 16-20 11

829 1, 2, 4, 6, 10, 11, 13, 17, 18, 20, 22, 23 12

854 1, 3, 5, 6, 10-14, 17, 20, 22 12

827 1-6, 10, 11, 13, 14, 18, 20, 23 13

846 1-4, 6, 10, 11, 13, 16, 18-22 14

847 1-3, 5, 6, 10, 11, 13, 14, 16-18, 20, 21, 23 15

К759 1-6, 10, 11, 13, 14, 16-18, 20, 21, 23 16

804 1-6, 8, 10-14, 16-18, 20, 22-23 18

805 1-6, 8, 10-14, 16-18, 20, 22-23 18

845 1-6, 10-14, 16-21, 23 18

К756 1-6, 8, 10, 11, 13, 14, 16-21, 23 18

863 антигенно відмінний 0

878 антигенно відмінний 0

881 антигенно відмінний 0

882 антигенно відмінний 0

Для подальшого вивчення i встановлення таксономічного положення чотирьох штамів вірусів (863, 878, 881, 882), які не нейтралізувалися сироватками крові до референтних штамів ЕВС, одержані гiперiмуннi кролячі сироватки з титром вiруснейтралiзуючих антитіл 1:128 - 1:512. У перехресній реакції вiруснейтралiзацiї встановлено, що штам 863 є антигенним варіантом 5-го серотипу. Штами 878, 881 та 882 вступають у слабкi перехресні реакції з сироватками крові до референтних штамів ЕВС 10-ти серотипiв, антигенна спорідненість яких не перевищує 37 %. Між собою штами антигенної спорідненості не мають, крім штамів вірусів 881 та 882, які антигенно ідентичні (табл.2).

Таблиця 2

Антигенна спорідненість (R) штамів вірусів з референтними штамами

ЕВС 21-го серотипу ( %)

Серотип 1 2 3 4 5 6 8 10 11 12 13 14 15

Штам вірусу Konratice F 59 F 34 F 78 F 12 F 7 V 13 M 2323 K 9 K 22 Л 90 М 116 Ч 73

863 0 70 50 54 73 0 0 37 37 22 13 21 0

878 0 0 0 21 0 0 0 0 0 0 0 0 0

881 0 0 0 37 0 0 0 0 0 8 25 28 20

882 0 0 0 37 0 0 0 0 0 8 25 28 20

Продовження табл. 2

Серотип 16 17 18 19 20 21 22 23 АВ АВ АВ АВ

Штам вірусу Г 95 В 111 Ч 184 Д 227 И 249 П 142 В 151 И 393 863 878 881 882

863 12 32 11 0 0 0 24 0 100 0 0 0

878 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0 0

881 0 17 15 20 0 0 24 22 0 0 100 100

882 0 17 15 20 0 0 24 22 0 0 100 100

Примітка. “АВ” – штами ЕВС, антигенно відмінні від відомих серотипів.

Для вивчення морфологічних особливостей цих штамів проведено електронну мікроскопію. Вірусні частки мають сферичну форму, не містять зовнішньої лiпiдовмiщуючої оболонки. Діаметр вiрiонiв становить 28 нм. За морфологічними ознаками штами 863, 878, 881, 882 відповідають класифікаційним ознакам ентеровiрусiв.

Таким чином, на підставі вивчення біологічних, фiзико-хiмiчних та антигенних властивостей усі виділені штами вірусів віднесені до родини Picornaviridae роду Enterovirus. Слід відмітити, що штами, які вступають в міжтипові серологічні реакції, мають фiзико-хiмiчнi та бiологiчнi властивості, притаманні ентеровiрусам, i зберігають свої антигенні властивості після триразового клонування методом крайніх розведень з послідуючим триразовим клонуванням методом бляшок.

З метою виявлення вiруснейтралiзуючих антитіл до ЕВС проведено ретроспективний аналіз 55 сироваток крові, відібраних від хворих свиней з клінічними ознаками пневмоентериту, i 39 сироваток – з ознаками ураження центральної нервової системи. У результаті проведених досліджень у 9-ти сироватках крові, відібраних від свиней з симптомами пневмоентеритiв, виявлено антитіла до 1-го, 5-го, 10-го, 12-го, 13-го, 14-го, 18-го, 19-го та 23-го серотипiв у розведенні 1:32. Деякі сироватки містили антитіла одночасно до декількох референтних штамів ЕВС, що зумовлено циркуляцією вірусів з міжтиповими антигенними властивостями або циркуляцією в господарстві ентеровiрусiв різних серотипiв. У сироватках крові, відібраних від хворих свиней з клінікою енцефаломiєлiту, містяться антитіла до першого серотипу в розведенні 1:32 i вище (табл.3).

Таблиця 3

Результати ретроспективного аналізу сироваток крові, відібраних від свиней в господарствах, неблагополучних щодо інфекційних хвороб

№ сироватки Клінічні ознаки хвороби Титр віруснейтралізуючих антитіл Виявлено антитіла до серотипів ЕВС

1 2 3 4

772 пневмоентерит 1:32 1, 12, 13 і 18

781 ѕ '' ѕ 1:32 10 і 13

782 ѕ '' ѕ 1:32 10, 13 і 23

842 ѕ '' ѕ 1:32 12 і 14

843 ѕ '' ѕ 1:32 12 і 14

883 ѕ '' ѕ 1:32 19

884 ѕ '' ѕ 1:32 19

890 ѕ '' ѕ 1:32 19

885 ѕ '' ѕ 1:32 5

788 енцефаломієліт 1:32 1

805 ѕ '' ѕ 1:32 1

806 ѕ '' ѕ 1:32 1

Продовження таблиці 3.

1 2 3 4

810 ѕ '' ѕ 1:32 1

811 ѕ '' ѕ 1:32 1

812 ѕ '' ѕ 1:32 1

818 ѕ '' ѕ 1:256 1

819 ѕ '' ѕ 1:128 1

820 ѕ '' ѕ 1:512 1

Таким чином, виходячи з результатів вiрусологiчних дослiджень та ретроспективного аналiзу сироваток кровi, у свинарських господарствах України широко розповсюдженi ентеровiруси свиней з міжтиповими антигенними властивостями, що ускладнює їх ідентифікацію на рiвнi серотипу.

Гемаглютинуючi властивостi ЕВС. Дослiджено гемаглютинуючi властивостi 58 штамiв ентеровiрусiв свиней, з яких 33 вступають в міжтипові серологічні реакції; 4 штами вiрусiв, антигенно вiдмiнні вiд референтних; та референтні штами ЕВС 1-6, 8, 10-23 серотипів. У результатi дослiдiв встановлено, що тiльки 8 монотипових штамiв аглютинували еритроцити людини рiзних груп кровi, свинi, кроля, барана, морської свинки, мишi, курки, при температурi 4 i 20° С та рН 6,7-7,5. Титр гемаглютинiну становив 1:2-1:8. Штами з міжтиповими антигенними властивостями не аглютинують досліджувані еритроцити, хоч мають антигенні зв'язки з референтними штамами ЕВС, в яких ця властивість виявлена.

Очищення штамiв з міжтиповими антигенними властивостями ЕВС вiд спiльних антигеннiв культури клiтин СНЕВ. Однiєю з причин наявності мiжтипових серологiчних реакцiй у штамів вірусів може бути адсорбцiя спільних антигенних компонентiв клiтин хазяїна на поверхнi вiрусних часток. Наявнiсть антитiл до спiльних антигенiв клiтин хазяїна в сироватках кровi може симулювати антигенну спорiдненiсть мiж вiрусами рiзних серологічних груп.

Для звiльнення штамiв вірусів з міжтиповими антигенними властивостями (К422, Р501, Ч756) вiд антигенiв культури клiтин СНЕВ проведено 5 їх послiдовних пасажiв в культурі клiтин Vero та Mark-145. Віруси не проявили цитопатогенної дiї в культурах клiтин приматiв i в подальших дослiдженнях не використовувались.

З цiєю ж метою проведено 2-3 послiдовнi пасажі 5 штамiв ЕВС (К422, Р501, Ч756, Г681, Г705) з міжтиповими антигенними властивостями через головний мозок поросят 2,5-мiсячного вiку. Встановлено, що iнкубацiйний перiод при iнтрацеребральному зараженні тривав вiд 10 до 62 дiб. При появi клiнiчних ознак енцефаломiєлiту поросят забивали i вiдбирали матерiал (головний та спинний мозок, лiмфатичнi вузли, легенi, кишечник, паренхiматознi органи) для вiрусологiчних дослiджень. У переважнiй бiльшостi вiруси видiлялися з головного і спинного мозку. Вiрусвмiстну суспензiю головного та спинного мозку з найвищим титром використовували для послiдуючого пасажу на поросятах. Штами Г681 та Г705 вже у другому пасажі не накопичувалися і в подальших дослідах не використовувалися. Віруси, накопиченi в головному мозку поросят в 2-му - 3-му пасажах, очищували хлороформом і використовували для гiперiмунізації кролів, морських свинок i бiлих мишей. У перехреснiй реакцiї нейтралiзацiї вiрусу сироватками крові до референтних штамів ЕВС 1-6, 8, 10-23 серотипів встановлено, що варiанти вiрусiв, якi пройшли 2-3 послiдовнi пасажi через головний мозок поросят i тим самим звiльненi вiд спiльних антигенних компонентiв культури клiтин СНЕВ, не втратили міжтипових антигенних властивостей i залишилися антигенно спорiдненими вихiдним варiантам вiрусів (табл.4).

Таблиця 4

Антигенна спорiдненiсть штамiв ЕВС після очищення вiд антигенiв культури клiтин СНЕВ

Серо-тип Штам вірусу К 422 Р 501 Ч 756

* ** *** **** * ** *** **** * ** *** ****

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

1 Konratice + + + + - - - - + + + +

2 F59 + + + + + + + + + + + +

3 F34 + + + + - - - - + + + +

4 F78 + + + + + + + + + + + +

5 F12 + + + + + + + + + + + +

6 F7 + + + + - - - - + + + +

8 V13 + + + + - - - - + + + +

10 M2323 + + + + + + + + + + + +

11 K9 + + + + + + + + + + + +

12 К22 + + + + + + + + - - - -

13 Л90 + + + + + + + + + + + +

14 М116 + + + + + + + + + + + +

15 Ч73 - - - - - - - - - - - -

16 Г95 - - - - - - - - + + + +

17 Б111 - - - - + + + + + + + +

Продовження таблиці 4.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

18 Ч184 + + + + + + + + + + + +

19 Д227 + + + + + + + + + + + +

20 И249 + + + + + + + + + + + +

21 П142 - - - - - - - - + + + +

22 В151 - - - - - - - - - - - -

23 И 393 + + + + + + + + + + + +

Контроль СНЕВ - - - - - - - - - - - -

Кількість серотипів 16 16 16 16 13 13 13 13 18 18 18 18

Примiтки: "*" - вихiдна вiрусвмiстна культуральна суспензiя;

"**" - вiрус, який пройшов 2-3 послiдовнi пасажi через головний мозок поросят;

"***" - вiрус, очищений ультрацентрифугуванням в градiєнтi щiльностi сахарози;

"****" - вiрусвмiстна культуральна суспензiя, виснажена сироваткою кровi до культури клiтин СНЕВ.

Очищення вiд баластних бiлкiв i концентрування трьох штамiв ЕВС К422, Р501, Ч756 з міжтиповими антигенними властивостями проводили диференцiйним центрифугуванням з послiдуючим ультрацентрифугуванням в ступiнчастому градiєнтi щiльностi сахарози. Вiрус розподiлявся по всьому градiєнту, на що вказує iнфекцiйнiсть усiх 8 вiдiбраних фракцiй. Виражений пiк iнфекцiйної активностi вірусів, який становить 8,5 - 10,5 lg ТЦД50/мл, виявлено у фракцiях з вмiстом сахарози 25%. В середньому пiк iнфекцiйної активностi штамiв вiрусiв, взятих у дослід, був на 0,5 lg ТЦД50/мл нижчий iнфекцiйної активностi концентрованого вiрусу, який наносили на градiєнт, i на 1-2 lg ТЦД50/мл бiльший вихiдної вiрусвмiстної суспензiї до концентрування.

Для контролю за якiстю очищення вiрусiв проводили електронномiкроскопiчнi дослiдження препаратiв, концентрованих ультра-центрифугуванням та очищених у градiєнтi щiльностi сахарози. У препаратах концентрованих вiрусiв виявлено нативнi вiруснi частки сферичної форми дiаметром 28 нм без зовнiшньої лiпiдовмістної оболонки, вiрiони, якi втратили цiлiснiсть i частково профарбованi контрастуючою речовиною ("порожнi" вiруснi частки), електронно доступнi уламки зруйнованих вiрiонiв меншого розмiру неправильної форми (можливо, сегменти капсидiв), поодинокi форми вiрусу, якi мають вигляд пустих вiрiонiв з електронно-прозорим центром, вiдокремленим вiд периферічного кiльця капсомерiв дiлянкою контрастуючої речовини ("дефектнi" в iнфекцiйному вiдношеннi нуклеокапсиди). Крiм того, виявлено багато агрегатiв повних i порожнiх вiрусних часток. Така морфологiчна неоднорiднiсть концентрованих препаратiв зумовлює широкий профiль розподiлу вiрусу по всiх фракцiях.

У препаратах вiрусiв, очищених в градiєнтi щiльностi сахарози (фракцiї з пiком iнфекцiйної активностi), спостерiгали поодинокi повнi вiрiони та агрегати, утворенi двома вiрусними частками дiаметром 28 нм.

Таким чином, при центрифугуваннi в градiєнтi щiльностi сахарози вiдбувається очищення вiрусів вiд баластних білків культури клiтин, зруйнованих елементiв вiрусів, дефектних вiрусних часток та великих агрегатiв вiрусiв.

Усi фракцiї вiрусiв, вiдiбранi після очищення в ступiнчастому градiєнтi щiльностi сахарози, перевiрялися на iдентичнiсть в антигенному вiдношеннi з вихiдним i очищеним вiрусом в реакцiї нейтралiзацiї вiрусу вiдповiдними гомологiчними специфiчними сироватками. Встановлено, що в усiх фракцiях iнфекцiйнiсть зумовлена вірусами з однаковими антигенними властивостями.

До очищених у градiєнтi щiльностi сахарози штамiв вiрусiв одержали гiперiмуннi кролячi сироватки крові, якi використовували для встановлення антигенної спорiдненостi очищених вiрусiв з вихiдними та референтними штамами ЕВС. Згiдно з результатами, наведеними в таблицi 4, очищенi вiруси зберегли свої антигенні властивостi: штам вiрусу К 422 залишився антигенно спорiдненим 16 серотипам ЕВС, штам Р 501 – 13 серотипам i штам Ч 756 – 18 серотипам ЕВС.

Сироватка кровi, одержана до культури клiтин СНЕВ, не нейтралiзувала як очищенi вiруси, так i вихiднi вiруси в культуральнiй суспензiї. Пiсля виснаження сироваткою кровi титри вiрусiв не змiнилися, а штами не втратили міжтипових антигенних зв'язків (табл. 4).

Проведенi дослiдження свiдчать про те, що антигени культури клiтин СНЕВ не впливають на антигенні властивості ентеровiрусiв свиней. Міжтипові антигеннi зв'язки штамiв вiрусiв зумовленi спiльними антигенними детермiнантами вiрусного походження.

Створення рекомбінантних штамiв ЕВС з міжтиповими антигенними властивостями. При культивуваннi сумiшi референтних штамiв ЕВС F78 та И249 (відповідно, 4-го і 20-го серотипів) протягом 20 послiдовних пасажiв в перещеплюванiй культурi клiтин СНЕВ з високою множиннiстю iнокуляцiї, iнфекцiйні титри вiрусiв не змiнилися. Інфекційна активнiсть нуклеїнових кислот, видiлених iз вiрусiв цих штамiв, виявилася на 4 - 4,5 lg ТЦД50/мл нижче активностi нативних вiрусiв. У присутностi РНК-ази нуклеїновi кислоти не проявили цитопатогеної активностi, що свiдчить про вiдсутнiсть цiлих вiрiонiв в препаратах РНК. Дiаметр бляшок, якi утворювалися в моношарi культури клiтин СНЕВ пiд агаровим покриттям після iнокуляцiї нуклеїновими кислотами, був менший дiаметру бляшок, утворених нативними вiрусами. Iнокуляцiя культури клiтин сумiшами вiрусiв та їх нуклеїнових кислот призводила до утворення бляшок значно бiльшого дiаметру (табл. 5).

Таблиця 5

Бiологiчнi властивостi сумiшей штамiв ЕВС та їх нуклеїнових кислот в культурi клiтин СНЕВ

Варіант Інфекційна активність варіантів (lg ТЦД50/мл) Середній діаметр

Без РНК-ази В присутності РНК-ази бляшок (мм)

F78 7,5 7,5 1,8 ± 0,50

И249 8,0 8,5 0,84 ± 0,01

РНК F78 3,5 0 0,5 ± 0,10

РНК И249 3,5 0 0,5 ± 0,05

Суміш вірусів F78+И249 7,5 7,5 6,1 ± 0,50

Суміш РНК F78+И249 2,5 0 2,0 ± 0,10

Антигенний аналiз показав, що рекомбінантні клони штамів, вiдiбраних при культивуваннi сумiшi вiрусiв, мають 100 % антигенну спорiдненiсть з вихiдними референтними штамами F78 та И249, а також виявлені слабкi антигеннi зв'язки рекомбінантних клонів досліджуваних штамів з референтними штамами 6-ти - 13-ти серотипiв. Антигеннi властивостi вiрусiв, одержаних з нуклеїнових кислот, не вiдрiзнялися вiд властивостей вихiдних штамiв вiрусiв. При одноразовому зараженнi культури клiтин сумiшшю РНК штамів F78 та И249 їх клонованi варіанти мали антигеннi властивостi одного iз них або обох батькiвських штамiв, які до того ж вступали в серологiчнi реакцiї з сироватками кровi до ЕВС 2-го, 18-го, та 22-го серотипiв (табл. 6).

Таблиця 6

Атигенна спорiдненiсть (R) штамiв F78, И249 ЕВС та їх клонованих варiантiв сумiшей (%)

Штами вірусів F78 РНК F78 И249 РНК И249 Суміш F78 + И249 Суміш РНК F78+И249

F78 100 100 24 11 100 100

РНК F78 100 100 11 11 100 100

И249 24 11 100 100 100 73

РНК И249 11 11 100 100 100 73

Суміш F78 + И249 100 100 100 100 100 100

Суміш РНК F78+И249 100 100 73 73 100 100

Нуклеїновi кислоти штамiв К422, Р501, Ч756, які мають антигенні зв'язки з референтними штамами відповідно 16-ти, 13-ти та 18-ти серотипів ЕВС, володіють репродуктивними та бляшкоутворюючими властивостями, притаманними РНК референтних штамiв ЕВС. Антигеннi властивостi вiрусiв, отриманих з нуклеїнових кислот, були такими ж, як у вихiдних штамiв вiрусiв.

При вивченні морфології бляшок клонів вірусів (К422, Р501, Ч756), одержаних з нуклеїнових кислот та їх сумішей, виявлено розбiжнiсть в їх характеристиках: РНК, як i самi вiруси, з яких вони видiленi, утворювали бляшки круглi, прозорi з чiткими, рiвними краями; сумiшi РНК цих вірусів утворювали прозорi бляшки неправильної форми з нерiвними краями значно бiльшого дiаметру. Поряд з бляшками, якi мають змiнену морфологiю, спостерiгали бляшки, характернi для РНК одного iз штамiв.

Одержані результати свідчать, що нуклеїнові кислоти штамів ЕВС, які володіють міжтиповими антигенними властивостями, мають такi ж репродуктивні та бляшкоутворюючі властивостi, як i нуклеїновi кислоти референтних штамiв. Рекомбінантні штами ЕВС мали змінену морфологію бляшок, яка відрізнялася від бляшок вихідних штамів вірусів за формою та діаметром. Рекомбінантні штами вірусів, які одержані при культивуванні двох референтних штамів ентеровірусів свиней 4-го та 20-го серотипів та виділених із них нуклеїнових кислот, мали антигенні властивості обох вихідних штамів вірусів і нейтралізувалися сироватками крові до штамів інших серотипів ЕВС. В подальших дослідженнях властивості одержаних рекомбінантних штамів зберігалися. Мiжтиповi схрещування є багатофакторними i вимагають бiльш глибоких дослiджень бiологiчних властивостей одержаних рекомбінантних штамів та вивчення їх на молекулярному рiвнi.

Розробка набору дiагностикумiв. Видiлення ентеровiрусiв свиней, які мають міжтипові антигенні зв'язки, i вивчення їх бiологiчних, фiзико-хiмiчних та антигенних властивостей стало науковою основою розробки компактного набору дiагностикумiв ентеровiрусних пневмоентеритiв свиней. Набiр розроблено на основi двох штамiв ЕВС (И59 та Р501) з міжтиповими антигенними властивостями, кожен з яких антигенно спорiднений з 13-тю серотипами ЕВС, що є збудниками пневмонiй, гастроентеритiв та пневмоентеритiв свиней. До набору входять 2 штами И59 та Р501 і специфiчнi сироватки крові до них. Набiр дозволяє протягом 7 днiв в реакцiї нейтралiзацiї вiрусу визначити належність збудника до ЕВС та встановити титри вiруснейтралiзуючих антитiл в сироватках кровi хворих та перехворiлих тварин.

Застосування штамiв ЕВС з міжтиповими антигенними властивостями дозволяє скоротити кiлькiсть діагностичних штамiв, що робить набiр бiльш компактним, дешевим при виготовленнi i зручним у застосуваннi.

На набiр розроблено науково-технiчну документацiю (Технiчнi умови, Iнструкцiя по виготовленню i контролю якостi набору і Тимчасова настанова по його застосуванню) та методику виробничих випробувань. Набiр пройшов лабораторну перевiрку i проходить виробничi випробування на базi Центральної державної лабораторiї ветеринарної медицини Мiнiстерства аграрної полiтики України (м. Київ).

РОЗДІЛ 4. Аналіз та узагальнення результатів дослідження

У розділі 4 оцінено повноту вирішення поставлених завдань і достовірність результатів дослідження та співставлено їх з даними літературних джерел.

У процесі наших досліджень не підтвердилось, що антигени культури клiтин СНЕВ впливають на результати реакцiї нейтралiзацiї ентеровiрусiв свиней. На наш погляд, міжтипові антигеннi зв'язки зумовленi спiльними антигенними детермiнантами вiрусів. Однією з причин міжтипових антигенних зв'язків може бути рекомбінація між вірусами різних серотипів, що підтверджується результатами проведених нами досліджень. Запропонований “Набір діагностикумів ентеровiрусних пневмоентеритiв свиней” має ряд переваг перед існуючими аналогами.

В И С Н О В К И

1. Серед свинопоголів'я в Україні циркулюють ентеровіруси відомих серотипів, а також віруси, антигенно відмінні від них, та віруси, які мають міжтипові антигенні властивості.

2. Міжтипова антигенна спорідненість досліджених ЕВС зберігається після триразового клонування вірусів методом крайніх розведень з наступним триразовим клонуванням методом бляшок, не залежить від біологічних систем репродукції та методів очищення вірусів, що вказує на їх зв'язок із спільними антигенними детермінантами вірусів.

3. Штами з міжтиповими антигенними властивостями не аглютинують еритроцити людини чотирьох груп крові, свині, барана, кроля, морської свинки, миші та курки, хоч мають антигенні зв'язки