НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна

ДАНИЛОВИЧ ЮРІЙ ВОЛОДИМИРОВИЧ

УДК 577.352.45:612.396.22

ВЛАСТИВОСТІ ТА РОЛЬ Са2+/Н+-ОБМІНУ ПЛАЗМАЛЕМИ МІОМЕТРІЯ

03.00.04-біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ-2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України

Науковий керівник — доктор біологічних наук, ТУГАЙ Василь Андрійович,

провідний науковий співробітник, старший науковий

співробітник Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна

НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

ВОЙЦІЦЬКИЙ Володимир Михайлович,

професор кафедри біохімії Київського національного

університету імені Тараса Шевченка;

кандидат біологічних наук

КРАВЦОВ Олександр Васильович,

провідний науковий співробітник -

керівник лабораторії транспортних АТРаз

Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна

НАН України

Провідна установа — Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, відділ

Нейрохімії, м. Київ

Захист відбудеться "21 січня" 2002 року о 14 год на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26. 240. 01 в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна

НАН України за адресою: 01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інститута біохімії

ім. О. В. Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9)

Автореферат дисертації розісланий "17"грудня 2001 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук КІРСЕНКО О. В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Активація електрозбудливих клітин супроводжується входом Са2+ з позаклітинного середовища у цитоплазму за градієнтом концентрації [Костюк П. Г., 1986; Johnson J. D., 2000]. Вважається, що при збудженні недостатньо кальцію, який надходить в клітину через плазматичну мембрану (ПМ) для активації скорочення гладеньком'язових клітин (ГМК) [Kuriyama H., 1998]. Необхідне його додаткове вивільнення із внутрішньоклітинних депо. На даний час існує дві основні гіпотези щодо ініціації вивільнення Са2+ із саркоплазматичного ретикулума: деполяризація мембрани ретикулума під впливом потенціалу дії, який можливо досягає структур цього компартменту [McDonald T. F., 1994; Зима В. Л., 2000], або дія зовнішнього Са2+ на його Са2+ - вивільняючі канали (так зване, "Са2+ - індуковане вивільнення Са2+") [Рубцов А. М., 1997; Corbett E. F., 2000]. Ці гіпотези на даний час широко дискутуються і не мають повного підтвердження. Ми вважаємо, що в механізмі ініціації вивільнення Са2+ із місць депонування можуть бути задіяні зміни концентрації протона в цитоплазмі. Про таку можливість свідчать багаточисельні експериментальні дані. Зокрема, активація ряду еукаріотичних клітин супроводжується збільшенням рН цитоплазми (рНі), можливо, за рахунок виходу Н+ у позаклітинне середовище за градієнтом концентрації [Lukacs G. L., 1993]. Раніше було показано, що залуження середовища, яке оточує саркоплазматичний ретикум, призводить до звільнення Са2+ з цього компартменту [Тугай В. А., 1992]. Виходячи з даних літератури, можна припустити, що короткочасне залуження міоплазми ГМК при їх активації відбувається за рахунок Са2+/Н+-обміну ПМ [Wray S., 1996; Peng H.-L., 1998]. Вдалою моделлю при вивченні іонного обміну на рівні ПМ ГМК є везикули плазмалемного походження, які отримують методами диференційного центрифугування [Рыбальченко В. К., 1991].

Підвищення рівня цитозольного Са2+ в ГМК призводить до посилення утворення комплексу Са2+-кальмодулін, останній активує подальші реакції сигнальних систем в ГМК і, зокрема, ініціює скорочення шляхом збільшення активності кінази легких ланцюгів міозину [Horowitz A., 1996; Hill J. T., 2000]. Тому важливим питанням в з'ясуванні механізмів передачі Са2+-сигнала в ГМК стає вивчення можливості регуляції Са2+-зв'язуючих властивостей кальмодуліна змінами рН.

Серед гладеньком'язових органів важливу роль в організмі тварин відіграє матка внаслідок забезпечення репродуктивної функції. Міометрій матки характеризується активним окисним метаболізмом, а також циклічними змінами рН міоплазми в процесі скоротливої активності [Taggart, 1993]. Тому важливим питанням є вивчення ролі Н+ в передачі Са2+-сигнала в ГМК матки як в теоретичному аспекті, так і з метою спрямованої корекції порушень Са2+-гомеостазу, зокрема при ішемії [Harrison N., 1994].

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Тему дисертації було затверджено на засіданні вченої ради Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України 19 січня 1999 р. Робота виконувалась з 1999 по 2001 р. у рамках науково-дослідної теми №5 (держ. реєстр. №0199И000270) "Вивчення біохімічних механізмів електро- та фармакомеханічного спряження у гладеньких м'язах та ролі систем енергозалежного транспорту Са2+ у забезпеченні цього процесу" за проблемою "Біохімія тварин і людини".

Мета та задачі дослідження. Метою роботи було дослідити можливі зміни рН внутрішньовезикулярного середовища під впливом потенціал- і М-холінергічної активації входа Са2+ у везикули і вплив величини рН на утворення комплексу Са2+-кальмодулін.

Відповідно до мети роботи були поставлені такі задачі:

·

·

·

·

Об'єкт дослідження. Везикули плазмалеми міометрія, кальмодулін з мозку бика.

Предмет дослідження. Пасивний транспорт Са2+ за градієнтом концентрації та зміни рН внутрішньовезикулярного середовища ПМ ГМК під впливом зміни мембранного потенціала та активації М-холінорецепторів. Зв'язування Са2+ кальмодуліном в залежності від величини рН.

Методи дослідження. Диференційне центрифугування у градієнті густини сахарози, електронна мікроскопія, кількісний спектрофотометричний аналіз речовин та спектрофотометричний аналіз зміни топології везикул в ізо- та гіпертонічному середовищі (турбідиметричний аналіз), дослідження транспорту Са2+ з використанням радіоактивної мітки 45Са2+, визначення змін рН внутрішнього середовища везикул за допомогою радіоактивноміченого 14С-метиламіна, вивчення Са2+-зв'язуючих властивостей кальмодуліна з використанням високопоруватого ватману та радіоактивної мітки 45Са2+.

Наукова новизна одержаних результатів. На моделі переважно "правильно" орієнтованих везикул ПМ ГМК проведено систематичний аналіз взаємозв'язаного транспорту Са2+ та Н+ на рівні цієї мембранної структури.

Встановлено, що активація ПМ зміною мембранного потенціалу та зв'язуванням агоністів М-холінорецепторів призводить до збільшення її проникності для Са2+. Вперше показано, що активація входу Са2+ під впливом вказаних фізіологічних чинників супроводжується зростанням рН всередині везикул за рахунок можливого виходу Н+. Продемонстрована ефекторна дія низьких концентрацій (нМ) агоністів М-холінорецепторів на транспортні процеси ПМ. При цьому також встановлено, що розсіювання градієнта Н+ на ПМ призводить до посилення трансмембранного переміщення Са2+, яке блокується інгібіторами L-типу Са2+-провідності Cd2+ та ніфедипіном. Продемонстрована наявність Са2+-незалежної компоненти транспорту Н+ крізь мембрану, яка регулюється зміною мембранного потенціалу та дією М-холіноміметиків.

Встановлено посилення зв'язування Са2+ кальмодуліном при збільшенні величини рН від 6,5 до 7,5, а також досліджена роль Н+ у механізмах зв'язування Са2+ кальмодуліном.

Отримані результати свідчать про можливе існування in vivo процесу виходу Н+ із цитоплазми на початкових етапах активації клітин міометрія.

Теоретичне та практичне значення результатів. Результати проведених досліджень розширюють уявлення щодо процесів, які відбуваються на ПМ при збудженні клітин міометрія, а саме зміни проникності ПМ для Са2+ та Н+, що призводить до входу Са2+ у клітину та виходу Н+ у позаклітинний простір. Підвищення рНі, як результат зазначених змін іонного гомеостазу, призводить до активації Са2+-залежних цитозольних реакцій, зокрема ініціації утворення комплекса Са2+-кальмодулін.

Експериментальні результати стосовно впливу низьких (починаючи з 1 нМ) концентрацій агоністів М-холінорецепторів на транспорт Са2+ та Н+ в ПМ можуть бути основою обгрунтування використання цих речовин в фармацевтиці.

Під час виконання запланованих експериментів було розроблено методичний підхід до вивчення параметрів зв'язування атропіна з біомембранами на основі спектрофотометричного аналізу, що дозволило з'ясувати орієнтацію везикул ПМ ГМК.

Використання в дослідах 14С-метиламіну як DрН-індикатора дозволило вірогідно визначати зміни рН внутрішньовезикулярного середовища.

З застосуванням вперше запропонованого методичного прийому аналізу Са2+-зв'язуючих властивостей кальмодуліна, який включає стадію імобілізації білка на високопоруватому хроматографічному папері з подальшою сорбцією 45Са2+, вдалося дослідити рН-залежність цього процесу, а також деякі особливості зв'язування Са2+ при різних значеннях рН.

Простота, доступність та надійність розроблених методичних підходів дозволяє використовувати їх як в лабораторній практиці, так і в навчальному процесі.

Особистий внесок здобувача. Концепція роботи запропонована науковим керівником д. б. н. Тугайом В. А. Експериментальна частина роботи та розробка методичних прийомів виконані дисертантом особисто. Виділення препарату кальмодуліна здійснювалось під керівництвом к. б. н. Слінченко Н. М. за безпосередньою участю дисертанта; електронно-мікроскопічний аналіз препарата проводився групою електронної мікроскопії Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України (керівник к. б. н. Чернишов В. І. ); вимірювання Na+, К+-АТРазної активності везикул ПМ проводив д. б. н. Капля О. А. на препаратах, одержаних дисертантом. Аналіз та обговорення результатів проведено спільно з науковим керівником д. б. н. Тугайом В. А. та завідувачем відділу біохімії м'язів, д. б. н., професором Костеріним С. О. Друковані праці підготовлено безпосередньо дисертантом при науковому редагуванні керівника.

Апробація результатів дисертації. Викладені в дисертації результати досліджень були представлені на таких наукових конференціях: Всеукраїнська науково-методична конференція "Хімічні науки і сучасність", Україна, м. Полтава, 1999 р.; "Горизонти біохімії", Росія, м. Пущино, 2001 р. Експериментальні результати апробовані на конкурсах молодих вчених в 1999 р. (3 місце) та 2000 р. (заохочувальна премія). Результати експериментів доповідались на наукових семінарах відділу біохімії м'язів та засіданнях вченої ради Інститута біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України в 1999-2001 р.

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 4 статті в Українському біохімічному журналі та 3 тези доповідей на міжнародній та вітчизняних наукових конференціях.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 116 сторінках машинописного тексту і складається з таких розділів: "Вступ", "Огляд літератури" (7 підрозділів), "Експериментальна частина" (підрозділи — "Методи і матеріали", "Результати та обговорення"), "Заключення", "Висновки", "Список використаних джерел", який містить 213 посилань. Робота ілюстрована 25 рисунками.

Огляд літератури

Огляд літератури складається з 7 підрозділів. Перший присвячений механізмам передачі зовнішніх сигналів через плазмалему. Наступні два — механізмам регуляції рівня цитозольного Са2+ та функціональної інтеграції кальцієвих пулів в клітинах. Четвертий та п'ятий підрозділи присвячені проблемам підтримання рН-гомеостаза в м'язових клітинах та ролі внутрішньо- та позаклітинного рН в регуляції Са2+-гомеостазу. Заключний розділ присвячений ролі кальмодуліна в передачі Са2+-сигнала в гладеньком'язових клітинах.

Методи дослідження

ПМ ГМК виділяли з міометрія свині диференційним центрифугуванням у градієнті густини сахарози [Кондратюк Т. П., 1986] з використанням середовища, яке не містило KCl. Кількість білка в мембранному препараті визначали по його реакції з реактивом Кумасі G-250 після попереднього розчинення аліквоти мембранного препарату в 3% NaOH [Bradford M. M., 1976].

Для отримання електронних знімків ПМ їх ультратонкі зрізи зафарбовували уранілацетатом і цитратом свинцю [Гайер Г., 1974].

Осмотичну активність везикул досліджували на спектрофотометрі марки СФ-4, l=520 нм [Дядюша Г. П., 1983].

Оцінювали питому активність Na+, К+-АТРази по утворенню в середовищі інкубації неоганічного фосфату, який визначали за методом Фіске-Субарова в модифікації [Капля А. А., 1982].

Для визначення зв'язування атропіна з плазмалемою осад мембран ресуспендували в 0,025М K+,Na+ - фосфатному буфері, рН=6,8. Суспензію мембран в кількості по 500 мкг білка вносили в кожну із 10 центрифужних пробірок, які містили 0,025 М фосфатний буфер, рН=6,8 і зростаючі концентрації атропіну (2-8)·10 -6М. Кінцевий об'єм 10 мл, t=200С. Через 30 хв мембрани осаджували шляхом центрифугування при 105000 g на протязі 60 хв. Аналізували надосадові рідини контрольних і дослідних проб на їх здатність поглинати УФ - світло в варіанті двопроменевої спектрофотометрії за допомогою Specord UV VIS, l=209 нм.

Для створення DрН на мембрані везикул використовувався метод "DрН-стрибка" [Костерин С. А., 1990]. Отриманий осад мембран ресуспендували в 3 мл 0,15М сахарози та 0,01М HEPES-TRIS, рН якого було 6,0 з додаванням в ряді випадків сполук для зміни властивостей плазмалеми або внутрішньовезикулярного середовища. Мембрани витримували в холодильнику (+4оС) на протязі 15 годин. За таких умов внутрішнє середовище мембранних везикул урівноважується з зовнішнім оточенням, і рН везикулярного середовища теоретично повинно бути 6,0. Так як рН всередині везикул постійне і дорівнює 6,0, а рН середовища для розведення везикул в експерименті можна змінювати від 6,0 до 8,0, то при змішуванні аліквоти мембран з розчином для розведення формується градієнт Н+ величиною 0-2 одиниці, чому сприяє застосування HEPES-TRIS буфера, інгредієнти якого мають низьку проникність через біомембрани. При розсіюванні градієнта Н+ змінюється рН внутрішньовезикулярного простору, що можна зареєструвати відповідним переміщенням DрН-індикатора, введеного у середовище розведення. В якості DрН - індикатора використовували 14С-метиламін (14С-МА ) [Тугай В. А., 1992]. Середовище розведення об'ємом 2 мл містило: 0,15М cахарозу, 0,01М HEPES-TRIS, рН якого було 6,0-7,0-7,5-8,0, в кожному варіанті по 2х 10- 5 М 14С-МА, а також сполуки, що змінюють проникність ПМ для Са2+ та Н+, які вказані в підписах на малюнках та поясненні в тексті. При дослідженні транспорта Са2+ у везикули використовували 45Са2+, який додавали в індикаторних кількостях замість 14С-МА у середовище розведення.

Формування наведеного мембранного потенціала проводили за допомогою системи "К+-валіноміцин", а також холінхлориду, користуючись для розрахунку поза- та внутрішньовезикулярних концентрацій К+ та Cl- рівнянням Нернста [Печатников В. А., 1980; Костерин С. А., 1990] Послідовність виміру була слідуюча. Аліквоту білка (0,2мг) вносили у відмічене середовище, розмішували і через 30, 60, 90, 180 сек відбирали аліквоти по 0,5 мл , фільтрували крізь ультрафільтри (діам. пор 0,45 мкм, "Millipore", США) під вакуумом, промивали розчином 0,15М сахарози, рН якого було 6,0. Радіоактивність фільтрів реєстрували на лічильнику BECKMAN у сцинтиляційній рідині ЖС-1.

Кальмодулін з мозку бика виділяли за методом Гопалакришни [Gopalokrishna R., 1982]. Отриманий кальмодулін зберігали у рідкому азоті. Перед дослідом проводили діаліз білка проти 1,5 % амоній-ацетатного буфера, рН=5,0 протягом 12 годин [Бобровник С. А., 1998]. Кількість білка визначали за Бредфордом [Bradford M. M., 1976].

Твердим носієм для утримання кальмодуліна був високопоруватий ватман №3 з такими характеристиками: вага 100 мг/см2, товщина 0,36 мм, всмоктуюча здатність 150-250 умовних одиниць.

Зібраний після діалізу кальмодулін в кількості 80 мкг в об'ємі 0,05 мл наносили на полоски ватману розміром 20х20 мм. Після цього полоски з нанесеним білком поміщали в сухий термостат на 3 год. при t=37оС. За цих умов відбувається випарування амоній-ацетатного буфера і на ватмані утворюється плівка кальмодуліна. В ряді дослідів замість кальмодуліна на полоски ватману наносили альбумін людини за тих же самих умов.

Потім на смужки ватману з білком наносили 0,05 мл середовища для зв'язування Са2+ слідуючого складу: 20 мМ HEPES-TRIS буфер, рН=6,5-7,5; 100 мМ KCl; 10-7-10-4 М (40Са2++45Са2+). Контролем були смужки ватману без білка. Процес зв'язування Са2+ з кальмодуліном проводили на протязі 30 хв. при 37оС в термостаті.

З метою відокремлення неспецифічно сорбованого Са2+ від поверхні бумаги та кальмодуліну смужки ватману промивали на протязі 5 хв. в середовищі такого складу: 2 мМ LaCl3; 20 мМ HEPES-TRIS-буфер, рН=6,5-7,5; 100 мМ KCl. Об'єм – 20 мл.

Радіоактивність висушених смужок ватману підраховували за допомогою сцинтиляційного лічильника Intertecnique-SL100 в сцинтиляційній рідині ЖС-1.

Для розрахунків зв'язування атропіна з мембранним препаратом та Са2+ з кальмодуліном використовували координати Клотца, Скетчарда і Хілла [Варфоломеев С. Д., 1982]

Результати досліджень оброблені статистично з використанням t-критерія Стьюдента [Налимов В. В., 1981]. Визначення зв'язування проводили у вказаних координатах з використанням методу найменших квадратів. Для відповідних розрахунків користувалися стандартним пакетом програм IBM PC.

Результати досліджень і обговорення

1. Характеристика фракції везикул плазмалеми міометрія.

В багаточисельних дослідженнях по визначенню чистоти фракції везикул ПМ міометрія, виділених зазначеним вище методом диференційного центрифугування у градієнті густини сахарози, встановлено, що переважна більшість мембранних фрагментів в отриманій фракції плазмалемного походження. Водночас питання про орієнтацію везикул, виділених в середовищі різного складу, до кінця не з'ясоване [Рыбальченко В. К., 1991].

З метою отримання переважної кількості "правильно" орієнтованих везикул, тобто цитоплазматичним боком всередину застосовували середовище для виділення, яке не містило KCl. Це передбачає існування на зовнішній поверхні мембранних фрагментів, багатій карбоксильними групами, високого нескомпенсованого негативного заряду, який може призвести до "правильного" замикання везикул на стадії гомогенізації міометрію в процесі виділення мембранного препарату.

Для оцінки наявності везикул в отриманій фракції ПМ міометрія було проведено відповідні електронно-мікроскопічні дослідження. Дані електоронно-мікроскопічних знімків вказують на те, що виділені мембранні препарати мають в більшості везикулярну структуру. Розміри і форма везикул варіюють. Крім того, на препараті можна відмітити і невезикульовані фрагменти. Їх кількість не перевищує 20%. Ця величина отримана на основі вимірів активності Na+, K+-АТРази без порушення везикул та після обробки додецилсульфатом натрія. На основі цих дослідів можна зробити також припущення про "правильну" орієнтацію більшості везикул отриманої фракції.

Допоміжним і надійним тестом на замкненість мембранних везикул служить вимірювання осмотичної активності препарату [Дядюша Г. П., 1983]. Наші результати свідчать про те, що поглинання видимого світла при l=520 нм препаратом везикул значно збільшується в гіпертонічному розчині у порівнянні з ізотонічним, тобто отриманий нами мембранний препарат є осмотично активним, а значить складається з замкнених пухірців.

Зовнішня поверхня ПМ ГМК, як відомо, містить М-холінорецептори (М-ХР) різних підтипів, що можуть бути її маркерами [Kuriyama, 1998]. Одним з відомих неспецифічних антагоністів М-ХР є алкалоїд атропін, що здатний з високою спорідненістю і зворотньо зв'язуватись з М-ХР [Mei L., 1989]. Цю властивість атропіну можна використати для визначення орієнтації отриманих везикул ПМ.

Нами був розроблений методичний підхід для вимірювання зв'язування атропіна з поверхнею везикул плазмалеми на основі визначення рівноважної концентрації атропіна методом двопроменевої спектрофотометрії. Умова мономолекулярної сорбції атропіна препаратом виконується в межах його початкової концентрації від 2 до 6 мкМ, що дозволяє розрахувати зв'язування в цьому діапазоні. Нами знайдено, що величина уявної Кд зв'язування сягає 1 мкМ, кількість граничних місць зв'язування 3,2х10-5 моль/г, енергія зв'язування -32 кДж/моль. Процедура триразового заморожування-відтаювання везикульованих препаратів, тобто порушення цілісності везикул, призводить до зниження енергії зв'язування до -13 кДж/моль, причому гранична кількість місць зв'язування збільшується на 28%. Це свідчить про появу менш специфічного зв'язування з мембранами розірваних везикул та дозволяє припустити, що "правильно" орієнтованих везикул в мембранному препараті більшість. Отримані таким чином везикулярні препарати дають змогу досліджувати в подальшому ті процеси, які пов'язані з функціонуванням ПМ (формування мембранного потенціалу, транспорт іонів і рецепцію нейромедіаторів), уникаючи впливу цитозольних біохімічних процесів.

В серії досліджень з використанням неіонного детергенту тритон-Х100 було доведено, що для використаної моделі властива бар'єрна стосовно Са2+ функція.

2. Умови формування трансмебранного градієнту протонів на мембрані везикул та вплив його розсіювання на трансплазмалемне переміщення Са2+.

Наступне питання, яке вирішувалося в рамках даної роботи — це можливість формування градієнта протонів на мембрані везикул та дослідження змін рН внутрішньовезикулярного середовища. Біологічні мембрани характеризуються такою фундаментальною особливістю, як напівпроникність, зокрема, для одновалентних катіонів [Геннис Р., 1997]. Ця особливість лежить в основі створення в експерименті трансмембранної різниці DрН з використанням буферної системи HEPES-TRIS, компоненти якої слабко проникають крізь ПМ. Наявність трансмембранної різниці DрН в нашій моделі на везикульованій ПМ можна довести експериментально, використовуючи слабкі кислоти або основи. Для доказів можливості створення трансмембранного DрН у фракції везикул ПМ міометрія та з метою подальшого дослідження зміни рН внутрішньовезикулярного середовища була використана слабка основа 14С-МА. Нейтральна форма слабкої основи більш швидко проникає через природні і штучні мембрани в порівнянні з зарядженою формою, рівноважний рівень накопичення 14С-МА у компартменті з більш низьким рН теоретично залежить від величини рН у середовищі по обидва боки мембрани та від рКа слабкої основи за умови використання її індикаторних кількостей, які самі по собі не змінюють рН середовища [Тугай В. А., 1992].

В ході експерименту встановлено, що штучно створений градієнт Н+, спрямований з везикул у середовище розведення, призводить до накопичення у везикулах 14С-МА (рис. 1). Його кількість, акумульована везикулами, залежить від величини DрН на мембрані. Введення в інкубаційне середовище неіонного детергенту тритон - Х100 (0,05%) призводить до зменшення накопичення 14С-МА у фракції везикул типу рНі=6,0/рНо=8,0 до рівня його сорбції мембранами. Результати досліду свідчать про те, що 14С-МА проникає крізь сарколему і накопичується всередині везикул.

Аналіз результатів, представлених на рис. 1 свідчить про відносну стійкість у часі штучноствореного DрН, бо на 30 сек рН всередині везикул менше, ніж рН середовища їх розведення (рНо). Наші результати щодо накопичення 14С-МА везикулами в часі від 0 до 180 сек вказують на те, що на 30 с транспорту слабкої основи у везикули вже практично досягається рівноважний стан. Додавання до середовища розведення везикул типу рНі=6,0/рНо=7,5 протонофора КЦХФГ (0,05%) призводить до зменшення накопичення 14С-МА у фракції везикул ПМ у порівнянні з контролем. Так як протонофор швидко розсіює градієнт Н+ на везикульованій ПМ, отримані результати підтверджують теоретичне припущення про накопичення 14С-МА у везикулах в залежності від величин рНі та рНо.

Виходячи з сучасних теоретичних уявлень і наших експериментальних результатів, слабка основа 14С-МА проявляє властивості DрН-індикатора і розподіляється між внутрішнім і зовнішнім середовищами везикул ПМ міометрія в залежності від величини трансмембранного DрН. Можна зробити висновок, що за умов створення рНі=6,0 у середині везикул і швидкого розведення мембранного препарата середовищем з рНо=7,0-8,0, створюється штучний градієнт протонів, спрямований з внутрішнього середовища везикул у середовище інкубації. Штучно створений градієнт Н+ розсіюється з часом і не виникає у присутності детергенту або протонофора. Швидкість накопичення 14С-МА у мембранній фракції буде знижуватись при збільшенні швидкості виходу Н+ з везикул. Ці висновки є підставою для використання 14С-МА у подальших дослідженнях з метою вивчення відносної зміни рН внутрішньовезикулярного середовища при впливі на мембрану фізіологічних подразників.

У фізіологічних дослідженнях показано, що при деполяризації окремих типів електрозбудливих клітин реєструється Н+-струм, спрямований у позаклітинний простір. Вихідний струм Н+ при збудженні ПМ специфічно блокується Cd2+ та Zn2 [Lukacs G. L., 1993] Тому виникає питання про можливу регуляцію градієнтом протону Са2+-проникності ПМ. Нами встановлено, що при створенні градієнту Н+ 1,5 од. на мембрані везикул спостерігається збільшення включення Са2+ у везикули у два рази у порівнянні з контролем (рис. 2). Введення у середовище інкубації везикул протонофору 2,4-динітрофенолу призводить до зниження накопичення Са2+ у везикулах по відношенню до контролю. З наведених експериментальних результатів можна зробити висновок, що розсіювання градієнту Н+ з везикул призводить до збільшення проникності ПМ для іонів Са.

В подальших дослідженнях вивчали вплив відомих інгібіторів катіонного транспорту крізь ПМ збудливих клітин Cd2+ та ніфедипіну (представника ряду дигідропіридинів) [McDonald T. F., 1994]. Специфічний блокатор протонного та кальцієвого транспорту L-типу через плазмалему збудливих еукаріотичних клітин Cd2+ (1 мМ) призводить до 70% інгібування включення 45Са2+ у везикули ПМ типу рНі=6,0/рНо=7,5 (рис. 3, а). Гальмівний вплив на транспорт Са2+ чинить високоспецифічний блокатор плазмалемних Са2+-струмів L-типа ніфедипін в наномолярній концентрації (рис. 3, б). Гальмуваня DрН-залежного трансмембранного переміщення іонів Са класичними блокаторами Ca2+ транспорту L-типу також свідчить на користь існування тісного зв'язку між обміном Са2+ та Н+ на ПМ ГМК.

3. Вплив модельної деполяризації та ацетилхоліна на транспорт Са2+ в везикули в умовах розсіювання трансмембранного DрН

Важливим фізіологічним фактором, що призводить до підвищення проникності ПМ для іонів Са є зміна трансмембранного потенціалу (деполяризація) [Зима В. Л., 2000]. Ми вивчали вплив розрахованого за рівнянням Нернста штучнонаведеного потенціалу на мембрані на вхід іонів Са у везикули в умовах розсіювання трансплазмалемного DрН. Фізіологічний зміст такої постановки експерименту полягає у вивченні стаціонарної компоненти Са2+-струму крізь сарколему [Костерин С. А., 1990]. Встановлено, що модельна деполяризація ПМ везикул від -40 до +20 мВ призводить до посилення входу Са2+ у везикули по градієнту концентрації катіона (рис. 4). Вхід Са2+ у везикули плавно зростає від -40 до +10 мВ, досягає максимального значення при +10 мВ і при подальшій деполяризації починає знижуватися. Отримані результати відповідають уявленням про потенціалзалежність входу Са2+ крізь ПМ ГМК, характер кривої на рис. 4 якісно подібний ходу кривої вольт-амперної характеристики потенціал-залежних Са2+-струмів.

Крім зміни мембранного потенціалу, іншим важливим фізіологічним фактором, здатним підвищувати проникність ПМ для Са2+, виступає агоніст М-ХР ацетилхолін [Kuriyama, 1998]. Проведеними нами дослідженнями встановлено, що ацетилхолін достовірно збільшує вхід Са2+ у везикули ПМ ГМК матки по відношенню до контролю в умовах розсіювання трансмембранного градієнту протонів, спрямованого з везикул у середовище розведення (рис. 5). Крім того, при концентрації ацетилхоліна 10-6 М ефект був значно більшим, ніж при використанні 10-4 М агоніста. Останній результат можна пояснити тим, що збільшення концентрації агоніста вище її фізіологічного значення призводить до порушення функціонально-значимої відповіді.

Виходячи з експериментальних результатів, було зроблено висновок, що зміна мембранного потенціала (деполяризація) або/та активація ПМ ГМК ацетилхоліном, взаємозв'язані чинники перших етапів активації ПМ, призводять до збільшення проникності ПМ для Са2+ за умови трансмембранного розсіювання градієнту протонів.

4. Вплив основних фізіологічних активаторів мембрани на величину рН внутрішньовезикулярного середовища

Вхід Са2+ у м'язову клітину активує протилежно спрямовані струми моновалентних катіонів. Носіями цього вихідного струму може бути К+ або/і Н+. Роль струму іонів водню на перших етапах активації клітини з'ясована недостатньо повно, хоча показано, що цей струм спостерігається за відсутності інших моновалентих катіонів в цитозолі [Костюк П. Г., 1986]. У випадку ГМК систематичних досліджень в цьому напрямку не проводилось.

Нами встановлено, що градієнт Са2+, спрямований у везикули, знижує накопичення 14С-МА на 30-й с реєстрації процесу, тобто посилює вихід Н+ з везикул. Отримані результати відповідають уявленню про взаємозв'язок між обміном Са2+ та Н+ на рівні ПМ міометрію.

Зміна штучно створеного трансмембранного потенціалу у фізіологічно-значимому діапазоні від -40 до +20 мВ посилює вихід Н+ з везикул ПМ. Про це свідчить зниження кількості накопиченого DрН-індикатора у везикульованій фракції ПМ на 30-й с процесу (рис. 6). Максимум виходу Н+ з везикул спостерігається при значенні мембранного потенціала, розрахованому за рівнянням Нернста, +10 мВ, що відповідає величині мембранного потенціала, при якій накопичення Са2+ у везикули досягає максимального рівня (рис. 4). З аналізу отриманих результатів можна зробити припущення про можливе посилення виходу Н+ з цитозолю ГМК матки у позаклітинне середовище під час збудження ПМ шляхом деполяризації.

На наступному етапі досліджень вивчали дію агоністів М-ХР (ацетилхоліну та карбахолу) на рівень 14С-МА в везикулах ПМ ГМК. Вплив М-холіноміметиків на транспорт Н+ крізь ПМ є мало вивчений. За умови існування протилежно спрямованих градієнтів Са2+ та Н+, напрямок яких відповідає фізіологічному, ацетилхолін посилює дисипацію градієнта Н+, починаючи з 10-8 М ацетилхоліну, причому його ефект збільшується від 10-8 М до 10-4 М (рис. 7) За умов відсутності градієнту Са2+, спрямованого у везикули, ацетилхолін, починаючи з 10-10 М достовірно посилює дисипацію штучного градієнту Н+, спрямованого з везикул у середовище розведення. В цьому варіанті досліду дія ацетилхоліну також є концентраційно-залежною і посилюється від 10-10 М до 10-4 М концентрацій агоністу (рис. 7). Інший холіноміметик карбахол (10-4 М та 10-7 М) також стимулює вихід Н+ з везикул, про що свідчить зменшення включення в них 14С-МА. Отримані дані свідчать про можливість посилення процесів взаємозв'язаного обміну Са2+ і Н+ на рівні ПМ ГМК фізіологічно-значимими кількостями М-холіноміметиків. Аналіз даних, представлених на рис. 7, дозволяє припустити, що на рівні ПМ ГМК існують механізми регуляції Н+-транспорту, незалежні від позаклітинного Са2+. Це припушення відповідає уявленню про існування Н+-канальної провідності в ПМ електрозбудливих клітин. Таким чином, хоча обмін Са2+ і Н+ на рівні ПМ ГМК взаємозв'язаний, але цей взаємозв'язок не є жорстко детермінованим.

Для з'ясування механізмів дії агоністів М-ХР використали їх відомий неспецифічний антагоніст атропін. Предінкубація везикул ПМ з атропіном достовірно знижує наступний стимулюючий ефект ацетилхоліну та карбохолу на дисипацію Н+ в присутності позавезикулярного 0,5 мМ Са2+. Отримані результати свідчать про те, що дія М-холіноміметиків на досліджуваний транспорт катіонів зв'язана з М-холінорецепторами. Виявлена в дослідженнях ефекторна дія низьких концентрацій холіноміметиків на транспортні процеси ПМ важлива при використанні цих речовин в фармацевтиці.

Таким чином, на модельній системі везикул ПМ встановлено, що стимуляція входу Са2+ зміною мембранного потенціала і активацією М-холінорецепторів супроводжується одночасним підвищенням рН внутрішньовезикулярного середовища, можливо за рахунок виходу Н+.

5. Дослідження рН-залежності зв'язування Са2+ кальмодуліном

З даних наукової літератури відомо, що підвищення рНі є стимулом для вивільнення Са2+ із саркоплазматичного ретикулума [Тугай В. А., 1993]. Як відомо, наступним етапом розвитку Са2+-сигналу в ГМК є процес зв'язування Са2+ з кальмодуліном, який тільки в комплексі з кальцієм активує внутрішньоклітинні процеси, що призводить до скорочення міоцитів [Hill J. T., 2000]. Тому з'ясування механізмів регуляції Са2+-зв'язуючої властивості кальмодуліна циклічними змінами рНі важливе для з'ясування шляхів передачі збудження на ПМ до цитозольних ефекторних систем.

Для дослідження Са2+-зв'язуючих властивостей кальмодуліна був запропонований методичний підхід з використанням 45Са2+. Метою цієї частини роботи було дослідити процес зв'язування Са2+ з кальмодуліном в залежності від величини рН в межах її значень 6,5-7,5.

Функціональну активність виділеного кальмодуліна тестували по активації фосфодіестерази та солюбілізованої і високоочищеної Са2+, Mg2+-АТРази [Курский М. Д., 1990].

Проведеними дослідженнями встановлені відмінності у зв'язуванні Са2+ з кальмодуліном і альбуміном, останній з яких не розглядається як Са2+-специфічний білок і використаний нами для порівняння. Кальмодулін зв'язує приблизно в три рази більшу кількість Са2+, ніж альбумін, причому спостерігаються різні рН-залежності цього процесу.

Зв'язування Са2+ кальмодуліном характеризується насиченням по Са2+ при рН=7,5 (рис. 8, б). Це дозволяє лінеаризувати експериментальні дані представлені на рис. 8, б (ізотерми зв'язування) в координатах Скетчарда. Концентраційна залежність зв'язування Са2+ з кальмодуліном при рН=6,5 має складний характер (рис. 8, а), який може вказувати на наявність кооперативних ефектів в процесі зв'язування і потребує використання координат Хілла для аналізу.

Встановлено, що величина умовної Кд зв'язування при рН 6,5 та 7,5 становить, відповідно, 0,38 х 10-7 М та 0,91 х 10-8 М. Ці величини узгоджуються з тими, які отримані при вивченні властивостей кальмодуліна міометрію крольчих [Курский М. Д., 1985]. Таким чином, збільшення величини рН від 6,5 до 7,5, тобто у близькому до фізіологічно-значимого діапазона рН, призводить до збільшення спорідненості Са2+ до кальмодуліну всередньому в 4,3 рази. В той же час наші розрахунки показали, що така зміна рН не впливає на кількість місць зв'язування Са2+ на кальмодуліні (0,61 нмоль Са2+/мг білку при рН= 6,5 та рН=7,5). Цей результат відповідає уявленню про існування 4 константних місць зв'язування для Са2+ у молекулі нативного кальмодуліна.

Для експериментальних даних у випадку рН 6,5 досягається спрямлення у координатах Хілла. Розраховане з використанням методу найменших квадратів значення nh дорівнює 0,55. Це значення коефіцієнта Хілла вказує на існування від'ємної кооперативності при зв'язуванні Са2+ кальмодуліном при рН 6,5. Отриманий нами результат і дані наукової літератури [Hill J. T., 2000] дозволяють зробити припущення, що при більш кислому значенні рН середовища зв'язування (рН 6,5) амінокислотні залишки Са2+-зв'язуючих центрів знаходяться у відносно більш протонованому стані, і тому дисоціація Н+ від них є лімітуючою стадією зв'язування Са2+. З іншого боку, зв'язування Са2+ з кальмодуліном супроводжується експонуванням на поверхні білка значних гідрофобних ділянок, що перешкоджає дисоціації Н+.

Отримані експериментальні результати підтверджують наше припущення про те, що в процесі надходження Са2+ в клітину при збудженні спостерігається вихід Н+ з клітини і короткочасне підвищення рНі сприяє утворенню комплекса Са2+-кальмодулін, який активує подальші реакції сигнальних систем.

Висновки

1. Результати дисертаційної роботи вказують на те, що зростання цитозольного рН клітин еукаріот при їх активації може бути обумовлено механізмом Са2+/Н+-обміну на початкових етапах розвитку Са2+-сигнала.

2. Отримано везикульовані препарати плазмалеми гладеньком'язових клітин матки, які за характеристиками зв'язування антагоніста М-холінорецептора атропіна та визначення питомої активності Na+, K+-АТРази в присутності зростаючої концентрації додецилсульфата натрія мають в більшості "правильно" орієнтовані (цитоплазматичним боком всередину) везикули і можуть бути моделлю плазмалеми in vivo.

3. Розроблений методичний підхід до визначення змін рН всередині везикул за допомогою 14С-метиламіна як DрН-індикатора.

4. Встановлено, що кількість акумульованого у везикулах Са2+ за градієнтом концентрації зростає в умовах розсіювання протилежно спрямованого градієнта Н+, пригнічується Cd2+ та ніфедипіном. Це вказує на існування у везикулах плазмалеми Са2+-провідності L-типа, яка посилюється в умовах розсіювання трансмембранного градієнту протонів.

5. Показано, що зміна штучно наведеного потенціалу на мембрані везикул від -40 до +20 мВ, тобто модельна деполяризація, викликає відповідне збільшення накопичення Са2+ у везикулах, яке призводить до підвищення рН внутрішньовезикулярного середовища.

6. Ацетилхолін та його синтетичний аналог карбахол стимулюють вхід Са2+ і зростання рН всередині везикул. Дія ацетилхоліну на транспортні процеси є концентраційно-залежною, проявляється в концентрації 1 нМ. В присутності атропіна вплив холіноміметиків на вимірювані процеси в плазмалемі значно знижуються, що свідчить на користь взаємодії цих сполук з рецепторами зовнішньої поверхні мембрани.

7. Існує Са2+-незалежна компонента переміщення Н+ крізь мембрану везикул, яка посилюється при збільшенні мембранного потенціалу та зв'язуванні агоністів М-холінорецепторів з плазматичною мембраною.

8. На основі розробленого методичного підходу до вивчення Са2+-зв'язуючих властивостей кальмодуліна з застосуванням високопоруватого хроматографічного паперу і 45Са2+ встановлено, що зміна рН середовища зв'язування від рН 6,5 до рН 7,5 призводить до збільшення спорідненості Са2+ до кальмодуліна в середньому в 4,3 рази при постійній кількості місць зв'язування.

СПИСОК РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Тугай В. А., Данилович Ю. В. Зміни транспорту Са2+ у плазматичній мембрані клітин міометрія в умовах розсіювання градієнта протонів // Укр. біохім. журн. - 2000. - Т. 72, №3. - С. 61-68.

2. Данилович Ю. В., Тугай В. А. Вплив фізіологічно значущих подразників на Са2+/Н+ - обмін плазматичної мембрани міометрія // Укр. біохім. журн. - 2001. - Т. 73, №1. - С. 48-53.

3. Данилович Ю. В., Тугай В. А. Характеристика взаємодії атропіна з плазматичними мембранами клітин міометрія // Укр. біохім. журн. - 2001. - Т. 73, №3. - С. 34-37.

4. Данилович Ю. В., Тугай В. А. Вивчення рН-залежності зв'язування Са2+ з кальмодуліном // Укр. біохім. журн. - 2001. - Т. 73, №5. - С. 14-18.

5. Данилович Ю. В., Павлова С. В., Тугай В. А. Вивчення впливу трансмембранного градієнту протона на переміщення Са2+ у препаратах везикул сарколеми міометрію // Хімічні науки і сучасність. Матеріали Всеукраїнської науково-методичної конференції. - Полтава: Освіта, 1999. - С. 10-13.

6. Данилович Ю. В. Вплив мембранного потенціалу і деяких холіноміметиків на Cа2+/Н+-обмін плазматичної мембрани міометрія. // Актуальні проблеми фундаментальної та прикладної біохімії - 2000. Укр. біохім. журн. - 2000. - Т. 72, №6. - С. 124-125.

7. Данилович Ю. В. Исследование влияния некоторых физиологических активаторов клетки на обмен кальция и протона сарколемы миометрия // 5аяПущинская конференция молодых ученых, Пущино, 16-20 апреля 2001. - С. 16-17.

Анотація

Данилович Ю. В. Властивості та роль Са2+/Н+-обміну плазмалеми міометрія. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ, 2001.

Дисертація присвячена дослідженню ролі Н+ в передачі Са2+-сигнала гладеньком'язових клітин матки.

На моделі з переважною більшістю "правильно" (цитоплазматичним боком всередину) орієнтованих везикул плазмалеми міометрія з використанням 45Са2+ та DрН-індикатора 14С-метиламіна показано, що модельна деполяризація мембрани призводить до посилення входу Са2+ у везикули та залуження внутрішньовезикулярного простору, можливо, за рахунок виходу Н+ з везикул. Аналогічний вплив на транспорт катіонів чинять агоністи М-холінорецепторів ацетилхолін та карбохол. Їх ефект обумовлений взаємодією з холінорецепторами зовнішньої поверхні везикул, він є концентраційно-залежним і проявляється, починаючи з 1 нМ. Доведено, що розсіювання трансмембранного градієнту Н+ призводить до збільшення проникності плазмалеми до Са2+, яке пригнічується Cd2+ та ніфедипіном.

З застосуванням розробленого автором методичного підходу показане збільшення спорідненості