НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ВІРУСОЛОГІЇ

ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

ФУРТАТ ІРИНА МИХАЙЛІВНА

УДК 579.871.1:234+8.097

СКЛАД ПОВЕРХНЕВИХ БІЛКІВ КЛІТИННОЇ СТІНКИ ТА

АНТИГЕННІ ВЛАСТИВОСТІ НЕПАТОГЕННИХ КОРИНЕБАКТЕРІЙ

03.00.07- мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі мікробіології та загальної імунології Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, академік НАН

України Смірнов Валерій Веніамінович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри мікробіології та загальної імунології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Захарова Ірина Яківна,

Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, науковий консультант відділу біохімії

доктор біологічних наук, професор Стародуб Микола Федорович

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

завідувач відділу біохімії сенсорних та регуляторних систем.

Провідна установа: Інститут епідеміології та інфекційних захворювань ім. Л.В. Громашевського МОЗ України, м. Київ

Захист відбудеться “ 18 “ квітня 2001 р. j 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.233.01 в Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154)

Автореферат дисертації розіслано “ 16 “ березня 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Відомо, що загальноприйнята схема диференціації представників класу Actinobacteria, до якого належить рід Corynebacterium, базується на сукупності культуральних, морфологічних, фізіологічних та хемотаксономічних ознак, а також результатах ДНК-гібридизації та рестрикційного аналізу 16S рРНК [Aubel, 1997; Stackebrandt, 1997]. За сучасними уявленнями рід Corynebacterium складається із 7 непатогенних (C. ammoniagenes, C. callunae, C. flavescens, C. glutamicum, C. terpenotabidum, C. variabilis, C. vitaeruminis) та 57 видів клінічного походження, які включають як представників нормофлори, так і види, патогенні для людини і тварин. Необхідно відмітити, що існує суттєвий розрив між сучасною класифікацією коринебактерій та практичною ідентифікацією окремих штамів чи видів цього роду. Тому, актуальною залишається розробка нових підходів для швидкої ідентифікації окремих видів коринебактерій, а також підбір об'єктивних ознак для їх диференціації, які були б доступними і добре відтворюваними при практичній діагностиці. Одними із перспективних напрямків є дослідження електрофоретичних білкових профілів коринебактерій та їх антигенних властивостей. Це обумовлено тим, що склад поверхневих білків клітинної стінки (КС) є специфічною ознакою для представників одного виду, а антигенна структура бактерiй є вiдносно стабiльною ознакою, яка визначається хiмiчним складом їх КС. Для діагностики патогенних представників роду Corynebacterium широко використовують методи імунохімічного аналізу. Вони дозволяють проводити диференціацію не тільки окремих видів і штамів, але й виявляти їх антигенні взаємозв'язки. Застосування такого аналізу для детекції непатогенних видів обмежене через недостатню вивченість антигенних властивостей вказаних бактерій. Для видової діагностики непатогенних коринебактерій ці методи раніше не використовувались. Одержання нових даних про біохімічні та антигенні властивості поверхневих білків КС непатогенних коринебактерій є важливим для вирішення цілого ряду дискутивних питань таксономії цих мікрорганізмів.

Видам Corynebacterium та спорідненим з ними бактеріям, під час росту притаманні складні процеси трансформації при переході клітин від одного морфологічного типу до іншого. Однак, відомостей про зміни складу поверхневих біополімерів бактерій залежно від стадії розвитку недостатньо. Тому дослідження, проведені у цьому напрямку, дозволять з'ясувати закономірності змін зазначених біологічних характеристик, які відбуваються в процесі росту бактерій.

Розробка швидких і надійних методів ідентифікації видів Corynebacterium актуальна і для контролю біотехнологічних виробництв, в яких як продуценти застосовують коринебактерії. Зокрема, при широкомасштабному виробництві лізину гостро стоїть проблема мікробної контамінації. Запропоновані на сьогодні методи ідентифікації сторонньої мікрофлори, в основному, бактеріологічний контроль, залишаються багатостадійними, довготривалими, трудомісткими та неспроможними до прямої реєстрації контамінуючих мікроорганізмів. Перспективним у цьому напрямку є впровадження високоспецифічних і чутливих імунохімічних методів, що потребує поглибленого вивчення антигенних властивостей коринебактерій та їх діагностично значимих антигенів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у межах науково-дослідної роботи кафедри мікробіології та загальної імунології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка за темами: "Створення тест-системи та вдосконалення існуючих методів для прискореного контролю мікробіологічних виробництв", держбюджетна тема №567; "Структурно-функціональні зв'язки і біологічна різноманітність коринеподібних і нокардіоподібних бактерій", держбюджетна тема №781; "Механізми розвитку та регуляції імунної відповіді на антигенні субстанції умовно-патогенних бактерій", держбюджетна тема 97085 (номер державної реєстрації 0197U003569).

Мета і задачі дослідження. Метою досліджень було охарактеризувати поверхневі білки клітинної стінки та антигенні властивості непатогенних коринебактерій; обгрунтувати можливість і доцільність використання електрофоретичних білкових спектрів, антигенних властивостей цілих клітин та їх поверхневих біополімерів як додаткових критеріїв для класифікації непатогенних коринебактерій.

Відповідно до поставленої мети було сформульовано такі задачі:

1. Опрацювати метод та одержати за його допомогою препарати поверхневих біополімерів КС непатогенних коринебактерій.

2. Вивчити склад поверхневих білків КС виробничих лізинсинтезуючих штамів та його зміни на різних фазах розвитку культури.

3. Провести порівняльний аналіз складу поверхневих білків КС різних видів непатогенних коринебактерій та оцінити можливість застосування електрофоретичних спектрів як додаткового критерію для їх диференціації.

4. Дослідити антигенні властивості виробничих лізинсинтезуючих штамів на різних фазах розвитку культури.

5. Провести порівняльний аналіз антигенного складу препаратів поверхневих біополімерів досліджених штамів.

6. Дати оцінку антигенних властивостей цілих клітин та їх поверхневих біополімерів як критеріїв для диференціації та ідентифікації коринебактерій.

7. На основі вивчених антигенних властивостей, розробити імунохімічний метод для швидкої ідентифікації C. glutamicum - продуцентів лізину.

Об'єктом дослідження були представники непатогенних видів роду Corynebacterium, включаючи виробничі штами – продуценти лізину.

Предметом дослідження були білкові спектри та антигенні властивості цілих клітин та поверхневих біополімерів клітинної стінки непатогенних видів Corynebacterium.

Матеріали і методи дослідження. Для виконання поставлених завдань було опрацьовано метод екстракції із інтактних клітин та одержано препарати поверхневих біополімерів КС коринебактерій, визначено вміст білків і вуглеводних сполук, досліджено амінокислотний склад препаратів виробничих лізинсинтезуючих штамів, проведено електрофоретичні дослідження поверхневих біополімерів КС при забарвленні гелів кумасі блакитним і нітратом срібла. Досліджено антигенні властивості цілих клітин коринебактерій та їх поверхневих біополімерів. У роботі застосовували одержані нами імунні сироватки, специфічні до виробничого штаму C. glutamicum 22Л та представників різних видів непатогенних коринебактерій. Дослідження проводили із використанням методів аглютинації, преципітації, імуноферментного аналізу, імунофлуоресценції та імуноелектроблотингу. Визначення коефіцієнтів подібності препаратів за спектром сумарних і основних білків, а також за складом антигенів і встановлення ступеня їх антигенної спорідненості проводили із застосуванням спеціальних комп'ютерних програм.

Наукова новизна одержаних результатів. Отримані оригінальні дані про склад поверхневих білків КС коринебактерій на різних фазах розвитку культури. Вперше показано, що зміни морфотипу клітин супроводжуються змінами складу поверхневих білків КС, а також антигенних властивостей бактерій та різною експресією їх поверхневих антигенів. Електрофоретичний спектр поверхневих білків у культур фази сповільненого росту коринебактерій є стабільною ознакою штаму і може бути використаний для їх ідентифікації. Вперше досліджено електрофоретичні спектри поверхневих білків КС представників різних видів непатогенних коринебактерій та встановлено їх видоспецифічний набір. Із застосуванням спеціальної комп'ютерної програми проведено кластерний аналіз та групування різних видів Corynebacterium і побудована дендрограма, яка відображає ступінь їх спорідненості. Показано, що електрофоретичні спектри білків є таксономічно інформативною ознакою, яка може бути успішно використана для класифікації непатогенних коринебактерій, оскільки дозволяє розрізняти види у межах роду та визначати серед них найбільш споріднені.

Одержано імунні сироватки, специфічні до представників різних видів непатогенних Corynebacterium та досліджено антигенні взаємозв'язки між ними за допомогою спеціальної комп'ютерної програми. Вперше показано, що антигенні властивості непатогенних коринебактерій співпадають з традиційними діагностичними ознаками. На основі дослідження антигенних властивостей виробничих лізинсинтезуючих штамів розроблено новий комбінований ефективний метод для швидкої ідентифікації C. glutamicum - продуцентів лізину.

Практичне значення одержаних результатів. Показано принципову можливість застосування одержаних результатів для класифікації представників роду Corynebacterium, оскільки досліджені ознаки (спектри поверхневих білків, антигенні властивості цілих клітин коринебактерій та їх поверхневих біополімерів) у поєднанні із традиційними біологічними ознаками можуть бути успішно використані при ідентифікації та диференціації коринебактерій, а також для розширення інформації про біологічні властивості Corynebacterium, зокрема видів, які включені до Української Колекції Мікроорганізмів.

На зразках, одержаних на різних стадіях технологічного процесу виробництва лізину, показана можливість застосування запропонованого комбінованого методу для раннього, швидкого та чутливого визначення сторонньої мікрофлори під час ферментацій, а також для контролю стерильності поживних середовищ і посівного матеріалу.

Опрацьовані під час виконання дисертаційної роботи методи одержання поверхневих біополімерів КС, отримання специфічного кон'югату антитіла-ФІТЦ та методика проведення імунофлуоресцентного аналізу запроваджені у наукові дослідження та учбовий процес на кафедрі мікробіології та загальної імунології Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Автором дисертаційної роботи особисто здійснено аналіз літератури, проведено біохімічні та імунохімічні дослідження, математичну обробку даних, підготовлено публікації за результатами, а також здійснено їх представлення на наукових конференціях. Аналіз результатів, їх узагальнення, інтерпретацію та формулювання основних положень і висновків проведено спільно із науковим керівником. Друковані роботи підготовлено при безпосередній участі автора спільно з науковим керівником. Частину досліджень проведено за участю співробітників кафедри мікробіології та загальної імунології Київського національного університету імені Тараса Шевченка, які є співавторами опублікованих робіт.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що викладено в дисертаційній роботі, були представлені на: Всесоюзній конференції "Достижения биотехнологии - агропромышленному комплексу” (Чернівці, 1991); І установчому (VIII) з'їзді Українського мікробіологічного товариства (Одеса, 1993); XVIII International Carbohydrate Symposium (Milan, 1996); 6-й Щорічній науковій конференції “Україна: людина, суспільство, природа” (Київ, 2000); Міжнародній конференції “Микробиология и биотехнология на рубеже ХХІ столетия” (Мінськ, 2000); Міжгалузевій конференції молодих учених - 2000 (Київ, 2000); ІІ установчому (IХ) з'їзді Українського мікробіологічного товариства (Чернігів, 2000).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 20 робіт, з яких 13 - статті у наукових журналах, 7 - матеріали конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 156 сторінках машинописного тексту і складається з розділів “Вступ”, “Огляд літератури”, “Матеріали і методи досліджень”, “Результати досліджень та їх обговорення” (включає 3 розділи власних досліджень), “Висновки”, “Список використаних джерел”, який містить 178 посилань (з яких 106 іноземних авторів). Робота містить 29 таблиць та 28 рисунків.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається із 3 підрозділів, які містять сучасну інформацію про склад поверхневих білків КС бактерій, їх біологічні функції та антигенні властивості, а також погляди на перспективність застосування цих показників як діагностичних маркерів для класифікації мікроорганізмів.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об'єктом досліджень були штами, одержані із посівної лабораторії Трипільського біохімічного заводу (ТБЗ) та Української Колекції Мікроорганізмів (УКМ) Інституту мікробіології і вірусологіі ім. Д.К. Заболотного НАН України: C. glutamicum 22Л, УКМ Ас-714, УКМ Ас-715, УКМ Ас-733, Corynebacterium sp. (Brevibacterium flavum) Е531 і ВНИИгенетика 90, C. аmmoniagenes УКМ Ас-732, C. vitaеrumіnis УКМ Ас-718, C. variabilis УКМ Ас-717 і УКМ Ас-716, Corynebacterium sp. (Brevibacterium stationis Тип) УКМ Ас-719, Brevibacterium linens УКМ Ас-728, Brevibacterium iodinum УКМ Ас-642. Бактерії вирощували на МПА або МПБ з глюкозою (1%) та дріжджовим екстрактом чи автолізатом (0,5%).

У роботі також були використані виділені та ідентифіковані нами штами родів Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Stomatococcus, а також Р. citreus, A. macrocytogenes, E. aerogenes, K. pneumoniae, P. vulgaris, P. rettgeri, E. coli, які є представниками домінуючої на ТБЗ сторонньої мікрофлори. Відібрані культури найбільше серед досліджених контамінантів впливали на розвиток виробничих лізинсинтезуючих штамів і склад ферментаційних середовищ. Бактерії виділяли із виробничих посівних та ферментаційних середовищ, їх складових, технологічної та аміачної води, пінопогашувача, культуральної рідини (КР) під час технологічного процесу, а також кінцевого продукту. Виділення чистих культур, визначення родової та видової належності контамінантів, а також вивчення морфолого-культуральних та фізіолого-біохімічних ознак проводили загальноприйнятими методами.

Поверхневі біополімери КС одержували шляхом екстракції з інтактних клітин коринебактерій. Бактерії осаджували із культурального середовища центрифугуванням при 8 тис. об/хв протягом 15 хв та тричі відмивали стерильним 0,15М розчином NaCl. Відмиті клітини ресуспендували у спеціально підібраному буфері екстракції: 1% додецилсульфату натрію (DS-Na) ("BDH", Англія) у 0,15М розчині NaCl, pH 4,5. Екстракцію проводили за постійного перемішування на магнітній мішалці протягом 2 год при кімнатній температурі. Екстракти відділяли центрифугуванням (8 тис. об/хв, 20 хв). Бактеріальні клітини після екстракції висівали на МПА для контролю життєздатності, фарбували за Грамом та проводили електронно-мікроскопічний аналіз їх цілісності.

Вміст білків у препаратах визначали методом Лоурі, вуглеводів - в реакції з антрон-сірчаною кислотою [Захарова, 1982], а амінокислотний склад препаратів - на автоматичному аналізаторі Т-339 (“Mikrotechn”, Чехословаччина).

Електрофорез (ЕФ) проводили у системі DS-Na- ПААГ за Laemmli у модифікації [Laemmli, 1970; Позур та ін., 1995] із застосуванням 14% гелів у комерцiйному апаратi для вертикального електрофорезу (“Хийу Каллур”, Естонія) при 90 В i 30 мА на гелеву пластину протягом 2,5 год при 40 С. Для вiзуалiзації електрофореграм використовували фарбування гелів кумасi блакитним R-250 ("Serva", Німеччина) та нейтральне фарбування нiтратом срiбла ("Sigma", США) [Harlow, 1988]. Для визначення молекулярних мас (ММ) застосовували набори маркерних білків LMW виробництва “Pharmacia” (Швеція) або “Bio-Rаd” (США). Для порівняння складу білків використовували значення ММ, розраховані при аналізі 3-5 гелів. Всі розрахунки проводили за спеціальною комп'ютерною програмою, за допомогою якої обчислювали коефіцієнт подібності препаратів (%), т.з."Dice Coefficient" [Vauterin, 1993].

Кролячі та мишачі імунні сироватки одержували за опрацьованими нами схемами із врахуванням ступеня імуногенності різних видів коринебактерій. Кролячі антисироватки отримували проти інтактних клітин C. glutamicum 22Л на різних фазах розвитку культури. У дослідах використовували кролів породи “Шиншилла” віком 6 міс по 3 тварини у кожній групі. Антисироватки, специфічні до клітин C. glutamicum 22Л різного віку, позначали як: анти-22Л(А) - проти 3 год культури, анти-22Л(В) - проти 12 год культури, анти-22Л(С) - проти 24 год культури, анти-22Л(D) - проти 48 год культури та анти-22Л(Е) - проти 72 год культури.

Мишачі антисироватки одержували шляхом імунізації нелінійних мишей віком 3 міс (10-15 тварин у групі) інтактними клітинами штамів C. ammoniagenes УКМ Ас-732, C. vitaeruminis УКМ Ас-718, C. variabilis УКМ Ас-717, C. glutamicum УКМ Ас-733, Corynebacterium sp. УКМ Ас-719. Ці антисироватки відповідно позначали як: анти-732, анти-718, анти-717, анти-733, анти-719. Сироватки крові одержували загальноприйнятим методом [Кетті, 1991]. Титр імунних сироваток визначали в ELISA, їх специфічність - у реакції аглютинації та ELISA.

Реакцію аглютинації проводили у 96-лункових круглодонних планшетах для імунологічних реакцій [Leinonen, 1985].

Iмуноферментний аналiз (ELISA) проводили у 96-лункових плоскодонних планшетах (“Labsystems”, Фiнляндiя) за загальноприйнятою методикою [Єгоров, 1991; Takaj, 1994]. У реакції були використані iнтактні клiтини (термолабільні АГ) та термостабiльні АГ, якi одержували шляхом кип'ятiння добових культур протягом 1 год при 1000 С, а також препарати поверхневих бiополiмерiв КС. Реакцію проводили із застосуванням конячих антитiл проти iмуноглобулiнiв кроля та миші, кон'югованих з пероксидазою хрону (“Bio-Rаd”, США). Субстратом та хромогеном були перекис водню та 1,2-фенiлендиамiндигiдрохлорид ("Sigma", США).

Показники інтенсивності ELISA (Е492), які підлягали аналізу, були середніми значеннями із 3-9 незалежних вимірювань. Для оцінки ступеня подібності антигенів застосовували комп'ютерну програму, за допомогою якої будували графіки залежності Е492 від розведень антисироваток та визначали умовно прийнятий коефіцієнт R. Цей коефіцієнт, розрахований на основі значень Е492 при взаємодії АГ із різними антисироватками, характеризував ступінь їх антигенної спорідненості з імуногеном. Значення коефіцієнта R дорівнювало “0” для гомологічної системи АГ-імунна сироватка, у випадку найбільш віддалених між собою антигенів - R=1. За цією програмою розраховували також середньоквадратичну похибку S.

Iмуноелектроблотинг (ІЕБ) проводили за методикою [Towbin, 1979] у комерцiйному апаратi для електропереносу (“Трансорб”, Росія) в різних режимах (при 75 мА протягом 2 год, 30 мА, 15 мА чи 12 мА протягом 15-18 год) при 40 С. Субстратом та хромогеном були перекис водню та 4-хлор-1-нафтол ("Sigma", США).

Одержання кон'югату з флуоресцеїну ізотіоционатом (ФІТЦ) проводили за методикою [Кетті, 1991]. Для отримання g-глобулінової фракції застосовували сироватку анти-22Л(С). Умови проведення ІФ (кількість АГ, фіксація, рН буферних розчинів, робоче розведення кон'югату, час інкубації препаратів з кон'югатом та ін.) підбирали експериментально. Для виявлення у препаратах контамінантів мазки після обробки кон'югатом додатково фарбували водним розчином акридинового оранжевого (АО). Реєстрацію флуоресценції проводили мікроскопічно: специфічну імунофлуоресценцію - за свіченням оболонки клітин штамів-продуцентів лізину, а бактерії-контамінанти - за свіченням всієї поверхні клітин. Апробацію комбінованого методу проводили на таких дослідних матеріалах: зразках КР із лабораторних ферментацій, штучно інфікованих контамінантами, виділеними із різних джерел; зразках посівного матеріалу, отриманих із виробничої посівної лабораторії ТБЗ; зразках КР, одержаних з виробничих ферментерів ТБЗ.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Електрофоретичні спектри поверхневих білків клітинної стінки як ознака для ідентифікації непатогенних коринебактерій.

На прикладі 3-х виробничих лізинсинтезуючих штамів (22Л, Е531 і ВНИИгенетика 90) нами було опрацьовано метод одержання поверхневих біополімерів КС коринебактерій екстракцією із інтактних клітин буфером, який містив 1% DS-Na. В результаті такого впливу на клітини, одержано препарати, які містили білки та вуглеводні компоненти у співвідношенні 1:0,2 - 1:33. Застосована нами екстракція не призводила до лізису клітин, що підтверджено світловою та електронною мікроскопією препаратів, а бактерії після екстракції зберігали здатність забарвлюватись за Грамом та росли на МПА.

Встановлено, що в препаратах поверхневих біополімерів КС штамів 22Л, Е531, ВНИИгенетика 90 на різних фазах розвитку культури відсутні суттєві відміни у кількості білків, тоді як вміст вуглеводних компонентів змінювався залежно від віку. Максимальну їх кількість реєстрували у препаратах 12, 24, 48 год культур. При вивченні амінокислотного складу препаратів було виявлено амінокислоти (АМК), характерні для поверхневих білків КС, зокрема тих, що формують S-шари бактерій. У препаратах переважали кислі АМК - глутамін, аланін, аспарагін, треонін, серин, гліцин і пролін. Їх вміст у середньому становив 74% (у 22Л); 71% (у Е531) і 73% (у ВНИИгенетика 90). Препарати містили 18-19% нейтральних (валін, лейцин, ізолейцин, тирозин, фенілаланін) та 7% основних (лізин, гістидин, аргінін) АМК. Кількість більшості амінокислот практично не змінювалась під час росту коринебактерій. Виключення становили глутамін і аспарагін - їх співвідношення до аланіну змінювалось по мірі старіння культури у всіх досліджених штамів в середньому від 5,7:1,8:1 в препаратах 3 год культур до 2,3:0,8:1 у 72 год культур (рис.1).

При електрофоретичному аналізі в препаратах виявляли від 30 до 80 індивідуальних біополімерів з ММ від 165,0 до 10,0 кДа. Їх кількість в препаратах залежала від віку культури або штаму, тоді як в КР після осадження бактерій вони не зареєстровані.

У виробничих штамів 22Л, Е531 і ВНИИгенетика 90 на різних фазах розвитку, поряд із значною кількістю мінорних компонентів, були зареєстровані білки з ММ 58,0; 55,0; 54,0; 52,0; 48,0; 44,0; 34,0; 33,0; 20,0-17,0 та 12,0-10,0 кДа, склад і кількість яких визначались стадією розвитку культури. Крім специфічних для окремих фаз розвитку, були ідентифіковані також штамоспецифічні білки. Слід зазначити, що незважаючи на фазові та штамові відмінності, в усіх

досліджених зразках серед основних білків були визначені такі, які постійно виявляються в препаратах з ММ: 85,0; 62,0; 39,0; 16,0 та 13,5 кДа (рис. 2).

Для встановлення подібності препаратів досліджених штамів за значною кількістю індивідуальних білків (рис.2) та одержання статистично вірогідних результатів при їх порівнянні застосовували комп'ютерний аналіз. Порівняльний аналіз проводили одночасно за двома параметрами – обчислювали коефіцієнт подібності (КП) препаратів за спектром сумарних (всі ідентифіковані в препаратах білки) та основних (максимально виражені) білків.

Аналіз електрофореграм і розрахунок КП препаратів за спектром сумарних і основних білків дозволив встановити, що у виробничих штамів на певній стадії розвитку відбувається активний синтез окремих поверхневих білків, який тісно пов'язаний з морфологічними перебудовами та фізіологічними процесами, що відбуваються в цей час у клітинах. Була виявлена певна залежність КП білкових спектрів від віку культури. Найвищими були КП препаратів, одержаних із клітин тих фаз, які безпосередньо змінюють одна одну і, навпаки, найбільшу різницю виявляли між препаратами віддалених за часом фаз. Зокрема, було показано, що білкові профілі штамів 22Л лаг-фази та Е531 логарифмічної фази практично співпадали - відповідно КП за спектром основних білків цих зразків становив 82,8%. Препарат штаму ВНИИгенетика 90 логарифмічної фази, хоча і містив значну кількість білків, за спектром основних білків дещо відрізнявся від вищезгаданих культур (із 22Л КП=68,2% та із Е531=67,4%). Максимальний рівень подібності, реєстрували для препаратів добових культур: 84,8% (22Л і Е531), 81,6% (22Л і ВНИИгенетика 90) та 78,9% (Е531 і ВНИИгенетика 90).

Таким чином, на прикладі виробничих штамів, було доведено, що препарати поверхневих біополімерів КС культур фази сповільненого росту є найбільш стабільними та інформативними і дозволяють охарактеризувати різні штами за дослідженими ознаками. Тому, для аналізу білкових спектрів представників різних видів непатогенних коринебактерій нами було застосовано той самий підхід, що й при дослідженні виробничих штамів - визначали КП препаратів за складом сумарних і основних білків.

У результаті електрофоретичних досліджень показано, що білкові профілі досліджених штамів коринебактерій, характеризувались наявністю специфічного спектру поверхневих білків, який був характерним для певного виду (рис. 3). Крім того, у всіх досліжених коринебактерій були виявлені спільні білки з ММ: 66,0; 60,0; 58,0; 55,0; 50,0; 45,0; 44,0; 42,0; 40,0; 38,0; 33,0; 30,0; 29,0; 28,0; 22,0; 21,5; 21,0; 16,0; 15,0 і 12,0-10,5 кДа. Оскільки кожний вид характеризувався специфічним спектром саме основних білків, ми вважали доцільним порівнювати їх між собою за цією ознакою.

КП препаратів за спектром основних білків відображали характеристики електрофоретичних профілів кожного із досліджених штамів і дозволили визначити ступінь однорідності за цією ознакою різних видів, виявити серед них найбільш споріднені та встановити міжвидові зв'язки у межах роду. На підставі аналізу білкових спектрів було визначено діапазон подібності: КП для штамів одного виду складав більше 60%, для близькоспоріднених видів у межах роду КП = 40-60% і для віддалених – КП < 40%. На основі КП було проведено кластерний аналіз і побудована дендрограма спорідненості різних штамів коринебактерій. За результатами аналізу спектру основних білків і ступенем їх подібності всі коринебактерії було розділено на 3 групи (рис. 4). Першу групу утворювали всі представники виду C. glutamicum. Практично ідентичними між собою за спектром основних білків були штами 22Л і Е531 (КП=86%). Незначні відмінності зафіксовано між ними і штамом ВНИИгенетика 90 (КП=79%). Серед інших штамів виду найбільшу подібність проявляли колекційні лізинсинтезуючі штами УКМ Ас-714 і УКМ Ас-715 (КП=75%). Штам C. glutamicum УКМ Ас-733 займав проміжне положення і проявляв практично однаковий ступінь подібності з лізинсинтезуючими штамами цього виду (КП у середньому складав 60%). За білковими спектрами близькоспорідненими виявились штами другої групи, які представляють різні види коринебактерій - C. ammoniagenes, C. vitaeruminis та Corynebacterium sp. УКМ Ас-719. Середній рівень подібності у межах цієї групи становив 57%. Максимально спорідненими між собою були штами C. аmmoniagenes УКМ Ас-732 і Corynebacterium sp. УКМ Ас-719 (КП=70%). Відрізнялись за спектром основних білків від інших коринебактерій штами третьої групи, які належать до виду C. variabilis. Рівень подібності між ними складав 56%, тоді як із іншими коринебактеріями – 42%. Порівняння спектрів основних білків КС коринебактерій з представниками спорідненого з ними роду Brevibacterium показало достатньо високу родову специфічність цієї ознаки для коринебактерій. Рівень подібності між дослідженими видами корине- і бревібактерій за цим показником складав 10%.

C.glutamicum E531                    

C.glutamicum 22Л                    

C.glutamicum BНИИгенетика 90                                        

С.glutamicum УКМ Ас-733                    

C.glutamicum УКМ Ас-714                    

С.glutamicum УКМ Ас-715                                        

С.ammoniagenes УКМ Ас-732                    

Сorynebacterium sp. УКМ Ас-719                    

С.vitaeruminis УКМ Ас-718                                        

С.variabilis УКМ Аc-717                    

С.variabilis УКМ Аc-716                                        

B.linens УКМ Ас-728                    

B.iodinum УКМ Ас-642                    

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Таким чином, проведені нами дослідження дають підстави стверджувати, що електрофоретичні спектри поверхневих білків КС є таксономічно значимими для представників роду Corynebacterium, у першу чергу, видів С. glutamicum і C. variabilis, які відрізняються між собою та від видів C. ammoniagenes і C. vitaeruminis. Останні два види, а також Corynebacterium sp. УКМ Ас-719 проявляли достатньо високий рівень подібності за цією ознакою, тому для їх диференціації необхідно додатково використовувати інші хемотаксономічні та серологічні ознаки. Тому, наступним етапом нашої роботи, було вивчення антигенних властивостей непатогенних коринебактерій.

2. Антигенність поверхневих біополімерів клітинної стінки непатогенних коринебактерій.

Враховуючи те, що у виробничих штамів 22Л, Е531 і ВНИИгенетика 90 було виявлено зміни у складі поверхневих білків КС, які залежали від фази росту, можна передбачити наявність такої залежності і для антигенних властивостей. За допомогою одержаних імунних сироваток (анти-22Л(А), анти-22Л(В), анти- 22Л(С), анти-22Л(D), анти-22Л(Е) в ELISA показано, що клітини досліджених штамів відрізнялись на різних фазах розвитку культури. Встановлено відмінності між культурами у фазах логарифмічного та сповільненого росту, тоді як у 3, 48 і 72 год культур їх не виявлено. Найбільш імуногенною виявилась культура штаму 22Л фази сповільненого росту, у той час, як для 3 год культур були зареєстровані найнижчі значення екстинції в ELISA з усіма дослідженими антисироватками. Зміни антигенних властивостей у культур на певних годинах росту (12-24 год культивування), тісно пов'язані із змінами складу поверхневих біополімерів КС, які відбуваються в цей час у клітинах.

За допомогою ELISA та імуноелектроблотингу встановлено, що склад індивідуальних АГ в одержаних нами препаратах у певній мірі залежав від фази розвитку. У препаратах культур наприкінці лаг-фази залежно від штаму одночасно виявляли 6 - 17 індивідуальних та 8 - 10 спільних антигенів для всіх досліджених штамів. Максимальну кількість спільних антигенів - 68 з ММ від 110,0 до 10,5 кДа було ідентифіковано в препаратах 24 год культур. Встановлено, що відміни у складі індивідуальних АГ у виробничих штамів максимально проявляються у кінці лаг-фази та на кінцевих етапах розвитку, починаючи з 48 год культивування, тоді як препарати культур фази сповільненого росту за антигенним складом є практично ідентичними. Показано також, що антисироватки, специфічні до клітин штаму 22Л на різних фазах розвитку культури, дозволили охарактеризувати індивідуальні особливості штамів, пов'язані із певною фазою росту, тоді як антисироватка проти добової культури, виявляла практично весь спектр поверхневих антигенів.

Таким чином, одержані результати про високу антигенну спорідненість штамів 22Л, Е531 і ВНИИгенетика 90 є підтвердженням того, що вони мають спільні поверхневі АГ, наявність яких в клітинній стінці пов'язана із певною фазою розвитку та, у деякій мірі, залежить від штаму бактерій. Встановлено, що, найбільш придатними для порівняння антигенних властивостей різних штамів коринебактерій є добові культури та специфічні до них імунні сироватки.

Для встановлення можливості застосування антигенних властивостей як критерію віднесення виробничих штамів до C. glutamicum ми вважали доцільним порівняти їх за цією ознакою з колекційними штамами даного виду та іншими представниками роду Corynebacterium. Порівняльний аналіз антигенних властивостей культур 22Л, Е531 та ВНИИгенетика 90 з колекційними штамами C. glutamicum (УКМ Ас-714, УКМ Ас-715, УКМ Ас-733) та іншими непатогенними коринебактеріями проводили в ELISA з використанням анти-22Л(С). Враховуючи те, що аналіз характеру розміщення декількох кривих екстинції одночасно в одній системі викликав певні труднощі та ускладнював сприйняття експериментального матеріалу, нами була проведена математична обробка результатів. За допомогою спеціальної комп'ютерної програми визначали коефіцієнт R, який характеризував ступінь антигенної спорідненості досліджених штамів. Було показано, що штами Е531 і ВНИИгенетика 90 проявляли високий ступінь антигенної подібності з іншими представниками виду C. glutamicum. Для остаточного підтвердження їх видової належності ми дослідили деякі біологічні властивості цих культур. Встановлено, що вони: грампозитивні, некислотостійкі, каталазопозитивні, нерухомі, не утворюють спори, при рості на МПА колонії блискучі, маслянисті, жовтувато-лимонного кольору, ріст рясний. Клітини добових культур паличковидні, короткі (0,7-1,0 х 2,0-4,0 мкм), розташовані під кутом, з часом вкорочуються до коковидних. Факультативні анаероби. Досліджені фенотипічні властивості цих штамів були співставлені нами з характеристиками типового штаму C. glutamicum АТСС 13032 [Abe et al., 1967] та інших штамів цього виду [Liebl et al., 1991]. Вивчення хемотаксономічних ознак штамів Е531 і ВНИИгенетика 90 показало, що діагностичною амінокислотою їх КС є діамінопімелінова кислота. До складу ПГ входять аланін, глутамінова кислота і мезо-ДАПК у молярному співвідношенні 2:1:1, що відповідає типу ПГ - А1g [Schleifer & Kandler, 1972]. Основними клітинними моносахаридами є галактоза і арабіноза (ІV хемотип КС). Метанолізати цілих клітин вказаних штамів містять коринеміколові кислоти. Таким чином, за морфолого-культуральними, фізіологічними і хемотаксономічними властивостями штами Е531 та ВНИИгенетика 90 відповідають характеристиці Corynebacterium glutamicum і повинні бути віднесені до цього виду. Одержані нами результати вивчення складу поверхневих білків та антигенних властивостей вказаних штамів підтверджують правильність такої класифікації та доводять, що вони можуть бути використані у комплексі ознак, необхідних для діагностики коринебактерій. Водночас, застосування нами антисироватки, специфічної до C. glutamicum 22Л, не дозволило зробити остаточні висновки про розподіл на серологічні групи різних штамів коринебактерій. Насамперед, це пов'язано із біологічними характеристиками штаму (виробничий ауксотрофний мутант), до якого була одержана ця сироватка.

Тому, необхідно було провести подальше дослідження антигенних властивостей коринебактерій за допомогою розширеного набору антисироваток, одержаних нами до представників різних видів непатогенних Corynebacterium. Показано, що реалізації можливостей імунохімічного аналізу для серодіагностики непатогенних коринебактерій перешкоджає не тільки недостатнє вивчення антигенних властивостей даної групи бактерій, але й проблема одержання високоспецифічних імунних сироваток. Встановлено, що ступінь імуногенності досліджених культур суттєво відрізнявся залежно від виду, що обумовлено особливостями складу їх поверхневих АГ, у зв'язку з чим не може існувати єдиної раціональної схеми одержання високоактивних антисироваток, специфічних до різних видів непатогенних коринебактерій.

За допомою одержаних імунних сироваток (анти-717, анти-718, анти-719, анти-732, анти-733) в ELISA з подальшим розрахунком коефіцієнта R було досліджено антигенні зв'язки між штамами C. glutamicum та іншими видами коринебактерій та побудовано гістограми, які відображали ступінь їх спорідненості. Показано, що представники роду Corynebacterium характеризувались наявністю спільних АГ, але відрізнялись між собою за ступенем антигенної спорідненості. Штами видів C. glutamicum і C. variabilis утворювали серологічно відокремлені групи (рис. 5). Значно відрізнялись між собою за антигенними властивостями C. ammoniagenes, C. vitaeruminis та Corynebacterium sp. УКМ Ас-719. Набільш серологічно віддаленими були види C. variabilis, C. ammoniagenes і C. glutamicum. Розподіл коринебактерій на групи за ступенем антигенної спорідненості залежно від специфічності застосованих імунних сироваток свідчив про те, що вони взаємодіяли з різними поверхневими антигенами досліджених штамів.

Рис.5. Спорідненість досліджених штамів коринебактерій при взаємодії з імунною сироваткою, специфічною до C. glutamicum УКМ Ас-733.

У зв'язку з цим, було досліджено антигенні властивості препаратів поверхневих біополімерів КС. Їх характеризували одночасно за трьома параметрами: визначали коефіцієнт антигенної подібності (R) сумарних препаратів за результатами ELISA, проводили порівняльний аналіз складу індивідульних антигенів методом ІЕБ та обчислювали КП препаратів за складом антигенів. Показано, що коринебактерії за антигенним складом відрізняються між собою. Серед досліджених штамів у межах роду можна виділити відокремлені види чи групи видів із різним ступенем однорідності, а також простежити їх взаємозв'язки. Представники C. glutamicum і C. variabilis утворювали однорідні за антигенним складом групи із максимальим ступенем внутрішньовидової подібності. C. ammoniagenes УКМ Ас-732 займав ізольоване положення і за антигенними властивостями найбільш віддалений від інших коринебактерій. Проміжне положення між C. ammoniagenes, C. vitaeruminis, C. variabilis і C. glutamicum по мірі віддалення видів один від одного займав Corynebacterium sp. УКМ Ас-719. Одержані результати дають підстави стверджувати, що він є представником самостійного виду роду Corynebacterium.

Проведені дослідження показали, що групування штамів коринебактерій за електрофоретичними спектрами співпадало з їх розмежуванням за антигенним складом. Таким чином було доведено, що антигенні властивості досліджених штамів у поєднанні з електрофоретичними спектрами поверхневих білків є таксономічно інформативними ознаками і можуть бути ефективно використані для видової та родової діагностики коринебактерій та їх диференціації. Можливість такої диференціації коринебактерій від інших мікроорганізмів у складних сумішах було доведено нами із застосуванням методів прямої імунофлуоресценції і люмінесцентної мікроскопії.

3. Створення експрес-методів контролю у виробництві лізину на основі антигенних властивостей коринебактерій.

У результаті проведених нами досліджень встановлено, що процес виробництва лізину на ТБЗ (з використанням штамів-продуцентів C. glutamicum) супроводжується значною контамінацією, склад якої дуже різноманітний. На різних етапах виробництва лізину як контамінанти найбільш поширені мікрококи (42%), стафілококи (31%) та стрептококи (17%). У КР переважали спороутворюючі бактерії, зокрема B. cereus (36,4%), крім того зустрічаються представники родів Azomonas (16%), Stomatococcus (6,5%) і Planococcus (3,2%). Вивчення деяких біологічних властивостей контамінантів (зокрема, здатність утилізувати амінокислоти, антагоністичні властивості та ін.) показало, що вони не є індеферентною мікрофлорою і суттєво впливають на біосинтез лізину. У зв'язку з цим, першочерговим є своєчасне виявлення контамінантів у процесі ферментації, що пов'язано із необхідністю розробки експрес-методів для їх ідентифікації. При такому різноманітті сторонньої мікрофлори абсолютно неефективним є застосування антисироваток, специфічних до бактерій-контамінантів. Тому, для розробки імунохімічних методів контролю стерильності біореакторів більш раціональним та надійним на наш погляд було застосування антисироваток, специфічних до штамів - продуцентів лізину.

Таким чином, вивчення антигенних властивостей виробничих штамів (22Л, Е531 і ВНИИгенетика 90) та наявність специфічної антисироватки (анти-22Л) стали основою для створення високочутливого методу для диференціації клітин продуцентів лізину від бактерій-контамінантів, незалежно від родової чи видової належності останніх.

Для контролю мікробіологічного стану виробництва лізину нами було розроблено ефективний комбінований метод, який базується на люмінесцентній мікроскопії (ЛМ) та імунофлуоресценції (ІФ). Люмінесцентна мікроскопія із застосуванням акридинового оранжевого дозволила диференціювати життєздатні бактерії від мертвих клітин-контамінантів. При аналізі 147 зразків (ферментаційні середовища, їх інгредієнти та зразки із виробничих ферментерів до інокуляції продуцентом) було визначено закономірний зв'язок між кількістю клітин у досліджених матеріалах, що виявляли при ЛМ, та проявом їх життєздатності, про яку свідчили дані культурального методу. Встановлено критерій придатності поживних середовищ для їх застосування у виробництві: якщо кількість клітин, забарвлених у зелений колір, у зразках становила 0-0,6 (у середньому із 20 полей зору), то такі середовища можна було вважати стерильними, незалежно від кількості клітин, забарвлених у червоний або оранжевий колір.

Опрацювання комбінованого методу проводили на зразках із штучно інфікованих лабораторних ферментацій. Їх аналізували запропонованим методом та проводили бактеріологічний контроль із висівом на селективні середовища, спеціально підібрані нами для виявлення бактерій-контамінантів, на яких пригнічується ріст C. glutamicum. Показано, що контамінацію можна реєструвати вже з 3 год культивування, тоді як традиційним бактеріологічним контролем - лише через 24 год. Оскільки, час аналізу запропонованим нами методом у лабораторних умовах становив 1,5-2