Інститут патології хребта і суглобів

імені професора М.І.Ситенка АМН України

ФАРХАН Махмуд Махмуд

УДК616.71-089.84:615.464.03:666.232

ЗАСТОСУВАННЯ ГІДРОКСИЛАПАТИТНОЇ КЕРАМІКИ, ЗБАГАЧЕНОЇ ІОНАМИ СРІБЛА, ДЛЯ ПЛАСТИКИ КІСТКОВИХ ПОРОЖНИН

(експериментально-клінічне дослідження)

14.01.21 - травматологія та ортопедія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Харків 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті патології хребта та суглобів

імені професора М.І. Ситенка АМН України

Науковий керівник: доктор медичних наук

Філіпенко Володимир Акимович

Інститут патології хребта та суглобів

імені професора М.І. Ситенка

АМН України,

завідуючий відділом патології

суглобів

Офіційні опоненти:

Провідна організація:

Захист відбудеться 28.09.2001 р. об 11-30 на засіданні спеціалізованної вченої ради Д.64.607.01 Інституту патології хребта та суглобів імені професора М.І. Ситенка АМН України (61024, м. Харків, вул.Пушкінська ,80).

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту патології хребта та суглобів імені професора М.І. Ситенка АМН України (61024, м. Харків, вул.Пушкінська ,80).

Автореферат розісланий 31.07.2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук Радченко В.О

Актуальність проблеми. Запальні ускладнення кісток при проведенні великих оперативних втручань реконструктивно-відновлювального характеру та при лікуванні закритих і відкритих переломів довгих кісток складають від 5 до 70,9% (Вернігора І.П., 1995, Чверкалюк А.К., 1998). Велике практичне значення цього питання пов'язане з тим, що у більшості випадків післятравматичним остеомієлітом страждають пацієнти у молодому працездатному віці. Незважаючи на наявні досягнення у консервативному і хірургічному лікуванні цієї категорії хворих, відсоток інвалідності залишається високим (Житницкий Р.Е., 1988, Пожарський В.Ф., 1989; Агаджанян В.В.,1998, Yamakawa T.,1998).

У останні роки накопичено значний досвід по застосуванню кістково-пластичних відновлювальних операцій для ліквідації кісткових дефектів різного генезу. Поширеним методом заміщення остеомієлітичних порожнин як у нашій країні, так і за рубежем є кісткова ауто- і алопластика (Крисюк А.П., 1985; Айвазян В.П., 1986; Панченко М.К., 1990; Hamer A.,1996, Delloye Ch.,1997). Проте використання аутотрансплантатів обмежується тим, що даний вид пластики збільшує тривалість часу оперативного втручання, поєднується з нанесенням додаткової травми хворому, неможливістю одержання значної за обсягом кількості матеріалу, ризиком втрати крови і можливістю інфікування донорської ділянки. Застосування алогенного матеріалу обмежується такими небажаними чинниками як можливість передачі гепатиту В і С, вірусу імунодефіциту людини, оскільки джерелом зараження є не тільки кров, але і кісткова тканина (Buck B., 1990, Shinto Y., 1992). Значною віхою у лікуванні гнійно-некротических ускладнень кісток явилося використання прожареної (180о С) ксеногенної або алогенної губчатої кісткової тканини, демінералізованого кісткового матриксу (Чверкалюк, 1998; Walsh W.,1995).

У технології лікування післятравматичних та післяопераційних запальних ускладнень кісток важливим є не тільки задача ліквідації порожнини, але й пошук імплантаційних матеріалів, які б сприяли оптимізації остеорепарації, були б стійкими до раневої інфекції та пригнічували запальний процес. Удосконалення способів застосування природних і штучних імплантаційних матеріалів, розвивається по шляху створення нових біоімплантатів, а також методів їх збагачення різними біологічно-активними речовинами - регуляторами остеогенезу, фармакологічними препаратами, у тому числі й антибіотиками, спроможними впливати як на грам-позитивну, так і на анаэробну мікрофлору.

Теперішнього часу у кістковій пластиці у якості штучних носіїв антибактеріальных препаратів використовується кістковий цемент (Li P., 1996, Langlais F., 1998), біорезорбуючі імплантати (Єнакієв І.П., 1996), а також кальційфосфатні кераміки, які приваблюють дослідників тим, що при їх імплантації досягається подвійний ефект - стимулюється індукція репаративного остеогенезу, спостерігається активне формування кісткової тканини у зоні імплантації й одночасно пригнічується інфекція у осередку запалення (Korkusur F., 1993, Hench L.,1998). У цьому плані перспективними представляються розробки, пов'язані зі створенням біоактивних керамік, у структуру яких введені іони, що надають їй нові властивості: фтор - тривкість, срібло - бактерицидність (Дубок В.А., 1998).

Про бактерицидні властивості срібла відомо давно. У медицині широко застосовуються бактерицидні препарати на основі срібла - протаргол, коларгол і ін. (Стожовская В.П.,1992, Машковский М.Д.,1997, Палий А.К., 1992). Використання імплантаційного матеріалу, який біодеградує та має бактерицидні властивості, відкриває нові можливості у лікуванні інфікованих кісткових порожнин. Теперішнього часу в Україні створена кераміка (“КЕРГАП”) на основі гідроксилапатиту (ГАП) з рівномірним і градієнтним розташуванням срібла у структурі гідроксилапатиту (Дубок В.В., 2000). Проте не вивчено вплив срібла, введеного у структуру кераміки на її остеокондуктивні властивості, на перебудову оточуючої таку кераміку кісткової тканини. Немає даних про те, чи має кераміка, збагачена сріблом, бактерицидні якості і від чого залежить їх вираженість.

Отже, проведення досліджень, спрямованих на створення і вивчення імплантаційних матеріалів із максимально зниженими антигенними властивостями, стійкими до впливу гнійної інфекції, таких що мають близьку до кісткової тканини структуру і склад, які б поєднували у собі остеокондуктивні та антибактеріальні властивості є актуальним завданням сучасної ортопедії.

Зв язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом науково-дослідних робіт Інституту патології хребта та суглобів ім. проф. М.І. Ситенка АМН України (шифр ОК.99.2, держ.реєстрація № 0199U003414. Автором особисто проведені клінічні та рентгенологічні обстеження 15 хворих; автор приймав участь у оперативному лікуванні цих хворих з використанням гідроксилапатитної кераміки для пластики кісткових порожнин; представляв результати розробок на наукових конференціях; шифр ЦФ 2001.5 АМНУ, держ.реєстрація № 0101U000650. Автором здійснена постановка експериментів на тваринах, вилучення матеріалу та його аналіз, морфометричні дослідження, обробка даних згідно з планом дисертаційної роботи, узагальнення результатів, формування висновків).

Мета роботи - експериментально обгрунтувати клінічне застосування гідроксилапатиту, збагаченого іонами срібла, для пластики кісткових порожнин при оперативному лікуванні запальних захворювань кісток та для профілактики інфекційних ускладнень.

Задачі дослідження:

1. Визначити стан і тенденції розвитку науки по проблемі лікування інфікованих кісткових порожнин з використанням імплантаційних матеріалів з антибактеріальними властивостями.

2. Вивчити в умовах in vitro бактерицидну дію гідроксилапатитної кераміки, збагаченої іонами срібла (у концентрації 0,5; 1,0 та 2,0 ваг%) на P. aeruginosa, St. aureus, E. cоli, як найбільш розповсюджені при гнійних процесах кісток штами мікроорганізмів.

3. Оцінити in vitro (у культурі мезенхімальних клітин високого ступеня щільності і кісткового мозку) цитотоксичні властивості і біологічну сумісність гідроксилапатитної кераміки, збагаченої іонами срібла (у концентрації 2,0 ваг%).

4. У експерименті на тваринах дослідити вплив гідроксилапатитної кераміки, збагаченої іонами срібла (1,0 ваг%), на репаративний остеогенез, в умовах пластики кісткових дефектів.

5. Вивчити особливості репаративного остеогенезу інфікованої St. aureus кісткової рани в експерименті на тваринах (кролики) при пластиці дефектів гідроксилапатитом, збагаченим іонами срібла (у концентрації 1,0 ваг%).

6. Визначити склад мікроелементів кісткової тканини після імплантації гідроксилапатитної кераміки, збагаченої іонами срібла (2,0 ваг%).

8. Провести апробацію у клініці дослідженої в експерименті на тваринах гідроксилапатитної кераміки, збагаченої іонами срібла, при пластиці неінфікованих та інфікованих кісткових порожнин різного генезу. Узагальнити результати і дати рекомендації для її клінічного використання.

Об'єкт дослідження - регенерація кісткової тканини при пластиці кісткових порожнин гідроксилапатитом, збагаченим сріблом

Предмет дослідження - біосумісність, цитотоксичність і бактерицидні властивості гідроксилапатиту, збагаченого сріблом; остеорепаративный процес в умовах пластики неінфікованих та інфікованих St. aureus кісткових порожнин тварин керамікою зі сріблом, перебудова кісткової тканини поблизу імплантату, клініко-рентгенологічні зміни у хворих після пластики кісткових порожнин гідроксилапатитом, збагаченим сріблом.

Методи дослідження: культура клітин- для вивчення біосумісності та цитотоксичних властивостей гідроксилапатиту; бактеріологічніий - для аналізу бактерицидних якостей кераміки; морфологічний з морфометрією площин новоутворених тканин навколо гранул кераміки - для порівняльної характеристики перебігу остеорепаративного процесу при пластиці гідроксилапатитом, збагаченим сріблом, неінфікованих та інфікованих кісткових порожнин; клінічні та рентгенологічні- для обстеження хворих; а також статистичні - для підтвердження вірогідності одержаних даних.

Наукова новизна. Вперше експериментально-теоретично обгрунтувана можливість застосування збагаченої іонами срібла гідроксилапатитної кераміки у пластиці інфікованих кісткових порожнин.

Вперше в експерименті in vitrо та in vivo доведені бактерицидні властивості гідроксилапатиної кераміки, збагаченої сріблом з концентрацією 0,5; 1,0 та 2,0ваг% при дії на мікроорганізми - St. aureus, E. coli, Ps. aerogunous. Встановлено, що вираженість бактерицидних властивостей гідроксилапатиту, збагаченого сріблом, залежить від концентрації срібла у кераміці, типу його розташування у структурі керамічного матеріалу (рівномірне та градієнтне), типу мікроорганізмів та структури використаного керамічного матеріалу (порошок, гранули, щільні зразки).

Вперше на експериментальному матеріалі клітинних культур кісткового мозку і скелетогенної мезенхіми при культивуванні з гранулами гідроксилапатиту, збагаченого сріблом, доведено, що введення іонів у структуру гідроксилапатиту не впливає на його біосумісність. Гідроксилапатитна кераміка, збагачена сріблом не проявляє цитотоксичних якостей. Клітини кісткового мозку і скелетогенної мезенхіми ділилися і диференціювалися при наявності гідроксилапатиту, збагаченого сріблом. Проте у разі градієнтного розподілу срібла у кераміці в кінцевому періоді культивування мезенхімальних клітин відзначається тенденція до збільшення кількості загиблих клітин.

Вперше при експериментальному вивченні процесу репаративного остеогенезу кісткової рани на тваринах встановлено, що введене у структуру гідроксилапатиту срібло не змінює спрямованості перебігу остеорепаративного процесу - між гранулами гідроксилапатитної кераміки, збагаченої сріблом, формується кісткова тканина, що розташовується не тільки навколо гранул, але й глибоко проникає у її пори, щільно контактуючи з матеріалом кераміки. При рівномірному розташуванні срібла в структурі кераміки стадійно-часові характеристики репаративного остеогенезу не відрізняються від таких при використанні звичайного гідроксилапатиту. Збільшення срібла на поверхні гранул кераміки, що відзначається при його градієнтному розподілі у структурі, супроводжується уповільненням формування кісткового регенерату у ранні терміни репаративного процесу.

На основі морфологічного дослідження стану інфікованої (St. aureus) кісткової порожнини при пластиці гідроксилапатитною керамікою, збагаченою сріблом, у експерименті на кроликах вперше доведена ефективність бактерицидної дії такої форми гідроксилапатиту. Вже в ранньому періоді репаративного процесу навколо гранул гідроксилапатиту зі сріблом відмічалися ділянки загибелі мікроорганізмів і формування навколо керамічних гранул новоутвореної кісткової тканини.

Доведено, що темпи формування кісткового регенерату у інфікованій St. aureus кістковій порожнині при пластиці гідроксилапатитною керамікою, збагаченою сріблом, були значно швидшими, ніж при використанні чистого гідроксилапатиту, що підтверджувалося у одні й ті ж терміни спостереження (90 та 180 доба) більшими у 3,46 та 2,85 рази показниками площі новоутвореної кісткової тканини навколо гранул кераміки зі сріблом.

На основі даних бактеріологічного (in vitro) дослідження, морофологічного аналізу остеорепаративного процесу та стану інфікованої кісткової порожнини у тварин при пластиці гідроксилапатитом, збагаченим сріблом, обгрунтована можливість застосування такої форми кераміки при лікуванні запальних ускладнень кісткок у людини, що є істотним внеском у вирішення проблеми лікування важких запальних захворювань кісток.

Практична значимість роботи. Запропоновано новий метод пластики кісткових порожнин у пацієнтів з запальним захворюванням кісток та з високим ризиком виникнення інфекційних ускладнень з використанням збагаченої іонами срібла гідроксилапатитної кераміки, що дозволило підвищити ефективність лікування.

Результати клінічних та експериментальних розробок дисертаційного дослідження впроваджені у клінічну практику Інституту патології хребта та суглобів ім. проф. М.І. Ситенка АМН України, Харківської обласної травматологічної лікарні, кафедри ортопедії, травматології та камбустіології Харківської акадамії післядиполомної освіти, кафедри ортопедії, травмвтології та ХЕС Одеського державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто проведені клінічні та рентгенологічні обстеження 15 хворих, він приймав участь у проведенні оперативних втручань вказаних хворих. Особисто дисертантом прооперовано 168 тварин (щури та кролики). Автор брав участь (разом з к.б.н. Малишкіною С.В.) у вивченні цитотоксичних властивостей і біосумісності імплантатів із гідроксилапатиту. Здобувач приймав участь у проведенні морфологічних та бактеріологічних досліджень (були виконані разом із д.б.н. Дєдух Н.В., наук. співр. Шевцовым Б.М та Атаманенко О.М.), автором виконані узагальнення та трактовка одержаних даних. Їм проведена статистична обробка цифрових показників по експериментальним дослідженням, підготовка до друку наукових статей .

Апробація результатів дисертації. Результати роботи повідомлені на Пленумі Української асоціації ортопедів-травматологів із міжнародною участю (Дніпропетровськ, 2000), на Республіканському науково-практичному семінарі “Стан надання спеціалізованої допомоги хворим остеомієлітом. Систематизація методів лікування і реабілітації на рівні обласних центрів” (Херсон, 2000.); на науково-практичній конференції молодих учених-медиків Харківської медичної академії післядипломного навчання “Нові технології в медицині” (Харків, 2000), науковій конференції, присвяченій 80-річчю кафедри ортопедії, травматології та ХЕС Одеського державного медичного університету (Одеса, 2001).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 наукових робіт, 4 з яких- у провідних наукових фахових виданнях.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається із вступу, 8 розділів, висновків, списку використаної літератури, додатків. Робота викладена на 181 сторінці машинописного тексту, ілюстрована 59 малюнками, 12 таблицями. Список використаної літератури включає 238 джерел, з них 155 іноземних.

ЗМІСТ РОБОТИ

Для досліджень використовували порошок, гранули (розміром 0,3-0,6 мм) та щільні зразки гідроксилапатитної (ГАП) кераміки, збагаченої сріблом, із рівномірним ( де іони срібла рівномірно розташовувалися у кристалічній решітці кераміки, заміщуючи іони кальцію з утворенням фази трикальційфосфату) і градієнтним розташуванням у структурі (іони срібла градієнтно розподілялися по перерізу часточок кераміки з максимальною концентрацією на їх поверхні та мінімальною всередині). Концентрація срібла у кераміці склала 0,5; 1,0 і 2,0 ваг%.

Експериментальні дослідження in vitro у культурі клітин кісткового мозку і клітин скелетогенної мезенхіми високого ступеня щільності були спрямовані на вивчення його цитотоксичності та біосумісності ГАП, збагаченого сріблом.

Для одержання клітин кісткового мозку у 3-х місячних щурів вилучали стегнові кістки і живильним середовищем 199 вимивали кістковий мозок. Для суспензіонної культури вводили 1,5х106 клітин у 1 мл середовища 199, що містить 10% телячої сироватки та антибіотики (Адамс Р., 1983). У пеніцилінових флакончиках з 2-ма мл середовища і клітинами кісткового мозку розташовували (20 мг) 4-6 гранул ГАП, збагаченого сріблом і культивували при 37°С протягом 1, 2 і 3 діб без зміни живильного середовища.

Клітини скелетогенної мезенхіми були отримані з зачатків кінцівок ембріонів щурів 13-15 доби розвитку. Суспензію клітин у вигляді капель, із розрахунку 2х106 клітин у 1 мл середовища, розміщували на поверхні покривного скельця (5 капель на площу 0,25 см2) поруч з гранулами ГАП. Культивування проводили у живильному середовищі 199 (Flow labs, USA) із додаванням 10 % телячої сироватки (Human, Hungery) і аскорбінової кислоти (50мкг/мл) при 37°С, 95% вологості і 5% CO2 (Hadhazy R.,1983). Кінцевий термін культивування мезенхімальних клітин - 5 діб.

Контролем правили культури клітин кісткового мозку та скелетогенної мезенхіми без кераміки (контроль 1) і культури з гранулами звичайного ГАП ( контроль

По закінченню терміна культивування підраховували кількість клітин у камері Горяєва, а також визначали число загиблих клітин при фарбуванні з трипановим синім. Після виконання зазначених процедур із суспензії клітин виготовляли мазки, які сушили на повітрі та фарбували азур-еозином для аналізу структурної організації клітин. У культурі клітин кісткового мозку додатково підраховували кількість мітозів у промилях. Для визначення наявності та ефективності бактерицидної дії ГАП, збагаченого сріблом із градієнтним і рівномірним розташуванням іонів срібла, був проведений бактеріологічний аналіз з використанням найбільш поширених при інфекційних ускладненнях кісток штамів мікроорганізмів -St. aureus, Ps. aeruginosa та еталонній культурі E. coli АТСС 25922. Культури засівали в чашки Петрі на мясопептонний агар, де у лунках розміщували по 20 мг керамічного матеріалу (порошок, гранули та таблетки (висота -2 мм, діаметр - 4 мм)., зрошеного стерильним фізіологічним розчином. Культури інкубували при 37о С у термостаті протягом доби і вимірювали зони затримки росту мікрофлори навколо зразків кераміки. Контролем правили зразки гідроксилапатиту без срібла.

Вивчення впливу срібла, введеного в структуру гідроксилапатиту, на остеорепаративний процес чистої (неінфікованої) кісткової порожнини досліджували на 116 білих лабораторних щурах лінії Вистар популяції Інституту патології хребта та суглобів 6-місячного віку, а інфікованої St. aureus - на 52 кроликах породи Шиншила (живою масою 1,8±0,2 кг).

Кістковий дефект (порожнина) в області дистального метаепіфізу стегнової кістки моделювали під загальним тіопенталовим наркозом з зовнішньої сторони суглоба зубним бором (діаметр 1,5 мм - для щурів і 4 мм - для кроликів) на глибину 3 і 6 мм (відповідно - щури і кролики) і імплантували у нього гранули гідроксилапатитної кераміки.

Для дослідження ефективності бактерицидної дії гідроксилапатитної кераміки, збагаченї сріблом, in vivo було проведено моделювання запального процесу у кістці при внесенні St. aureus. (1х10 6 м.т. у 1 мл) у порожнину стегнової кістки кроликів, безпосередньо після її моделювання.

Контролем правили тварини (група щурів з чистою кістковою порожниною та група кроликів з інфікованою порожниною), яким імплантували гранули чистого (без срібла) гідроксилапатиту.

Тварини були виведені з експерименту через 7, 21, 30, 90 та 180 діб шляхом передозування ефіру (щури) і введенням повітря у вушну вену (кролики), дотримуючись правил “Європейської конвенції захисту хребцевих тварин, що використовуються у експериментальних і інших наукових цілях”.

Проведено 6 серій експерименту:

1 серія (1-й контроль) - чистий дефект у кістці з імплантацією чистого гідроксилапатиту -28 щурів.

2 серія - чистий дефект у кістці з імплантацією гідроксилапатиту, збагаченого сріблом із рівномірним розподілом - 44 щурів.

3 серія - чистий дефект у кістці з імплантацією гідроксилапатиту, збагаченого сріблом із градієнтним розподілом - 44 щура.

4 серія - дефект у кістці, інфікування кісткової порожнини (St. aureus) - 12 кроликів.

5 серія (2-й контроль) - дефект у кістці, інфікування кісткової порожнини (St. aureus) та імплантація чистого гідроксилапатиту - 20 кроликів.

6 серія - дефект у кістці, інфікування кісткової порожнини (St. aureus) та імплантація гідроксилапатиту, збагаченого сріблом із рівномірним розподілом - 20 кроликів.

Стан оточуючих кісткову порожнину тканин і сформованого у дефекті регенерату вивчали з використанням методів морфологічного аналізу. Для цього фрагменти стегнових кісток з дефектом виділяли і фіксували в 10%-ному нейтральному розчині формаліну, декальцинували у 5% розчині мурашиної кислоти, обезводнювали в спиртах зростаючої міцності і заливали у целоідин (Саркісов Д.,1996). Готували гістологічні зрізи товщиною 7-9 мкм, які забарвлювали гематоксилін-еозином. У роботі застосовували морфометричний метод для визначення площин новоутворених тканин між гранулами кераміки по термінам дослідження. Морфометричні дослідження виконували за методом Автанділова Г.Г. (1990) із планіметричною окулярною сіткою під мікроскопом МБС-10 при збільшенні 28. Аналізували центральні зрізи дефекту. У полі зору мікроскопа підраховували число крапок (перетин сторін квадратів), що випадали на структуру об'єкта, який вивчали (грануляційна, фіброретикулярна та кісткова тканини). Отримане число (умовні одиниці) і визначало територію, що займав об'єкт. У кожному окремому випадку аналізували 3 зрізи.

Дослідження мікроелементів (ванадію -V, кремнію -Si, алюмінію- Al, титану -Ti, марганцю -Mn, заліза- Fe, стронцію- Sr, міді- Cu, цинку- Zn, свинцю- Pb і срібла- Ag (у мг/кг повітряно-сухої маси) кісткової тканини було проведено методом емісійного спектрального аналізу (спектрограф СТЭ-1). Фрагменти кісток (з ретельно видаленою керамікою) висушували до постійної ваги при температурі 105о С у сухожаровій шафі, розтирали у ступці у порошок і аналізували (Слуцький Л.І., 1969, Лапчинська К.В., 1998).

Гідроксилапатитна кеарміка, збагачена сріблом, у вигляді порошку і гранул (2-4 мм із 1,0 ваг%) та щільних зразків було імплантовано у кісткові порожнини 15 хворим, які прооперовані у клініках інституту. Хворі були розподілені на дві групи. Першу групу склали 5 пацієнтів з хронічними захворюваннями кісток. У другій групі було 10 пацієнтів, у яких визначалася висока ступінь ризику виникнення запальних післяопераційних ускладнень та інфікування кісткової порожнини. У цій групі гідроксилапатит, збагачений сріблом, використано з профілактичною ціллю. Локалізація кісткових порожнин була різною - суглоби, хребет, ступні та інш. Всі пацієнти обстежені клінічними та рентгенологічними методами. Термін спостереження до десяти місяців.

Всі використані виміри і параметри були приведені у відповідність до міжнародної системи одниниць, а отримані цифрові дані опрацьовували методами варіаційної статистики з використанням прикладного пакету STATISTICA 5.11 for Windows.

Результати досліджень. Проведене in vitro у культурі клітин кісткового мозку та мезенхімальних клітин вивчення біосумісності та цитотоксичних властивостей гідроксилапатиної кераміки, збагаченої іонами срібла (концентрація 2,0 ваг%) із рівномірним та градієнтним розподілом срібла, показало, що обидва види кераміки не проявляють цитотоксичних якостей. Ріст клітин кісткового мозку і скелетогенної мезенхіми при культивуванні з гранулами гідроксилапатиту, без срібла і збагаченого його іонами, характеризувався, у цілому, такими ж особливостями, як і ріст клітин у контрольній серії- без кераміки. Не було виявлено порушень проліферативної активності, росту культвованих клітин та їх структурної організації. Клітини скелетогенної мезенхіми диференціювалися у хондроцити. Протягом термінів культивування мезенхімальні клітини та кісткового мозку розташовувалися поблизу та безпосередньо на гранулах кераміки. Лише при використанні гідроксилапатитної кераміки з градієнтним розташуванням срібла встановлена тенденція до збільшення кількості загиблих мезенхімальних клітин у кінцевий термін культвування (5 діб). Перебіг проліферативних процесів і диференціровка клітин поблизу гідроксилапатиту, збагаченого сріблом, свідчить про нетоксичність та біологічну сумісність цього виду кераміки.

Результати бактеріологічного дослідження показали, що гідроксилапатитна кераміки, збагачена сріблом у концентрації 0,5; 1,0 та 2,0ваг% пригнічує ріст St. aureus, Ps. aeruginosa і E. coli з максимально вираженим ефектом дії на E. Сoli. Зі збільшенням концентрації срібла у кераміці розширялися діаметри зон затримки росту мікроорганізмів, що вказувало на залежність бактерицидної дії від концентрації срібла. Так, розміри зон затримки росту St. aureus, Ps. aeruginosa і E. coli E. Сoli при використанні гідроксилапатитної кераміки зі сріблом у концентрації 2ваг% (при рівномірному розташуванні срібла) були більшими порівняно з 0,5ваг%, відповідно, у 1,69; 2,39 і 1,39 рази. Аналогічна залежність встановлена і для гідроксилапатиту з градієнтним розташуванням срібла (1,62; 1,97 та 1,83 рази). Вираженість бактерицидної дії гідроксилапатитної кераміки, збагаченої сріблом, залежала також від структури керамічного матеріалу- порошок, гранули, таблетки. Діаметри зон затримки росту St. aureus, Ps. aeruginosa і E. coli порошкової форми гідроксилапатиту (з рівномірним розподілом срібла) перевищували вказані показники при застосуванні гранул у 1,24; 1,33 та 1,17 разів, а таблеток - у 1,78 та 1,79 для St. aureus, Ps. aeruginosa. Більша вираженість бактерицидної дії порошкової форми гідроксилапатиту пов'язана з тим, що саме порошок гідроксилапатитної кераміки має найбільшу площу питомої поверхні зіткнення з навколишнім біологічним середовищем, що й обумовлює максимальний вихід іонів срібла і його дію. З літератури відомо, що найактивнішими у плані остеокондуктивності, остеоінтеграційності і навіть остеоіндуктивності є високодисперсні гідрокилапатитні кераміки (Григорьян А.С., 1999; Зуев В.П.,1998). Розподіл срібла у структурі кераміки також впливає на її бактерицидні якості- быльш виражені вони при градієнтному розташуванні срібла у кераміці. При цьому ця закономірність не залежала від структури кераміки і виду мікроорганізму. Так, розміри діаметрів затримки росту St. aureus, Ps. aeruginosa і E. coli порошкової форми гідроксилапатиту з градієнтною формою були у 1,75; 1,48 та 1,24 рази більшими ніж при застосуванні відповідних форм гідроксилапатиту із рівномірним розташуванням срібла. При використанні гранул ці відмінності становили, відповідно - 1,59; 1,72 та 1,32 рази.

У подальших дослідженнях використовували гранули гідроксилапатиту, у зв язку з тим, що застосування порошкової форми кераміки потребує додаткових засобів утримання дрібних часточок у кістковій порожнині.

У зв,язку з введенням додаткових іонів металу у структуру кераміки був проаналізований мікроелементний склад кісткової тканини зони імплантації. Встановлено, що концентрація таких мікроелементів як кремній, алюміній, титан, марганець, стронцій, мідь, цинк, свинець, срібло вірогідно не відрізнялися від контрольних значень - імплантація чистого гёдроксилапатиту у терміни дослідження (90 діб). Встановлено вірогідне збільшення (при порівнянні з контролем) у 1,11 рази вмісту ванадія - мікроелементу, відомого своїми остеотропними властивостями. Істотно більше (у 1,26 рази) стосовно контролю було заліза, яке, як відомо, забезпечує множину сигналів стимуляції кісткоутворення. Отримані дані казують на те, що гідроксилапатит, збагачений сріблом, не чинить негативної дії на мікроелементний склад кістки.

Вивчення особливостей впливу гідроксилапатиту, збагаченого сріблом, на репаративний остеогенез показало, що гідроксилапатитна кераміка, збагачена сріблом (з концентрацією 0,1 ваг % ), не порушує спрямованості перебігу репаративного остеогенезу в умовах пластики кісткових дефектів. По термінам дослідження навколо гранул гідроксилапатиту, збагаченого сріблом, формується грануляційна тканина з прошарками фіброретикулярної, остеоїд та пластинчаста кісткова тканина. При цьому клітини кісткового мозку та остеогенні клітини розташовувалися безпосередньо на гранулах, а новоутворені кісткові трабекули глибоко проникали у пори керамічних гранул. Проте встановлені деякі відмінності у часових характеристиках перебігу репаративного осоеогенезу при використанні гідроксилапатиту із рівномірним і градієнтним розподілом срібла. При рівномірному розташуванні срібла у керамиці площі новоутвореної кісткової тканини і терміни її утворення, тобто стадійно-часові характеристики процесу остеорепарації не відрізнялися від показників гідроксилапатиту без срібла. Через 90 діб гранули гідроксилапатиту у обох випадках були повністю оточені пластинчастою кістковою тканиною. Характер перебудови материнскької кістки поблизу зони імплантації був аналогічним.

У разі застосування гідроксилапатиту з градієнтним розподілом срібла зафіксовано уповільнення формування репаративної клітинної бластеми, що призводило до затримки утворення кіскової тканини навколо гранул кераміки. Площі новоутвореної кісткової тканини, особливо, у ранні терміни спостереження при порівнянні з контролем і дослідом, де застосовували гідроксилапатит із рівномірним розподілом срібла були більш низькими. Так, на 7-му та 21-у доби площі кісткової тканини навколо гранул гідроксилапатиту з рівномірним розподілом срібла були, відповідно, у 2,53 та 1,56 рази більшими ніж при градієнтному розташуванні срібла. До кінця спостереження (90 доба) показники площ новоутвореної кісткової тканини навколо гранул кераміки із градієнтним розподілом срібла значно підвищувалися і вірогідно не відрізнялися від дослідних показників, проте залишалися нижчими у 1,3 рази, ніж у контролі.

У зв'язку з встановленими відмінностями у часових характеристиках формування кісткової тканини навколо гідроксилапатиту із градієнтним розподілом срібла в структурі, у подальших дослідженнях використовували кераміку з рівномірним розподілом срібла.

Для вивчення бактерицидної дії гідроксилапатиту, збагаченого сріблом, in vivo (на кроликах)- розроблена експериментальна модель запального процесу у кістковій тканині, заснована на інфікуванні St. aureus (1х106 мікробних тіл у 1мл) кісткової порожнини безпосередньо після її моделювання. Аналіз процесу загоєння інфікованих кісткових порожнин показав, що запальний процес розвивався як у області ушкодження, так і на невеликому протязі оточуючих дефект тканин - материнській кістці, кістковому мозку і періості. У ранні терміни дослідження запальний процес у кістковій порожнині носив гострий характер, а згодом - він перетворювався на хронічний. Остеорепаративний процес був порушений. Отримані результати свідчать що інфікування кісткової порожнини St. aureus безпосередньо після її виконання, дозволяє одержати модель хронічного гнійного запалення, котре нерідко зустрічається у людини.

Розроблена модель використана у експериментальних дослідженнях по вивченню бактерицидної дії гідроксилапатиту, збагаченого сріблом, та його впливу на остеорепаративний процес у інфікованії St. aureus кістковій порожнині у порівнянні з гідроксилапатитом без срібла.

Отримані результати по морфології заживлення кісткових порожнин, одержані при порівнянні поржнин заповнених гідроксилапатитом без срібла та керамікою, збагаченою сріблом, свідчать про позитивний вплив гідроксилапатиту на остеогенез у інфікованій кістковій рані. Проте, якщо для пластики використовувався гідроксилапатит, збагачений сріблом, то вже через 7 діб поблизу гранул кераміки були відзначені невеличкі ділянки вільні від мікроорганізмів з молодою грануляційною тканиною. Навколо гранул чистої кераміки в цей період і протягом практично всього терміна спостереження визначалися ділянки некрозу, гнійні інфільтрати, що відбивалося на темпах кісткоутворення. Так, площі новоутвореної кісткової тканини у випадку використання гідроксилапатиту, збагаченого сріблом, була на 90 і 180 доби у 3,46 та 2,85 рази більшими, ніж при пластиці звичайним гідроксилапатитом. При цьому відзначені розходження і у топографії утворення кісткової тканини. Якщо при використанні чистого гідроксилапатиту кісткова тканина формувалася практично лише з боку материнської кістки, то при застосуванні гідроксилапатиту, збагаченого сріблом - новоутворення кісткової тканини було зафіксовано в першу чергу на гранулах та поблизу гранул кераміки, збагаченої сріблом, тобто по всій території дефекту. Осередків некрозу і запальних інфільтратів на 180 добу не виявлено.

Одержані дані свідчать, що гідроксилапатит, збагачений сріблом, при імплантації у інфіковані кісткові порожнини пригнічує дію St. aureus, що обумовлює значні відмінності у характері перебігу остеорепаративного процесу. Відмічається значне випередження формування кісткової тканини, при порівнянні з гідроксилапатитом без срібла.

Результати комплексних експериментальних досліджень свідчать про ефективність використання гідроксилапатиту, збагаченого сріблом, у пластиці інфікованих кісткових порожнин, що дозволило рекомендувати його для апробації у клінічних умовах.

Апробація гідроксилапатитної кераміки, збагаченої сріблом ( порошок, гранули, щільні зразки з концентрацією срібла 1,0 ваг%), була проведена у клінічних умовах при лікуванні 15 хворих, розділених на дві групи. В першу групу ввійшли 5 пацієнтів із хронічними і запальними захворюваннями кісток. Друга група - це 10 хворих з високим ризиком винекнення післяопераційних запальних ускладнень (порожнини після резекції пухлин, пухлиноподібних захворювань, ревізіонне ендопротезування стегнового суглобу, а також інші патології у ослаблених хворих або місця, які визначають високий ризик інфікування - ступня, ділянки крижі), де гідроксилапатит, збагачений сріблом, використовувався з метою профілактики запальних процесів.

У двох пацієнтів першої групи було виділено збудників інфекції - золотистий стафілокок та кишечна паличка. Гістологічні дослідження видалених (під час операції) тканин, підтверджували наявність хронічного запального процесу. При оцінці результатів лікування враховували не тільки характер заживлення кісткової рани, але й відсутність рецедиву запального процесу. Терміни спостереження становили від двох до 10 місяців. У всіх пацієнтів рани зажили первинним натягом. Ні в одному випадку у вказані терміни після оперативного втручання рецедиву не відмічено. Результати клінічних досліджень показали, що гідроксилапатит, збагачений сріблом має широкий спектр протимікробної активності і пригнічує ріст таких мікроорганізмів як St. aureus та E.coli, що були виявлені у хворих, яких лікували. Перевагою цієї форми гідроксилапатиту є також те, що така кераміка може бути використана і при лікуванні пацієнтів, у яких не завжди вдається виділити і чітко визначити природу збудника.

При лікуванні 10 хворих другої групи, де гідроксилапатит застосовували для профілактики вторинних інфекційних ускладнень. Терміни дослідження склали від двох до семи місяців. Одержані позитивні результати. Гідроксилапатит добре виконував роль пластичного матеріалу, заповнюючи кісткові дефекти, поступово перебудовувався, заміщуючись новоутвореною кістковою тканиною.

У жодному випадку використання гідроксилапатиту, збагаченого сріблом, у клініці не було отримано ускладнень і рецидиву запального процесу у кістці. Хороші та задовільні результати відзначені у всіх 15 хворих. Отримані дані свідчить про доцільність застосування гідроксилапатитної кераміки, збагаченої іонами срібла, при пластиці інфікованих кісткових порожнин.

Таким чином, на підставі проведеного комплексного експериментально-клінічного вивчення гідроксилапатитної кераміки, збагаченої сріблом, яке включало дослідження біосумісності, цитотоксичності, антибактеріальних властивостей даного виду кераміки, а також особливостей остерепаративного процесу при пластиці неінфікованих та інфікованих St. aureus кісткових порожнин гідроксилапатит з іонами срібла, одержані обгрунтовані дані щодо можливості та ефективності застосування нового виду біоактивної кераміки - гідроксилапатиту, збагаченого іонами срібла, у клінічній практиці при пластиці інфікованих кісткових порожних та з метою профілактики запальних ускладнень.

Успішна апробація даного виду кераміки у клінічних умовах дозволяє рекомендувати гідроксилапатитну кераміку, збагачену іонами срібла, до широкого клінічного застосування.

На підставі результатів проведеного дослідження зроблені такі висновки.

1. Дано експериментально-клінічне обгрунтування можливості застосування гідроксилапатиту, збагаченого сріблом (з градієнтним та рівномірним розташуванням у структурі) у пластицї чистих та інфікованих кісткових порожнин при проведенні реконструктивно-відновлювальних операцій на скелеті.

2. Гідроксилапатит, збагачений сріблом (у концентрації 0,5; 1,0 та 2,0ваг%) чинить бактерицидну дію на вивчені штамми мікроорганізмів - St. aureus, Ps. aerogunous і E. coli з найбільш вираженим ефектом на E. coli. Бактерицидна дія гідроксилапатиту, збагаченого сріблом, залежить від структури кераміки (порошок, гранули, таблетки), концентрації срібла у кераміці, а також характеру розташування срібла у її структурі. Більш виражена бактерицидна дія порошкової форми гідроксилапатиту із градієнтним розподілом срібла.

3. Гідроксилапатит, збагачений сріблом із рівномірним і градієнтним розподілом у структурі, не чинить цитотоксичної дії на клітини кісткового мозку і скелетогенної мезенхіми. В умовах спільного культивування клітин і гранул гідроксилапатиту зі сріблом морфологія клітин, їх проліферативна активність та диференціровка не порушувалася, що вказує на біосумісність гідроксилапатиту, збагаченого сріблом.

4. Гідроксилапатит, збагачений іонами срібла, не порушує склад мікроелементів- кремній, алюміній, титан, марганець, стронцій, мідь, цинк, свинець, срібло. Відмічається незначне збільшення ванадію та заліза.

5. Гідроксилапатит, збагачений сріблом (концентрація 1 ваг%) з рівномірним та градієнтним розташуванням у структурі, не порушує спрямованості перебігу репаративного остеогенезу в умовах пластики кісткових дефектів - навколо гранул формується кісткова тканина. Проте часові характеристики остеорепарації відрізняються. При градієнтному розрашуванні срібла відмічається менша щільність клітин репаративної бластеми та більш пізнє формування кісткової тканини. На 7 та 21 добу площі кісткової тканини навколо гранул з рівномірним розподілом срібла перевищували показники градієнтої кераміки у 2,5 та 1,6 рази. На 90 добу у структурній організації кісткового регенерату не було відмінностей.

6. Гідроксилапатит, збагачений сріблом ( концентрація 1,0 ваг%), на відміну від чистого гідроксилапатиту у інфікованій St.aureus кістковій порожнині пригнічує дію мікроорганізмів, що призводить до виражених відмінностей стадійно-часових характеристик репаративного остеогенезу. Площі новоутвореної кісткової тканини навколо гранул гідроксилапатиту зі сріблом на всі терміни спостереження були набагато більшими, ніж при імплантації звичайної кераміки. На 90 та 180 добу ця різниця становила 3,4 та 2,9 рази.

7. Експерментально-клінічно обгрунтувані можливості застосування гідроксилапатиту, збагаченого сріблом, у пластиці кісткових порожнин, що дозволило одержати хороші та задовільні результати при лікуванні 15 хворих, як з запальними захворюваннями кісткок, так і з метою профілактики післяопераційних інфекційних ускладнень у пацієнтів з високим ризиком їх виникнення. Результати експериментально-клінічних досліджень дозволяють рекомендувати гідроксилапатит, збагачений сріблом, для широкого використання у клінічній практиці.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Корж Н.А., Радченко В.А., Филиппенко В.А., Кладченко Л.А., Тимченко И.Б., Фархан Махмуд Применение ипмплантационных материалов в качестве носителей антибактериальных препаратов // Вісник ортопедії, травматології та протезування.-2000.-№ 1.-С.93-99.

2. Филиппенко В.А., Малишкина С.В., Фархан М.М., Шевцов Б.Н., Ульянчич Н.В., Ляхнякевич Т.Г., Атаманенко О.Н. Структурные характеристики и бактерицидные свойства гидроксилапатита, обогащенного серебром // Ортопедия, травматология и протезирование.- 2000.- № 4.-С. 50-54.

3.Радченко В.А., Малышкина С.В., Фархан Махмуд, Герус Г.Б., Никольченко О.А. Исследование биологической совместимости гидроксилапатита, обогащенного ионами серебра// Український медичний альманах.-2000.-Т.3.- № 5.- С.150-153.

4. Дедух Н.В., Малышкина С.В., Фархан Махмуд. Регенерация костной раны при имплантации гидроксиапатита, обогащенного серебром // Ортопедия, травматология и протезирование.- 2001.- № 2.-С. 19-21.

5.Фархан Махмуд, Іванов Г. В. Мікроелементний склад кісткової тканини в умовах пластики кісткових дефектів гідроксилапатитом, легованим сріблом// Матеріали конф. молодих вчених “Нові технології в медицині“.- Харків, 2000.-С.20.

АНОТАЦІЯ

Фархан М.М. Застосування гідроксилапатитної кераміки, збагаченої іонами срібла, для пластики кісткових порожнин (експериментально-клінічне дослідження).-Рукопис. Дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.21. - травматологія та ортопедія. Інститут патології хребта і суглобів ім. проф. М.І.Ситенка АМН України, Харків, 2001.

У дисертації представлені дані комплексного експериментально-клінічного дослідження гідроксилапатитної кераміки, збагаченої іонами срібла, яке введене в структуру кераміки - градієнтно та рівномірно з концентрацією від 0,5 до 2,0 ваг%.

У експеріментах при культивуванні мезенхімальних клітин та кісткового мозку в присутності гранул ГАП, збагаченого сріблом, встановлена його біосумісність та відсутність цитотоксичної дії. Бактеріологічними дослідженнями доведена його бактерицидна дія на St. aureus, Ps. aerogunous та E. coli з найбільш вираженим ефектом на E. coli. Показано, що ефект бактерицидної дії був більшим з підвищенням концентрації срібла та при градієнтному розташуванні срібла у структурі кераміки. Максимально вираженим був ефект порошку гідроксилапатиту. Встановлено, що гідроксилапатит зі сріблом не порушує направленності остеорепаративного процесу у кістковій порожнині. Проте відмічається відставання у формуванні кісткового регенерату при використанні градієнтної форми кераміки.

Темпи кісткоутворення та площі зновсформованої кісткової тканини навколо гранул гідроксилапатиту зі сріблом у інфікованій St.aureus кістковій порожнині при були набагато більшими, ніж при гідроксилапатиті без срібла.

Проведена успішна апробація гідроксилапатиту зі сріблом у клініці при лікуванні 15 хворих із інфікованими кістковими порожнинами та при високому ступені ризику післяоперційного запального ускладення кісток.

Ключові слова: гідроксилапат, збагачений сріблом, кісткова пластика, неінфіковані та інфіковані кіскові порожнини.

АНОТАЦИЯ

Фархан М. М. Использование гидроксилапатитной керамики, обогащенной ионами серебра, для пластики костных полостей (экспериментально-клиническое исследование)-Рукопись.

Дисертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.21. - травматология и ортопедия

Институт патологии позвоночника и суставов им. проф. М.И.Ситенка АМН Украини, Харьков, 2001.

В диссертации представлены данные комплексного экспериментально-клинического исследования гидроксиапатитной керамики, обогащенной серебром, которое введено в его структуру