НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ

ім. Д.К.ЗАБОЛОТНОГО

Фурзікова Тетяна Михайлівна

УДК 579.852.11

ВПЛИВ МАКРООРГАНІЗМУ ТА ХІМІОТЕРАПЕВТИЧНИХ

ПРЕПАРАТІВ НА БІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ

БІОСПОРИНУ ТА СУБАЛІНУ

03.00.07 – мікробіологія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі мікробіології та загальної імунології Київського національного університету імені Тараса Шевченка та у відділі антибіотиків Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, академік

НАН України Смірнов Валерій Веніамінович,

завідувач кафедри мікробіології та загальної

імунології Київського національного університету

імені Тараса Шевченка.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, член-

кореспондент НАН України Коваленко Надія

Костянтинівна, провідний науковий співробітник

відділу фізіології промислових мікроорганізмів

Інституту мікробіології і вірусології

ім. Д. К. Заболотного НАН України;

доктор біологічних наук, професор Федоровська

Олена Олексіївна, завідувач лабораторії мікро-

біології та імунних препаратів крові Інституту

гематології та трансфузіології АМН України.

Провідна установа: Інститут епідеміології та інфекційних хвороб

ім. Л. В. Громашевського АМН України.

Захист відбудеться “24” січня 2001 року о 930 на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України (03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154, Інститут мікробіології і вірусології НАН України, зал засідань).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України.

Автореферат розісланий “ 23 ” грудня 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

канд. біол. наук Л.М.Пуріш

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Взаємовідносини між людиною та мікроорганізмами формувалися і продовжують формуватися протягом всього періоду існування людини як виду. Одні мікроорганізми стали невід’ємною ланкою процесів життєдіяльності людини, інші – причиною їх порушень. Відкриття І. Мечниковим мікробного антагонізму, яке показало можливість боротьби з бактеріальними захворюваннями за допомогою інших бактерій, дало поштовх для розвитку бактеріотерапії як перспективного напряму медицини. Препарати, основою яких є живі мікробні культури, привертають до себе все більшу увагу завдяки багатогранному позитивному впливу на макроорганізм та відсутності небажаних наслідків при їх використанні [Козлова Э.П., 1986; Лесняк С.В. и др., 1988; Поспелова В.В. и др., 1990; Fuller R., 1992]. Але, незважаючи на велику кількість новітніх препаратів з живих мікробних культур, проблема їх розробки, удосконалення та розширення меж застосування залишається актуальною. Основною причиною цього є комплекс факторів, які спричиняють порушення нормального мікробіоценозу шлунково-кишкового тракту, та обмеженість специфічної активності існуючих пробіотиків [Беляев Е.И., 1988].

Співробітниками Інституту мікробіологіі і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України були створені принципово нові пробіотики з аеробних спороутворюючих бактерій роду Bacillus – біоспорин та субалін. Ці пробіотики характеризуються унікальним спектром антагоністичної активності, по відношенню до патогенних та умовнопатогенних мікроорганізмів, і не впливають на представників нормального мікробіоценозу кишок. Їх антагоністична активність проявляється також до антибіотикорезистентних штамів бактерій. Крім того, субалін, створений методами генної інженерії, поряд з високою антибактеріальною активністю, характеризується ще й вираженою антивірусною дією завдяки продукції інтерферону -2 типу людини. Доцільність створення пробіотика з вірусно-бактеріальною активністю зумовлена поширенням захворювань змішаної етіології та недостатністю засобів лікування таких захворювань.

Аналізуючи сучасні джерела літератури стосовно пробіотиків з бацил, слід відмітити, що основну увагу дослідники звертають на ті ефекти, які здійснюють ці препарати на макроорганізм [Слабоспицкая А.Т. и др., 1990; Смирнов В.В. и др., 1980, 1993]. Вплив же макроорганізму на бактерії, що є основою цих пробіотиків, малодосліджений і практично не враховується при їх призначенні.

До того ж біоспорин та субалін використовують як самостійний засіб у профілактиці та лікуванні захворювань, що супроводжуються змінами складу мікробіоценозу кишок, через відсутність відомостей про їх активність при використанні у комплексній терапії. Окремі повідомлення свідчать, що раціональне використання хіміотерапевтичних препаратів разом з резистентними до них пробіотиками сприяє підвищенню терапевтичного ефекту при лікуванні інфекційних захворювань та запобігає негативним наслідкам антибіотикотерапії [Крилов В.П. и др., 1998; Bazovic M., 1986; Mazza P. еt al., 1992].

Актуальною є також проблема, направлена на вирішення питання підвищення терапевтичного ефекту пробіотиків, завдяки включенню до їх складу домішок, які можуть стимулювати біологічну активність бактерій, що є основою цих пробіотиків [Reddy B., 1998; Roberfoid M., 1998].

Таким чином, для удосконалення схем використання біоспорину та субаліну, необхідним було дослідження умов, при яких спостерігається найбільша активність штамів бацил, що є їх основою, а також доцільності використання цих пробіотиків у комплексній терапії інфекційних захворювань.

Зв’язок роботи з науковими програмами, темами, планами. Робота виконана згідно планів науково-дослідних робіт Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України, а також програм ДНТП “Імунопрофілактика населення” (проект № 11 “Розробка методів підвищення ефективності використання імунобіологічних препаратів та впровадження їх у практику охорони здоров’я”), Міністерства науки України (проект 02.02/5179 “Впровадити у медичну практику принципово новий пробіотик субалін комплексної дії”).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи – вивчити вплив макроорганізму на біологічні характеристики пробіотиків біоспорин і субалін, можливості підвищення їх терапевтичного ефекту та використання у комплексній терапії.

Згідно наявної мети необхідним було вирішення наступних завдань:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Наукова новизна результатів досліджень

-

-

-

-

Практичне значення отриманих результатів. На основі отриманих результатів щодо впливу макроорганізму на біологічну активність біоспорину та субаліну внесені певні корективи до інструкцій по використанню цих пробіотиків.

Продемонстровано можливість підвищення терапевтитчного ефекту пробіотиків та вдосконалення їх виробництва за допомогою деяких фітовідварів.

Доведено здатність попередження у піддослідних тварин негативних наслідків хіміотерапії при включенні до комплексного лікування пробіотиків біоспорин та субалін.

Субалін рекомендовано як необхідний компонент комплексної терапії менінгоенцефаліту.

Отримані результати увійшли до інструкцій по застосуванню біоспорину і субаліну та тимчасової фармакопейної статті на субалін.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертації самостійно виконані основні експериментальні дослідження, проаналізовані їх результати і обгрунтовані науково-практичні висновки. Окремі дослідження було проведено разом з А.В.Руденко (вивчення чутливості пробіотиків до антимікробних агентів за допомогою автоматизованої системи Abbot - на базі Інституту урології та нефрології АМН України), С.Л.Рибалко та А.О.Руденко (Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського - дослідження включення субаліну до комплексної терапії хворих менінгоенцефалітом) за що автор роботи висловлює свою глибоку вдячність. Особлива подяка науковому керівнику д.м.н., проф., акад НАН України В.В.Смірнову та консультанту д.б.н. І.Б.Сорокуловій за дієву допомогу та підтримку.

Апробація результатів досліджень. Результати роботи доповідались на науковій конференції професорсько-викладацького складу Київського національного університету імені Тараса Шевченка (1999), Всеукраїнській конференції з питань пробіотиків (Харків, 2000) та на Всеукраїнському мікробіологічному з’їзді (Чернігів, 2000).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 5 робіт (з них 4 статті в профільних журналах і 1 в тезах доповідей).

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 182 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, власних експериментальних досліджень, узагальнення результатів дослідженнь, висновків, списку літератури та додатків. Робота ілюстрована 23 таблицями та 15 рисунками. Бібліографічний список містить 326 літературних джерел, в тому числі 143 - іноземних авторів.

ЗМІСТ РОБОТИ

В трьох підрозділах огляду літератури розглянуті сучасні уявлення про формування динамічних взаємовідносин між макроорганізмом та його нормальною мікрофлорою, причини та наслідки їх порушень, а також можливість корегування цих порушень за допомогою бактеріотерапії.

Розділ 2. Матаріали і методи досліджень

Об’єктом дослідження були культури аеробних спороутворюючих бактерїй роду Bacillus, які входять до складу пробіотиків біоспорину та субаліну.

В дослідах були використані ліофілізовані промислові препарати біоспорин (комерційної серії 190396) та субалін (серії 2), виготовлені на ВАТ “Дніпрофарм”, а також вегетативні клітини та спори штамів бактерій Bacillus subtilis 3 та Bacillus subtilis 2335/105, що є, відповідно, основою зазначених пробіотиків.

При дослідженні антагоністичної активності пробіотиків використовували тест-культури різних таксономічних груп (Staphylococcus aureus 209, Escherichia coli 338, Proteus vulgaris 12, Salmonella typhi 11, Shigella sonnei 38, Candida albicans 690), отримані в Інституті епідеміології і інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського АМН України.

Секреторні рідини та сироватку крові отримували із клінічних лабороторій. Дослідження впливу слини на біологічні властивості пробіотиків проводили ex tempore.

В роботі були використані відвари деревію звичайного, звіробою звичайного, лепехи звичайної, м’яти перцевої, подорожника великого, полину гіркого, ромашки лікарської та шлункового збору № 3, які готували згідно рекомендованих інструкцій.

Інтенсивність росту досліджуваних штамів бацил під впливом різних концентрацій секреторних рідин, сироватки крові та амінокислот, значень pH, температури та деяких фітовідварів вивчали методом граничних розведень.

Тривалість фаз росту, під впливом деяких із зазначених агентів, визначали фотоколориметричним методом на КФК-2-УХЛ-4.2, вимірюючи величину оптичної густини [Gerhardt P., 1994].

Для визначення антагоністичної активності, використовували методику відстроченого антагонізму [Егоров Н.С., 1986].

Морфологію клітин вивчали у фіксованих препаратах на поляризаційно-інтерференційному мікроскопі “Biolar” (х 1250), а мікрофотографії робили з використанням мікрофотонасадки МФН-10 У 4.2.

Фарбування за Грамом проводили в модифікації Хукера [Герхардт Ф. и др.,1984].

Спори отримували при вирощуванні бацил на спеціальному поживному середовищі для спороутворення [Герхардт Ф. и др., 1984]. Культуральну рідину додатково прогрівали на водяній бані при 800 С протягом 20 хв.

Для виявлення спор у процесі культивування готували препарати за методом Schfeffer-Fulton [Gerhardt Р., 1994].

Чутливість до антимікробних препаратів вивчали диско-дифузійним методом [Меньшиков В.В., 1987].

Динаміку росту мікроорганізмів у присутності антимікробних препаратів вивчали за допомогою швидкісної автоматизованої системи для мікробіологічних та інших наукових досліджень MS-2 фірми “Abbot”.

ДНК-азну активність, токсигенність та вірулентність визначали загальноприйнятими методами [Биргер М.О., 1982].

Специфічність штамів визначали за допомогою імунних флюорокуючих сироваток [Сорокулова И.Б., 1999].

Вивчення мікробіоценозу кишок проводили згідно методичних рекомендацій [Грачева Н.М. и др., 1986].

Визначення титрів інтерферону в сироватці крові проводили прямим імуноферментним методом з використанням моно- і поліклональних антитіл до інтерферону, а також за біологічною активністю (пригніченням цитопатичної дії вірусу везикулярного стоматиту в гомологічних культурах тканин) [Рейнару И.К., Гемусова А.A., 1981] і виражали в міжнародних одиницях активності на мілілітр (МО/мл).

Визначали загальну кількість імунокомпетентних клітин (T- і B–лімфоцитів), оцінювали субпопуляції Т-лімфоцитів, а саме: Т-активних лімфоцитів, теофілін-стійких Т-лімфоцитів (хелперів) і теофілін-чутливих Т-лімфоцитів (супресорів), кількість та активність В-лімфоцитів [Дж. Клаус, 1990].

Статистичну обробку результатів експериментальних досліджень проводили згідно [Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962].

Розділ 3. Результати власних досліджень

Біологічні зміни аеробних спороутворюючих бактерій Bacillus subtilis 3 та Bacillus subtilis 2335/105 – основи біоспорину та субаліну - під впливом макроорганізму

З метою раціонального використання терапевтичних препаратів необхідними є знання про механізм їх дії та формування взаємовідносин з макроорганізмом. Основою цих взаємовідносин є, як дія препарату на макроорганізм, так і тих факторів макроорганізму, що здатні впливати на біологічну активність самого препарату при його використанні.

При пероральному використанні пробіотиків бактерії, що є їх основою, підлягають впливу різних значень pH, які реєструються в певних відділах шлунково-кишкового тракту. Встановлено, що pH від 7,0 до 9,0 суттєво не відображується на розвитку досліджуваних бацил незалежно від характеру посівного матеріалу (спори або вегетативні клітини). Зниження pH від 7,0 до 2,0 інгібує розмноження вегетативних клітин бацил. Спори при значеннях pH від 6,0 до 2,0 не проростають, але залишаються повністю життєздатними і після перенесення їх у середовище з оптимальним значенням pH відновлюють свою життєдіяльність.

Значенням pH, при якому спостерігається найбільша антагоністична активність бацил, є pH 7,0. При підвищенні pH їх антагоністична активність знижується до грамнегативних бактерій та грибів роду Candida. Вплив низьких значень pH на антагоністичну активність бацил не встановлено, через відсутність їх росту при pH нижче 6,0 (табл.1).

Таблиця 1

Вплив pH середовища на антагоністичну активністьB.subtilis 3

і B.subtilis 2335/105

Культура-антагоніст |

pH | Зони затримки росту тест-культур (в мм)

S.aureus

209 | E.coli

338 | P.vul-garis 12 | S.typhi

11 | S.sonnei 38 | C.albi-

cans 690

B.subtilis 3 | 7,0

9,0

9,5 | 25+0,5

30+0,5

30+0,5 | 12+0,3

11+0,3

8+0,2 | 15+0,3

14+0,3

9+0,2 | 13+0,3

8+0,2

8+0,2 | 13+0,2

10+0,2

3+0,2 | 20+0,3

0

0

B.subtilis

2335/105 | 7,0

9,0

9,5 | 27+0,5

30+0,5

25+0,5 | 15+0,1

9+0,2

5+0,1 | 17+0,3

10+0,3

0 | 13+0,2

5+0,2

0 | 14+0,2

11+0,2

5+0,2 | 20+0,3

0

0

Досліджуючи вплив температури на штами B.subtilis 3 та B.subtilis 2335/105 встановлено, що вегетативні клітини цих бактерій є повністю життєздатними в діапазоні температур від 300 до 400 С. Визначено також тривалість lag-фази росту в залежності від температури культивування. Найкоротша тривалість lag-фази (4 год) спостерігалась при температурі 370 С, зі зниженням температури до 300 С її тривалість збільшувалась до 5-6 год, а з підвищенням температури до 400 С досягала 10-11 год. З часом інтенсивність росту при різних температурах була майже однакова (рис.1).

Зі зміною температури змінюється і антагоністична активність досліджуваних пробіотиків. При температурі 300-370 С не спостерігали відмінностей у середніх значеннях величин зон затримки росту тест-культур. При температурі 400 С відмічали зниження антагоністичної активності у відношенні до E.coli, S.typhi, S.sonnei та P.vulgaris, проте зміна температури не впливала на антагоністичну активність до S.aureus та C.albicans (рис. 2).

Пероральне використання пробіотиків зумовлює також тісний контакт бактерій, що є їх основою, з секреторними рідинами, кількість продукції яких залежить від характеру та кількості їжі.

Встановлено, що нативна слина не впливає на життєздатність бактерій, які складають основу біоспорину та субаліну.

Збільшення концентрації шлункового соку в середовищі від 1% до 50% інгібує ріст та розвиток досліджуваних культур. Інгібуючу дію шлункового соку в першу чергу пов’язують з його низьким значенням pH. Н.І. Коган (1984) відмічає, що натщесерце реакція шлункового вмісту є нейтральною і знижується лише після прийому їжі. В наших дослідженнях показано, що нейтралізований шлунковий сік не впливає на життєздатність B.subtilis 3 та B.subtilis 2335/105.

Збільшення концентрації шлункового соку в середовищі від 1% до 10% також пригнічує антагоністичну активність пробіотиків у відношенні до кишкової палички, шигел, сальмонел та грибів роду Candida і не впливає на антагоністичну активність до стафілококів та протеїв (табл. 2).

Таблиця 2

Вплив шлункового соку на антагоністичну активність

Bacillus subtilis 3 і Bacillus subtilis 2335/105

Концент-рація шл. соку | Зони затримки росту тест-культур (в мм)

S.aure-us 209 | E.coli

338 | P.vul-garis12 | S.typhi

11 | S.son-nei 38 | C.albi-cans 690

Bacillus subtilis 3

К. | 25+0,5 | 12+0,3 | 15+0,3 | 13+0,3 | 13+0,2 | 20+0,3

1% | 27+0,3 | 6+0,2 | 20+0,7 | 0 | 5+0,1 | 3+0,1

5% | 28+0,2 | 0 | 23+0,8 | 0 | 0 | 0

10% | 23+0,5 | 0 | 14+0,4 | 0 | 0 | 0

Bacillus subtilis 2335/105

К. | 27+0,5 | 15+0,1 | 17+0,3 | 13+0,3 | 14+0,2 | 20+0,3

1% | 30+0,5 | 11+0,2 | 15+0,3 | 9+0,1 | 7+0,1 | 15+0,2

5% | 27+0,3 | 4+0,2 | 12+0,2 | 3+0,1 | 3+0,1 | 8+0,2

10% | 23+0,5 | 0 | 14+0,4 | 0 | 0 | 0

Жовч не впливає на інтенсивність росту досліджуваних штамів основи біоспорину та субаліну.

При вивченні впливу жовчі на бактерії пробіотиків, показано взаємозв’язок між рівнем споруляції бацил та їх антагоністичною активністю. Антагоністична активність досліджуваних штамів бацил зростала лише при вмісті 1% жовчі в середовищі, а інтенсивність спороутворення при цьому досягала 90-95%. При підвищенні концентрації жовчі в середовищі від 5 до 50%, антагоністична активність знижувалася, а спороутворення припинялося починаючи з 10% вмісту жовчі. Проте ця закономірність не поширюється на антагоністичну активність до S.aureus (рис.3).

Зважаючи на явище безсимптомної бактеріємії, при пероральному використанні пробіотиків, досліджували також вплив сироватки крові на біологічні характеристики біоспорину та субаліну. Встановлено, що нативна сироватка крові не впливала на інтенсивність росту досліджуваних штамів бацил, проте збільшення її концентрації в середовищі пригнічувало антагоністичну активність та інгібувало спороутворення.

При дослідженні впливу амінокислот в концентраціях, які визначаються в крові та секреторних рідинах, на активність пробіотиків, чітких та суттєвих закономірностей встановити не вдалося. Одна і та ж сама амінокислота може як підсилювати, так і пригнічувати антагоністичну активність бацил у відношенні до різних тест-культур.

Проведені дослідження дозволили встановити деякі закономірності впливу макроорганізму на штами бактерій, що є основою біоспорину та субаліну, на підставі чого вдалося раціоналізувати схеми по використанню цих пробіотиків.

Вплив фітовідварів на специфічну активність пробіотиків

Можливість підвищення терапевтичного ефекту пробіотиків привертає увагу багатьох учених. Досліджуються, в основному, речовини, які можуть стимулювати інтенсивність росту мікроорганізмів, що є основою пробіотиків і при цьому не впливають на макроорганізм [Шендеров Б.А., 1997]. Останнім часом з’являються повідомлення про такі домішки до пробіотиків, які здійснюють позитивний вплив як на мікроорганізми-пробіотики, так і безпосередньо на сам макроорганізм [Reddy B.,1998]. До таких домішок належать екстракти та відвари з деяких рослин.

Нами було досліджено вплив на інтенсивність росту та антагоністичну активність штамів B.subtilis 3 та B.subtilis 2335/105 таких фітовідварів, які зазвичай використовують при шлунково-кишкових захворюваннях (звіробою, деревію, лепехи, м’яти, подорожника, полину, ромашки та шлункового збору).

Інтенсивність росту досліджували на рідкому стрептоміцетному середовищі, де замість дистильованої води було взято відвар тієї або іншої рослини. Встановлено, що всі фітовідвари позитивно впливають на приріст біомаси бактерій, що є основою біоспорину та субаліну, а фітовідвари з деревію, полину та подорожника стимулюють її приріст більш ніж удвічі (рис.4). Вплив фітовідварів на інтенсивність приросту біомаси для обох досліджуваних штамів був майже однаковий.

Вплив фітовідварів на антагоністичну активність пробіотиків досліджували виходячі з двох позицій.

У першому випадку вивчали антагоністичну активність на щільному поживному середовищі, виготовленому на основі фітовідварів. Встановлено, що на середовищах із подорожником та шлунковим збором значно зростає антагоністична активність у відношенні до всіх тест-культур. Відвар деревію стимулює антагоністичну активність до грибів роду Candida та кишкової палички.

У другому випадку вивчали антагоністичну активність штамів B.subtilis 3 та B.subtilis 2335/105 після пасування через рідке середовище на основі фітовідварів з наступним їх висівом на щільне середовище без фітовідварів. Встановлено, що після п’яти пасажів антагоністична активність бацил посилюється у всіх випадках, а особливо при використанні лепехи, звіробою, деревію та подорожника.

Отже, фітовідвари можуть бути ефективною домішкою у виробництві пробіотиків та у клінічній практиці при комплексній терапії.

Вивчення можливості використання пробіотиків у комплексній терапії інфекційних захворювань

Вплив антимікробних препаратів та їх сумісного використання з пробіотиками на мікрофлору кишок мишей. Існують повідомлення про ефективність сумісного використання антибіотиків з резистентними до них пробіотиками з метою запобігання негативним наслідкам антибіотикотерапії. Використання пробіотиків з антибіотиками, до яких вони є чутливими, не давало позитивного результату [Greene W. et al., 1991; Mazza P. et al., 1992]. Аналогічні дослідження з пробіотиками біоспорином та субаліном не проводились. Тому, для раціоналізації схем по використанню цих пробіотиків, необхідним було дослідити можливість їх застосування в комплексі з різними хіміотерапевтичними препаратами.

На першому етапі було досліджено чутливість штамів бацил, що є основою біоспорину та субаліну, до широкого спектра антимікробних препаратів диско-дифузійним методом (табл.3) та з допомогою швидкісної автоматизованої системи MS-2 фірми “Abbot”. На підставі отриманих результатів, для подальшого дослідження, були відібрані антимікробні препарати, які по різному впливали на ріст зазначених штамів: бісептол пригнічував ріст обох штамів досліджуваних бацил, до поліміксину М ці пробіотики були резистентними, а канаміцин інгібував розвиток штаму B.subtilis 3 і не впливав на ріст штаму B.subtilis 2335/105.

Таблиця 3

Чутливість штамів бацил – основи біоспорину

та субаліну – до різних антибіотиків та антимікробних агентів*

Антимікробні препарати | B.subtilis 3 | B.subtilis 2335/105

Пеніциліни:

-Азлоцилін | 18+0,2 | 16+0,5

-Амоксицилін | 18+0,1 | 16+0,1

-Ампіцилін | 10+0,3 | 12+0,4

-Карбеніцилін | 24+0,4 | 22+0,5

-Мезлоцилін | 20+0,3 | 18+0,4

-Оксацилін | 14+0,3 | 12+0,4

Продовження табл. 1

-Бензилпеніцилін | 8+0,1 | 8+0,1

-Тикарцилін | 24+0,4 | 24+0,4

-Піперацилін | 18 +0,3 | 18 +0,3

Монобактами:

-Азтреонам | 0 | 0

Карбапенеми:

-Імепенем | 36+0,4 | 45 +0,6

Цефалоспорини:

-Моксалактам | 12 +0,3 | 14 +0,3

-Цефалотин | 32 +0,5 | 38 +0,5

-Цефазолін | 24 +0,2 | 19 +0,2

-Цефамандол | 37 +0,1 | 36 +0,2

-Цефокситин | 16 +0,3 | 10 +0,2

-Цефоперазон | 16 +0,1 | 20 +0,2

-Цефотаксим | 14 +0,2 | 8 +0,1

-Цефтазидим | 8 +0,2 | 0

-Цефтизоксим | 0 | 0

-Цефтриаксон | 18 +0,3 | 12 +0,1

-Цефуроксим | 0 | 0

Аміноглікозиди:

-Амікацин | 20 +0,2 | 0

-Гентаміцин | 24 +0,2 | 19 +0,1

-Канаміцин | 23 +0,1 | 0

-Тобраміцин | 24 +0,2 | 0

Інші:

-Ванкоміцин | 12 +0,1 | 14 +0,1

-Кліндаміцин | 10 +0,3 | 14 +0,1

-Тетрациклін | 24 +0,3 | 18 +0,1

-Хлорамфенікол | 16 +0,2 | 18 +0,2

-Поліміксин Е | 10 +0,1 | 0

-Нітрофурантоін | 16 +0,2 | 18 +0,5

-Триметоприм | 24 +0,2 | 22 +0,5

-Бактрим | 30 +0,2 | 30 +0,1

-Норфлоксацин | 24 +0,2 | 30 +0,1

-Налідіксова к-та | 20 +0,2 | 22 +0,1

-Поліміксин М

сульфат | 0 | 0

Примітка: *- діаметр зон затримки росту культур (в мм)

Встановлено, що при введенні піддослідним тваринам бісептолу, поліміксину та канаміцину (у середній добовій дозі з розрахунку на 1 кг ваги) протягом десяти діб відбуваються зміни у складі нормофлори кишок мишей, які можна характеризувати як дисбактеріоз другого ступеня у випадку введення бісептолу та поліміксину і дисбактеріоз третього ступеня – у випадку введення канаміцину.

Комбіноване використання цих антибактеріальних препаратів з пробіотиками біоспорином та субаліном суттєво запобігало розвитку дисбактеріозу.

Так, при введенні тваринам бісептолу разом з біоспорином або субаліном вміст практично всіх досліджуваних груп бактерій залишався майже незмінним. Якщо при введенні лише бісептолу кількість E.coli зі зниженою ферментативною активністю збільшувалась з 10% до 99% вже на третю добу, то при введенні бісептолу з субаліном вона залишалась незмінною протягом всього періоду дослідження, а у випадку комбінування з біоспорином – збільшувалась лише на десяту добу спостережень до 50%. Слід зазначити, що при використанні лише бісептолу з’являлися гемолітичні форми кишкової палички та стафілокока, тоді як при його комбінованому використанні з пробіотиками гемолітичні форми не висівалися в жодному випадку.

При сумісному введенні поліміксину М із зазначеними пробіотиками кількісні коливання досліджуваних груп мікроорганізмів зовсім не виходили за межі норми.

У випадку одночасного введення канаміцину (антибіотика, який вибірково пригнічує ріст штаму B.subtilis 3 і не впливає на ріст B.subtilis 2335/105) з біоспорином та субаліном помічена різниця у здатності цих пробіотиків запобігати дисбіотичним змінам. Так, при сумісному використанні канаміцину з субаліном кількість кишкової палички зі зниженою ферментативною активністю не перевищувала норми (‹10%), а у випадку введення канаміцину з біоспорином її вміст значно збільшувався. В той же час комбіноване використання канаміцину як з біоспорином, так і з субаліном, запобігало зниженню кількості біфідобактерій та лактобацил, зростанню кількості таких умовнопатогенних мікроорганізмів, як стафілококи, протей та кандіди, а також появі гемолітичних форм бактерій (табл. 4).

Після 10-добового введення піддослідним тваринам хіміотерапевтичних препаратів, вони були розділені на три підгрупи, для проведення реабілітаційної терапії. Тваринам першої та другої підгруп вводили пробіотики біоспорин та субалін, відповідно, протягом семи діб. Тварини третьої підгрупи були контрольними – отримували фізрозчин. Встановлено, що за допомогою біоспорину та субаліну (1 та 2 підгрупа) відновлення нормофлори відбувалось протягом 5-7 діб, тоді як самостійне відновлення мікрофлори (3 підгрупа), порушеної введенням антимікробних препаратів, за цей час не відбувалося.

Таблиця 4

Вплив канаміцину та його комбінацій з біоспорином і

субаліном на мікрофлору кишок мишей

Група мікро-організмів | До-ба | Кількість КУО при введенні:

фіз. роз-чину | канаміцину | Канаміцину + біоспорин | канаміцину + субалін

Біфідобактерії | 3-6 | 108-1010 | 108-1010 | 108-1010 | 108-1010

10 | 103-105 | 108-1010 | 108-1010

Лактобацили | 3-6 | 108-109 | 108-109 | 108-109 | 108-109

10 | 103-106 | 107-109 | 107-109

Ешеріхії з нор-мальною фер -ментативною активністю | 3 |

(6,3+0,3)

х107 | (1,90,8)x106 | (3,5+0,5)х106 | (8,60,2)x107

6 | <102 | <102 | (4,00,8)x107

10 | <102 | <102 | (1,20,2)x106

-“- зі зниженою ферментативною активністю та лактозонегативні | 3 | До 10% від зага-льної кількості | 80% | 60% | <10%

6 | 99% | 80% | <10%

10 | 99% | 80% | <10%

Гемолітичні ешеріхії | 3 |

0 | 0 | 0 | 0

6 | (3,60,4)x103 | 0 | 0

10 | (2,40,8)x105 | 0 | 0

Cтафілококи (загальна кількість) | 3 |

(1,2+0,3)

х103 | (1,3+0,4)х103 | (1,41,2)x103 | (1,30,4)x103

6 | (2,80,6)x105 | (5,60,3)x104 | (4,50,5)x103

10 | (9,80,2)x105 | (5,80,3)x104 | (1,00,5)x104

Cтафілокок гемолітичний | 3-6 | 0 | 0 | 0 | 0

10 | (1,20,6)x103 | 0 | 0

Мікроби р. Proteus | 3-10 | <104 | <104 | <104 | <104

Дріжджеподібні гриби р.Candida | 3 |

<103 | <103 | <103 | <103

6 | (4,90,4)x105 | (1,90,9)x103 | (2,30,5)x103

10 | (2,80,8)x106 | (2,10,3)x104 | (2,30,7)x103

Для спостереження за станом мікробіоценозу кишок, групи тварин, які отримували одночасно антимікробний препарат і пробіотик, розділили на дві підгрупи: тваринам першої підгрупи відмінили введення антимікробних препаратів і продовжували вводити лише пробіотик, тваринам другої підгрупи відмінили введення обох агентів. У тварин першої підгрупи повна нормалізація мікробіоценозу кишок спостерігалась на третю добу реабілітаційної терапії. В другій підгрупі, де відмінили введення як хіміопрепарату так і пробіотика, повна нормалізація мікрофлори відбувалася за 3-5 діб.

Отже, експериментально доведено, що комплексне використання біоспорину та субаліну разом з антимікробними препаратами запобігало розвитку дисбактеріозу навіть у випадку, коли бактерії – основа пробіотиків – були чутливими до них.

Вплив імунодепресантів на специфічні характеристики бацил - основи пробіотиків. Відомо, що наслідком імуносупресивної терапії є дисбактеріоз, а інколи септичні процеси ендогенного походження [Аманов Н. и др., 1989; Пырич Л.А. и др., 1983]. Тому одним з актуальних завдань є запобігання таким ускладненням та скорочення терміну одужання.

Досліджено вплив імунодепресантів на специфічні показники бактерій – основи пробіотиків. Вплив імунодепресантів визначали після десяти пасажів штамів бацил на середовищі з різним вмістом преднізолону та циклофосфану на такі біологічні показники: розмір клітин, спороутворення, ДНК-азну активність, токсигенність, вірулентність, антагоністичну активність, а також визначали автентичність штамів за допомогою флюорокуючих штамоспецифічних сироваток. Встановлено, що жоден з досліджуваних показників не зазнавав змін. Крім того, на середовищах, що містили цитостатики, антагоністична активність зростала зі збільшенням їх концентрації у середовищі.

Ці результати знайшли застосування при розробці схем лікування в Інституті урології та нефрології АМН України і показали, що одночасне застосування імунодепресантів з пробіотиками значно запобігає розвитку дисбактеріозу [Баран Є.Я., Радіонов М.Л., Руденко А.В., 1997 ].

Використання субаліну в комплексній терапії хворих менінгоенцефалітом. Позитивні результати досліджень сумісного використання субаліну з антимікробними препаратами, а також його антибактеріальні, антивірусні, антитоксичні та антиалергічні властивості обумовили необхідність дослідження ефективності включення цього пробіотика до комплексної терапії складного вірусно-бактеріального захворювання – менінгоенцефаліту. Крім субаліну в комплексну терапію входили: антибіотики (цефтріаксон та ципробай або цефотаксим та цефобіт), осмотичні діуретики та салуретики, дезінтоксикаційно-дегідраційні засоби, вітаміни, ноотропи, лідаза, церебролізин. Субалін призначали по одній дозі тричі на день за 30 хв до їди.

Встановлено, що при включенні субаліну у комплексне лікування хворих менінгоенцефалітом відмічається нормалізація порушеного мікробіоценозу кишок протягом 14 діб. При терапії ж менінгоенцефаліту без субаліну дисбактеріоз прогресує і потребує постзагального лікування (табл. 5).

Таблиця 5

Стан мікробіоценозу кишок при терапії менінгоенцефалітів

Група мікроорганізмів

Норма

М + Мlog10 | До-ба | Кількість КУО в

М + Мlog10

Гр.1* | Гр. 2**

Біфідобактерії | 8,6 + 0,6 | 5 | 5,7+0,2 | 5,6+0,4

14 | 7,9+0,5 | 5,6+0,6

Лактобацили | 6,9+0,2 | 5 | 5,4+0,3 | 5,3+0,2

14 | 6,7+0,4 | 4,6+0,9

Ешеріхії з нормальною ферментативною активністю | 7,7+0,3 | 5 | 6,0+0,3 | 6,3+0,2

14 | 7,5+0,1 | 4,1+0,8

Ешеріхії зі зниженою ферментативною активністю | 6,7+0,2 | 5 | 8,3+1,0 | 8,4+0,4

14 | 6,5+0,5 | 8,6+0,5

Гемолітичний стафілокок | 0 | 5 | 0,6+3,9 | 0,5+1,5

14 | 0 | 0,8+0,9

Гриби р. Candida | <4 | 5 | 4,6+0,6 | 3,6+0,6

14 | 0,3+0,4 | 4,9+0,4

Примітка: Гр 1* - до комплексного лікування включено субалін;

Гр. 2** - контрольна група (не отримувала субалін).

Зважаючи на здатність штаму B.subtilis 2335/105 – основи субаліну –синтезувати та індукувати продукцію інтерферону, досліджували його рівень

у крові. Встановлено, що при включенні субаліну до комплексної терапії менінгоенцефалітів відмічається зростання титрів інтерферону в крові хворих (рис. 5).

Була також показана залежність зростання титру інтерферону в крові хворих, від дня госпіталізації. Так, при госпіталізації після третього дня захворювання розвивається деяка стійкість до інтерферонової терапії субаліном, але не загальна, як при терапії лише інтерфероном.

Встановлено, що при включенні субаліну до комплексної терапії менінгоенцефалітів поліпшуються і деякі інші показники імунологічного стану хворих, зокрема, кількість та активність Т- та В-лімфоцитів.

Лікарі також зазначають, що стабілізація імунологічного і бактеріологічного стану хворих при терапії субаліном призводить до скорочення тривалості та гостроти клінічних симптомів хвороби (температури, слабкості, головного болю, ністагму, болючості в точках виходу черепномозкових нервів).

Отже, субалін було рекомендовано як один з необхідних компонентів комплексної терапії менінгоенцефалітів.

Таким чином, проведені дослідження дозволили удосконалити схеми застосування біоспорину та субаліну, показали можливість розширення сфер їх використання при включенні до комплексної терапії інфекційних захворювань і відкрили шляхи вдосконалення виробництва цих препаратів.

В И С Н О В К И

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Фурзікової (Сергійчук) Т.М.

1.

2.

3.

4.

5.

АНОТАЦІЯ

ФУРЗІКОВА Т.М. Вплив макроорганізму та хіміотерапевтичних препаратів на біологічні властивості біоспорину та субаліну. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07. – мікробіологія. – Інститут мікробіології і вірусології ім Д.К.Заболотного НАН України, Київ, 2001.

Дисертацію присвячено питанням оптимізації схем використання пробіотиків з аеробних спороутворюючих бактерій роду Bacillus – біоспорин та субалін. Досліджено вплив факторів макроорганізму на зазначені пробіотики. Згідно отриманих результатів рекомендовано їх призначення в період між основними прийомами їжі. Виявлено унікальний стимулюючий ефект деяких фітовідварів на приріст біомаси бактерій з біоспорину та субаліну. Продемонстрована можливість запобігання дисбактеріозу при сумісному використанні цих пробіотиків з хіміотерапевтичними препаратами, навіть з такими, що інактивують досліджувані штами. Клінічно доведено ефективність використання субаліну в комплексній терапії менінгоенцефаліту та розроблені схеми щодо його застосування.

Ключові слова: пробіотики, біоспорин, субалін, дисбактеріоз,

бактеріотерапія, менінгоенцефаліт.

АННОТАЦИЯ

ФУРЗИКОВА Т.М. Влияние макроорганизма и химиотерапевтических препаратов на биологические свойства биоспорина и субалина. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07. – микробиология. – Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного НАН Украины, Киев, 2001.

Диссертация посвящена вопросам оптимизации схем по использованию пробиотиков из аэробных спорообразующих бактерий рода Bacillus - биоспорин и субалин.

Впервые установлено влияние факторов макроорганизма, с которыми сталкиваются пробиотики при их пероральном применении, на основные характеристики штаммов, составляющих основу биоспорина и субалина. На основании полученных результатов рекомендовано применение указаных пробиотиков в период между основными приемами пищи, когда отмечается наименьшая активность секреторных желез, так как экспериментально установлено, что максимальная активность пробиотиков отмечается при минимальных концентрациях секреторных жидкостей.

Показана возможность повышения биологической активности пробиотиков с помощью фитоотваров аира, зверобоя, мяты, подорожника, полыни, тысячелистника и желудочного сбора № 3. В частности установлен уникальный стимулирующий эффект этих фитоотваров на интенсивность роста и антагонистическую активность штаммов B. subtilis 3 и B. subtilis 2335/105.

Изучена чувствительность пробиотиков к широкому спектру антимикробных агентов. Установлено, что исследуемые штаммы не отличаются по своей чувствительности к антимикробным агентам за исключением резистентности штамма B. subtilis 2335/105 – основы субалина к амикацину, тобрамицину, канамицину, к которым штамм B. subtilis 3 был высокочувствительным.

Экспериментально продемонстрирована эффективность комбинированого использования пробиотиков с антимикробными препаратами, даже с такими, к которым они чувствительны. Так, введение подопытным животным канамицина, полимиксина М и бисептола в течение 10 дней приводит к развитию дисбактериоза второй степени в случае применения бисептола и полимиксина и третей степени – канамицина. В тоже время при комбинированном использовании этих антибиотиков с биоспорином или субалином отмечаются лишь незначительные изменения состава микробиоценоза кишечника.

Клинически подтверждена эффективность включения субалина в терапию заболевания вирусно-бактериальной этиологии – менингоэнцефалита.

Ключевые слова: пробиотики, биоспорин, субалин, дисбактериоз,

бактериотерапия, менингоэнцефалит.

SUMMARY

FURZIKOVA T.M. Influence of the macroorganism and chemiotherapeutic preparations on biological characteristics of biosporin and subalin. - Manuscript.

The thesis for obtaining of scientific degree of candidate of biological science as speciality 03.00.07. – Microbiology. – D.K. Zabolotny Institute of microbiology and virology of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv, 2001.

The thesis is devoted to the question of the optimisation of schemes of aplication of probiotics from the aerobic sporoforming bacteria of Bacillus genus – biosporin and subalin. It was researched the influence of factors of macroorganism on aboved probiotics. According to the obtained results it was recommended their